一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法及蚕蛹蛋白抗氧化肽的应用
阅读：580发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法及蚕蛹蛋白抗氧化肽的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种蚕蛹蛋白抗 氧 化肽的制备方法，属于 食品加工 技术领域。所述制备方法包括：1)将蚕蛹粉与石油醚混合，超声，固液分离；2)将 脱脂 蚕蛹粉、 水 和蚕蛹蛋白 水解 酶混合进行酶解；3)将蚕蛹粉酶解液灭酶，离心，将得到的上清液采用0.40～0.50μm滤 膜过滤 ，收集滤液；4)将滤液采用3000Da的 超滤 膜超滤，收集透过液，得到超滤液；5)将超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物。本发明制备得到的蚕蛹蛋白肽中必需 氨 基酸含量达到43％左右，总抗氧化能 力 、对超氧阴离子(O2·)的清除能力、对·OH清除能力以及对DPPH的清除能力均较强。，下面是一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法及蚕蛹蛋白抗氧化肽的应用专利的具体信息内容。
1.一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：
1)将蚕蛹粉与石油醚混合，超声脱脂，固液分离，得到的固相进行干燥，得到脱脂蚕蛹粉；
2)将所述步骤1)中的脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶混合进行酶解，得到蚕蛹粉酶解液；
3)将所述步骤2)的蚕蛹粉酶解液灭酶，离心，将得到的上清液采用0.40～0.50μm滤膜过滤，收集滤液；
4)将所述步骤3)中的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液；
5)将所述步骤4)中的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物，所述截留物为蚕蛹蛋白抗氧化肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶的质量比为5～8:95～105:2.5～4；
所述蚕蛹蛋白水解酶的比活力为0.5×105～2.0×105U/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为4～6h。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中酶解时的pH值为7.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中蚕蛹粉的质量与石油醚的体积比为1g:6～10mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中超声脱脂的次数为2～4次，超声的功率为100～150W，超声的时间为30～50min/次，超声的温度为35～45℃。
7.根据权利要求1、5～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中蚕蛹粉的粒度为140～160目。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中干燥的温度为50～60℃，干燥的时间为45～60min。
9.根据权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中收集截留物后还包括将所述截留物进行冷冻干燥；所述冷冻干燥的温度为-40～-20℃，所述冷冻干燥的时间为8～12h。
10.权利要求1～9任意一项所述的方法制备得到的蚕蛹蛋白抗氧化肽在制备食品或抗氧化药品中的应用。
一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法及蚕蛹蛋白抗氧化肽的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 目前我国产茧量约60万吨，占世界的80％左右。蚕蛹(Silkwormpupa)是蚕蛾科昆虫家蚕蛾(Bombyx moilL.)的蛹，蚕蛹是传统中药，《本草纲目》、《圣济总录》、《圣惠方》、《东医宝鉴》等古代医药经典著作都对蚕蛹功能有详细记载，认为蚕蛹具有生津止渴、消食理气、镇惊、壮阳、键脾胃、祛风湿、长肌退热等功效。
