免疫调节性小细胞及使用方法
阅读：748发布：2020-08-08
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1.细菌小细胞，其包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白，其中所述小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子。
2.如权利要求1所述的小细胞，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯特菌溶素O、李斯特菌溶素O L461T、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O L461T、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。
3.如权利要求1所述的小细胞，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素O。
4.如权利要求1所述的小细胞，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含侵袭素。
6.如权利要求1-4中任一项所述的小细胞，其中所述小细胞不包含侵袭素。
7.如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含Th1细胞因子。
8.如权利要求7所述的小细胞，其中所述Th1细胞因子选自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-α和IFN-γ。
9.如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含Th2细胞因子。
10.如权利要求9所述的小细胞，其中所述Th2细胞因子选自：IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
11.如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含磷脂酶。
12.如权利要求11所述的小细胞，其中所述磷脂酶选自PC-PLC和PI-PLC。
13.如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含选自以下的蛋白毒素：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素B、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及以上物质的组合。
14.如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其中所述小细胞不包含任何其他的治疗活性部分。
15.如权利要求14所述的小细胞，其中所述小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的治疗性蛋白或治疗性核酸。
16.如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其中所述小细胞不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
17.产小细胞的细菌，其包含：
编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；以及
重组表达盒，其能够功能性表达胆固醇依赖性细胞溶素蛋白，其中所述细菌不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子，并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
18.如权利要求17所述的产小细胞的细菌，其还包含：
编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述产小细胞的细菌的染色体包含所述核酸内切酶的一个或多个识别位点；
确定的营养缺陷型；和
lpxM/msbB基因的缺失或突变。
19.如权利要求18所述的产小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶选自：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。
20.如权利要求18或19所述的产小细胞的细菌，其中所述营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。
21.如权利要求17-20中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述编码产小细胞的基因产物的可表达的基因选自：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。
22.如前述权利要求中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯特菌溶素O、李斯特菌溶素O L461T、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O E247M、李斯菌特溶素O D320K、李斯特菌溶素O L461T、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。
23.如权利要求17-21中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素O。
24.如权利要求17-21中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO:1。
25.如权利要求17-24中任一项所述的产小细胞的细菌，其还包含能够功能性表达侵袭素的重组表达盒。
26.治疗癌症的方法，包括向有需要的患者给予包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的细菌小细胞，其中所述给药诱导非免疫原性的抗肿瘤免疫调节效应。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯特菌溶素O、李斯特菌溶素O L461T、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O L461T、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。
29.如权利要求26或27所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素O。
30.如权利要求26或27所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO:1。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含侵袭素。
32.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述小细胞不包含侵袭素。
33.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含Th1细胞因子。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述Th1细胞因子选自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-α和IFN-γ。
35.如权利要求26-34中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含Th2细胞因子。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述Th2细胞因子选自；IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
37.如权利要求26-36中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含磷脂酶。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述磷脂酶选自PC-PLC和PI-PLC。
39.如权利要求26-38中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含选自以下的蛋白毒素：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素B、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及以上物质的组合。
40.如权利要求26-39中任一项所述的方法，其中所述小细胞不包含任何其他的治疗活性部分。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的治疗性蛋白或治疗性核酸。
42.如权利要求26-41中任一项所述的方法，其中所述小细胞不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
43.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤、转移瘤或液体瘤。
44.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症为上皮、成纤维细胞、肌肉或骨起源的。
45.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、食管癌、胆囊癌、皮肤癌、子宫癌、阴道癌、阴茎癌和肾癌。
46.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症为膀胱癌。
47.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：腺癌、肉瘤、纤维肉瘤以及眼癌、脑癌和骨癌。
48.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病和慢性髓性白血病。
49.如权利要求26-48中任一项所述的方法，其中所述给药产生Th1优势免疫反应。
50.如权利要求26-48中任一项所述的方法，其中所述给药产生Th2优势免疫反应。
免疫调节性小细胞及使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2012年10月2日递交的美国临时申请第61/709102号的优先权，其通过引用整体明确地并入本文中。
[0004] 本申请连同电子形式的序列表一起递交。序列表提供为2013年10月2日生成、大小20Kb、标题SEQLISTING.TXT的文件。电子形式序列表的信息通过引用整体并入本文中。
[0005] 发明背景
技术领域
[0007] 相关领域的描述
[0008] 提供了本发明背景的以下描述以帮助理解本发明，但并非承认其描述或构成了本发明的现有技术。本申请中提及或叙述的文章、专利和专利申请及所有其他文件和可电子获取的信息的内容，均通过引用整体并入本文中，其程度就像明确和单独地指出通过引用并入每个单独的出版物。申请人保留从任何这样的文章、专利、专利申请或其他文件实际并入任何和所有材料和信息至本申请的权利。
[0009] 已熟知免疫系统在预防癌症中起重要作用。越来越清楚免疫调节可能是癌症治疗的具吸引力的治疗方式。使用最久的市售抗癌免疫调节治疗剂为牛分枝杆菌
(Mycobacterial bovis)、卡介苗(BCG)的活的减毒菌株，其被用作非肌肉侵入性膀胱癌治疗的术后辅助治疗。其他非市售实验性抗癌免疫调节方法包括使用细菌的其他活的减毒物种，如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、双歧杆菌(Bifidobasterial)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesius)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)。虽然在某种程度上有效，使用的每种菌株受到感染风险、害怕活的减毒菌株遗传回复至致病性以及败血症的限制。
所有这些方法均出现了在最有效剂量或接近最有效剂量时发生的具毒性活细菌感染的极大毒性回复。这造成了每种菌株类型的较窄的治疗指数。
(Mycobacterial bovis)、卡介苗(BCG)的活的减毒菌株，其被用作非肌肉侵入性膀胱癌治疗的术后辅助治疗。其他非市售实验性抗癌免疫调节方法包括使用细菌的其他活的减毒物种，如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、双歧杆菌(Bifidobasterial)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesius)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)。虽然在某种程度上有效，使用的每种菌株受到感染风险、害怕活的减毒菌株遗传回复至致病性以及败血症的限制。
所有这些方法均出现了在最有效剂量或接近最有效剂量时发生的具毒性活细菌感染的极大毒性回复。这造成了每种菌株类型的较窄的治疗指数。
[0010] 为了解决活细菌作为免疫调节治疗的毒性问题，其他人已尝试使用不同的细菌组分(与完整的活生物体相反)来产生相同的免疫效应。这种类型的实验性治疗剂包括：纯化的细菌毒素、纯化的促炎性脂多糖(LPS)、纯化的磷壁酸(TCA)和其他细菌细胞壁制剂，以及其他细菌亚细胞级分。这些方法改善了毒性特性，但在一些情况下伴随功效的损失。另外，许多仅刺激极化免疫反应(Th1或Th2)，大多数刺激Th2(产生抗体的)反应。有文献合理而充分记载的是，Th1(细胞免疫反应)反应看起来对具有抗肿瘤免疫调节效应是优先的。最后，这些制剂可能很难以支持市场需求的规模和质量制备，并且最终仅可生成不能产生抗肿瘤效应的免疫反应子集。在用于治疗大多数癌症的蛋白毒素的情况下，蛋白毒素的功效由于对正常组织具有毒性而明显受限。另外，有助于系统性暴露水平的药物代谢动力学(PK)参数，通常不被且不能被完全优化以同时最大化抗肿瘤活性和最小化副作用，特别是当相同的细胞靶标或机制负责抗肿瘤活性和正常组织毒性时。再次地，这引起对大多数蛋白毒素共有的非常窄的治疗指数。
[0011] 除了作为免疫调节“通用物”的活的细菌载体和细菌组分外，其他研究者已尝试开发不同的、特异性的Th1免疫调节性细胞因子和趋化因子作为抗癌治疗剂。实例包括但不限于：干扰素γ(IFN-γ)、干扰素α(IFN-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)和白介素-18(IL-18)。这些方法中的每种受限于预期不到的和严重的毒性，以及在单独给药时具有很少或没有免疫治疗益处。在某种程度上已清楚，单种细胞因子或趋化因子试剂并不引起具有抗癌效应所需的完整Th1免疫反应谱，并且这些因子可能以随时间变化的不同水平一起发挥作用。用多重产物制剂(formulation)来重演(recapitulate)和协调(orchestrate)，这是近乎不可能的免疫信号转导事件级联。大多数单种试剂细胞因子在临床上失败了，除了用于治疗慢性肝炎C病毒感染的聚乙二醇化干扰素外。
[0012] 基于观察到的这些开发免疫调节性抗癌治疗剂的方法的限制，人们需要免疫调节性治疗，其能够模拟活细菌感染而不引入感染和感染相关毒性的风险，同时仍然引起足以赋予抗癌活性的有效和不同的免疫反应。
[0013] 发明概述
[0014] 一些实施方案公开了细菌小细胞，其包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白，其中所述小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子。
[0015] 在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯特菌溶素O、李斯特菌溶素O L461T、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O L461T、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素(sphaericolysin)、炭疽杆菌溶素O(anthrolysin O)、蜡状芽孢杆菌溶素(cereolysin)、苏云金芽孢杆菌溶素O(thuringiensilysin O)、韦氏芽孢杆菌溶素(weihenstephanensilysin)、蜂房类芽胞杆菌溶素(alveolysin)、短芽孢杆菌溶素(brevilysin)、丁酸芽孢梭菌溶素(butyriculysin)、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素(novyilysin)、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素(mitilysin)、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素(intermedilysin)、伊氏李斯特菌溶素(ivanolysin)、斯氏李斯特菌溶素O(seeligeriolysin O)、阴道加德纳菌溶素(vaginolysin)和化脓隐秘杆菌溶素(pyolysin)。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素O(perfringolysin O)。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0016] 在一些实施方案中，小细胞还包含侵袭素。在一些实施方案中，小细胞不包含侵袭素。
[0017] 在一些实施方案中，小细胞还包含Th1细胞因子。在一些实施方案中，Th1细胞因子选自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-α和IFN-γ。
[0018] 在一些实施方案中，小细胞还包含Th2细胞因子。在一些实施方案中，Th2细胞因子选自：IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
