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稳定化A7R多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的用途

阅读：1008发布：2020-06-29

专利汇可以提供稳定化A7R多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属药学领域，涉及一类高稳定性的、具有靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的多功能靶向多肽分子，其修饰的复合物，递药系统，在肿瘤诊断和治疗中的用途。具体涉及与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和神经纤毛蛋白‑1(NRP‑1)高结合活性的逆序D构型多肽DA7R(D构型氨基酸序列DRDPDPDLDWDTDA)和首尾酰胺键环合多肽cA7R(L构型氨基酸序列c(CATWLPPR))，其修饰的荧光素和药物，其修饰的高分子载体材料及其构建的递药系统，在肿瘤影像和治疗中的应用。结果显示：所述多肽在血清中更稳定；具有更强的肿瘤靶向和影像功能；其构建的多肽药物复合物和纳米递药系统更有效地将药物递送至靶组织，显著提高抗肿瘤药效，其直接与抗肿瘤药物联合使用能显著增强抗肿瘤药效。，下面是稳定化A7R多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.稳定化A7R多肽，其特征在于，所述多肽为逆序D构型多肽DA7R和首尾酰胺键环合多肽cA7R；
其中，D构型多肽DA7R其氨基酸序列为DRDPDPDLDWDTDA；酰胺键环合多肽cA7R其L构型氨基酸序列为c(CATWLPPR)；
所述的逆序D构型多肽DA7R和首尾酰胺键环合多肽cA7R介导新生血管内皮生长因子受体2和神经纤毛蛋白-1，实现药物分子或纳米载药系统的肿瘤靶向递送。
2.按权利要求1所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，逆序D构型多肽DA7R和酰胺键环合D
多肽cA7R，巯基化后与含有马来酰亚胺基团的影像物质反应，制得A7R-X复合物和cA7R-X复合物。
3.按权利要求2所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的DA7R-X复合物和cA7R-X复合物中，X是荧光物质Fluorescein，近红外染料cy5.5、IR820、DiR，磁共振影像剂Gd-DTPA，用作高表达新生血管内皮生长因子受体2肿瘤或用作高表达神经纤毛蛋白-1肿瘤的影像诊断和示踪。
4.按权利要求1所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的逆序D构型多肽DA7R和酰胺键环合多肽cA7R，通过pH敏感的腙键、pH敏感的硼酸脂键、二硫键与治疗药物连接，或直接与多肽药物缩合制成融合多肽，制得DA7R-Y复合物和cA7R-Y复合物。
5.按权利要求4所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的DA7R-Y复合物和cA7R-Y复合物中，Y是抗肿瘤药物中的阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、依托泊苷、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽，用作高表达新生血管内皮生长因子受体2肿瘤或用作高表达神经纤毛蛋白-1肿瘤的靶向治疗。
6.按权利要求1所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的逆序D构型多肽DA7R和酰胺键环合多肽cA7R，巯基化后与马来酰亚胺化的聚乙二醇-Z复合物连接，制得DA7R-聚乙二醇-Z复合物和cA7R-聚乙二醇-Z复合物。
7.按权利要求6所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的DA7R-聚乙二醇-Z复合物和cA7R-聚乙二醇-Z复合物中，Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)。
8.按权利要求7所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的DA7R-聚乙二醇-磷脂复合物和cA7R-聚乙二醇-磷脂复合物用于制备脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统和聚合物圆盘递药系统。
9.按权利要求7所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的DA7R-聚乙二醇-聚乳酸复合D D
物、A7R-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物、A7R-聚乙二醇-聚己内酯复合物、cA7R-聚乙二醇-聚乳酸复合物、cA7R-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物、cA7R-聚乙二醇-聚己内酯复合物用于制备聚合物胶束递药系统、纳米粒递药系统。
10.按权利要求8或9所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统包载诊断药物。
11.按权利要求10所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的递药系统包载的诊断药物是5-羧基荧光素5-FAM,近红外染料Cy5.5、IR820、DiR或DiD，磁共振影像剂Gd-DTPA，用于高表达新生血管内皮生长因子受体2肿瘤或高表达神经纤毛蛋白-1肿瘤的影像诊断和示踪。
12.按权利要求8或9所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统包载抗肿瘤药物。
13.按权利要求12所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的递药系统所包载抗肿瘤药物是阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、依托泊苷、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康、顺铂、奥沙利铂、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽、贝伐单抗、曲妥单抗等，用于高表达新生血管内皮生长因子受体2肿瘤或高表达神经纤毛蛋白-1肿瘤的靶向治疗。
14.按权利要求1所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的逆序D构型多肽DA7R和酰胺键环合多肽cA7R与抗肿瘤药物联合用药，用于抗肿瘤药物的协同增效。
15.按权利要求14所述的稳定化A7R多肽，其特征在于，所述的联合使用的抗肿瘤药物是阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、替莫唑胺、依托泊苷、巯嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康、顺铂、奥沙利铂、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽、贝伐单抗或曲妥单抗。