[0003] 蚕蛹中蛋白质含量高达45％～55％，多为球蛋白，富含18种氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸含量超过总量的40％，必需氨基酸与非必需氨基酸之比大于0.6，高于世界卫生组织和联合国粮农组织(WHO/FAO)提出的参考蛋白模式，是一种全价的优质蛋白，具有潜在的食用价值。
[0004] 虽然蚕蛹蛋白是优质蛋白，但是由于分子量大其水溶性较差，不仅影响它们在食品工业中的应用，也影响人体对它的消化吸收。蚕蛹蛋白还存在着大约30kDa以上的大分子蛋白，可能引起部分人出现过敏反应，这些都阻碍了蚕蛹蛋白在食品中的应用，也给蚕蛹蛋白的直接利用带来了风险。
[0005] 而且，由于蚕蛹缫丝通常采用的条件是高温强碱，因此缫丝后的蚕蛹不仅有很难除尽的腥味，而且蛋白质发生变性，脂肪也发生氧化而产生出严重的酸败味，消费者难以接受这些不良风味，目前主要将蚕蛹用作饲料，而将其直接作为食品原料的较少，影响了蚕蛹附加值的提升。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法及蚕蛹蛋白抗氧化肽的应用，具有较强的抗氧化功能，且易于消化吸收，可作为食品食用。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 1)将蚕蛹粉与石油醚混合，超声脱脂，固液分离，得到的固相进行干燥，得到脱脂蚕蛹粉；
[0011] 3)将所述步骤2)的蚕蛹粉酶解液灭酶，离心，将得到的上清液采用0.40～0.50μm滤膜过滤，收集滤液；
[0012] 4)将所述步骤3)中的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液；
[0013] 5)将所述步骤4)中的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物；所述截留物为蚕蛹蛋白抗氧化肽。
[0014] 优选的，所述步骤2)中脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶的质量比为5～8:95～105:2.5～4；
[0015] 所述蚕蛹蛋白水解酶的比活力为0.5×105～2.0×105U/g。
[0016] 优选的，所述步骤2)中酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为4～6h。
[0017] 优选的，所述步骤2)中酶解时的pH值为7.0～8.0。
[0018] 优选的，所述步骤1)中蚕蛹粉的质量与石油醚的体积比为1g:6～10mL。
[0019] 优选的，所述步骤1)中超声脱脂的次数为2～4次，超声的功率为100～150W，超声的时间为30～50min/次，超声的温度为35～45℃。
[0020] 优选的，其特征在于，所述步骤1)中蚕蛹粉的粒度为140～160目。
[0021] 优选的，所述步骤1)中干燥的温度为50～60℃，干燥的时间为45～60min。
[0022] 优选的，所述步骤5)中收集截留物后还包括将所述截留物进行冷冻干燥；所述冷冻干燥的温度为-40～-20℃，所述冷冻干燥的时间为8～12h。
[0023] 本发明提供了一种上述方案所述的方法制备得到的蚕蛹蛋白抗氧化肽在制备食品或抗氧化药品中的应用。
[0024] 本发明提供了一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法，先将蚕蛹粉经石油醚进行脱脂，防止蚕蛹粉中的脂肪在肽的制备过程中发生氧化及与蛋白质发生乳化，得到脱脂蚕蛹粉后再利用蚕蛹蛋白水解酶进行酶解，使与抗氧化活性有关的芳香族氨基酸、支链氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸的比例都升高，且使这些氨基酸残基暴露，提高抗氧化活性。进一步进行过滤，超滤，使制备得到的蚕蛹蛋白肽中必需氨基酸含量达到43％左右，符合FAO/WHO(联合国粮农组织FAO或世界卫生组织WHO)提出的必需氨基酸含量在40％左右的要求。同时制备得到的蚕蛹蛋白肽分子量在200～3000Da，易于消化吸收。实施例结果表明：相较于采用蚕蛹蛋白水解专用酶+风味蛋白酶酶解时得到的蚕蛹蛋白肽的总抗氧化能力、对超氧阴离子(O2·)的清除能力、对·OH清除能力以及对DPPH的清除能力分别依次提高73.8％～85.7％、107.6％～112.6％、74.1％～80.6％和29.9％～32.53％；相较于采用蚕蛹蛋白水解专用酶+木瓜蛋白酶酶解，本发明的制备方法在总抗氧化能力、对超氧阴离子(O2·)的清除能力、对·OH清除能力以及对DPPH的清除能力方面分别依次提高49.0％～59.2％、
50.6％～55.8％、52.7％～58.4％和34.2％～36.8％。
50.6％～55.8％、52.7％～58.4％和34.2％～36.8％。
具体实施方式