[0019] 在一些实施方案中，小细胞还包含磷脂酶。在一些实施方案中，磷脂酶为PC-PLC或PI-PLC。
[0020] 在一些实施方案中，小细胞包含蛋白毒素，其选自：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素B(botulinolysin B)、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及以上物质的组合。
[0021] 在一些实施方案中，小细胞不包含任何其他的治疗活性部分。在一些实施方案中，小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的治疗性蛋白或治疗性核酸。在一些实施方案中，小细胞不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。在一些实施方案中，小细胞不包含任何治疗性核酸如siRNA。
[0022] 本文中公开的一些实施方案提供了产小细胞的细菌，其包含：编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；和能够功能性表达胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的重组表达盒，其中所述细菌不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子，并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
[0023] 在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含：编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述产小细胞的细菌的染色体包含所述核酸内切酶的一个或多个识别位点；确定的营养缺陷型；以及lpxM/msbB基因中的缺失或突变。
[0024] 在一些实施方案中，核酸内切酶选自：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。在一些实施方案中，编码产小细胞的基因产物的可表达的基因选自：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。
[0025] 在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯特菌溶素O、李斯特菌溶素O L461T、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O L461T、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素O。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO:1。
[0026] 在一些实施方案中，小细胞还包含能够功能性表达侵袭素的重组表达盒。
[0027] 一些实施方案提供了治疗癌症的方法，包括向有需要的患者给予包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的细菌小细胞，其中所述给药诱导非免疫原性的抗肿瘤免疫调节效应。
[0028] 在一些实施方案中，小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子。
[0029] 在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯特菌溶素O、李斯特菌溶素O L461T、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O L461T、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素O。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO:1。
[0030] 在一些实施方案中，小细胞还包含侵袭素。在一些实施方案中，小细胞不包含侵袭素。
[0031] 在一些实施方案中，小细胞还包含Th1细胞因子。在一些实施方案中，Th1细胞因子选自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-α和IFN-γ。
[0032] 在一些实施方案中，小细胞还包含Th2细胞因子。在一些实施方案中，Th2细胞因子选自：IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
[0033] 在一些实施方案中，小细胞还包含磷脂酶。在一些实施方案中，磷脂酶为PC-PLC或PI-PLC。
[0034] 在一些实施方案中，所述方法还包括蛋白毒素，其选自：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素B、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及以上物质的组合。
[0035] 在一些实施方案中，小细胞不包含任何其他的治疗活性部分。在一些实施方案中，小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的治疗性蛋白或治疗性核酸。在一些实施方案中，小细胞不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
[0036] 在一些实施方案中，癌症包括实体瘤、转移瘤或液体瘤。在一些实施方案中，癌症为上皮、成纤维细胞、肌肉或骨起源的。在一些实施方案中，癌症选自：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、食管癌、胆囊癌、皮肤癌、子宫癌、阴道癌、阴茎癌和肾癌。在一些实施方案中，癌症为膀胱癌。在一些实施方案中，癌症选自：腺癌、肉瘤、纤维肉瘤和眼癌、脑癌和骨癌。在一些实施方案中，癌症选自：非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病和慢性髓性白血病。
[0039] 图2的图显示了相对于小细胞递送的等量产气荚膜梭菌溶素O(PFO)，纯化的重组产气荚膜梭菌溶素O(BTX-100)的体外细胞毒性。
[0040] 图3的图显示，靶向部分侵袭素的去除对包含PFO的小细胞的抗肿瘤活性没有影响。
[0041] 图4描述的相片和图表显示了在肺和卵巢转移中VAX-IPD小细胞的相似的抗肿瘤效应。
[0042] 图5的柱状图显示，静脉内给药后在小鼠的肺而非卵巢中可检测到VAX-IPD小细胞。
[0043] 图6的柱状图显示，VAX-IPD小细胞在严重免疫缺陷的NIH-III小鼠中具有很少的抗肿瘤效应。
[0044] 图7的图显示，VAX-IP小细胞在建立的非肌肉侵入性膀胱癌MB49鼠模型中高度有效。
[0045] 图8是构建产VAX-IP小细胞的菌株及来源于其的VAX-IP小细胞的总体方案示意图。
[0046] 图9是pVX-336的质粒图。
[0047] 图10是pVX-128的质粒图。
[0048] 图11显示了可诱导的小细胞形成的扫描电子显微照片。
[0049] 图12示出了显示VAX-IP小细胞中侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O的表达的照片和图表。
[0050] 发明详述
[0051] 定义
[0052] 如本文所用，术语“Th1免疫调节性小细胞”是指能够刺激Th1免疫反应的小细胞。
[0053] 如本文所用，术语“Th2免疫调节性小细胞”是指能够刺激Th2免疫反应的小细胞。
[0054] 如本文所用，术语“Th1/Th2免疫调节性小细胞”是指能够刺激Th1和Th2免疫反应的小细胞。
[0055] 如本文所用，术语“重组侵入性免疫调节性小细胞”是指经遗传改造而表达和显示能够刺激内化至真核细胞的异源小细胞表面蛋白的小细胞。
[0056] 如本文所用，术语“天然侵入性的免疫调节性小细胞”是指这样的小细胞，其从正常侵入性的细菌制备而来，使得所述小细胞表达和显示天然存在的能够刺激内化至真核细胞的小细胞表面蛋白。
[0057] 如本文所用，术语“免疫原性的”是指通过适应性免疫机制介导的抗原特异性的体液或细胞免疫反应。免疫原性的小细胞指导免疫反应响应特定和具体的抗原，并且可用于例如使用免疫原性的小细胞作为病原体特异性疫苗的环境中。
[0058] 如本文所用，术语“免疫调节”是指以所需的形式(包括但不限于产生Th1和Th2免疫反应)总体调节(即，非免疫原性本身)免疫反应。
[0059] 如本文所用，术语“免疫治疗”是指使用免疫调节化合物如免疫调节性小细胞，产生针对消除或减缓疾病特别是癌症的进展具有有益效果的总体(即，非免疫原性本身)免疫反应。
[0060] 如本文所用，术语“粘附小细胞”是指能够结合和粘附至非组成性吞噬真核细胞表面而不显著刺激所述小细胞的内吞的小细胞。
[0061] 如本文所用，术语“粘膜-粘附小细胞”是指能够结合和粘附至粘膜表面的小细胞。
[0062] 如本文所用，术语“VAX-P小细胞”是指表达和包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)的小细胞。
[0063] 如本文所用，术语“VAX-IP小细胞”是指表达和显示来自假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)的泛β1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞还包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)。
[0064] 如本文所用，术语“VAX-IPT小细胞”是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛β1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞还包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和蛋白毒素。
[0065] 如本文所用，术语“VAX-IPP小细胞”是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛β1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和除蛋白毒素外的外源性多肽。
[0066] 如本文所用，术语“VAX-IPD小细胞”是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛β1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和白喉毒素的催化片段。
[0067] 如本文所用，术语“VAX-IPG小细胞”是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛β1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和白树毒素。
[0068] 如本文所用，术语“VAX-IPPA小细胞”是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛β1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和假单胞菌外毒素A。
[0069] 如本文所用，术语“VAX-IPR小细胞”是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛β1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和蓖麻毒素A。
[0070] 如本文所用，术语“成孔细胞溶素蛋白”和术语“胆固醇依赖性细胞溶素蛋白”可互换使用，并且是指这样的蛋白，其能够攻击包含胆固醇的细胞膜而在膜上形成孔。对于一些胆固醇依赖性细胞溶素蛋白，细胞膜中胆固醇的存在并非胆固醇依赖性细胞溶素蛋白结合细胞膜所需要。例如，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白可以为革兰氏阳性细菌分泌的β-桶成孔外毒素的家族成员。胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的非限制性实例包括：李斯特菌溶素O、李斯特菌溶素O L461T、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O E247M、李斯特菌溶素O D320K、李斯特菌溶素O L461T、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素、化脓隐秘杆菌溶素和产气荚膜梭菌溶素O。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含ECTGLAWEWWR(SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含WEWWRT(SEQ ID NO:2)所示的氨基酸序列。
[0071] 如本文所用，术语“治疗性核酸”是指当被引入真核生物体(例如，哺乳动物如人)时具有治疗效应的核酸分子。治疗性核酸可为例如ssDNA、dsDNA、ssRNA(包括shRNA)、dsRNA(包括siRNA)、tRNA(包括稀有密码子使用tRNA)、mRNA、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、肽核酸(PNA)、DNA:RNA杂合体、反义寡核苷酸、核酶、适体或以上物质的任意组合。
[0072] 如本文所用，术语“治疗性蛋白”是指当被引入至真核生物体(例如，哺乳动物如人)时具有治疗效应的蛋白。治疗性多肽可为例如蛋白毒素、胆固醇依赖性细胞溶素、功能酶、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿透肽或者前述物质的任意组合和/或多个。
[0073] 如本文所用，术语“治疗的”是指具有预防、抑制、消除或防止动物的疾病进展或其他异常生物过程的生物效应或生物效应组合。治疗活性部分可包括，例如治疗活性的小分子、治疗活性的蛋白和/或治疗活性的核酸。
[0074] 如本文所用，术语“小分子”是指具有生物效应且具有小于5000道尔顿的分子量的分子。在一些实施方案中，小分子具有小于2500道尔顿的分子量。在一些实施方案中，小分子具有小于1000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，小分子具有小于800道尔顿的分子量。在一些实施方案中，小分子具有小于500道尔顿的分子量。
[0075] 如本文所用，术语“治疗性小分子药物”或“小分子药物”是指当被引入至真核生物体(例如，哺乳动物如人)时具有治疗效应的小分子。
[0076] 如本文所用，术语“β1整合素侵袭素靶标”是指能够被侵袭素结合的哺乳动物β1整合素异质二聚体。
[0077] 如本文所用，术语“原核细胞分裂基因”是指编码参与原核细胞分裂过程的基因产物的基因。本领域已发现和定征了许多细胞分裂基因。细胞分裂基因的实例包括但不限于：zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsI、ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、ftsZ、minC、minD、minE、seqA、ccdB、sfiC和ddlB。
[0078] 如本文所用，术语“转基因”是指天然地或通过众多基因工程技术中的任何一种被从一个生物体转移至另一个生物体的基因或遗传物质。在一些实施方案中，转基因为包含从一个生物体分离并引入至不同生物体的基因序列的DNA片段。该DNA的非天然片段可保留有在转基因生物体中产生RNA或蛋白的能力，或者其可改变转基因生物体的遗传密码的正常功能。在一些实施方案中，转基因为被引入至先前未发现该转基因的生物体中的人工构建的DNA序列，而不管其是否包含基因编码序列。
[0079] 如本文所用，如果相对于从其中纯化该试剂的组合物，组合物中试剂的浓度增加和/或一种或多种不需要的污染物浓度降低，则该试剂被叙述为已被“纯化”。在一些实施方案中，纯化包括富集组合物中的试剂和/或从中分离试剂。
[0080] 如本文所用，术语“基本上没有亲本细胞”与“基本上没有”同义，是指纯化的小细胞组合物，其具有对靶标治疗小细胞的毒性特性和/或治疗效应有很少或没有影响的亲本细胞污染水平。
[0081] 如本文所用，术语“结构域”或“蛋白结构域”是指具有共同物理和/或化学特性的分子或结构的区域。蛋白结构域的非限制性实例包括：疏水性跨膜或膜外围结合区域、球形酶促或受体区域、蛋白-蛋白相互作用结构域和/或核酸结合结构域。
[0082] 如本文使用，术语“真细菌”和“原核生物”与本领域使用的那些相似。本文所用的术语“真细菌”和“原核生物”包括真细菌，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性菌、原核生物病毒(例如，噬菌体)和专性细胞内寄生生物(例如，立克次氏体、衣原体等)。
[0083] 术语“免疫增强性多肽”与“免疫刺激性多肽”和“免疫调节性多肽”同义，并且这些术语在本文中可互换使用，是指当被引入真核生物体或细胞(例如，哺乳动物如人)时具有免疫调节效应的不同蛋白分子类型的任何集合。免疫调节性多肽可为细胞因子、趋化因子、胆固醇依赖性细胞溶素、功能酶、抗体或抗体模拟物、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿透肽或上述物质的任意组合和/或多种。
[0084] 术语“免疫原”和“抗原”在本文中可互换使用，并且是指针对其可加强抗原特异性抗体、细胞和/或过敏性反应的多肽、糖、脂质、核酸和其他分子。在本发明的上下文中，小细胞的“免疫原性”与“抗原性”同义，其不是免疫治疗效应的原因。抗原特异性免疫反应依赖于抗原/免疫原的存在，并且不包括在如本文所用的Th1或Th2免疫调节性反应的定义中。
