一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽及其制备方法
和应用
技术领域
背景技术
[0002] 血管紧张素转换酶(Angotensin Converting Enzyme，ACE)是一种存在于不同组织里的多功能胞外含锌二羧肽酶，能被氯离子激活并具有较宽的底物特异性。它在肾素-血管紧张素系统(Renial Angiotensin System，RAS)和激肽酶-激肽系统(Kallikrein-Kinin，KKS)具有重要和关键的生理功能。它的主要作用是把血管紧张素I(Angiotensin I Converting Enzyme)转
化成血管紧张素II(Angiotensin II Converting Enzyme)，同时还会使血管舒缓激肽失活，最终导致人体血压升高。
[0003] 血管紧张素转换酶抑制多肽是由数个
氨基酸组成具有生物活性的多肽，并且对ACE活性区域具有较强亲和
力的
抑制剂，它们与ACE的亲和力比血管紧张素I或舒缓激肽更强，而且也较不容易从ACE结合区释放，降低ACE活性或使其失去活性，从而阻碍ACE催化血管紧张素I转化成血管紧张素II，以及阻碍ACE
水解舒缓激肽成为失活
片段，从而达到降低血压的作用。
[0004] 公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的
现有技术。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽，其从蚕蛹蛋白的水解产物中提取得到，其具有明显的ACE抑制活性，为制备降血压药物提供理论指导。
[0006] 本发明提供了一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0008] (1)将冷冻蚕蛹按照1:3的比例加入到蒸馏水中，匀浆搅拌1h后过滤，重复3次；合并滤液，滤液在100℃水浴条件下加热30min至蛋白变性，再调节pH为3.0使蛋白沉降，蛋白溶液在4℃条件下静置12h，使蛋白充分沉淀与溶液分层，随后高速冷冻离心4℃、
8000r/min离心45min去除上清液，收集沉淀，干燥，即得到蚕蛹
粗蛋白粉；
[0009] (2)将蚕蛹粗蛋白粉按照
质量比1:50加入到蒸馏水中，完全溶解，然后加入1.5％的中性蛋白酶，在pH为7.0，
温度为50℃条件下进行酶解，酶解时间为3h；酶解完成后在90℃水浴灭活10min，水解液离心后取上清液；用截留分子量为5KDa
超滤膜过滤，将超滤透过液
冷冻干燥，得到冻干粉末；
[0010] (3)将步骤(2)中得到的冻干粉末溶解在浓度为0.01mol/L，pH为8.5的
磷酸盐缓冲液中；以1.0mL/min的速度上样于平衡好的阴离子交换
树脂色谱柱，用磷酸盐缓冲液洗柱至在220nm处吸收峰回到基线，洗脱流速为1.0mL/min；用NaCl溶液对样品进行梯度洗脱，洗脱流速为1.0mL/min，洗脱梯度为0-1.0mg/mL；按照时间段收集各个组分进行冷冻干燥并检测活性，在-20℃条件下保存；
[0011] (4)将步骤(3)中活性最好的冻干粉末上样于平衡好的Sephadex G-15凝胶色谱柱，以水为流动相进行洗脱，洗脱流速为1.0mL/min；检测
波长为280nm；按照时间段收集各个组分进行冷冻干燥并检测活性，在-20℃条件下保存；
[0012] (5)将步骤(4)中活性最好的冻干粉末溶解在超纯水中，进行反相高效液相色谱分离，流动相，A相：含0.1％三氟乙酸的纯水；B相：乙腈；检测波长为220nm，分段收集各个组分进行冷冻干燥并检测活性，在-20℃条件下保存；
[0013] (6)将步骤(5)得到的活性最好的冻干粉末再次经过反相高效液相色谱分离，流动相，A相：含0.1％三氟乙酸的纯水；B相：乙腈；检测波长为220nm，收集保留时间为17.5-20min的组分进行冷冻干燥，即得血管紧张素转换酶抑制多肽。
[0014] 作为优选，步骤(5)中所述的乙腈进行梯度洗脱，其浓度在0-60min时间内从5％上升为30％。
[0015] 作为优选，步骤(6)中所述的乙腈进行梯度洗脱，其浓度在0-30min时间内从7％上升为9％。
[0016] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备降血压药物中的应用。
[0017] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备食品中的应用。
[0018] 本发明还提供了所述的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在制备保健品中的应用。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0020] (1)本发明从蚕蛹蛋白的水解产物中分离得到了一种具有ACE抑制活性的血管紧张素转换酶抑制多肽，为