[0025] 本发明提供了一种蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：
[0026] 1)将蚕蛹粉与石油醚混合，超声脱脂，固液分离，得到的固相进行干燥，得到脱脂蚕蛹粉；
[0027] 2)将所述步骤1)中的脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶混合进行酶解，得到蚕蛹粉酶解液；
[0028] 3)将所述步骤2)的蚕蛹粉酶解液灭酶，离心，将得到的上清液采用0.40～0.50μm滤膜过滤，收集滤液；
[0029] 4)将所述步骤3)中的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液；
[0030] 5)将所述步骤4)中的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物；所述截留物为蚕蛹蛋白抗氧化肽。
[0031] 本发明将蚕蛹粉与石油醚混合，超声脱脂，固液分离，得到的固相进行干燥，得到脱脂蚕蛹粉。本发明中，所述蚕蛹粉的质量与石油醚的体积比优选为1g:6～10mL，更优选为1g:8mL。本发明中，所述蚕蛹粉的粒度优选为140～160目，更优选为150目。本发明中，所述蚕蛹粉的制备方法优选为将缫丝蚕蛹在40～50℃下干燥120～180min后粉碎、过筛。所述缫丝蚕蛹的干燥温度优选为45℃。所述缫丝蚕蛹的干燥时间优选为150min。本发明对所述缫丝蚕蛹的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明中，所述石油醚的沸程优选为60～90℃。本发明对所述石油醚的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用的石油醚购自成都市科龙化工试剂厂。
[0032] 本发明中，所述超声脱脂的次数优选为2～4次，更优选为3次。所述超声的功率优选为100～150W，更优选为120W。所述超声的时间优选为30～50min/次，更优选为40min/次。所述超声的温度优选为35～45℃，更优选为40℃。本发明中，得到的固相进行干燥时的温度优选为50～60℃，更优选为55℃。得到的固相进行干燥的时间优选为45～60min，更优选为
50min。本发明将蚕蛹粉与石油醚混合，超声，有利于脱除蚕蛹粉中的脂肪，防止在后续的水解过程中脂肪影响蛋白质在水溶液中的溶解影响肽的获得，同时还可以防止在后续过程中脂肪发生氧化以及脂肪与蛋白质发生乳化，影响多肽产品品质及蛋白质溶液的分离。
50min。本发明将蚕蛹粉与石油醚混合，超声，有利于脱除蚕蛹粉中的脂肪，防止在后续的水解过程中脂肪影响蛋白质在水溶液中的溶解影响肽的获得，同时还可以防止在后续过程中脂肪发生氧化以及脂肪与蛋白质发生乳化，影响多肽产品品质及蛋白质溶液的分离。
[0033] 将所述固相进行干燥后，本发明优选将得到的干燥后的固相进行粉碎。所述粉碎的粒度优选为190～210目，更优选为200目。本发明将干燥后的固相进行粉碎可以使固相更均匀，利于后续的酶解。本发明对所述超声和干燥采用的设备没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
[0034] 得到脱脂蚕蛹粉后，本发明将所述脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶混合进行酶解，得到蚕蛹粉酶解液。本发明中，所述蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶的质量比优选为5～8:95～105:2.5～4，更优选为6:100:3。所述蚕蛹蛋白水解酶的比活力优选为0.5×105～2.0×105U/g，更优选为1.0×105U/g。所述酶解的温度优选为50～60℃，更优选为52℃。所述酶解的时间优选为4～6h，更优选为5h。本发明对所述蚕蛹蛋白水解酶的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用的蚕蛹蛋白水解酶购自南宁东恒华道生物科技有限公司。
[0035] 酶解时混合液的pH值优选为7.0～8.0，更优选为7.2。本发明中，在酶解过程中优选每25～35min检测一次pH值。本发明中，调节pH值用的溶液优选为盐酸溶液或氢氧化钠溶液。所述盐酸溶液的浓度优选为1mol/L。所述氢氧化钠溶液的浓度优选为1mol/L。
[0036] 本发明中，采用蚕蛹蛋白水解酶进行酶解使与抗氧化活性有关的芳香族氨基酸、支链氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸的比例都升高，且使这些氨基酸残基暴露，提高抗氧化活性。