[0085] 如本文所用，术语“过表达”是指宿主细胞的DNA所编码的功能性核酸、多肽或蛋白的表达，其中所述核酸、多肽或蛋白或者并非天然存在于宿主细胞中，或者相比从编码所述核酸、多肽或蛋白的内源基因的正常表达，其中所述核酸、多肽或蛋白在宿主细胞中以更高的水平存在。
[0086] 如本文所用，术语“调节”是指与靶标直接或间接相互作用以改变靶标调控生物过程的活性。“调控”模式包括但不限于：增加靶标活性、抑制靶标活性、限制靶标活性和延长靶标活性。
[0087] 如本文所用，术语“异源的”是指并非小细胞或产小细胞的细菌菌株中天然发现的蛋白、基因、核酸、显像剂、缓冲剂成分或任何其他生物活性或失活的物质，其由产小细胞的细菌菌株表达、转录、翻译、扩增或者以其他方式生成，所述产小细胞的细菌菌株具有编码所述异源物质或编码能够产生所述异源物质(例如，并非亲本细胞天然具有的生物活性代谢物)的基因的重组遗传物质。
[0088] 如本文所用，术语“外源的”是指并非细胞天然具有的，或者在小细胞的情况下并非小细胞的亲本细胞天然具有的蛋白(包括抗体)、基因、核酸、小分子药物、显像剂、缓冲剂、放射性核素或任何其他生物活性或失活的物质。由于其单独生成、纯化和添加这一事实，外源性物质不同于异源物质。
[0089] 如本文所用，术语“治疗的”是指具有预防、抑制、消除或防止动物疾病或其他异常生物过程的进展的生物效应或生物效应组合。
[0090] 如本文所用，术语“诊断的”是指具有检测、监测、追踪和/或确定动物(包括人)的或来自包括但不限于血液、尿、唾液、汗液和粪便物的生物样本的疾病或病况的能力。
[0091] 如本文所用，术语“治疗诊断的”是指具有治疗和诊断组合物的组合作用。
[0092] 如本文所用，术语“重组表达的”是指使用现代基因工程技术构建的一种或多种核酸和/或来自核酸分子的蛋白的表达，其中所构建的核酸分子在小细胞和/或产小细胞的细菌菌株中并非天然存在，其中人工核酸分子存在为游离的核酸分子或作为产小细胞的细菌染色体的一部分。
[0093] 如本文所用，术语“游离的”是指独立于给定生物体或细胞的染色体的核酸分子。
[0094] 如本文所用，术语“解毒”是指对引起修饰后的组合物或其组分的急性毒性显著降低的组合物或其组分进行的修饰，而不管组合物或其组分的毒性发生的起因性生物学基础。
[0095] 如本文所用，术语“生物活性分子”是指当被引入人生物体或细胞时对真核生物体或细胞(例如，哺乳动物如人)具有生物效应的分子。生物活性分子包括但不限于：治疗性核酸、治疗性多肽(包括蛋白毒素)和治疗性小分子药物。
[0096] 描述
[0097] 本申请涉及在体外和体内使用细菌小细胞刺激免疫系统，以使得具有由所述免疫反应介导的间接抗癌效应。真细菌小细胞具有作为免疫调节物的独特优势，这在于它们模拟活细菌但不是活的并且不具感染性，从而相比活细菌免疫调节治疗其具有减少的毒性。另外，细菌小细胞可被遗传改造以便包含不同的分子组成，其每种可优先增加、引发或者刺激某种类型的免疫反应(即，Th1相对Th2)。本文公开的细菌小细胞经设计能够产生具有除任何直接的抗肿瘤活性外的间接抗癌活性的免疫反应。小细胞还可特异性靶向已知涉及起始、促进、支持和维持动物的免疫反应的细胞类型或组织。本申请提供了细菌小细胞作为癌症和其他疾病的非活的免疫调节性治疗剂的应用。
[0098] 细菌小细胞为在破坏细菌细胞的正常分裂装置后由细菌形成的非染色体的、膜包封的生物纳米粒子(直径约250–500nm)。本质上，小细胞为正常细菌细胞的小的、代谢活性的复制体，除了它们不包含染色体DNA并因此而为非分裂性的、非活的和非感染性的。尽管小细胞不包含细菌染色体，已显示质粒DNA分子(比染色体小)、RNA分子(所有亚型和结构的)、天然和/或重组表达的蛋白，以及其他代谢物被分隔进入小细胞中。小细胞独特地适合作为体内免疫调节物，因为它们可被改造以将一种或多种不同的天然存在的、异源的或外源的免疫调节分子成分纳入至单个粒子中，其中每种组分以单独的量存在。这与基于活细菌的免疫治疗完全不同，在基于活细菌的免疫治疗中，活细菌在体内给药后能够继续分裂、维持和从头产生未知量的免疫调节组分。活细菌免疫治疗的维持和繁殖可引起许多不同的并发症，包括感染、器官衰竭、败血症和死亡。简而言之，小细胞可被“改造”以优先包封、结合至或吸收生物活性分子，包括用于随后在预防和治疗药物应用中产生免疫调节反应的各种核酸、蛋白、小分子药物及其任何组合，其中通过所述免疫调节反应预防、维持和/或抑制疾病是可取的。
[0099] 通常，经改造的细菌小细胞已被直接用作抗癌剂，如美国专利第7,183,105号中描述的，其通过引用整体并入本文中。例如，美国专利第7,183,105号中已教导可对小细胞改造，以一起或配合使用小细胞表面定位的抗体来将小分子药物、肽、蛋白和各种核酸直接靶向和递送至癌细胞，从而赋予直接靶向型抗癌效应。其他研究者也报导了相同的发现，如美国专利第7,183,105号中所教导的使用小细胞作为靶向型递送媒介物，如美国专利申请第20070298056、20080051469和20070237744号中所示例的，其每个均通过引用并入本文中。这些参考文献中均没有教导了小细胞可被改造并用作能够赋予间接抗肿瘤效应的抗癌免疫治疗剂。相反，每篇参考文献教导了使用小细胞仅体内直接特异性靶向和递送抗癌剂至肿瘤细胞的相同的方法。上文包括的参考文献共同教导了避免使用作为体内癌症治疗剂时引起非免疫原性的免疫调节效应的细菌小细胞。例如，美国专利第7,183,105号描述了可用于减少或避免免疫反应的几种方法，包括使用来自L-型细菌(不包含外膜)的小细胞以及生成原生质体(不包含外膜且没有细胞壁)。美国专利申请第20070298056、20080051469和20070237744号中提供的实例表明，使用对结合至小细胞媒介物表面的已知肿瘤选择性细胞表面受体具有选择性的抗体进行靶向，为抗肿瘤活性所需要。此外，这些参考文献还表明，当使用非靶向的小细胞时，未观察到明显的抗肿瘤反应。在其他相关的工作中，MacDiarmid和同事证明，不包含细胞毒性药物荷载的非靶向的小细胞和肿瘤靶向的小细胞同样地不能产生抗肿瘤反应，并且需要靶向抗体及细胞毒性荷载(MacDiarmid,et al.Cancer Cell,2007,Volume 11,p.431-445)。另外，MacDiarmid et al.讨论了躲避免疫系统的益处，描述了这样的躲避作为其设计原理的一部分，并因此明确教导了避免使用小细胞作为免疫调节治疗剂。相反，本公开提供了例如使用细菌小细胞作为能够诱发有效的、间接的抗肿瘤活性的免疫调节治疗剂。例如，本文公开的小细胞可被用于在对象中诱导非免疫原性的抗肿瘤免疫调节效应。
[0100] 在一些实施方案中，本公开提供了通过分别由直接的肿瘤靶向和伴随的抗肿瘤免疫调节效应介导的同时直接和间接机制，使用细菌小细胞作为能够诱发有效的抗肿瘤效应的免疫调节治疗剂。例如，所述小细胞可被设计用于非特异性刺激抗癌免疫反应，同时还与所述免疫反应配合，并通过直接递送毒性荷载至癌细胞而特异性起作用。因此，本公开的一些实施方案涉及通过使用小细胞的靶向性药物递送以及通过间接非特异性辅助效应，包括NK激活和其他免疫细胞活性(包括但不限于释放Th1反应的典型细胞因子)，直接杀伤肿瘤细胞和/或肿瘤内皮细胞。
[0101] 如本文所公开，其他活的细菌治疗剂在过去已被用作抗癌剂，但由于其存活特性而受到毒性的限制。这些技术的提供者声称活的细菌治疗剂通过优先定殖肿瘤的低氧区、在该过程中侵入肿瘤细胞以及造成进一步的坏死而起作用。重要的是，这些技术中的每种强调了具有活细菌制剂来实现疗效的重要性，并且一些甚至证明杀死的细菌治疗剂无活性。这些实例不会使得技术人员使用小细胞，然而，相反通过教导肿瘤组织中的细菌活力、定殖和维持对于效力至关重要而避免这样做。小细胞不是活的，不会持续，并因此考虑到使用活细菌治疗剂的那些教导，预期不会具有效果。与这些教导相反，本公开利用了不能体内维持的自限制的、非活的小细胞作为针对癌症的免疫治疗剂。
[0102] 本文公开的免疫调节治疗可用于任何肿瘤类型。本领域技术人员应理解，某些肿瘤类型可能更为敏感，并因此可能对该方法治疗更为顺从。例如，本文公开的免疫调节治疗剂和小细胞可用于治疗侵入性膀胱癌。每年全球报导超过300,000例新增膀胱癌，其中的70％在早期非肌肉侵入阶段检测到。该群体通常被分为3个疾病阶段，称为Ta、T1和Tis，其中肿瘤为乳头状的(以前称为表面的)已分别侵入固有层(lamnia propria)但还未侵入肌肉，以及原位癌(扁平的非侵入性肿瘤)。每种肿瘤类型基于不同的因素如增殖指数等进一步通过等级(1-3级)进行划分。针对低风险疾病的护理标准，基于阶段和等级，为经尿道膀胱肿瘤去除(TURBT)，然后立即术后给予化疗剂。建议的中间风险患者的护理标准为TURBT，然后立即术后安装化疗，然后以化疗进行6周的诱导处理。如果患者化疗失败，则进行二次膀胱镜切除，并在14天后向患者给予活的牛分枝杆菌、卡介苗(BCG)的减毒珠。用于立即术后安装的化疗选择为丝裂霉素C，尽管阿霉素、表柔比星、戊柔比星、紫杉醇和吉西他滨均已被使用并具有相似的效应。在高风险疾病，包括患有原位癌的那些患者中，BCG是唯一有效的试剂。BCG免疫调节治疗远好于目前为止在中间和高风险人群中使用的任何化疗方法，但其限制在于其不能立即术后给药。TURBT方案中膀胱应当穿孔的与全身性吸收活的BCG相关的风险太大，难以评判其在术后早期环境中的应用，尽管关于所观察到的复发率，BCG介导的免疫调节是远优于化疗的方法。因此，大多数泌尿医师倾向于等待14天再给予BCG，同时先进行建议的术后早期安装。另一方面，如果使用术后早期临床治疗指导开始治疗，结果(也依据复发)更佳。总之，明显需要能够向已接受非肌肉侵入性膀胱癌的TURBT的患者术后早期给予的不像BCG的非活免疫调节治疗。此外，估计30％的自愿接受BCG的患者由于毒性副作用而中止了治疗。已证明毒性为BCG活力的函数。因此，存在对能够给予与BCG相同的免疫调节益处，但没有感染风险或活力相关毒性的治疗剂的强烈需求。
[0103] 在一些实施方案中，免疫调节性小细胞可在如下情况下用作膀胱内给予的免疫治疗：(i)非肌肉侵入性膀胱癌中的术后早期环境，(ii)代替BCG治疗来诱导和维持相同的治疗，以及(iii)作为不耐受BCG的和BCG难治性患者的挽救疗法。该使用方法不以任何方式意在限制本公开，但相反示例了对用于癌症的有效的、非活的免疫治疗剂的需求。另外，使用包含在小细胞表面上的整合素靶向部分侵袭素的多效应整合素靶向的免疫调节性小细胞，连同包封的细胞毒性多肽、内体破坏性多肽、小分子药物或核酸的一种或多种组合，在膀胱癌中是有利的，因为它们能够通过整合素靶向和递送的方式造成直接的肿瘤细胞杀伤效应和肿瘤内皮细胞杀伤效应，同时仍然发挥额外的由免疫系统赋予的间接抗肿瘤免疫调节效应。多效应整合素靶向的细胞毒性免疫调节性小细胞在膀胱癌中的一种非限制性应用为使用VAX-IP，其为包含位于表面的整合素靶向部分侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O的小细胞。VAX-IP可用作免疫调节治疗和/或作为直接的抗肿瘤/肿瘤内皮细胞治疗。多效应整合素靶向的细胞毒性免疫调节性小细胞在膀胱癌中的另一非限制性应用为使用VAX-IPD，其为包含位于表面的整合素靶向部分侵袭素、白喉毒素的催化片段和产气荚膜梭菌溶素O的小细胞。VAX-IPD可用作免疫调节治疗和/或作为直接的抗肿瘤/肿瘤内皮细胞治疗。
[0104] 在一些实施方案中，小细胞经改造并被用于产生Th1优势的免疫反应。Th1免疫调节性小细胞能够导致Th1细胞因子和趋化因子的产生，包括但不限于：IFN-γ、IFN-α、IL-12、IL-2、GMCSF、IL-18、TGF-β和TNF-α。
[0105] 在一些实施方案中，本文公开的小细胞包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白。在一些实施方案中，小细胞不显示包含抗体的Fc区的分子。包含抗体的Fc区的分子可以为例如抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，小细胞不包含侵袭素。在一些实施方案中，小细胞不包含治疗性小分子和/或治疗性核酸。在一些实施方案中，小细胞也不包含除蛋白毒素、Th1细胞因子、Th2细胞因子、磷脂酶和/或胆固醇依赖性细胞溶素蛋白外的任何治疗性蛋白。在一些实施方案中，小细胞不包含除蛋白毒素、Th1细胞因子、Th2细胞因子、磷脂酶和/或胆固醇依赖性细胞溶素蛋白外的任何治疗活性部分。在一些实施方案中，小细胞上的胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的量为这样的水平，当所述小细胞接触所述哺乳动物细胞时对哺乳动物细胞有毒。
[0106] 在一些实施方案中，Th1免疫调节性小细胞包括但不限于由细菌的天然侵入性的菌株制备的那些，包括但不限于以下细菌的侵入性菌株：沙门氏菌(Salmonella spp.)、李斯特菌(Listeria spp.)、分枝杆菌(Mycobacteria spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、耶尔森菌(Yersinia spp.)和大肠杆菌(Escherichia coli)。这些天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞将显示天然存在的位于小细胞表面的配体，其能够刺激内化小细胞至真核细胞中，以帮助产生Th1-优势免疫治疗反应。本领域技术人员应理解，天然侵入性的小细胞本身在天然下不存在，而是使用一种或多种用于产生如本文所述的小细胞的遗传方法从细菌的非产生小细胞的侵入性菌株改造而来。
[0107] 在一些实施方案中，天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞还包含经设计用于进一步促进、调节或稳定Th1-优势免疫反应的一种或多种重组表达的蛋白和核酸。所述重组表达的蛋白包括但不限于：Th1细胞因子，如IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-α和IFN-γ。另外，天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞可表达一种或多种成孔细胞溶素蛋白如李斯特菌溶素O(LLO)及其任何功能变体或等同物，以促进小细胞组成物内体逃逸至已内化所述小细胞的细胞的胞液中，从而促进、调节或稳定所述小细胞介导的Th1-优势免疫反应。磷脂酶如PC-PLC或PI-PLC也可通过促进从内体释放小细胞组成物至已内化所述小细胞的真核细胞的胞液中，用作促进、调节或稳定Th1-优势免疫反应的内体破坏试剂。天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞可表达一种或多种Th1细胞因子与一种或多种内体破坏性细胞溶素的组合。天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞也可包含重组表达的蛋白毒素以促进坏死和/或凋亡，其进而还可进一步促进、调节和/或稳定Th1免疫反应。优选的重组表达/制备的蛋白毒素为产气荚膜梭菌溶素O。其他可使用天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞加以利用的重组表达/制备的蛋白毒素包括但不限于：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素B、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、李斯特菌溶素O的pH稳定变体(独立于pH的；氨基酸替换L461T)、李斯特菌溶素O的热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K)、李斯特菌溶素O的pH和热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K和L461T)、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及前述实例的任意组合。多肽的重组表达可起因于来自本领域已知的多种附加型重组原核表达载体(包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)以及以上实例的任意组合)中任何一种的表达。以类似的方式，重组表达可通过存在于产小细胞的亲本细胞染色体一个或多个拷贝中的位于染色体的原核表达盒来实现。天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞也可经改造用于表达或包含已知能刺激位于内体的Toll样受体3、7、8和/或9的一种或多种免疫调节性核酸，从而促进Th1免疫调节效应。这样的核酸包括但不限于：单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA、DNA发卡和RNA发卡，其中的每个均可被重组表达，这容易为本领域技术人员所认可。在一些实施方案中，天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞来源于具有美国专利申请第20100112670的归巢核酸内切酶遗传自杀系统的产小细胞的菌株，其通过引用并入本文中。本文所述的I-ceuI归巢核酸内切酶选择性在离散的保守位点消化大多数细菌物种的染色体，一方面用于选择性杀伤亲本细胞，并且另一方面用于在所述过程中产生双链DNA片段。