说明书全文

稳定化A7R多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的用途

技术领域

[0001] 本发明属药学领域，涉及高度稳定且可同时靶向血管内皮生长因子受体2和神经纤毛蛋白-1高表达细胞的逆序D构型多肽和首尾酰胺键环合多肽，其药物复合物和修饰的纳米递药系统，具体涉及D构型多肽DA7R(D构型氨基酸序列DRDPDPDLDWDTDA)、酰胺键环合多肽cA7R(L构型氨基酸序列c(CATWLPPR))，其诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料所构建的脂质体、聚合物胶束等纳米递药系统，以及在肿瘤诊断和肿瘤靶向治疗以及在协同增效抗肿瘤药物的应用。

背景技术

[0002] 现有技术公开了肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高居所有疾病死亡率首位。传统的化疗作为肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷。为此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来纳米递药系统得到越来越多的关注。纳米递药系统具有载药量高、体内循环时间长等优势，其可利用肿瘤的EPR效应，能使药物被动地富集于肿瘤部位，但效率较低。

[0003] 近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织靶向效率的重要策略。主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中。常用的对应配体包括单克隆抗体、多肽、核酸适体、小分子化合物等。配体修饰后的纳米递药系统可通过EPR效应富集于肿瘤部位，再通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现纳米递药系统对肿瘤的主动靶向目标。

[0004] 血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)是血管内皮生长因子(VEGF)的特异性受体，主要高表达于血管内皮细胞和绝大部分肿瘤细胞。VEGF/VEGFR2 信号通路是生理性及病理性血管生成最重要的限速步骤，对肿瘤的血管生成至关重要。VEGF及VEGFR2不仅是目前临床中各种抗肿瘤血管靶向治疗最主要的靶位，而且也是肿瘤学基础研究领域中的热点。最近有研究发现，VEGFR2在脑胶质瘤细胞形成VM过程中起到了关键的作用，提示VEGFR2极有可能成为抗血管新生和拟态血管的共同靶点。神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1，NRP-1)是一种跨膜糖蛋白，是Sema3A和VEGF165的共同受体，在肿瘤新生血管生成、肿瘤生长及转移中发挥重要作用。有研究表明，NRP-1不仅表达于肿瘤血管内皮细胞，同时在多种肿瘤细胞膜上过度表达，包括神经胶质瘤、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤等。另外，脑胶质瘤血管的机能失调和高间隙压力，限制了药物穿透血管内皮细胞进入肿瘤实质组织，导致药物的疗效降低。研究发现CendR多肽(由R/KXXR/K氨基酸序列构成的一系列多肽)与NRP-1受体结合后能够增加血管和肿瘤组织通透性，提高了药物或治疗基因穿透进入肿瘤深层组织的能力。