[0037] 得到蚕蛹粉酶解液后，本发明将所述蚕蛹粉酶解液灭酶，离心，将得到的上清液采用0.40～0.50μm滤膜过滤，收集滤液。本发明中，所述灭酶的方式优选为高温灭酶。所述灭酶的温度优选为95～110℃，更优选为100℃。所述灭酶的时间优选为4～8min，更优选为6min。灭酶后，本发明优选将灭酶后的酶解液进行冷却。所述冷却的方式优选为流动水冲洗。在酶解过程中由于高温，部分水分蒸发，为了使测定前后的体积保持不变，提高测定结果的准确度，在冷却后，本发明优选将冷却液加水补充至酶解前的体积。本发明中，所述离心的转速优选为3500～4500r/min，更优选为4000r/min。所述离心的时间优选为10～
20min，更优选为15min。本发明中，所述滤膜过滤的方式优选为抽滤。所述抽滤时的真空度优选为0.08～0.10Mpa，更优选为0.09Mpa。所述滤膜的孔径优选为0.45μm。本发明将灭酶后的蚕蛹粉酶解液进行离心、抽滤可以去除酶解液中的大颗粒杂质，防止在后续的超滤过程中堵住膜孔，影响膜通量。
20min，更优选为15min。本发明中，所述滤膜过滤的方式优选为抽滤。所述抽滤时的真空度优选为0.08～0.10Mpa，更优选为0.09Mpa。所述滤膜的孔径优选为0.45μm。本发明将灭酶后的蚕蛹粉酶解液进行离心、抽滤可以去除酶解液中的大颗粒杂质，防止在后续的超滤过程中堵住膜孔，影响膜通量。
[0038] 本发明对所述滤膜的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用的滤膜购自天津市津腾实验设备有限公司。
[0039] 得到滤液后，本发明将所述滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液。所述超滤时的温度优选为室温。所述超滤时的压力优选为0.25Mpa。
[0040] 本发明中，采用3000Da的超滤膜超滤可以收集3000Da以下的多肽。
[0041] 本发明对所述3000Da的超滤膜的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用上海摩速科学器材有限公司的MSM-2008实验用超滤微滤膜分离装置进行超滤。
[0042] 得到超滤液后，本发明将所述超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物。所述超滤时的温度优选为室温。所述超滤时的压力优选为0.4Mpa。本发明中，采用200Da的超滤膜超滤可以去除分子量小于200Da的多肽，使多肽的分子量控制在200～3000Da，提高抗氧化性。
[0043] 本发明对所述200Da的超滤膜的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用上海摩速科学器材有限公司的MSM-2008实验用超滤微滤膜分离装置进行超滤。
[0044] 由于在蚕蛹蛋白酶解过程不断加入NaOH，酶解过程中形成部分盐。本发明中，收集截留物后，优选采用分子截留量为100～200Da的纳滤膜纳滤，进行脱盐处理，得到脱盐后的截留物。
[0045] 本发明中，收集截留物后，本发明优选将所述截留物进行真空冷冻干燥，得到蚕蛹蛋白抗氧化肽。所述真空冷冻干燥的温度优选为-40～-20℃，更优选为-25℃。所述真空冷冻干燥的时间优选为8～12h，更优选为10h。
[0046] 本发明对所述真空冷冻干燥时采用的设备没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用SIGMA的ALPAAI-4LSC真空冷冻干燥机。
[0047] 本发明制备得到的蚕蛹蛋白肽中氨基酸含量在51.86％～56.09％，必需氨基酸含量在41％以上，高于FAO/WHO提出的必需氨基酸含量在40％左右的要求。
[0048] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0049] 实施例1
[0050] 称量100g粒度为140目的蚕蛹粉，用滤纸包好，放入玻璃容器中，在玻璃容器中加入600mL沸程为60～90℃的石油醚，在100W，45℃条件下超声脱脂4次，每次30min，超声后将采用滤纸包裹的蚕蛹粉取出，在50℃下干燥60min，得到脱脂蚕蛹粉，将得到的脱脂蚕蛹粉再次粉碎至190目后，将脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶按5:105:2.5的质量比混合，将得到的混合液在50℃下酶解6h(酶解过程中控制pH值为7.0(每25min检测一次溶液的pH，当发生变化时，采用1mol/L的盐酸或氢氧化钠进行调整)后再在95℃下灭酶8min。灭酶后采用流水使灭酶后的酶解液冷却，并在灭酶后的酶解液中添加水至灭酶后的酶解液体积恢复至酶解前的体积。再以3500r/min的转速离心20min，将得到的上清液采用0.40μm滤膜在真空度为0.08Mpa的条件下抽滤，收集滤液。将得到的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液。将得到的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物。将得到的截留物在-20℃下真空冷冻干燥12h。