[0108] 一些实施方案提供了天然侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌，其包含：(i)编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；以及(ii)能够刺激免疫治疗效应的蛋白毒素，包括但不限于产气荚膜梭菌溶素O。在一些实施方案中，所述细菌不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子，并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。在一些实施方案中，天然侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌还包含以下中的一种或多种：(iii)编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述天然侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌的染色体包含核酸内切酶的一个或多个识别位点；(iv)确定的营养缺陷型；以及(v)lpxM/msbB基因(或其他功能等同物)中的缺失或突变。在一些实施方案中，产小细胞的基因为细胞分裂基因。细胞分裂基因的实例包括但不限于：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。在一些实施方案中，产小细胞的基因在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，核酸内切酶自杀基因位于产小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶为归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶包括但不限于：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，核酸内切酶在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。在一些实施方案中，缺失或失活突变在dapA基因或其功能同系物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含在编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码的基因产物造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生改变的脂质A分子。在一些实施方案中，改变的脂质A分子相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷性的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的，从而降低从遗传自杀机制回复的风险。在一些实施方案中，天然侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：耶尔森菌、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、沙门氏菌、志贺氏菌、立克次氏体(Rickettsia spp.)和大肠杆菌的侵入性菌株。在一些实施方案中，天然侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于分枝杆菌、链球菌(Streptococcus spp.)、单核细胞增多性李斯特菌、衣原体(Chlamydia spp.)和布鲁氏菌(Brucella spp)。
[0109] Th1免疫调节性小细胞包括但不限于产生自经遗传改良而成为侵入性细菌的非侵入性菌株的那些。许多细菌的非侵入性菌株为技术人员已知，并且包括但不限于：大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)、假单胞菌等的非侵入性菌株。这些正常非侵入性的菌株经遗传改良以显示能够刺激小细胞内化至真核细胞中的位于异源小细胞表面的配体。产生的重组侵入性Th1免疫调节性小细胞可通过免疫和其他真核细胞被内化，从而产生Th1-优势免疫治疗反应。在一些实施方案中，重组侵入性Th1免疫调节性小细胞还包含经设计用于进一步促进、调节或稳定Th1-优势免疫反应的一种或多种重组表达的免疫调节蛋白和核酸。免疫调节蛋白的实例包括但不限于：Th1细胞因子，如IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-α和IFN-γ。重组侵入性Th1免疫调节性小细胞可表达一种或多种成孔细胞溶素蛋白如李斯特菌溶素O(LLO)及其任何功能变体或等同物，以促进小细胞组成物内体逃逸至已内化小细胞的细胞的胞液中，从而促进、调节或稳定所述小细胞介导的Th1-优势免疫反应。磷脂酶如PC-PLC或PI-PLC通过促进从内体释放小细胞组成物至已内化小细胞的真核细胞的胞液中，也可用作促进、调节或稳定Th1-优势免疫反应的内体破坏性试剂。重组侵入性Th1免疫调节性小细胞可表达一种或多种Th1细胞因子与一种或多种内体破坏性细胞溶素的组合。天然侵入性的Th1免疫调节性小细胞也可包含重组表达的蛋白毒素，以促进坏死和/或凋亡，其进而还可进一步促进、调节和/或稳定Th1免疫反应。优选的重组表达/制备的蛋白毒素为产气荚膜梭菌溶素O。可使用重组侵入性Th1免疫调节性小细胞来加以利用的重组表达/制备蛋白毒素的其他实例包括但不限于：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、LF和EF的炭疽毒素、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素B、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、李斯特菌溶素O的pH稳定变体(独立于pH的；氨基酸替换L461T)、李斯特菌溶素O的热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K)、李斯特菌溶素O的pH和热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K和L461T)、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及前述实例的任意组合。多肽的重组表达可起因于来自本领域已知的多种附加型重组原核表达载体(包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)以及前述实例的任意组合)中任何一种的表达。以类似的方式，重组表达可通过存在于产小细胞的亲本细胞染色体一个或多个拷贝中的位于染色体的原核表达盒来实现。重组侵入性Th1免疫调节性小细胞也可经改造用于表达或包含已知能刺激位于内体的Toll样受体3、7、8和/或9的一种或多种免疫调节性核酸，从而促进Th1免疫调节效应。这样的核酸包括但不限于：单链DNA、单链RNA、双链DNA、线性双链DNA、双链RNA、DNA发卡和RNA发卡，其中的每个均可被重组表达，这容易为本领域技术人员认可。在一些实施方案中，重组侵入性Th1免疫调节性小细胞来源于具有美国专利申请第2010-0112670号的归巢核酸内切酶遗传自杀系统的产小细胞的菌株，其通过引用并入本文中。本文描述的I-CeuI归巢核酸内切酶在离散的保守位点选择性消化大多数细菌物种的染色体，一方面用于选择性杀伤亲本细胞，并且另一方面用于在所述过程中产生双链线性DNA片段。
[0110] 一些实施方案提供了重组侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌，其包含(i)编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；(ii)能够功能性表达和表面显示一种或多种能够刺激内化至真核细胞中的位于异源小细胞表面的靶向部分的重组表达盒，以及(iii)能够刺激免疫治疗效应的蛋白毒素，包括但不限于产气荚膜梭菌溶素O。在一些实施方案中，重组侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌也可包含以下中的一种或多种：(iv)编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述产小细胞的细菌的染色体包含所述核酸内切酶的一个或多个识别位点；(v)确定的营养缺陷型；和(vi)lpxM/msbB基因(或其他功能等同物)中的缺失或突变。在一些实施方案中，产小细胞的基因为细胞分裂基因。细胞分裂基因包括但不限于：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。在一些实施方案中，产小细胞的基因在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，核酸内切酶自杀基因位于产小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶为归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶包括但不限于：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，核酸内切酶在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。在一些实施方案中，缺失或失活突变位于dapA基因或其功能同系物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生了改变的脂质A分子的基因产物。在一些实施方案中，相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，改变的脂质A分子关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷型的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的。在一些实施方案中，重组侵入性Th1免疫调节性产生小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌、兔热病弗朗西斯氏(Franciscella tularemia)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、克雷伯氏菌(Kliebsella)、耶尔森菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌和大肠杆菌。在一些实施方案中，重组侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、乳酸杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
[0111] 在一些实施方案中，Th1免疫调节性小细胞产生自细菌的非侵入性的菌株。许多细菌的非侵入性的菌株为本领域技术人员已知，并且包括但不限于：大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、乳酸杆菌、假单胞菌等的非侵入性的菌株。这些非侵入性的Th1免疫调节性小细胞可通过免疫和其他真核细胞被内化，从而产生Th1-优势免疫治疗反应。在一些实施方案中，重组非侵入性Th1免疫调节性小细胞还包含一种或多种经设计用于进一步促进、调节或稳定Th1-优势免疫反应的重组表达的免疫调节蛋白和核酸。免疫调节蛋白的实例包括但不限于：Th1细胞因子，如IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-α和IFN-γ。重组非侵入性Th1免疫调节性小细胞可表达一种或多种成孔细胞溶素蛋白如李斯特菌溶素O(LLO)及其功能变体或等同物，以促进小细胞组成物内体逃逸至已内化所述小细胞的细胞的胞液中，从而促进、调节或稳定所述小细胞介导的Th1-优势免疫反应。磷脂酶如PC-PLC或PI-PLC也可用作通过促进从内体释放小细胞组成物至已内化所述小细胞的真核细胞的胞液中，而用作促进、调节或稳定Th1-优势免疫反应的内体破坏试剂。重组非侵入性Th1免疫调节性小细胞可表达一种或多种Th1细胞因子与一种或多种内体破坏性细胞溶素的组合。重组非侵入性Th1免疫调节性小细胞也可包含重组表达的蛋白毒素以促进坏死和/或凋亡，其进而还可进一步促进、调节和/或稳定Th1免疫反应。优选的重组表达/制备的蛋白毒素为产气荚膜梭菌溶素O。其他可使用重组非侵入性Th1免疫调节性小细胞来加以利用的重组表达/制备的蛋白毒素包括但不限于：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素B、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、假单胞菌外毒素A、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、李斯特菌溶素O的pH稳定变体(独立于pH的；氨基酸替换L461T)、李斯特菌溶素O的热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K)、李斯特菌溶素O的pH和热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K和L461T)、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及前述实例的任意组合。多肽的重组表达可产生于来自本领域中已知的多种附加型重组原核表达载体(包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)以及前述实例的任意组合)中任何一种的表达。以类似的方式，重组表达可通过存在于产小细胞的亲本细胞染色体一个或多个拷贝中的位于染色体的原核表达盒来实现。重组非侵入性Th1免疫调节性小细胞也可经改造用于表达或包含已知能刺激位于内体的Toll样受体3、7、8和/或9的一种或多种免疫调节性核酸，以增强Th1免疫调节效应。这样的核酸包括但不限于：单链DNA、单链RNA、双链DNA、线性双链DNA、双链RNA、DNA发卡和RNA发卡，其中的每个均可被重组表达，这可容易地被本领域技术人员认可。在一些实施方案中，重组非侵入性Th1免疫调节性小细胞来源于产小细胞的菌株，所述菌株具有美国专利申请第2010-0112670号中描述的归巢核酸内切酶遗传自杀体系，其通过引用的方式并入本文中。其中描述的I-CeuI归巢核酸内切酶在离散的保守位点选择性消化大多数细菌物种的染色体，一方面用于选择性杀伤亲本细胞，并且另一方面用于在所述过程中产生双链线性DNA片段。
[0112] 一些实施方案提供了重组非侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌，其包含：(i)编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；以及(ii)能够刺激免疫治疗效应的蛋白毒素，包括但不限于产气荚膜梭菌溶素O。在一些实施方案中，重组非侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌还包含以下中的一种或多种：(iii)编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述重组非侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌的染色体包含核酸内切酶的一个或多个识别位点；(iv)确定的营养缺陷型；以及(v)lpxM/msbB基因(或其他功能等同物)中的缺失或突变。在一些实施方案中，产小细胞的基因为细胞分裂基因。细胞分裂基因包括但不限于：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。在一些实施方案中，产小细胞的基因在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，核酸内切酶自杀基因位于产小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶为归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶的实例包括但不限于：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，核酸内切酶在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。在一些实施方案中，缺失或失活突变位于dapA基因或其功能同系物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生改变的脂质A分子的基因产物。在一些实施方案中，相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，改变的脂质A分子关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷型的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的，从而降低从遗传自杀机制回复的风险。在一些实施方案中，重组非侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：耶尔森菌、弯曲杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺氏菌、立克次氏体和大肠杆菌的侵入性菌株。在一些实施方案中，重组非侵入性Th1免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：分枝杆菌、链球菌、单核细胞增多性李斯特菌、衣原体和布鲁氏菌。
[0113] 在一些实施方案中，小细胞经改造并被用于产生Th2-优势免疫反应。能够导致产生Th2细胞因子和趋化因子的Th2免疫调节性小细胞的实例包括但不限于：IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
[0114] 在一些实施方案中，Th2免疫调节性小细胞包括但不限于从以下菌株制备而来的那些：天然存在的非侵入性的、粘附的或粘膜-粘附的细菌菌株，包括但不限于链球菌、葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、乳酸杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌和大肠杆菌的非侵入性的、粘附的和粘膜-粘附的菌株。这些天然非侵入性Th2免疫调节性小细胞不显示天然存在的位于小细胞表面的配体，其能够刺激内化小细胞至真核细胞中，尽管它们可被组成性吞噬免疫细胞如巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞吞噬。粘附的和粘膜-粘附的Th2免疫调节性小细胞表达位于小细胞表面的蛋白，其分别可刺激粘附至真核细胞表面和粘膜表面，但不造成很大的内化，除正常组成性吞噬细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞以外。本领域技术人员应理解，天然非侵入性Th2免疫调节性小细胞、粘附的Th2免疫调节性小细胞和粘膜-粘附的Th2免疫调节性小细胞本身在天然下不存在，而是使用生成如本文所述小细胞的遗传方法中一种或多种，从非产小细胞的非侵入性的、粘附的和粘膜-粘附的细菌物种改造而来。链球菌、葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、乳酸杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌和大肠杆菌的非粘附菌株易于由分子生物学和/或微生物遗传学领域技术人员改造，以通过细菌细胞表面粘附因子的克隆和重组表达成为粘附态，使得所述异源粘附因子的表达产生重组粘附的Th2免疫调节性小细胞。