[0005] 噬菌体展示技术是筛选靶向肿瘤组织有效配体的重要手段之一，通过该技术筛选L出来的多肽已经可应用于肿瘤诊断和治疗。A7R(L构型氨基酸序列ATWLPPR)是通过噬菌体展示技术筛选出的与VEGFR2和NRP-1有高度结合活性的七肽，能靶向VEGFR2和NRP-1高表达的肿瘤新生血管、拟态血管和肿瘤细胞；但LA7R在体内的稳定性较差，在血液中易降解，从而降低了其肿瘤靶向能力。

[0006] 针对现有技术存在的上述问题，本发明的申请人拟提供高度稳定且可同时靶向血管内皮生长因子受体2和神经纤毛蛋白-1高表达细胞的逆序D构型多肽和首尾酰胺键环合多肽，并构建其药物复合物和修饰的纳米递药系统，实现肿瘤的靶向诊断和治疗；利用A7R多肽与CendR多肽具有类似结构且靶向NRP-1，可增加药物对肿瘤组织的穿透力，实现对抗肿瘤药物的协同增效。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供稳定化A7R多肽及其在肿瘤靶向诊疗和在用于协同增效抗肿瘤药物的用途，具体涉及制备具有高稳定性的A7R的逆序D构型多肽DA7R(D构型氨基酸序列D D D D D D DRP PLW TA)和首尾酰胺键环合多肽cA7R(L构型氨基酸序列c(CATWLPPR))，并用其修饰药物分子和高分子载体材料，构建稳定性A7R药物复合物、包载药物的稳定性A7R-纳米递药系统，以提高药物对肿瘤的靶向诊疗效果，以及稳定性A7R直接与抗肿瘤药物联用，达到协同增效的效果。

[0008] 具体的，本发明根据多肽逆序合成技术，设计并制备了逆序D构型多肽DA7R，根据“Native Chemical Ligation”反应设计并制备了首尾酰胺键环合多肽cA7R，两条多肽均对血清具有高稳定性、与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)具有高亲和力。

[0009] 本发明所设计的cA7R和连接半胱氨酸后的DA7R，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化荧光物质(如Fluorescein、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR等)和磁共振影像剂Gd-DTPA反应形成复合物。

[0010] 本发明所设计的cA7R和DA7R修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、依托泊苷、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及药物硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及药物p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物)的多肽-药物复合物。

[0011] 本发明所设计的cA7R和连接半胱氨酸后的DA7R，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，可用于DA7R或cA7R修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。

[0012] 本发明所设计的DA7R或cA7R修饰的纳米递药系统可包载阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、依托泊苷、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康、顺铂、奥沙利铂、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽、贝伐单抗、曲妥单抗等；也可包载荧光物质和磁共振影像剂，如FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD、Gd-DTPA等。

[0013] 本发明所设计的DA7R或cA7R可与抗肿瘤药物联合给药、协同治疗，这些药物包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、替莫唑胺、甲氨蝶呤、依托泊苷、巯嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康、顺铂、奥沙利铂、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽、贝伐单抗、曲妥单抗等。

[0014] 本发明所设计的DA7R和cA7R可介导药物或纳米递药系统靶向血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)高表达的细胞及其组织，用于肿瘤的靶向诊断和治疗；可通过NRP-1受体途径增加药物对肿瘤组织的穿透力，用于抗肿瘤药物的协同增效。

[0015] 本发明提供了DA7R、cA7R制备和性质考察以及上述所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊疗的物质基础。本发明的试验结果表明：DA7R和cA7R比LA7R在血清中具有更高的稳定性，且与VEGFR2和NRP-1受体蛋白的亲和性相近，与高表达这两种受体的模型细胞亲和活性相近，但在模型动物体内具有更好的肿瘤组织靶向能力和影像效果；与LA7R修饰的药物复合物或纳米递药系统相比，DA7R或cA7R修饰的药物复合物或纳米递药系统均显示出了更好的肿瘤靶向性能和更强的抗肿瘤效果；本发明进一步提供了DA7R和cA7R作为协同增效剂，与抗肿瘤药物联合用药，可增加药物在肿瘤组织中的穿透深度，发挥更强的抗肿瘤效果。