[0051] 采用L-8900型全自动氨基酸分析仪，Hitachi检测制备得到的蚕蛹蛋白水解物中氨基酸组成及含量，结果如表1所示。
[0052] 表1蚕蛹蛋白水解物中氨基酸组成及含量
[0053]
[0054] 由表1可以看出，本发明制备得到的蚕蛹蛋白水解物的氨基酸含量在54.20％。
[0055] 根据表1中氨基酸的检测结果，统计氨基酸种类的分布，结果如表2所示。
[0056] 表2蚕蛹蛋白水解物中氨基酸的种类分布
[0057]疏水氨基酸％ 21.42
必需氨基酸％ 43.69
芳香族氨基酸％ 20.15
支链氨基酸％ 24.31
酸性氨基酸％ 13.60
碱性氨基酸％ 14.20
必需氨基酸％ 43.69
芳香族氨基酸％ 20.15
支链氨基酸％ 24.31
酸性氨基酸％ 13.60
碱性氨基酸％ 14.20
[0058] 由表2可以看出，本发明制备得到的蚕蛹蛋白水解物中必需氨基酸含量在43％以上，高于FAO/WHO提出的必需氨基酸含量在40％左右的要求。
[0059] 实施例2
[0060] 称量100g粒度为160目的蚕蛹粉，采用滤纸包好，放入玻璃容器中，在玻璃容器中加入1000mL沸程为60～90℃的石油醚，在150W，35℃条件下超声脱脂2次，每次50min，超声后将采用滤纸包裹的蚕蛹粉取出，在60℃下干燥45min，得到脱脂蚕蛹粉，将得到的脱脂蚕蛹粉再次粉碎至210目后，将脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶按8:95:4的质量比混合，将得到的混合液在60℃下酶解4h(酶解过程中控制pH值为8.0(每35min检测一次溶液的pH，当发生变化时，采用1mol/L的盐酸或氢氧化钠进行调整)后再在105℃下灭酶4min。灭酶后采用流水使灭酶后的酶解液冷却，并在灭酶后的酶解液中添加水至灭酶后的酶解液体积恢复至酶解前的体积。再以4500r/min的转速离心10min，将得到的上清液采用0.50μm滤膜在真空度为0.1Mpa的条件下抽滤，收集滤液。将得到的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液。将得到的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物。将得到的截留物在-40℃下真空冷冻干燥8h。
[0061] 采用L-8900型全自动氨基酸分析仪，Hitachi检测制备得到的蚕蛹蛋白水解物中氨基酸组成及含量，结果如表3所示。
[0062] 表3蚕蛹蛋白肽中氨基酸组成及含量
[0063]
[0064]
[0065] 由表3可以看出，本发明制备得到的蚕蛹蛋白水解物的氨基酸含量在51.86％。
[0066] 根据表3中氨基酸的检测结果，统计氨基酸种类的分布，结果如表4所示。
[0067] 表4蚕蛹蛋白肽中氨基酸组成及含量
[0068]
[0069]
[0070] 由表4可以看出，本发明制备得到的蚕蛹蛋白水解物中必需氨基酸含量约42％，高于FAO/WHO提出的必需氨基酸含量在40％左右的要求。
[0071] 实施例3
[0072] 称量100g粒度为150目的蚕蛹粉，采用滤纸包好，放入玻璃容器中，在玻璃容器中加入800mL沸程为60～90℃的石油醚，在120W，40℃条件下超声脱脂3次，每次40min，超声后将采用滤纸包裹的蚕蛹粉取出，在55℃下干燥50min，得到脱脂蚕蛹粉，将得到的脱脂蚕蛹粉再次粉碎至100目后，将脱脂蚕蛹粉、水和蚕蛹蛋白水解酶按6:100:3的质量比混合，将得到的混合液在55℃下酶解6h(酶解过程中控制pH值为7.7(每30min检测一次溶液的pH，当发生变化时，采用1mol/L的盐酸或氢氧化钠进行调整)后再在100℃下灭酶6min。灭酶后采用流水使灭酶后的酶解液冷却，并在灭酶后的酶解液中添加水至灭酶后的酶解液体积恢复至酶解前的体积。再以4000r/min的转速离心15min，将得到的上清液采用0.45μm滤膜在真空度为0.09Mpa的条件下抽滤，收集滤液。将得到的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液。将得到的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物。将得到的截留物在-25℃下真空冷冻干燥10h。
[0073] 采用L-8900型全自动氨基酸分析仪，Hitachi检测制备得到的蚕蛹蛋白水解物中氨基酸组成及含量，结果如表5所示。