[0115] 一些实施方案提供了天然非侵入性的、粘附的或粘膜-粘附的Th2免疫调节性产小细胞的细菌，其包含：(i)编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种。在一些实施方案中，天然非侵入性的、粘附的或粘膜-粘附的Th2免疫调节性产小细胞的细菌还包含以下中的一种或多种：(ii)编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中天然非侵入性的、粘附的和/或粘膜-粘附的Th2免疫调节性产小细胞的细菌的染色体包含核酸内切酶的一个或多个识别位点；(iii)确定的营养缺陷型；以及(iv)lpxM/msbB基因(或其功能等同物)中的缺失或突变。在一些实施方案中，产小细胞的基因为细胞分裂基因。细胞分裂基因包括但不限于：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。在一些实施方案中，产小细胞的基因在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，核酸内切酶自杀基因位于产小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶为归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶的实例包括但不限于：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，核酸内切酶在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。
在一些实施方案中，所述缺失或失活突变位于dapA基因或其功能同系物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生改变的脂质A分子的基因产物。在一些实施方案中，相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，改变的脂质A分子关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷型的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的，从而降低从遗传自杀机制回复的风险。在一些实施方案中，天然非侵入性的、粘附的和/或粘膜-粘附的Th2免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：耶尔森菌、弯曲杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺氏菌、立克次氏体和大肠杆菌的侵入性菌株。在一些实施方案中，天然非侵入性的、粘附的或粘膜-粘附的Th2免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：分枝杆菌、链球菌、单核细胞增多性李斯特菌、衣原体和布鲁氏菌。
在一些实施方案中，所述缺失或失活突变位于dapA基因或其功能同系物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生改变的脂质A分子的基因产物。在一些实施方案中，相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，改变的脂质A分子关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷型的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的，从而降低从遗传自杀机制回复的风险。在一些实施方案中，天然非侵入性的、粘附的和/或粘膜-粘附的Th2免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：耶尔森菌、弯曲杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺氏菌、立克次氏体和大肠杆菌的侵入性菌株。在一些实施方案中，天然非侵入性的、粘附的或粘膜-粘附的Th2免疫调节性产小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：分枝杆菌、链球菌、单核细胞增多性李斯特菌、衣原体和布鲁氏菌。
[0116] 一些实施方案提供了多效应靶向的细胞毒性免疫调节性小细胞。多效应靶向的细胞毒性免疫调节性小细胞包含位于小细胞表面的靶向部分、细胞毒性荷载和/或内体逃逸蛋白。多效应靶向的细胞毒性免疫调节性小细胞除了能够引起Th1免疫调节效应(其能够引起进一步的抗肿瘤活性)外，还能够通过直接靶向和递送细胞毒性荷载至肿瘤细胞的方式诱发直接的抗肿瘤效应。
[0117] 如本文所述，VAX-IP小细胞包括所有一致地表达和显示侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O的多效应细胞毒性免疫调节性小细胞。优选地，小细胞的最终制剂由解毒的LPS组成，并且凭借新的、可诱导的遗传自杀机制和DAP营养缺陷型基本上消除任何体内活的污染性亲本细胞。
[0118] 如本文所述，VAX-IPT小细胞包括所有一致地表达和显示侵袭素、产气荚膜梭菌溶素O和蛋白毒素的多效应细胞毒性免疫调节性小细胞。优选地，小细胞的最终制剂由解毒的LPS组成，并且凭借新的、可诱导的遗传自杀机制和DAP营养缺陷型基本上消除任何体内活的污染性亲本细胞。
[0119] 如本文所述，VAX-IPT小细胞的一个非限制性优选亚类为VAX-IPD小细胞，其为一致地表达和显示侵袭素、产气荚膜梭菌溶素O和白喉毒素的催化片段(片段A)的多效应细胞毒性免疫调节性小细胞。优选地，小细胞的最终制剂由解毒的LPS组成，并且凭借新的、可诱导的遗传自杀机制和DAP营养缺陷型基本上消除任何体内活的污染性亲本细胞。在一些实施方案中，VAX-IPD细菌小细胞被用于体外和体内靶向和更有效地递送白喉毒素的催化片段。例如，在侵袭素、PFO和白喉毒素的催化片段(片段A)中所有3种均存在下，观察到最佳的杀伤活性。并且，VAX-IPD对所有3种组分具有相似的要求，以在已知表达活化的β1整合素的一组鼠和人内皮及肿瘤细胞类型中发挥广谱效应。令人吃惊地，同样已知表达β1整合素的HL60细胞不受VAX-IPD影响。这一结果是出人意料的，并且在进一步回顾文献后，发现HL60细胞表达β1整合素，但为未活化的形式。然而，已得到充分定征的侵袭素活性从未报导为依赖于β1激活状态本身。该出人意料的结果可能还导致缺乏体内显示的预期的毒性，因为β1整合素表达于许多组织类型中(虽然在大多数情况下以非常低的水平表达)，并且还是以配体结合的或未活化的形式被发现。重要的是，观察到VAX-IPD小细胞能够预防或消除转移，以及发挥初步的体内抗肿瘤效应。还观察到了关于活性和毒性的类似结果，虽然是在不同的模型中。
[0120] 蛋白G为革兰氏阳性细菌G群链球菌表达的细胞表面蛋白。其天然生物功能为通过结合抗体的Fc区防止感染过程中G群链球菌的调理素作用，使得所述Fc区被掩蔽于免疫系统外。蛋白G包含两个Fc结合结构域。在一些实施方案中，所述小细胞没有蛋白G的Fc结合部分。在一些实施方案中，所述小细胞不显示蛋白G的Fc结合部分。
[0121] 蛋白A为革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表达的细胞表面蛋白。如同蛋白G，其天然生物功能也为防止感染过程中金黄色葡萄球菌的调理素作用。金黄色葡萄球菌使用蛋白A结合抗体的Fc区。蛋白A包含4个离散的Fc结合结构域。在一些实施方案中，所述小细胞没有蛋白A的Fc结合部分。在一些实施方案中，所述小细胞不显示蛋白A的Fc结合部分。
[0122] 在一些实施方案中，本文公开的小细胞不包含抗体或含有抗体的Fc区的其他分子。在一些实施方案中，本文公开的小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子。
[0123] 一些实施方案提供了产VAX-P小细胞的细菌，其包含：(i)编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；以及(ii)能够功能性表达产气荚膜梭菌溶素O的重组表达盒。在一些实施方案中，所述细菌不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子，并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。在一些实施方案中，产VAX-P小细胞的细菌还包含以下中的一种或多种：(iii)编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述产小细胞的细菌的染色体包含核酸内切酶的一个或多个识别位点；(iv)确定的营养缺陷型；以及(v)lpxM/msbB基因(或其他功能等同物)中的缺失或突变。在一些实施方案中，产小细胞的基因为细胞分裂基因。细胞分裂基因的实例包括但不限于：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。在一些实施方案中，产小细胞的基因在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，核酸内切酶自杀基因位于产小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶为归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶的实例包括但不限于：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，核酸内切酶在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。在一些实施方案中，缺失或失活突变位于dapA基因或其功能同系物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码的基因产物造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生改变的脂质A分子。在一些实施方案中，相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，改变的脂质A分子关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷型的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的。在一些实施方案中，产VAX-P小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：
空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳博代氏杆菌、布鲁氏菌、兔热病弗朗西斯氏、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟氏菌、克雷伯氏菌、耶尔森菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟氏菌、嗜肺军团菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。在一些实施方案中，产VAX-P小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：葡萄球菌、乳酸杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、艰难梭菌和蜡样芽孢杆菌。
空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳博代氏杆菌、布鲁氏菌、兔热病弗朗西斯氏、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟氏菌、克雷伯氏菌、耶尔森菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟氏菌、嗜肺军团菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。在一些实施方案中，产VAX-P小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：葡萄球菌、乳酸杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、艰难梭菌和蜡样芽孢杆菌。
[0124] 一些实施方案提供了产VAX-IP小细胞的细菌，其包含：(i)编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；以及(ii)除表达产气荚膜梭菌溶素O外还能够功能性表达和表面显示侵袭素的重组表达盒。在一些实施方案中，细菌不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子，并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。在一些实施方案中，产VAX-IP小细胞的细菌还包含以下中的一种或多种：(iii)编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述产小细胞的细菌的染色体包含核酸内切酶的一个或多个识别位点；(iv)确定的营养缺陷型；和(v)lpxM/msbB基因(或其他功能等同物)的缺失或突变。在一些实施方案中，产小细胞的基因为细胞分裂基因。细胞分裂基因的实例包括但不限于：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。在一些实施方案中，产小细胞的基因在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，核酸内切酶自杀基因位于产小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶为归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶的实例包括但不限于：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，核酸内切酶在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。在一些实施方案中，缺失或失活突变位于dapA基因或其功能同系物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码的基因产物造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生改变的脂质A分子。在一些实施方案中，相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，改变的脂质A分子关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷型的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的。在一些实施方案中，产VAX-IP小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳博代氏杆菌、布鲁氏菌、兔热病弗朗西斯氏、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟氏菌、克雷伯氏菌、耶尔森菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟氏菌、嗜肺军团菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。在一些实施方案中，产VAX-IP小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：葡萄球菌、乳酸杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、艰难梭菌和蜡样芽孢杆菌。