[0016] 更具体的，本发明中包括，

[0017] 1.DA7R、DA7R-Cys及其荧光标记物(DA7R-Fluorescein)的合成

[0018] 根据逆序多肽合成技术，采用固相合成方法制备DA7R和DA7R-Cys。通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了DA7R-Fluorescein。MS表征结构。

[0019] 2.cA7R及其荧光标记物(cA7R-Fluorescein)的合成

[0020] 根据“Native Chemical Ligation”反应制备cA7R。通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了cA7R-Fluorescein。MS表征结构。

[0021] 3.DA7R和cA7R稳定性和受体亲和性评价

[0022] 从血清稳定性、与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)结合能力和与高表达这两种受体的细胞摄取能力三方面进行DA7R和cA7R性质的考察。将DA7R、cA7R和LA7R分别与小鼠血清在37℃进行孵育，在不同时间点检测多肽的浓度进行稳定性的比较。采用表面等离子共振法评价DA7R、cA7R和LA7R与两种受体蛋白的结合能力。比较DA7R-Fluorescein、cA7R-Fluorescein、LA7R-Fluorescein对血管内皮生长因子受体2和神经纤毛蛋白-1蛋白高表达的细胞(如：脐静脉内皮细胞HUVEC)和模型肿瘤细胞(如：脑胶质瘤细胞U87)的体外靶向性。比较体外肿瘤拟态血管模型对DA7R-Fluorescein、cA7R-L
Fluorescein、A7R-Fluorescein的摄取能力。

[0023] 4.DA7R和cA7R对药物修饰

[0024] cA7R和连接半胱氨酸后的DA7R与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物。

[0025] cA7R和连接半胱氨酸后的DA7R与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、依托泊苷、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康等含羟基或氨基的药物。

[0026] cA7R和DA7R通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物。

[0027] cA7R和DA7R通过固相合成直接与多肽药物缩合制成融合多肽，其中所涉及药物包括p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物。

[0028] 5.A7R-药物复合物靶向性、稳定性与药效学评价

[0029] 考察U87细胞和HUVEC细胞对DA7R-阿霉素复合物(DA7R-Aldoxorubicin)和LA7R-阿霉素复合物(LA7R-Aldoxorubicin)的摄取情况。

[0030] 将DA7R-Aldoxorubicin和LA7R-Aldoxorubicin分别与不同pH的0.1M 磷酸盐缓冲液37℃孵育，在不同时间点检测A7R-Aldoxorubicin的浓度进行pH稳定性的比较。将DA7R-L
Aldoxorubicin和A7R-Aldoxorubicin分别与小鼠血清在37℃进行孵育，在不同时间点检测A7R-Aldoxorubicin的浓度进行血清稳定性的比较。

[0031] 通过荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉分别注射DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin和游离阿霉素，1h后取出肿瘤制作冰冻切片，CD31标记血管，DAPI染核，比较各组药物在肿瘤内分布。

[0032] 考察DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin和游离阿霉素对U87细胞和HUVEC细胞生长的抑制。

[0033] 荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉分别注射DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin、游离阿霉素和生理盐水，以瘤体积、瘤重为指标评价体内抗肿瘤效果。

[0034] 将皮下瘤药效学试验的各给药组小鼠的脏器组织解剖后固定于4％多聚甲醛的PBS溶液中，石蜡包埋切片进行HE染色，考察各组药物的全身毒性。

[0035] 6.DA7R-PEG-脂质体递药系统和cA7R-PEG-脂质体递药系统的构建与表征

[0036] 首先合成DA7R、cA7R、LA7R修饰的高分子材料DA7R-PEG-DSPE、cA7R-PEG-DSPE和LA7R-PEG-DSPE。将DA7R-Cys与Mal-PEG-DSPE在pH 7.2的PBS和DMF的混合溶液中反应得到DA7R-PEG-DSPE。将LA7R-Cys、cA7R分别与Mal-PEG-DSPE按上述方法反应得到cA7R-PEG-DSPE和LA7R-PEG-DSPE。