[0074] 表5蚕蛹蛋白水解物中氨基酸组成及含量
[0075]
[0076]
[0077] 由表5可以看出，本发明制备得到的蚕蛹蛋白水解物的氨基酸含量在56.09％。
[0078] 根据表5中氨基酸的检测结果，统计氨基酸种类的分布，结果如表6所示。
[0079] 表6蚕蛹蛋白水解物中氨基酸组成及含量
[0080]
[0081]
[0082] 由表6可以看出，本发明制备得到的蚕蛹蛋白水解物中必需氨基酸含量在40.90％，符合FAO/WHO提出的必需氨基酸含量在40％左右的要求。
[0083] 对比例1
[0084] 称量100g粒度为150目的蚕蛹粉，采用滤纸包好，放入玻璃容器中，在玻璃容器中加入800mL沸程为60～90℃的石油醚，在120W，40℃条件下超声脱脂3次，每次40min，超声后将采用滤纸包裹的蚕蛹粉取出，在55℃下干燥50min，得到脱脂蚕蛹粉，将得到的脱脂蚕蛹粉再次粉碎至100目后，将脱脂蚕蛹粉、水和复合酶(复合酶为蚕蛹蛋白水解专用酶和风味酶，两者的质量比为1:1)按6:100:3的质量比混合，将得到的混合液在55℃下酶解6h(酶解过程中控制pH值为8.0(每30min检测一次溶液的pH，当发生变化时，采用1mol/L的盐酸或氢氧化钠进行调整)后再在100℃下灭酶6min。灭酶后采用流水使灭酶后的酶解液冷却，并在灭酶后的酶解液中添加水至灭酶后的酶解液体积恢复至酶解前的体积。再以4000r/min的转速离心15min，将得到的上清液采用0.45μm滤膜在真空度为0.09MPa的条件下抽离，收集滤液。将得到的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液。将得到的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物。将得到的截留物在-25℃下真空冷冻干燥10h。
[0085] 对比例2
[0086] 称量100g粒度为150目的蚕蛹粉，采用滤纸包好，放入玻璃容器中，在玻璃容器中加入800mL沸程为60～90℃的石油醚，在120W，40℃条件下超声脱脂3次，每次40min，超声后将采用滤纸包裹的蚕蛹粉取出，在55℃下干燥50min，得到脱脂蚕蛹粉，将得到的脱脂蚕蛹粉再次粉碎至100目后，将脱脂蚕蛹粉、水和复合酶(复合酶为蚕蛹蛋白水解专用酶和木瓜蛋白酶，两者的质量比为1:1)按6:100:3的质量比混合，将得到的混合液在50℃下酶解6h(酶解过程中控制pH值为7.5(每30min检测一次溶液的pH，当发生变化时，采用1mol/L的盐酸或氢氧化钠进行调整)后再在100℃下灭酶6min。灭酶后采用流水使灭酶后的酶解液冷却，并在灭酶后的酶解液中添加水至灭酶后的酶解液体积恢复至酶解前的体积。再以4000r/min的转速离心15min，将得到的上清液采用0.45μm滤膜在真空度为0.09MPa的条件下抽离，收集滤液。将得到的滤液采用3000Da的超滤膜超滤，收集透过液，得到超滤液。将得到的超滤液采用200Da的超滤膜超滤，收集截留物。将得到的截留物在-25℃下真空冷冻干燥10h。
[0087] 实施例4
[0088] 以实施例1～3作为实验组，对比例1和2分别作为对照组1和2，分别测定水解度、总还原能力、对超氧阴离子(O2·)的清除能力、对·OH清除能力以及对DPPH的清除能力，具体结果如表7所示。上述指标的具体测定方法如下：
[0089] 水解度的测定
[0090] 采用甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量，计算水解度，具体公式为：
[0091]
[0092] 还原力的测定
[0093] 将所得的蚕蛹多肽液稀释100倍进行还原力测定。在2.5mLpH值为6.6的磷酸盐缓冲液中加不同浓度的样品液2.5mL，质量分数1％的铁氰化钾溶液2.5mL，混合物在50℃恒温20min后，再加入2.5mL体积分数10％的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心分离10min，取上层清液5mL加蒸馏水5mL和质量分数0.1％FeC13溶液0.5mL，在700nm处测定吸光值，以吸光值表示还原力。吸光度越高，还原能力越强，同时作试剂空白和阳性对照。超氧阴离子(O2·)清除能力的测定
[0094] 将所得的蚕蛹多肽水解液10倍稀释进行O2·清除率的评价。
[0095] 以1mL蒸馏水加入2.5mL的0.1mol/LTris-HCL缓冲溶液(pH8.2，其中含1mmol/LEDTA)调零，加入10μL50mmol/L的邻苯三酚(25℃水浴预热)，迅速混匀，在320nm处每隔30s读取吸光度一次，5min后结束，作吸光值随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V1。