[0125] 一些实施方案提供了产VAX-IPD小细胞的细菌，其包含：(i)编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种；和(ii)除表达产气荚膜梭菌溶素O和白喉毒素的催化片段(片段A)外，还能够功能性表达和表面显示侵袭素的重组表达盒。在一些实施方案中，细菌不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子，并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。在一些实施方案中，产VAX-IPD小细胞的细菌还包含以下中的一个或多个：(iii)编码异源核酸内切酶的可表达的“遗传自杀”基因，其中所述产小细胞的细菌的染色体包含核酸内切酶的一个或多个识别位点；(iv)确定的营养缺陷型；和(v)lpxM/msbB基因(或其他功能等同物)中的缺失或突变。在一些实施方案中，产小细胞的基因为细胞分裂基因。细胞分裂基因的实例包括但不限于：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。在一些实施方案中，产小细胞的基因在可诱导的启动子控制下表达。在一些实施方案中，核酸内切酶自杀基因位于产小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶为归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶的实例包括但不限于：I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，核酸内切酶在可诱导的启动子的控制下表达。在一些实施方案中，营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。在一些实施方案中，缺失或失活突变位于dapA基因或其功能类似物中。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良。在一些实施方案中，失活的基因为lpxM/msbB，其编码造成细菌产生相比相应的野生型细菌中的脂质A分子发生改变的脂质A分子的基因产物。在一些实施方案中，相比相应的野生型细菌中的脂质A分子，改变的脂质A分子关于添加肉豆蔻酸至脂多糖分子的脂质A部分为缺陷型的。在一些实施方案中，产小细胞的细菌还包含参与同源重组的基因中的缺失或失活突变，其中所述基因相比相应的野生型基因经遗传改良，其中所述产小细胞的细菌为DNA损伤修复缺陷型的。在一些实施方案中，产VAX-IPD小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌，包括但不限于：空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳博代氏杆菌、布鲁氏菌、兔热病弗朗西斯氏、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟氏菌、克雷伯氏菌、耶尔森菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟氏菌、嗜肺军团菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。在一些实施方案中，产VAX-IPD小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌，包括但不限于：葡萄球菌、乳酸杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、艰难梭菌和蜡样芽孢杆菌。
[0126] 关于加载免疫调节性多肽(例如，细胞因子、蛋白毒素和细胞溶素)以及核酸(例如，双链RNA、发卡RNA、双链线性DNA)，小细胞具有独特的机制和优势。例如，免疫调节性产小细胞的亲本细菌细胞可用于在制备小细胞之前或同时重组表达/产生一种或多种细胞因子、蛋白毒素和细胞溶素。将重组多肽表达、隔离并包封在小细胞中，然后用于促进、调控和/或稳定免疫调节性小细胞在体内引发的Th1或Th2免疫反应。可通过技术人员已知的重组表达方法的任何组合，来促进可包括但不限于产气荚膜梭菌溶素O和侵袭素的各种免疫调节性小细胞蛋白组分的重组产生。通过非限制性实例的方式，可从编码特定蛋白组分如侵袭素的位于染色体的可操作连接的开放阅读框来促进重组表达。可通过使用一种或多种附加型原核表达构建体如质粒、粘粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)来促进免疫调节性小细胞的蛋白组分的重组表达。编码最终的免疫调节性小细胞产品的单个所需蛋白组分的可操作连接的原核开放阅读框，可存在于相同的附加型表达构建体或单独的或不同的附加型表达构建体上。产生的所需的蛋白组分可置于可诱导的原核启动子控制下，或者可置于组成性活性原核启动子系统的控制下。本领域技术人员可容易地鉴别适合用于本发明的原核启动子系统。启动子系统的实例包括但不限于：IPTG可诱导的Lac系统及其无数的衍生物，L-鼠李糖可诱导的pRHA系统、L-阿拉伯糖可诱导的pBAD系统、T7聚合酶系统、CI857ts系统等。制备产VAX-IP小细胞的菌株和来自其的VAX-IP小细胞的一个非限制性实施方案示出在实施例6和图8中。
[0127] 在由亲本细胞通过从原核表达盒重组表达(位置为染色体的或附加型的)然后包装在小细胞内部作为免疫增强剂而预先形成多肽的情况下，可通过使用具有在负责蛋白水解的蛋白酶基因(例如，大肠杆菌的lon蛋白酶)中的一个或多个缺失或其他非功能性突变的免疫调节性产小细胞的细菌菌株，来增加小细胞中多肽的半衰期。在没有蛋白酶的情况下，蛋白毒素分子累积至较高的水平，从而增加靶向的小细胞递送治疗性多肽分子的效力。在大肠杆菌的产小细胞的菌株的情况下，可将突变或缺失引入至以下中的一种或多种：lon、tonB、abgA、ampA、ampM、pepP、clpP、dcp、ddpX/vanX、elaD、frvX、gcp/b3064、hslV、hchA/b1967、hyaD、hybD、hycH、hycI、iadA、ldcA、ycbZ、pepD、pepE、pepQ、pepT、pmbA、pqqL、prlC、ptrB、sgcX、sprT、tldD、ycaL、yeaZ、yegQ、ygeY、yggG、yhbO、yibG、ydpF、degS、ftsH/hflB、glpG、hofD/hopD、lepB、lspA、pppA、sohB、spa、yaeL、yfbL、dacA、dacB、dacC、degP/htrA、degQ、iap、mepA、nlpC、pbpG、tsp、ptrA、teas、umuD、ydcP、ydgD、ydhO、yebA、yhbU、yhjJ和nlpD基因。
[0128] 在由亲本细胞通过从原核表达盒重组表达(位置为染色体的或附加型的)然后包装在小细胞内部作为免疫增强剂的方式而预先形成免疫调节性核酸的情况下，通过使用在具有负责双链RNA降解的核酸酶基因(例如，大肠杆菌的rnc核酸酶)中的一个或多个缺失或者其他非功能性突变的免疫调节性产小细胞的细菌菌株，来增加小细胞中的核酸的半衰期。在没有核酸酶的情况下，免疫调节性核酸分子累积至较高的水平，从而增加了具有所述免疫调节性核酸分子的免疫调节性小细胞的效力。
[0129] 为了将免疫调节性小细胞用作人的免疫治疗剂，所述小细胞应当包含很少的或者没有污染物，如活的亲本细菌细胞。活的污染细胞和其他污染物的水平必须足够低，使得不会在患者中造成不利的副作用或干扰小细胞活性。归巢核酸内切酶基因的可诱导的表达(称为遗传自杀机制)，是消除活的污染亲本细胞的优选机制，特别是在联合常规过滤方法使用时。因为小细胞来源于一些致病性的或有机会致病的细菌，可取的是在系统性且特别是静脉内给药前从给定群体中功能性消除污染性亲本细胞。这对经膀胱内给药至已接受了TURBT手术的非肌肉侵入性膀胱癌患者也是一样的，特别是在膀胱中的穿孔已发生或疑似发生时。因此，所需的小细胞制剂为这样的制剂，其中残留的活亲本细胞计数尽量少，以便不造成不利的副作用或干扰期望的小细胞活性。为了将安全性最大化并限制由于任何污染性亲本细胞的存活而产生的毒性，本文公开的小细胞来源于包含安全特性的产小细胞的菌株，例如，下文公开的3种安全特性中的一种或多种。在一些实施方案中，产小细胞的菌株包含至少这3种协同性的安全特性。第一种为遗传自杀机制，其在完成小细胞形成步骤后杀伤残留的活亲本细胞而不将其溶解(并排出游离的脂多糖)。本申请包括使用调控的遗传自杀机制，其在暴露至合适的诱导物后诱导产小细胞的亲本细胞染色体的不可修复的损伤，如美国专利公开第20100112670号中所描述的。自杀机制运行以在亲本细胞的染色体中引入不可修复的双链破坏，并可用作常规分离技术的辅助来改善小细胞纯化。第二种安全特性为确定的营养缺陷型，优选但未必在二氨基庚二酸(DAP)生物合成通路中，并且最优选在大肠杆菌的产小细胞的菌株的dapA基因中。展现DAP营养缺陷型(dapA-)的大肠杆菌的产小细胞的菌株，在实验室外不补充DAP时不能存活。此外，DAP未在哺乳动物包括人中发现，并因此，存在于小细胞产品中的任何产小细胞的亲本细胞在环境中或在体内将不能存活。不同的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌存在关于这一主题的许多变异。例如，在沙门氏菌(Salmonella,spp.)中，芳香族氨基酸生物合成通路(aro基因)的营养缺陷型产生效果相同的结果。在志贺氏菌的情况下，鸟嘌呤生物合成通路的营养缺陷型将产生效果相同的结果。第三种安全特性是可选的，并引起在大肠杆菌的产小细胞的菌株中lpxM基因的缺失。lpxM基因的缺失可引起解毒的脂多糖(LPS)分子的产生。lpxM基因(也称为msbB基因)功能为添加末端肉豆蔻酸基团至LPS分子的脂质A部分，而去除该基团(通过清除lpxM基因的方式)造成明显的LPS解毒。具体而言，解毒的特征在于响应暴露至LPS而使产生的促炎性细胞因子减少。本领域技术人员应理解，仍然可使用解毒形式的LPS产生细胞因子。解毒仅控制产生的细胞因子的水平，使得可能抑制急性败血症样促炎性反应，同时允许实现更有力的Th1和/或Th2免疫反应而不产生明显的毒性。该缺失可被引入至任何革兰氏阴性或革兰氏阳性产小细胞菌株的任何功能等同的基因，以实现相同的效应。增加的安全特性可减少感染风险和发展败血症可能性、减少通过与其他细菌的重组事件而遗传回复的可能性，以及将宿主中的插入事件的风险降低最低。从管理和生产的角度，优选从产小细胞的亲本细胞菌株的细菌染色体消除抗生素抗性标记。为了符合美国食品和药物管理局(FDA)针对用于人规定的管理要求，大多数抗生素抗性基因标记在细菌的产小细胞的菌株中的应用是不可取的。FDA仅允许为选择细菌或细菌生产菌株的目的使用卡那霉素抗性基因标记，其中终产物旨在用于人。
[0130] 一些实施方案提供了制备免疫调节性小细胞的方法，包括培养本文公开的合适的免疫调节性产小细胞的细菌，以及从所述产小细胞的亲本细胞基本上分离免疫调节性小细胞，从而生成包含免疫治疗性小细胞的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括从产小细胞的亲本细胞的培养物诱导免疫调节性小细胞形成。在一些实施方案中，所述方法还包括诱导编码遗传自杀性核酸内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，小细胞形成通过选自以下的一种或多种化合物的存在来诱导：异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四环素。在一些实施方案中，编码遗传自杀性核酸内切酶的基因的表达，通过温度变化来诱导。在一些实施方案中，所述方法还包括从组合物纯化免疫调节性小细胞。在一些实施方案中，免疫调节性小细胞基本上通过选自但不限于以下的方法来与亲本细胞分离：离心、过滤、超滤、超速离心、密度梯度、免疫亲和、免疫沉淀和前述纯化方法的任何组合。
[0131] 一些实施方案提供了包含外膜的真细菌小细胞，其中外膜的脂多糖成分包含没有肉豆蔻酸部分的脂质A分子(“解毒的脂多糖”或“解毒的LPS”)。相比通过来源于相应的野生型细菌的真细菌小细胞的外膜诱导的炎症反应，解毒的LPS造成哺乳动物宿主中的促炎性免疫反应减少。
[0132] 本公开描述了免疫调节性真细菌小细胞的新应用，其目的是为了以这样的方式刺激免疫系统，即使得除任何直接的抗肿瘤效应外具有完全或部分由免疫反应介导的有效的间接抗肿瘤效应。例如，本文公开的免疫调节性小细胞可用作非肌肉侵入性膀胱癌的膀胱内治疗。
[0133] 1.小细胞产生
[0134] 小细胞为破坏正常细胞分裂装置后由细菌形成的非染色体的、膜包封的生物纳米粒子(直径约250-500nm，取决于使用的菌株类型和生长条件)。本质上，小细胞为正常细菌细胞的小的、具有代谢活性的复制品，除了它们不包含染色体DNA并因此为非分裂性和非活的外。尽管小细胞不包含染色体DNA，已显示质粒DNA、RNA、天然和/或重组表达的蛋白以及其他代谢物均被隔离在小细胞中。
[0135] 染色体复制和细胞分裂之间协调的破坏引起从大多数杆状原核生物的极性区域形成小细胞。可通过参与隔膜形成和二分裂的一些基因的过表达，促进染色体复制和细胞分裂之间协调的破坏。可选地，可在具有参与隔膜形成和二分裂的基因中的突变的菌株中制备小细胞。受损的染色体分离机制还可引起许多在不同的原核生物中所显示的小细胞形成。
[0136] 类似地，可通过参与将新生的染色体隔离在子细胞中的基因的过表达或突变来实现小细胞制备。例如，已证明大肠杆菌的parC或mukB位点的突变能产生小细胞。二者均影响肠杆菌科(Enterobacteriacea)的染色体分离过程中的分离所必需的步骤。可以假定如同上述的细胞分裂基因，操控参与引起小细胞产生的染色体分离过程的任意给定基因的野生型水平具有在其他家族成员中相似的效应。
[0137] 因为细胞分裂和染色体复制过程对生存如此重要，在原核家族成员中存在关于负责这些过程的基因的高水平遗传和功能上保守。结果，能够驱动在一个家族成员中产生小细胞的细胞分裂基因的过表达或突变可用于在另一个中制备小细胞。例如，已表明在其他肠杆菌科成员如沙门氏菌和志贺氏菌以及其他类型成员如假单胞菌中的大肠杆菌ftsZ基因的过表达，将引起相似水平的小细胞产生。
[0138] 可在肠杆菌科的基于突变的产小细胞菌株中证明相同的结果。例如，任何肠杆菌科成员中的min位点的缺失均引起小细胞产生。来自其中的突变可引起小细胞形成的肠杆菌科的细胞分裂基因包括但不限于min基因(MinCDE)。虽然来自min突变菌株的小细胞产生是可能的，这些菌株根据作为生产菌株的商业价值有限。其原因在于，具有min基因内的缺失或突变的菌株使得小细胞处于组成性的低水平。这在商业化和规模经济方面存在两个问题。第一个问题为从这些菌株产生的小细胞较低，这增加了生成成本。第二个问题为小细胞产率随突变株为高度可变的，并且批次间变异对生产成本、制造质量控制和管理遵从具有巨大的影响。使用细胞分裂突变菌株以制备包封有生物活性分子如蛋白、RNA、DNA和其他代谢物的小细胞，从而用于诊断或治疗递送存在着问题。突变菌株中小细胞产生的起始不可控，并且以低水平发生，使得最终结果为一些小细胞不包含生物活性分子，而其他则包含广泛可变量的生物活性分子。这些缺点一起或单独考虑时极大地限制了这些突变菌株用于商业目的的应用。
[0139] 过表达细胞分裂基因(“过表达物”)的产小细胞的菌株相比基于突变的菌株是优选的，因为产小细胞的表型可控，只要将待过表达的细胞分裂基因置于可诱导的或其他条件性活性真细菌启动子系统的控制下。从过表达细胞分裂基因ftsZ的菌株制备小细胞由研究人员使用基于质粒的互补研究鉴定大肠杆菌中的必要细胞分裂基因时发现。在这些研究中，ftsZ基因在每个细胞中存在超过10个拷贝。证明ftsZ的多基因拷贝的存在能产生小细胞和特别长的丝状细胞。最后，至不可逆的丝状表型的这一转变消极地影响由过表达来自多拷贝质粒的ftsZ的菌株产生小细胞，尽管产生的小细胞数仍然高于任何突变菌株的数目。因此，已证明，通过将ftsZ基因拷贝数减少至单个染色体复制，产生的小细胞数增加至超过其中ftsZ位于多拷贝质粒上的那些菌株，并且丝状表型较不显著。因此，优选的组合物为这样的产小细胞的菌株，其能够可诱导地过表达来自重复的染色体整合ftsZ拷贝的ftsZ基因。所用重复的ftsZ基因可直接来源于这样的细菌物种，其中产小细胞的表型经改造且也能够来源于来自细菌其他物种的ftsZ基因序列。通过非限制性实例的方式，大肠杆菌ftsZ基因的过表达可用于从大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌产生小细胞。产生的菌株由野生型ftsZ基因和染色体上单独的、二重拷贝的和可诱导的ftsZ基因拷贝，以及美国专利公开第2010/0112670号中描述的可诱导的遗传自杀机制组成，其通过引用整体并入本文中。通过非限制性实例的方式，可被过表达以产生肠杆菌科的小细胞的分裂基因包括但不限于：ftsZ、minE、sulA、ccdB和sfiC。优选的组合物具有在稳定整合至给定真细菌菌株的染色体中的可诱导启动子控制下二重拷贝的细胞分裂基因。容易被本领域技术人员认可的是，如果可诱导的细胞分裂基因盒存在于细胞中的质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、重组噬菌体或其他附加型DNA分子上，则可实施这一相同的策略。
[0140] 这一通往小细胞产生的可诱导表型途径相比突变系统具有几个独特的优势。第一个优势是因为在这些菌株中没有组成性遗传突变，正常生长期间不存在选择压力，并且培养物的细胞维持非常稳定和正常的生理，直到诱导了小细胞表型。最终结果为可诱导的产小细胞菌株更健康且更稳定，其最终产生更高收率的小细胞。使用通往小细胞产生的可诱导表型途径的另一独特优势为在如下情况下，其中使用小细胞来递送可由产小细胞的亲本细胞产生的生物活性分子如蛋白、治疗性RNA、质粒DNA和其他生物活性代谢物，以便所产生的小细胞能包封那些生物活性分子。在这些情况下，优选的方法为在诱导小细胞表型之前，诱导在亲本细胞中形成生物活性分子，以便产生的所有小细胞都包含所需量的生物活性分子。可选地，小细胞自身能够在从亲本细胞分离后产生生物活性分子。这包括但不限于，从编码位于小细胞中的生物活性分子的附加型核酸或RNA或在从亲本细胞分离后通过小细胞的先已存在的蛋白组分形成生物活性分子。这些表达策略中的任何一种均可用于在小细胞的表面上表达和显示结合部分。当组合使用时，这些优势产生较高质量和数量的小细胞。另外，这些小细胞还可包含可加载至小细胞中的小分子药物，如下文中更详细描述的。
[0141] 2.小细胞纯化
[0142] 因为小细胞来源于为病原性或机会病原性细菌的一些细菌，最重要的是在给药前从给定群体功能性清除任何污染性亲本细胞。常规上，已通过物理方式或生物方式或二者来消除活的亲本细胞。
[0143] 物理方式包括使用基于离心的分离方案、过滤方法、色谱方法或以上方法的任意组合。
[0144] 通过但不限于如下方法来实现生物消除：优先溶解亲本细胞、使用营养缺陷型亲本菌株、以抗生素处理、以UV辐照处理、二氨基庚二酸(DAP)去除、选择性吸附亲本细胞、以其他DNA破坏试剂处理和诱导自杀基因。
[0145] 通常通过诱导溶源性前噬菌体的裂解周期来介导亲本细胞的优先溶解。在产小细胞的菌株的情况下，最有用的是使用溶解感受态的但为重复感染缺陷型的前噬菌体，以便小细胞随后不被感染并在溶解的表型的激活期间溶解。可选地并以非限制性实例的方式，可表达单个基因如归类为holin基因家族成员的那些，以实现相似水平的溶解而不用担心使用溶原性前噬菌体所固有的重复感染。两种方法均受限于以下事实：到溶解事件(不管用于实现其的方法)将不可接受量的游离内毒素排除至培养基中。如此大量的游离内毒素的去除是很耗时的，具有批次间变异，并最终成本高昂。
[0146] 营养缺陷型菌株的使用引起了关于回复的担忧，并因此仅可用于从细菌的共生或非病原菌株制备小细胞的情形下。因此，其应用关于被用作消除用于小细胞制备的活的非病原亲本细胞的方法具有局限性。
[0147] 小细胞产生运行时以UV照射处理可用于消除活的亲本细胞，除了UV照射对核酸的影响是随机的并且结果在批次间高度可变这一事实外。另外，当使用小细胞递送治疗或预防性核酸时这一方法并非优选的，因为UV照射随机破坏所有核酸。例如，质粒DNA也对UV照射造成的DNA损伤高度敏感，并且可变得无效，尽管仍然可被小细胞有效递送。