[0037] 然后分别制备DA7R、cA7R、LA7R修饰的脂质体(DA7R-PEG-脂质体、cA7R-PEG-脂质体和LA7R-PEG-脂质体)。以一定比例的HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE/DA7R-PEG-DSPE或cA7R-PEG-DSPE或LA7R-PEG-DSPE为膜材料，采用成膜水化法制备脂质体，用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，并分别包载DiR、FAM、阿霉素(DOX)等药物，构建平均粒径在100nm左右的脂质体。动态光散射法测定粒径分布，负染色电镜法观察脂质体形态。

[0038] 7.DA7R-PEG-脂质体递药系统和cA7R-PEG-脂质体递药系统的体内外肿瘤靶向性评价

[0039] 考察U87细胞、HUVEC细胞和U87拟态血管体外模型对DA7R-PEG-脂质体/FAM、cA7R-LPEG-脂质体/FAM、A7R-PEG-脂质体/FAM和PEG-脂质体/FAM的摄取情况。

[0040] 通过荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉分别注射DA7R-PEG-脂质体/DiR、cA7R-PEG-脂质体/DiR、LA7R-PEG-脂质体/DiR和mPEG-脂质体/DiR，比较不同递药系统在各时间点的肿瘤内分布。

[0041] 8.DA7R-PEG-脂质体递药系统和cA7R-PEG-脂质体递药系统的体内抗肿瘤效果评价

[0042] 通过荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉分别注射DA7R-PEG-脂质体/阿霉素、cA7R-PEG-脂质体/阿霉素、LA7R-PEG-脂质体/阿霉素、mPEG-脂质体/阿霉素、游离阿霉素和生理盐水，以瘤体积、瘤重和肿瘤组织细胞凋亡、新生血管和拟态血管数量为指标评价不同载阿霉素递药系统的体内抗肿瘤效果。

[0043] 9.A7R与阿霉素联合用药的药效学评价

[0044] 荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉分别注射DA7R、LA7R、DA7R与DOX、LA7R与DOX、DOX以及生理盐水，以瘤体积、瘤重为指标评价体内抗肿瘤效果。

[0045] 本发明采用多肽逆序合成法制备了D构型多肽靶向分子DA7R(D构型氨基酸序列D D D D D D DR P PL W T A)，采用“Native Chemical Ligation”反应合成了首尾酰胺键环合的环肽cA7R(L构型氨基酸序列c(CATWLPPR))，实验证实其能提高A7R分子的稳定性，其所修饰纳米递药系统对体内肿瘤靶向性能高，能实现对肿瘤靶向诊治的目标；与抗肿瘤药物联合用药，可发挥协同增效的效果。
附图说明