治疗高血压的食品、药物或保健品的开发利用提供了一种全新的途径。
[0021] (2)本发明的原料来源于丝绸工业的副产物蚕蛹，其资源丰富、价格低廉，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
[0022] 图1为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的离子交换色谱图及各组分抑制率图。
[0023] 图2为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的凝胶色谱图及各组分抑制率图。
[0024] 图3为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的第一次反相高效液相色谱图。
[0025] 图4为本发明蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽的制备方法中的第二次反相高效液相色谱图。
[0026] 图5为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在不同的贮藏温度下含量变化图。
[0027] 图6为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在不同的贮藏温度下对ACE抑制率的变化图。
[0028] 图7为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在人工模拟消化后含量变化图。
[0029] 图8为本发明制备的蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽在人工模拟消化后对ACE抑制率的变化图。
具体实施方式
[0030] 下面结合具体
实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种
修改，这些等价变化同样落于本发明所附
权利要求书所限定的范围。
[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所以用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例1：血管紧张素转换酶抑制多肽的制备
[0034] (1)将冷冻蚕蛹按照1:3的比例加入到蒸馏水中，匀浆搅拌1h后过滤，重复3次；合并滤液，滤液在100℃水浴条件下加热30min至蛋白变性，再调节pH为3.0使蛋白沉降，蛋白溶液在4℃条件下静置12h，使蛋白充分沉淀与溶液分层，随后高速冷冻离心4℃、
8000r/min离心45min去除上清液，收集沉淀，干燥，即得到蚕蛹粗蛋白粉；
[0035] (2)将蚕蛹粗蛋白粉按照质量比1:50加入到蒸馏水中，然后往溶液中加入1.5％的中性蛋白酶，在pH为7.0、温度为50℃条件下进行酶解，酶解时间为3h；酶解完成后在90℃水浴灭活10min，水解液离心后取上清液；用截留分子量为5kDa超滤膜过滤，将超滤透过液冷冻干燥，得到冻干粉末；
[0036] (3)将步骤(2)中得到的粉末溶解在浓度为0.01mol/L、pH为8.5的磷酸盐缓冲液中；以1.0mg/mL的速度上样于平衡好的的D201阴离子交换树脂色谱柱(10×300mm)，用磷酸盐缓冲液洗柱至在220nm处吸收峰回到基线，洗脱流速为1.0mg/mL；用NaCl溶液对样品进行梯度洗脱，洗脱流速为1.0mg/mL，洗脱梯度为0-1.0mg/mL；收集各个组分进行冷冻干燥并检测活性(见图1)，在-20℃条件下保存；
[0037] (4)将步骤(3)得到的活性最好的冻干粉末(即组分IE1)上样于平衡好的Sephadex G-15凝胶色谱柱(20×500mm)，以水为流动相进行洗脱，洗脱流速为1.0mg/mL；检测波长为280nm；收集各个组分进行冷冻干燥并检测活性(见图2)，在-20℃条件下保存；
[0038] (5)将步骤(4)得到的活性最好的冻干粉末(即组分GF2)溶解在超纯水中，进行反相高效液相色谱进行分离。流动相，A相：纯水(含0.1％三氟乙酸)；B相：乙腈，在0-60min时间内进行梯度洗脱，乙腈浓度为5-30％；检测波长为220nm，收集各个组分(见图3、表1)进行冷冻干燥并检测活性，在-20℃条件下保存。
[0039] 表1 第一次高效反相液相色谱分离各组分抑制活性(样品浓度0.006mg/mL)[0040]组分 保留时间(min) 抑制率(％)
HP 1 0.0-10.0 47.18
HP 2 10.0-12.0 69.05
HP 3 12.0-14.0 47.78
HP 4 14.0-16.0 56.23
HP 5 16.0-18.0 74.31