[0148] 二氨基庚二酸(DAP)去除可用于消除活的亲本细胞，除了这一方法受到其可被利用的物种数目的限制外。换句话说，并非所有能够产生小细胞的亲本细胞物种的生存都需要DAP。大肠杆菌产小细胞的菌株中的DAP突变体具有很大的优势，并且在一些情况下相比野生型为优选的。使用DAP的优势在于，该化合物(二氨基庚二酸，大肠杆菌细胞壁组成物)对大肠杆菌的生长至关重要，并且不存在于动物中或不由动物产生。因此，当连同靶向的小细胞一起给予“活的”大肠杆菌产小细胞的亲本细胞时，亲本细胞将不能够生长，并因此对动物且关于小细胞活性为惰性的。可使用基于沙门氏菌的产小细胞的亲本菌株的相似方法，除了在去除了aro基因优选aroB的情况下外。
[0149] 尚有待于开发关于从活的亲本细胞纯化小细胞的选择性吸附方法。选择性吸附确定为亲本细胞或小细胞凭借其对基质的亲和力优先吸附至基质的任何过程。通过非限制性实例的方式，可开发高亲和力蛋白-蛋白相互作用以用于这一应用。通过非限制性实例的方式，新的小细胞外膜蛋白Lpp-OmpA::蛋白A对大多数抗体的Fc区具有高亲和力。可容易地将置于可诱导的启动子控制下的编码Lpp-OmpA::蛋白A的基因引入至免疫调节性产小细胞菌株的染色体上。可在激活侵袭素基因的表达前，从该菌株产生免疫调节性小细胞，以便产生的小细胞在其细胞表面上不表达或显示Lpp-OmpA::蛋白A。一旦从所述菌株产生所需量的免疫调节性小细胞，即可给予培养物中的活细胞信号来产生Lpp-OmpA::蛋白A蛋白，以便在活细胞上仅表达和显示Lpp-OmpA::蛋白A。一旦Lpp-OmpA::蛋白A优先表达于活的亲本细胞的表面上，它们即可容易地吸附至包被有抗体或其他包含Fc区的蛋白的基质。一旦吸附，即可通过基于所用基质类型的不同方式从活的亲本细胞选择性纯化小细胞。基质包括但不限于用于重力过滤应用、磁珠、离子交换柱或HPLC柱的固相色谱柱。
[0150] 在一些实施方案中，从包含小细胞的组合物中的产小细胞的亲本细胞大幅分离了小细胞。例如，分离后，包含小细胞的组合物的大于约99.9％、99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、
81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、
50％、45％、40％、35％或30％没有产小细胞的亲本细胞。在一些实施方案中，组合物包含小于约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、
15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或
30％的产小细胞的亲本细胞。
81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、
50％、45％、40％、35％或30％没有产小细胞的亲本细胞。在一些实施方案中，组合物包含小于约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、
15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或
30％的产小细胞的亲本细胞。
[0151] 优选地，最终的组合物包含足够少的活的或死的污染性亲本细胞，以便体内给药用于治疗目的时不会太毒或干扰靶向的小细胞的活性。
[0152] 充分消除污染性活的亲本细菌细胞或阻止其体内存活的一种优选方法为通过并入可诱导的遗传自杀机制，包括但不限于归巢核酸内切酶或其功能等同物的激活和表达，如美国专利申请第20100112670号中所述的。
[0153] 3.将小细胞靶向特定的细胞、组织和器官
[0154] 在制备和随后的纯化后，VAX-IP、VAX-IPT、VAX-IPP、VAX-IPD、VAX-IPG、VAX-IPPA和VAX-IPR小细胞可用作靶向的递送载体，以靶向具有增加的β1-整合素表达和/或活性并且在体内与疾病相关的特定细胞类型，从而优先并更有效地递送其蛋白毒素负载至靶向的组织、器官和细胞类型。可将本文公开的靶向的VAX-IP、VAX-IPT、VAX-IPP、VAX-IPD、VAX-IPG、VAX-IPPA和VAX-IPR小细胞靶向真核癌细胞特异性的表面抗原，其包括但不限于整合素α3β1、整合素α4β1、整合素α5β1、整合素α6β1、整合素αvβ1和整合素β1。如下文中更详细描述的，相比正常组织和脉管系统中的低水平、未活化和/或配体占据的β1整合素，在许多实体瘤类型以及肿瘤脉管系统中发现了这些β1整合素家族成员的表达和/或活性水平。
[0155] 4.加载负荷至小细胞中
[0156] 真细菌小细胞能够包封和递送对动物具有治疗、预防或诊断效应的几种类型生物活性化合物。可通过小细胞递送的生物活性化合物(负载)类型包括但不限于：小分子(包括小分子药物)、核酸、多肽、放射性同位素、脂质、脂多糖及以上物质的任意组合。
[0157] 蛋白由多肽组成并且由DNA编码。蛋白可为生物上具有功能的，如酶、毒素或信号传导蛋白。蛋白可为结构的，如肌动蛋白等的情况。蛋白可紧密结合至其他蛋白如抗体和抗体模拟物，并用于破坏需要蛋白/蛋白相互作用的功能。蛋白可通过为荧光或生物发光的而提供定位信号。蛋白可用作免疫原或用于其他治疗目的(如供应或修复在靶细胞、组织、器官或动物中的酶)。蛋白能够协助其他负载类型的内吞后细胞内转移。例如，可采用来自单核细胞增多性李斯特氏菌的蛋白如李斯特溶素O，来促进从靶细胞的內吞小泡(endocytotic compartment)转移小细胞负载至靶细胞的胞液。蛋白也可为前药转化酶。一种非限制性的优选重组表达/产生的蛋白毒素为产气荚膜梭菌溶素O。通过靶向的小细胞递送的其他重组表达/产生的治疗性多肽包括但不限于：蛋白毒素、胆固醇依赖性细胞溶素、功能酶、抗体模拟物、蛋白/蛋白相互作用破坏物、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽以及前述各种物质的任意组合。重组表达治疗性多肽可产生于来自本领域已知的各种附加型重组原核表达载体(包括但不限于：质粒、粘粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)以及前述各种物质的任意组合)中的任何一种的表达。以类似的方式，可通过存在于产小细胞的亲本细胞染色体一个或多个拷贝中的位于染色体的原核表达盒实现重组表达。可通过技术人员已知的重组表达方法的任意组合促进重组产生各种免疫调节性小细胞蛋白组分(包括但不限于产气荚膜梭菌溶素O和侵袭素)。通过非限制性实例的方式，可由编码特定蛋白组分如侵袭素的位于染色体的可操作连接的开放阅读框来促进重组表达。可通过使用一种或多种附加型原核表达构建体如质粒、粘粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)来促进免疫调节性小细胞的蛋白组分的重组表达。编码最终的免疫调节性小细胞产物的单个所需蛋白组分的可操作连接的原核开放阅读框，可存在于相同的附加型表达构建体或者分开的和单独的附加型表达构建体上。可将所需蛋白组分的产生置于可诱导的原核启动子控制下，或者可置于组成性活性的原核启动子系统的控制下。本领域技术人员容易辨认可供使用的原核启动子系统。启动子系统的实例包括但不限：于IPTG可诱导的Lac系统及其无数的衍生物、L-鼠李糖可诱导的pRHA系统、L-阿拉伯糖可诱导的pBAD系统、T7聚合酶系统、CI857ts系统等。通过非限制性实例的方式，包括得到VAX-IP产小细胞的菌株和来自其的VAX-IP小细胞的具体方法，如实施例6和图8所示。
[0158] 蛋白毒素的实例包括但不限于：产气荚膜梭菌溶素O、白树毒素、白喉毒素片段A、白喉毒素片段A/B、破伤风毒素、大肠杆菌热不稳定毒素(LTI和/或LTII)、霍乱毒素、产气荚膜梭菌(C.perfringes)Iota毒素、假单胞菌外毒素A、志贺毒素、炭疽毒素、MTX(球形芽胞杆菌(B.sphaericus)灭蚊毒素)、链球菌溶素、大麦毒素、蜂毒肽、炭疽毒素LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、肉毒杆菌溶素B、肉毒杆菌溶素E3、肉毒杆菌溶素C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳S1毒素、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、李斯特溶素O的pH稳定变体(独立于pH的；氨基酸替换L461T)、李斯特溶素O的热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K)、李斯特溶素O的pH和热稳定变体(氨基酸替换E247M、D320K和L461T)、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、链球菌溶素O、链球菌溶素O c、链球菌溶素O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素O、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素O、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素O、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素O、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。蛋白毒素可位于小细胞的不同亚细胞隔室，这由技术人员自由裁定。当本文公开的靶向的小细胞来源于革兰氏阴性亲本产小细胞的菌株时，从其产生的重组表达的治疗性多肽可位于胞液、内膜的内叶、内膜的外叶、周质、外膜的内叶、小细胞的外膜以及前述各种的任意组合。当本文公开的靶向的小细胞来源于革兰氏阳性亲本产小细胞的菌株时，从其产生的重组表达的治疗性多肽可位于胞液、细胞壁、膜的内叶、小细胞的膜以及前述各种的任意组合。
[0159] 5.药物组合物
[0160] 本申请还涉及组合物，包括但不限于药物组合物。本文所用的术语“组合物”是指包含至少一种载体，优选生理上可接受的载体，以及一种或多种小细胞组合物的混合物。本文所用的术语“载体”是指不抑制或阻止掺入生物活性肽至细胞或组织中的化合物。载体通常为惰性物质，其允许将活性成分配制或化合至合适的剂型(例如，丸剂、胶囊、凝胶、薄膜、片剂、微粒(例如，微球)、溶液；油膏；糊剂、气溶胶、液滴、胶质或乳剂等)中。“药学上可接受的载体”为适合在生理条件下使用的载体，其不消除(减少、抑制或阻止)化合物的生物活性和特性。例如，二甲亚砜(DMSO)是载体，因为其促进摄取许多有机化合物至生物体的细胞或组织中。优选地，所述载体为生理上可接受的载体，优选药学上或兽医上可接受的载体，其中配置有所述小细胞组合物。
[0161] “药物组合物”是指这样的组合物，其中载体为药学上可接受的载体，而“兽用组合物”是其中载体为兽医上可接受的载体的组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”或“兽医上可接受的载体”包括不为生物学上或其他方面不良的任何介质或物质，即所述载体可连同小细胞组合物一起给予至生物体而不造成任何不良生物效应或以不利的方式与复合物或任何其组分或生物体相互作用。药学上可接受的试剂的实例提供在United States Pharmacopeia,The National Formulary,United States Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville,Md.1990中，其通过在本文中进行引用并入本申请中。术语“治疗有效量”和“药学有效量”是指足以在生物体的靶标细胞、组织或身体中诱导或实现可测量的反应的量。构成治疗有效量的内容取决于多种因素，熟练的从业人员需要对其加以考虑以达到所需的剂量方案。
[0162] 组合物也可包含其他化学成分，如稀释剂和赋形剂。“稀释剂”为稀释于溶剂，优选水性溶剂中的化合物，其可促进所述组合物溶解于所述溶剂中，并且其还可用于稳定所述组合物或者其一种或多种组分的生物活性形式。溶于缓冲溶液中的盐在本领域中用作稀释剂。例如，优选的稀释剂为包含一种或多种不同盐的缓冲溶液。优选的缓冲溶液的非限制性实例为磷酸盐缓冲盐水(特别是联合用于给药的组合物)，因为其模拟了人血液的盐浓度。由于缓冲盐可用低浓度控制溶液的pH，缓冲的稀释剂很少改变给定化合物或药物组合物的生物活性。
[0163] “赋形剂”为可被添加至组合物中以赋予合适的特性如合适的一致性，或用于制备药物制剂的任何或多或少惰性的物质。合适的赋形剂和载体包括，特别是填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨醇纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、琼脂、果胶、黄原胶、瓜尔豆胶、槐豆胶、透明质酸、酪蛋白马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、聚丙烯酸酯、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，也可包含崩解剂如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，如海藻酸钠。其他合适的赋形剂和载体包括水凝胶、可胶凝的亲水凝胶和壳聚糖。壳聚糖微球和微胶囊可用作载体。参见例如WO 98/52547(其描述了将化合物靶向胃的微球制剂，所述制剂包括含有一种或多种活性成分的内核(任选包含胶凝的水胶体)、由水溶性聚合物(例如，乙基纤维素)组成的膜以控制活性成分的释放速率，以及由生物粘附性阳离子聚合物如阳离子多糖、阳离子蛋白和/或合成的阳离子型聚合物组成的外层；美国专利第4,895,724号。通常，使用合适的试剂如戊二醛、乙二醛、表氯醇和丁二醛交联壳聚糖。可将采用壳聚糖作为载体的组合物配制成各种剂型，包括丸剂、片剂、微粒和微球，包括提供了活性成分的受控释放的那些。其他合适的生物粘附性阳离子聚合物包括：酸性明胶、聚半乳糖胺、聚氨基酸如聚赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚季胺化合物、醇溶谷蛋白、聚亚胺、二乙基氨基乙基葡聚糖(DEAE)、DEAE-亚胺、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-葡聚糖、DEAE-纤维素、聚对氨基苯乙烯、聚氧杂环丁烷、共聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺胺、阳离子型淀粉、聚乙烯基哌啶和聚硫代二乙基氨基甲基乙烯。
[0164] 可以任何合适的方式配制组合物。小细胞组合物可均一地(均质地)或不均一地(异质地)分散于载体中。合适的制剂包括干燥和液体制剂。干燥制剂包括冷冻干燥的和冻干的粉末，其特别适合于气溶胶递送至鼻窦或肺，或在给药前的长期储存然后在合适的稀释剂中重构。其他优选的干燥制剂包括其中本文公开的组合物被压缩成适合经口给药或化合至缓释制剂中的片剂或丸剂形式的那些。当期望通过经口给药将组合物递送至肠上皮时，优选以肠溶衣包封所述制剂，以保护所述制剂并防止过早释放其中包含的小细胞组合物。如本领域技术人员所理解的，可将本文公开的组合物置于任何合适的剂型中。丸剂和片剂代表了这些剂型中的一些形式。也可将组合物包封在任何合适的胶囊或其他包封材料中，例如通过压缩、浸渍、锅包衣、喷雾干燥等。合适的胶囊包括从明胶和淀粉制备的那些。进而，可用例如一种或多种另外的材料和肠溶衣(如果需要)包被这样的胶囊。脂质制剂包括水性制剂、凝胶和乳剂。
[0165] 一些实施方案提供了包含生物粘附性的，优选粘膜粘附性的包衣的组合物。“生物粘附性的包衣”为这样的包衣，相比没有包衣存在时发生的粘附，其允许物质(如小细胞组合物)更好地粘附至生物表面或物质。“粘膜附着包衣”优选为，相比没有包衣存在时发生的粘附，允许物质如组合物更好地粘附粘膜的生物粘附性包衣。例如，可用粘膜附着剂包被小细胞。然后可将经包被的颗粒组装为适合递送至生物体的剂型。优选地，并且取决于待靶向的细胞表面运输部分表达的位置，然后将剂量形式包覆上另一包衣以保护所述制剂直到其到达期望的位置，其中所述粘膜附着剂使得在所述组合物与靶细胞表面运输部分相互作用的同时所述制剂能够被保留。
[0166] 本文公开的组合物可被给予至任何生物体，例如动物，优选哺乳动物、鸟、鱼、昆虫或蛛形纲动物。优选的哺乳动物包括牛、犬、马、猫、绵羊和猪科动物以及非人的灵长类。人是特别优选的。本领域存在给予或递送化合物的多种技术，包括但不限于经口、经直肠(例如，灌肠或栓剂)气溶胶(例如，用于经鼻或经肺递送)、肠胃外和局部给药。优选地，递送足够量的生物活性肽以实现所需的效应。待递送的组合物的具体量取决于许多因素，包括待实现的效应、组合物递送至的生物体类型、递送途径、给药方案和生物体的年龄、健康状况和性别。因此，掺入至给定制剂中的组合物具体剂量留给技术人员自由裁定。
[0167] 本领域技术人员应理解，当作为试剂给予本文共开的组合物以实现所需的特定生物结果(其可包含治疗、诊断或保护效应(包括疫苗))时，可能可以将小细胞组合物与合适的药物载体组合。选择药物载体和制备小细胞作为治疗或保护剂，取决于预期的应用和给药模式。给予治疗剂的合适的制剂和方法包括用于经口、经肺、经鼻、经颊、经眼、经皮、经直肠、静脉内或经阴道递送的那些。
[0168] 根据采用的递送方式，依赖于内容物的功能实体可以各种药学上可接受的形式递送。例如，依赖于内容物的功能实体可掺入丸剂、胶囊、片剂、栓剂、气溶胶、液滴或喷雾剂中以固体、溶液、乳剂、分散剂等形式递送。丸剂、片剂、栓剂、气溶胶、粉剂、液滴和喷雾剂可具有复杂的多层结构，并且具有大范围的尺寸。气溶胶、粉剂、液滴和喷雾剂范围可为小(1微米)至大(200微米)的尺寸。
[0169] 本文公开的药物组合物可以固体、冻干粉、溶液、乳剂、分散剂等形式使用，其中产生的组合物包含本文公开的一种或多种化合物作为活性成分，并且混合有适合肠内或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂。可将活性成分与例如通常无毒、药学上可接受的载体化合，用于片剂、小球、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、悬浮剂和任何其他适合使用的形式。可以使用的载体包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、硅胶、马铃薯淀粉、尿素、中等链长三酸甘油酯、右旋糖酐和其他适合用于制备制剂的固体、半固体或液体形式的载体。另外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂和香料。稳定干燥剂的实例包括丙酮糖(triulose)，优选浓度为0.1％或更大(参见，例如美国专利第5,314,695号)。活性化合物以足以对疾病过程或状况产生所需的效应的量包含在药物组合物中。