[0046] 图1、DA7R的ESI-MS图谱

[0047] ESI-MS：840.4，与理论分子量相符合。

[0048] 图2、DA7R-Cys的ESI-MS图谱

[0049] ESI-MS：941.8，与理论分子量相符合。

[0050] 图3、LA7R的ESI-MS图谱

[0051] ESI-MS：840.4，与理论分子量相符合。

[0052] 图4、LA7R-Cys的ESI-MS图谱

[0053] ESI-MS：941.8，与理论分子量相符合。

[0054] 图5、cA7R的ESI-MS图谱

[0055] ESI-MS：924.8，与理论分子量相符合。

[0056] 图6、DA7R-Fluorescein的ESI-MS图谱

[0057] ESI-MS：1368.0，与理论分子量相符合。

[0058] 图7、LA7R-Fluorescein的ESI-MS图谱

[0059] ESI-MS：1368.0，与理论分子量相符合。

[0060] 图8、cA7R-Fluorescein的ESI-MS图谱

[0061] ESI-MS：1351.6，与理论分子量相符合。

[0062] 图9、DA7R-Aldoxorubicin的ESI-MS图谱

[0063] ESI-MS：1692.6，与理论分子量相符合。

[0064] 图10、LA7R-Aldoxorubicin的ESI-MS图谱

[0065] ESI-MS：1692.6，与理论分子量相符合。

[0066] 图11、DA7R-PEG3400-DSPE和cA7R-PEG3400-DSPE的1H-NMR图谱

[0067] Mal-PEG-DSPE的核磁图谱于6.7ppm显示出马来酰亚胺峰，而LA7R-PEG-DSPE、DA7R-PEG-DSPE与cA7R-PEG-DSPE的核磁图谱中该峰消失，显示Mal-PEG-DSPE中的马来酰亚胺基团已连接上A7R。

[0068] 图12、DA7R和cA7R的血清稳定性

[0069] 图纵坐标为完整多肽的残留百分比，可见DA7R和cA7R在25％小鼠血清中的稳定性显著高于LA7R，孵育2小时，LA7R完全降解、cA7R降解不足35％、DA7R几乎不降解。

[0070] 图13、DA7R和cA7R与VEGFR2结合活性

[0071] 可见DA7R、cA7R和LA7R与VEGFR2蛋白的结合活性相似，KD值分别为8.414nM、6.794nM和9.289nM。

[0072] 图14、DA7R及cA7R与NRP-1结合活性

[0073] 可见DA7R、cA7R和LA7R与NRP-1蛋白的结合活性相似，KD值分别为2.307nM、10.57nM和6.62nM。

[0074] 图15、脑胶质瘤细胞U87对Fluorescein标记多肽的摄取

[0075] 图A和图B分别为Fluorescein标记的DA7R、cA7R和LA7R与U87细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见U87细胞对DA7R、cA7R和LA7R的摄取明显高于游离荧光素，但对三种多肽的摄取没有明显差异。

[0076] 图16、脐静脉内皮细胞HUVEC对Fluorescein标记多肽的摄取

[0077] 图A和图B分别为Fluorescein标记的DA7R、cA7R和LA7R与HUVEC细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见HUVEC细胞对DA7R、cA7R和LA7R的摄取明显高于游离荧光素，但对三种多肽的摄取没有明显差异。

[0078] 图17、U87拟态血管体外模型对Fluorescein标记多肽的摄取

[0079] 图为Fluorescein标记的DA7R、cA7R和LA7R分别与U87拟态血管体外模型作用4h后的荧光显微镜照片。可见U87拟态血管体外模型对DA7R、cA7R和LA7R的摄取明显高于游离荧光素，但对三种多肽的摄取没有明显差异。

[0080] 图18、Fluorescein标记多肽的皮下移植瘤内分布

[0081] 图A为荷U87皮下移植瘤裸鼠尾静脉注射Fluorescein标记多肽1h后的离体肿瘤影像分布结果；图B为离体脏器的影像分布结果；图C为离体肿瘤的荧光半定量结果；图D为离体肿瘤和脏器的荧光半定量结果。Fluorescein标记的DA7R、cA7R和LA7R在肿瘤内的蓄积均显著高于游离荧光素(*p<0.05,**p<0.005)，且肿瘤靶向效果依次为：DA7R>cA7R>LA7R。

[0082] 图19、脑胶质瘤细胞U87对A7R-Aldoxorubicin的摄取

[0083] 图A和图B分别为A7R-Aldoxorubicin与U87细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见U87细胞对A7R-Aldoxorubicin均有摄取。

[0084] 图20、脐静脉内皮细胞HUVEC对A7R-Aldoxorubicin的摄取

[0085] 图A和图B分别为A7R-Aldoxorubicin与HUVEC细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见HUVEC细胞对A7R-Aldoxorubicin均有摄取。