HP 6 18.0-20.0 76.27
HP 7 20.0-22.0 69.08
HP 8 22.0-24.0 56.39
HP 9 24.0-26.0 35.91
HP 10 26.0-60.0 38.56
[0041] 表2 第二次高效反相液相色谱分离各组分抑制活性(样品浓度0.004mg/mL)[0042]组分 保留时间(min) 抑制率(％)
HP 61 2.5-4.5 41.52
HP 62 15.5-16.5 51.46
HP 63 16.5-17.5 67.30
HP 64 17.5-20.0 77.60
[0043] (6)将步骤(5)得到的活性最好的冻干粉末(即组分HP6)再次经过反相高效色谱进行分离。流动相，A相：含0.1％三氟乙酸的纯水；B相：乙腈，在0-30min时间内进行梯度洗脱，乙腈浓度为7-9％，检测波长为220nm，收集各个组分(见图4、表2)进行冷冻干燥并检测活性，在-20℃条件下保存。收集保留时间为17.5-20min的组分(即HP64)，即可得到血管紧张素转换酶抑制多肽。
[0044] 将上述制备得到的血管紧张素转换酶抑制多肽ACE抑制活性进行测定。
[0045] ACE抑制活性的测定原理为：多肽的ACE抑制活性测定采用体外模拟测定法，其原理为：底物
马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)在ACE的催化作用下，可以水解生成马尿酸(HA)与一个组氨酸和亮氨酸结合的二肽，通过高效液相色谱法检测生成的马尿酸的含量，可以测定ACE活性；而ACE抑制多肽的存在可以抑制ACE的活性，导致HA的生成量减少，可以间接测定ACE抑制多肽的活性。
[0046] ACE抑制活性的测定的方法步骤如下：选取eppendof(EP)管作为反应器，编号A、B、C，按表3的反应体系进行试验，测定ACE抑制多肽对ACE的抑制活性。
[0047] 表3 ACE抑制多肽体外活性检测反应体系
[0048]
[0049] 反应终止之后过0.45μm的滤膜，然后利用高效液相色谱法(HPLC)测定HA的含量。
[0050] 液相条件为：15％甲醇：85％超纯水(含0.1％TFA)，检测波长228nm，柱温25℃，上样量20μL。
[0051] ACE抑制率(IA)按照下式计算：
[0052]
[0053] 上式中：IA表示ACE抑制率(％)；Aa表示由于底物自身水解所生成的马尿酸的色谱峰面积(空白)；Ab表示反应体系中不存在ACE抑制剂的条件下的马尿酸按色谱峰面积(对照)；Ac表示ACE及ACE抑制剂均存在的条件下的马尿酸色谱峰面积(样品)。
[0054] 经测定，本发明制备的血管紧张素转换酶抑制多肽的体外ACE抑制IC50为12.61μg/mL。
[0055] 实施例2：血管紧张素转换酶抑制多肽的序列分析
[0056] 取实施例1中所制备得到的血管紧张素转换酶抑制多肽，经基质辅助激光
解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)测定，其分子量为603.7Da，其氨基酸序列为：Gly-Asn-Pro-Trp-Met(如SEQ ID NO:1所示)。
[0057] 实施例3：贮藏温度对血管紧张素转换酶抑制多肽的含量及抑制率影响[0058] 将实施例1中所制备得到的血管紧张素转换酶抑制多肽溶解在0.1mol/L
硼酸缓冲液(含NaCl 0.3mol/L、pH 8.3)中。将多肽溶液在40℃、60℃、80℃条件下贮藏6h。结束之后，测定溶液中多肽的含量(见图5)及其对ACE的抑制率(见图6)。按照下式计算多肽含量保存率：
[0059]
[0060] 结果表明：在不同的贮藏温度下保存6h后，血管紧张素转换酶抑制多肽的含量略微下降(图5)，但仍保留有较高的ACE抑制率(图6)，这说明该血管紧张素转换酶抑制剂具有较好的热
稳定性。
[0061] 实施例4：人工模拟消化对血管紧张素转换酶抑制多肽的活性影响[0062] 按照《中国药典2010版》提供的方法配置人工胃液和人工肠液，将实施例1制备的血管紧张素转换酶抑制多肽与人工胃液按照1:1混合，消化处理2h后调节pH值为7.0，与人工肠液1:1混合，消化处理4h。在0、2(取样40μL)和6h(取样80μL)分别取样测定溶液中多肽的含量(见图7)及其对ACE的抑制率(见图8)。
[0063] 结果表明：在经过人工胃液处理之后，血管紧张素转换酶抑制多肽的含量略微下降(图7)，但ACE抑制率变化不大(图8)；随后再经过人工肠液的处理，血管紧张素转换酶抑制多肽的含量剧烈下降(图7)，同时，ACE抑制率升高(图8)，这说明经过人工肠液处理之后具有更好的ACE抑制率，能为降血压药物的研究提供理论指导。
[0064] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
[0065]