[0170] 6.治疗适应证
[0171] 本公开涉及小细胞介导的针对包括但不限于实体瘤、转移瘤和液体瘤的癌症的免疫治疗。实体和转移瘤包括上皮、成纤维细胞、肌肉和骨来源的那些，并且包括但不限于：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、食管癌、膀胱癌、胆囊癌、皮肤癌、子宫癌、阴道癌、阴茎癌和肾癌。其他可以本文公开的免疫调节性小细胞治疗的实体癌症类型包括但不限于：腺癌、肉瘤、纤维肉瘤和眼癌、脑癌和骨癌。可通过本文公开的免疫调节性小细胞治疗的液体瘤包括但不限于：非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病以及其他白血病。
[0172] VAX-P、VAX-IP和VAX-IPD小细胞的体内免疫调节活性示出在图3-6中，并且在实施例2-4中有进一步描述。免疫调节效应有助于包含产气荚膜梭菌溶素O的小细胞制剂如VAX-P、VAX-IP和VAX-IPD小细胞的抗肿瘤特性的第一个体内证据是出人意料的。在进行VAX-IP的发展和体内定征的对照实验中，出人意料地发现，靶向部分侵袭素的去除对体内功效具有很少影响或没有影响(参见图3)。然而，产气荚膜梭菌溶素O组分的去除对小细胞阻止肿瘤生长的能力具有显著的影响。还出人意料地发现，小细胞能够对已定植在雌性小鼠卵巢的肿瘤具有巨大的抗肿瘤效应，即使卵巢中的小细胞为检测不到的(即，未定植)(参见图4&5)。在那些相同的小鼠中，已定植肺的肿瘤也被显著阻止生长，并显示大量的小细胞共定位。总之，这些不同的结果表明，肿瘤定位可能对抗肿瘤效应不是至关重要的，并且可能存在另一总体因素，可能是发挥作用的免疫系统的一些方面。另外，证明包含产气荚膜梭菌溶素O的小细胞对在严重免疫缺陷型的NIH-III小鼠(缺少除T-细胞功能外的NK细胞功能)中生长的肿瘤没有影响(参见图6)。
[0173] 由于按本文所述配制的小细胞的免疫调节效应，本发明的免疫调节性小细胞的一个非限制性但优选的治疗应用为膀胱内给药和治疗非肌肉侵入性膀胱癌。如图7中所示和实施例5中所述，免疫调节性小细胞已在非肌肉侵入性膀胱癌的小鼠模型中显示功效。
[0174] 7.小细胞制剂
[0175] 一些实施方案涉及产生来自但不限于细菌肠杆菌科的优化菌株及制备免疫调节性小细胞。
[0176] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/105个小细6
胞。在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/10个小细胞。
胞。在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/10个小细胞。
[0177] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/107个小细胞。
[0178] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/108个小细胞。
[0179] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/109个小细胞。
[0180] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1010个小细胞。
[0181] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1011个小细胞。
[0182] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1012个小细胞。
[0183] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1013个小细胞。
[0184] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1014个小细胞。
[0185] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1015个小细胞。
[0186] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1016个小细胞。
[0187] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。尽管参照实施方案和实例描述了本申请，应理解，可进行不同的修改而不脱离本发明的精神。本文引用的所有参考文献均通过引用明确地整体并入本文中。
[0188] 在以下实施例中更详细地公开了本申请的实施方案，其不以任何方式试图限制本申请的范围。实施例
[0189] 实施例1
[0190] 产气荚膜梭菌溶素O当通过VAX-IP小细胞靶向和递送时在体外具有细胞毒性，如表1和图2中所示。通过在包含10％的胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI-1640中以25,000个鼠转移细胞癌细胞系MB49接种96孔板，来进行体外实验。第二天，以每只接种的哺乳动物添加1,000:1比率的VAX-IP与VAX-I小细胞(MOI)，将VAX-IP、VAX-I(不包含产气荚膜梭菌溶素O)或重组产气荚膜梭菌溶素O(BTX-100，购自ATCC)添加至细胞。添加的BTX-100浓度等于通过VAX-IP递送的产气荚膜梭菌溶素O的量。最初，将乳酸脱氢酶(LDH)活性测定用作细胞毒性的替代读取，主要是因为LDH活性是哺乳动物细胞膜泄露的公知指示剂，其为报导的产气荚膜梭菌溶素O作用的机制。如同所预期的并且如图1中所示，在暴露至BTX-100后几乎立即从MB49细胞释放鼠乳酸脱氢酶(LDH)。用VAX-IP以1,000:1的MOI处理的MB49细胞也显示LDH活性，尽管释放的起始较慢，可能是由于需要VAX-IP小细胞内化、内体降解启动和通过产气荚膜梭菌溶素O介导的内体膜破坏的方式将产气荚膜梭菌溶素O最终释放至靶细胞。用作对照的VAX-I小细胞未显示明显的LDH释放。令人吃惊地，随后发现以BTX-100处理的细胞到24hr时间点时回复，并且具有完全的活力和粘附性。
另一方面，以VAX-IP小细胞处理的那些MB49细胞从板上脱离并且看起来像死了。为了证实这一结果，重复了相同的实验以针对一系列浓度的BTX-100与一系列VAX-IP小细胞进行比较，但在该情况下于24hr时间点时进行了标准的MTT细胞活力测定。这些实验的结果示出在实施例2中，其清楚地证明当通过小细胞递送时，经细胞内递送正常无毒浓度的产气荚膜梭菌溶素O可能相当有效。
另一方面，以VAX-IP小细胞处理的那些MB49细胞从板上脱离并且看起来像死了。为了证实这一结果，重复了相同的实验以针对一系列浓度的BTX-100与一系列VAX-IP小细胞进行比较，但在该情况下于24hr时间点时进行了标准的MTT细胞活力测定。这些实验的结果示出在实施例2中，其清楚地证明当通过小细胞递送时，经细胞内递送正常无毒浓度的产气荚膜梭菌溶素O可能相当有效。
[0191] 表1
[0192]
[0193] 实施例2
[0194] 包含产气荚膜梭菌溶素O的小细胞体内刺激抗肿瘤免疫调节活性的第一线证据，来自在无胸腺的裸鼠(裸鼠为部分免疫缺陷型的并且缺乏T细胞活性的完整补充)中进行的人异种移植研究。当基于总共6次给药的q3d方案经静脉内给药时，在使用人胰腺癌细胞系BxPC3进行皮下异种移植研究中证明了VAX-IP小细胞的抗肿瘤功效(参见图3)。在3
这一模型中，将肿瘤细胞经皮下植入裸鼠中，并允许达到100mm的大小，然后随机分至处理
8
组。基于总共6次给药的q3d方案，使用盐水媒介、紫杉醇、3.0x10“裸”小细胞(不包含
8
侵袭素或产气荚膜梭菌溶素O的大肠杆菌小细胞)、3.0x10VAX-P小细胞(小细胞表面上不
8
包含侵袭素蛋白)或3.0x10VAX-IP小细胞，经静脉内处理携带肿瘤的小鼠。令人吃惊地，非靶向的对照组VAX-P小细胞(小细胞表面上不包含侵袭素蛋白)与VAX-IP小细胞在阻止该模型中肿瘤生长中同样有效，而“裸”小细胞没有效应。小细胞媒介的表面上没有肿瘤靶向部分时的抗肿瘤活性是完全出人意料的。
这一模型中，将肿瘤细胞经皮下植入裸鼠中，并允许达到100mm的大小，然后随机分至处理
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组。基于总共6次给药的q3d方案，使用盐水媒介、紫杉醇、3.0x10“裸”小细胞(不包含
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侵袭素或产气荚膜梭菌溶素O的大肠杆菌小细胞)、3.0x10VAX-P小细胞(小细胞表面上不
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包含侵袭素蛋白)或3.0x10VAX-IP小细胞，经静脉内处理携带肿瘤的小鼠。令人吃惊地，非靶向的对照组VAX-P小细胞(小细胞表面上不包含侵袭素蛋白)与VAX-IP小细胞在阻止该模型中肿瘤生长中同样有效，而“裸”小细胞没有效应。小细胞媒介的表面上没有肿瘤靶向部分时的抗肿瘤活性是完全出人意料的。
[0195] 实施例3
[0196] 包含产气荚膜梭菌溶素O的小细胞体内刺激抗肿瘤免疫调节活性的第二线证据，来自使用B16F10鼠黑素瘤细胞系的肺和卵巢转移的同系鼠模型。在该模型中，通过尾静脉将组成性表达萤火虫荧光酶的B16F10鼠黑素瘤细胞经静脉内注射至雌性裸鼠中。每3天以荧光素注射小鼠一次，并通过用于检测小鼠肺中建立的转移的存在进行全鼠成像对动物成像。一旦证实了肿瘤确立，即将小鼠随机分至对照组和基于总共6次给药的qd3给药方8
案经静脉内接受盐水媒介或3.0x10个VAX-IPD小细胞。在VAX-IPD小细胞处理的小鼠中，观察到针对肺和卵巢转移的明显的抗肿瘤活性(参见图4)。在使用相同模型和给药方案的第二个和平行定量的基于VAX-IPD质粒特异性PCR的生物分布研究中，我们确定了VAX-IPD位于小鼠的肺和肺部肿瘤中。令人吃惊地，在测试的时间点中，没有VAX-IPD小细胞位于卵巢或卵巢肿瘤(参见图5)。从这两个结果的组合，可推断如果VAX-IPD小细胞没有位于卵巢组织或肿瘤但在该器官位点具有显著的肿瘤抑制效应，一些总体因子(可能是一种或多种免疫因子)必然有助于抗肿瘤活性。
案经静脉内接受盐水媒介或3.0x10个VAX-IPD小细胞。在VAX-IPD小细胞处理的小鼠中，观察到针对肺和卵巢转移的明显的抗肿瘤活性(参见图4)。在使用相同模型和给药方案的第二个和平行定量的基于VAX-IPD质粒特异性PCR的生物分布研究中，我们确定了VAX-IPD位于小鼠的肺和肺部肿瘤中。令人吃惊地，在测试的时间点中，没有VAX-IPD小细胞位于卵巢或卵巢肿瘤(参见图5)。从这两个结果的组合，可推断如果VAX-IPD小细胞没有位于卵巢组织或肿瘤但在该器官位点具有显著的肿瘤抑制效应，一些总体因子(可能是一种或多种免疫因子)必然有助于抗肿瘤活性。
[0197] 实施例4
[0198] 基于上述实施例2和3中进行的体内实验的观察结果，通过比较完全免疫缺陷型C57/BL6小鼠中的VAX-IPD小细胞的抗肿瘤效应与严重免疫缺陷型NIH-III小鼠(与C57/BL6具有相同的遗传背景单缺少T细胞和自然杀伤细胞活性)中的抗肿瘤活性，使用同系的3
B16F10鼠黑素瘤模型确定的皮下肿瘤变异进行了第三项研究。在肿瘤生长至100mm大小
8
后，将小鼠随机分至处理组，并基于总共6次给药的q3d方案经静脉内以盐水或3.0x10个VAX-IPD小细胞进行处理。在最后给药后，将小鼠安乐死，手术切除肿瘤，称重，并对肿瘤荷载评分。图6中示出的结果证明VAX-IPD小细胞在严重免疫缺陷型小鼠中无效。
B16F10鼠黑素瘤模型确定的皮下肿瘤变异进行了第三项研究。在肿瘤生长至100mm大小
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后，将小鼠随机分至处理组，并基于总共6次给药的q3d方案经静脉内以盐水或3.0x10个VAX-IPD小细胞进行处理。在最后给药后，将小鼠安乐死，手术切除肿瘤，称重，并对肿瘤荷载评分。图6中示出的结果证明VAX-IPD小细胞在严重免疫缺陷型小鼠中无效。
[0199] 实施例5
[0200] 在非肌肉侵入性膀胱癌的小鼠模型中起作用的VAX-IP小细胞的能力示出在图7中。在该实验中，将免疫缺陷型雌性C57/BL6小鼠麻醉，进行膀胱导管插入，并其在两个不同的位点使用与铂引导线连接且通过导管插入的电动手术装置(Bovie 940,设置为5W)烧灼膀胱壁。烧灼后，以50μL PBS冲洗膀胱，然后通过导管灌注100,000个MB49鼠转移细胞癌肿瘤细胞。将导管锁定在原处2hr以确保肿瘤粘附至膀胱壁。去除导管并允许动物从麻醉恢复。通过膀胱触诊每天监测动物直到可检测到肿瘤，此时将它们随机分至处理组。7
然后基于总共5次给药的q3d方案，通过导尿管使小鼠接受经膀胱内给予的盐水、5x10个
8
VAX-IP小细胞或1x10个VAX-IP小细胞。然后将动物安乐死，并切除膀胱，称重，并对肿瘤荷载评分。结果证明了VAX-IP小细胞针对该模型中确立的MB49膀胱癌具有强剂量依赖性抗肿瘤效应。
然后基于总共5次给药的q3d方案，通过导尿管使小鼠接受经膀胱内给予的盐水、5x10个
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VAX-IP小细胞或1x10个VAX-IP小细胞。然后将动物安乐死，并切除膀胱，称重，并对肿瘤荷载评分。结果证明了VAX-IP小细胞针对该模型中确立的MB49膀胱癌具有强剂量依赖性抗肿瘤效应。
[0201] 实施例6
[0202] VAX-IP小细胞产生从克隆质粒pVX-336(SEQ ID NO.3)开始。通过定向亚克隆侵袭素至L-鼠李糖可诱导的质粒pVX-128(SEQ ID NO.4,图10中示出的质粒图)的SalI和XbaI位点，构建了pVX-336(图9中示出的质粒图)。在确定阳性克隆后，进行随后的定向亚克隆产气荚膜梭菌溶素O至独特的XbaI and BamHI位点，以产生侵袭素与产气荚膜梭菌溶素O之间的转录融合物(编码两种蛋白侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O的单个原核信使RNA)。在pVX-336的阳性序列确定后，将质粒引入至大肠杆菌的可IPTG诱导的产小细胞的菌株(参见图8示意图的步骤1和图11中以IPTG诱导后产生小细胞的真实菌株)。所述菌株还包含可热诱导的I-ceuI自杀基因的染色体拷贝、dapA基因的缺失(使得亲代菌株不能在实验室外或在哺乳动物中生长)以及lpxM基因的缺失(减弱脂多糖的脂质A组分)。
在引入质粒和于包含10μg/mL二氨基庚二酸及50μg/mL卡那霉素的LB琼脂上进行选择后，使用单个集落开始在包含相同成分的液体LB培养基中于30℃过夜培养生长。第二天，将起始培养物以1/100稀释至包含10μg/mL二氨基庚二酸和50μg/mL卡那霉素的3L新鲜LB培养基中，并于30℃在震荡下培养。通过光密度600(OD 600)监测培养物浊度。当OD
600为0.1时，通过添加L-鼠李糖至终浓度为90μM来诱导培养物，以从pVX-336表达侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O。当OD 600为1.0时，通过添加IPTG至终浓度为100μM来诱导培养物，以用于VAX-IP小细胞形成。允许培养物过夜生长至稳定期，并在第二天使用本领域标准的差速离心步骤和随后的密度梯度纯化的组合来纯化VAX-IP小细胞。一旦纯化，即通过红细胞溶血测定的方式测试小细胞的PFO含量和活性，并通过蛋白质印迹检测侵袭素的存在(参见图12的溶血测定和蛋白质印迹)，其主要的检测抗体为侵袭素特异性的小鼠单克隆IgG2b(mAb3A2)。通过以2mM EDTA、10μg/mL溶菌酶、5mM半胱氨酸的组合来溶解VAX-IP小细胞，然后以冰冷却的蒸馏水进行渗透压休克，进行红细胞溶血测定。一旦溶解，即定量溶解物的蛋白含量，并将合适的量添加至96孔板中至100,000个绵羊红细胞。将板在37℃和强烈震荡下孵育1hr。在1hr孵育时间后，1,000xG下将红细胞离心沉降5min，并将上清液移至新的96孔板用于分析血红蛋白释放，作为541nm波长下对溶血活性的度量。
在引入质粒和于包含10μg/mL二氨基庚二酸及50μg/mL卡那霉素的LB琼脂上进行选择后，使用单个集落开始在包含相同成分的液体LB培养基中于30℃过夜培养生长。第二天，将起始培养物以1/100稀释至包含10μg/mL二氨基庚二酸和50μg/mL卡那霉素的3L新鲜LB培养基中，并于30℃在震荡下培养。通过光密度600(OD 600)监测培养物浊度。当OD
600为0.1时，通过添加L-鼠李糖至终浓度为90μM来诱导培养物，以从pVX-336表达侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O。当OD 600为1.0时，通过添加IPTG至终浓度为100μM来诱导培养物，以用于VAX-IP小细胞形成。允许培养物过夜生长至稳定期，并在第二天使用本领域标准的差速离心步骤和随后的密度梯度纯化的组合来纯化VAX-IP小细胞。一旦纯化，即通过红细胞溶血测定的方式测试小细胞的PFO含量和活性，并通过蛋白质印迹检测侵袭素的存在(参见图12的溶血测定和蛋白质印迹)，其主要的检测抗体为侵袭素特异性的小鼠单克隆IgG2b(mAb3A2)。通过以2mM EDTA、10μg/mL溶菌酶、5mM半胱氨酸的组合来溶解VAX-IP小细胞，然后以冰冷却的蒸馏水进行渗透压休克，进行红细胞溶血测定。一旦溶解，即定量溶解物的蛋白含量，并将合适的量添加至96孔板中至100,000个绵羊红细胞。将板在37℃和强烈震荡下孵育1hr。在1hr孵育时间后，1,000xG下将红细胞离心沉降5min，并将上清液移至新的96孔板用于分析血红蛋白释放，作为541nm波长下对溶血活性的度量。
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