[0086] 图21、DA7R-Aldoxorubicin和cA7R-Aldoxorubicin的pH稳定性

[0087] 由图可见A7R-Aldoxorubicin在pH5.5的介质中降解最快，在pH7.4的缓冲液中相对稳定，pH6.5弱酸性条件下也能较好地降解。说明该复合物在低pH时可是放出游离药物。

[0088] 图22、DA7R-Aldoxorubicin和cA7R-Aldoxorubicin的血清稳定性

[0089] 由图可见DA7R-Aldoxorubicin在25％小鼠血清中的稳定性显著高于LA7R-Aldoxorubicin，孵育2h，LA7R-Aldoxorubicin完全降解而DA7R-Aldoxorubicin降解不足
30％。

[0090] 图23、A7R-Aldoxorubicin皮下瘤内分布

[0091] 图为DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin和DOX在荷U87皮下移植瘤内分布结果。结果表明，A7R-Aldoxorubicin较Aldoxorubicin和DOX能更好地蓄积在肿瘤组织内，且能与新生血管共定位。DA7R-Aldoxorubicin的靶向效果优于LA7R-Aldoxorubicin。

[0092] 图24、A7R-Aldoxorubicin体外抗U87细胞和HUVEC细胞活性曲线

[0093] 图A和图B分别为DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin和DOX抗U87细胞和HUVEC细胞的活性曲线。图A表明U87细胞给药培养72h后，其IC50分别为6.76、13.18、2.95和0.081μM。四种化合物均具能抑制U87细胞的体外生长。图B表明HUVEC细胞给药培养72h后，其IC50分别为0.63、1.047、0.891和0.0105μM。四种化合物均具能抑制HUVEC细胞的体外生长。

[0094] 图25、A7R-Aldoxorubicin皮下瘤抑制实验

[0095] 图A为各组裸鼠肿瘤体积随时间变化的曲线，图B为各组裸鼠体重随时间变化的曲线，图C为将裸鼠处死取出肿瘤组织后称重的统计分析结果，由图可见A7R-Aldoxorubicin的抗肿瘤效果优于未修饰的Dox，其中DA7R-Aldoxorubicin的药效最佳。

[0096] 图26、CD31/PAS染色和TUNEL染色结果

[0097] 第一排为DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin和DOX抑制新生血管形成的CD31/PAS双染色照片(bar＝100μm)，其中新生血管细胞核呈棕黄色或棕褐色。与LA7R-Aldoxorubicin相比，DA7R-Aldoxorubicin抑制新生血管的形成更显著。

[0098] 第二排为DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin和DOX促进皮下瘤凋亡的TUNEL染色照片(bar＝100μm)，其中凋亡的阳性细胞核呈棕黄色或棕褐色。与LA7R-Aldoxorubicin相比，DA7R-Aldoxorubicin促进肿瘤组织的凋亡更显著。

[0099] 图27、A7R-Aldoxorubicin的全身毒性

[0100] 图为皮下瘤药效实验中各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾HE染色结果，表明药效实验中各组药物对裸鼠脏器没有明显毒性。

[0101] 图28、U87细胞对包载5-FAM多肽修饰脂质体的摄取

[0102] 图A和图B分别为包载荧光素5-FAM的DA7R、cA7R和LA7R修饰脂质体与U87细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见U87细胞对DA7R、cA7R和LA7R修饰脂质体的摄取量显著高于无多肽修饰脂质体。

[0103] 图29、HUVEC细胞对包载5-FAM脂质体的摄取

[0104] 图A和图B分别为包载5-FAM的各处方脂质体于37℃分别与HUVEC细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式结果。由图可知，HUVEC细胞对多肽修饰脂质体的摄取明显高于无多肽修饰脂质体。