[0096] 吸取样品1mL，加入2.5mL的0.1mol/L Tris-HCL缓冲溶液(pH8.2)，震荡混匀，在25℃水浴保温10min后加入10ul 50mmol/L的邻苯三酚(25℃水浴预热)，迅速混匀并开始计时，在320nm处测定吸光值A，每隔30s读取吸光值A320，5min后结束。作吸光值随时间变化的回归方程，其斜率为样品邻苯三酚自氧化速率V2。超氧阴离子(O2·)的清除率计算如下：
[0097]
[0098] 式中：
[0099] V1－对照组邻苯三酚自氧化速率
[0100] V2－样品邻苯三酚自氧化速率
[0101] 羟自由基(·OH)清除能力的测定
[0102] 将所得的蚕蛹多肽水解液稀释10倍进行·OH清除率的评价。
[0103] 在10mL试管中，分别加入2mL6mmol/L水杨酸-乙醇溶液，2mL6mmol/LFeSO4(含6mmol/LEDTA)，2mL样品溶液，最后加入2mL6mmol/LH2O2启动反应，37℃水浴反应30min后，
510nm处测量吸光值。在相同反应体系下分别测定空白对照组的吸光值、样品颜色组干扰的吸光值，·OH的清除率计算如下：
510nm处测量吸光值。在相同反应体系下分别测定空白对照组的吸光值、样品颜色组干扰的吸光值，·OH的清除率计算如下：
[0104]
[0105] 式中：
[0106] A1－空白对照组的吸光值
[0107] A2－样品组吸光度
[0108] A3－样品颜色组干扰的吸光值。
[0109] 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定
[0110] 将所得的蚕蛹多肽水解液稀释100倍进行DPPH·清除率的评价。
[0111] 用乙醇配制20μg/LDPPH·溶液，避光保存备用。分别取3mL水解液的待测液于试管中，加入3mL20μg/LDPPH·溶液，摇匀，放置30min后在517nm处测定其吸光值。在相同反应体系下分别测定空白对照组的吸光值、样品颜色组干扰的吸光值，·0H的清除率计算如下：
[0112]
[0113] 式中：
[0114] A1－空白对照组的吸光值
[0115] A2－样品组吸光度
[0116] A3－样品颜色组干扰的吸光值。
[0117] 表7不同方法制备的蚕蛹蛋白肽抗氧化能力的测定结果
[0118] 水解度(％) 总还原能力 O2·(％) ·OH(％) DPPH(％)
实施例1 20.71±0.21 0.75±0.03 34.54±1.85 43.77±1.32 79.38±0.54
实施例2 20.53±0.54 0.73±0.01 34.21±1.01 42.34±0.94 78.76±0.36
实施例3 21.02±0.36 0.78±0.02 35.04±0.46 43.91±1.02 80.34±0.24
对比例1 28.44±0.79 0.42±0.01 16.48±0.67 24.32±1.44 60.62±0.37
对比例2 26.81±0.49 0.49±0.01 16.07±1.00 27.72±0.85 58.71±0.60
实施例1 20.71±0.21 0.75±0.03 34.54±1.85 43.77±1.32 79.38±0.54
实施例2 20.53±0.54 0.73±0.01 34.21±1.01 42.34±0.94 78.76±0.36
实施例3 21.02±0.36 0.78±0.02 35.04±0.46 43.91±1.02 80.34±0.24
对比例1 28.44±0.79 0.42±0.01 16.48±0.67 24.32±1.44 60.62±0.37
对比例2 26.81±0.49 0.49±0.01 16.07±1.00 27.72±0.85 58.71±0.60
[0119] 由表7可以看出，采用双酶(蚕蛹蛋白水解专用酶+风味酶或蚕蛹蛋白水解专用酶+木瓜蛋白酶)酶解蚕蛹蛋白的水解度要高于单独用蚕蛹蛋白水解专用酶，当采用本发明的蚕蛹蛋白水解专用酶进行酶解，得到的蛋白肽的总抗氧化能力、对超氧阴离子(O2·)的清除能力、对·OH清除能力以及对DPPH的清除能力均高于采用对比例1和2的采用双酶酶解的效果。相较于对比例1分别依次提高73.8％～85.7％、107.6％～112.6％、74.1％～80.6％和29.9％～32.53％；相较于对比例2分别依次提高49.0％～59.2％、50.6％～55.8％、52.7％～58.4％和34.2％～36.8％。结果表明：本发明制备得到的蚕蛹蛋白肽具有较强的抗氧化能力。
[0120] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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