[0105] 图30、U87拟态血管体外模型对包载5-FAM脂质体的摄取

[0106] 图为包载5-FAM的各处方脂质体于37℃分别与U87拟态血管体外模型作用4h后的荧光显微镜照片。由图可知，U87拟态血管体外模型对多肽修饰脂质体的摄取明显高于无多肽修饰脂质体。

[0107] 图31、载近红外染料的PEG-脂质体的皮下瘤内分布

[0108] 图A为尾静脉注射24小时后的在体荧光分布图像，结果表明DA7R或cA7R修饰的脂质体能更好地靶向至肿瘤部位。图B为给药后各个时间点肿瘤内荧光强度半定量结果。图C为脏器的荧光分布图像。图D为图C的荧光半定量统计结果。

[0109] 图32、载阿霉素脂质体的粒径和电镜照片

[0110] 图A和图B分别为各阿霉素脂质体的粒径和电镜照片，由图可知，各处方脂质体大小和形态均无显著差异。

[0111] 图33、载阿霉素脂质体体外抗U87细胞和HUVEC细胞活性曲线

[0112] 图A和图B分别为LS/DOX、DA7R-LS/DOX、cA7R-LS/DOX、LA7R-LS/DOX和DOX抗U87细胞和HUVEC细胞的活性曲线。图A表明U87细胞给药4h培养72h后，其IC50分别为17.78、0.62、0.81、5.13和0.06μM。四种脂质体均具能抑制U87细胞的体外生长，其中DA7R-LS/DOX和L
cA7R-LS/DOX的体外活性分别为A7R-LS/DOX的8.27倍和6.33倍。图B表明HUVEC细胞给药4h培养72h后，其IC50分别为0.74、0.19、0.15、0.39和0.09μM。四种脂质体均具能抑制HUVEC细胞的体外生长，其中DA7R-LS/DOX和cA7R-LS/DOX的体外活性分别为LA7R-LS/DOX的2.05倍和
2.60倍。

[0113] 图34、载阿霉素脂质体体外对新生血管形成的抑制

[0114] 图A为LS/DOX、DA7R-LS/DOX、cA7R-LS/DOX、LA7R-LS/DOX和DOX对新生血管体外模型的抑制照片。图B为各组血管样结构的形成率统计结果，相比于LA7R-LS/DOX，DA7R-LS/DOX和cA7R-LS/DOX能显著抑制新生血管的形成(**p<0.005)。

[0115] 图35、载阿霉素脂质体体外对拟态血管形成的抑制

[0116] 图A为LS/DOX、DA7R-LS/DOX、cA7R-LS/DOX、LA7R-LS/DOX和DOX对拟态血管体外模型的抑制照片。图B为各组拟态血管结构的形成率统计结果，相比于LA7R-LS/DOX，DA7R-LS/DOX和cA7R-LS/DOX能显著抑制拟态血管的形成(*p<0.05)。

[0117] 图36、载阿霉素脂质体皮下瘤抑制实验

[0118] 图A为各组裸鼠肿瘤体积随时间变化的曲线，与生理盐水组相比，各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。DA7R-LS/DOX、cA7R-LS/DOX与LA7R-LS/DOX相比具有极显著性差异(n＝6，***p<0.001)。将裸鼠处死取出肿瘤组织后称重并进行统计分析(图B)，发现DA7R-LS/DOX和cA7R-LS/DOX组瘤重显著低于LA7R-LS/DOX(n＝6，***p<0.001)。

[0119] 图37、TUNEL染色结果

[0120] 图A为LS/DOX、DA7R-LS/DOX、cA7R-LS/DOX、LA7R-LS/DOX和DOX促进皮下瘤凋亡的TUNEL染色照片(bar＝50μm)，其中凋亡的阳性细胞核呈棕黄色或棕褐色。图B为阳性细胞数的统计结果，与LA7R-LS/DOX相比，DA7R-LS/DOX和cA7R-LS/DOX能显著促进肿瘤组织的凋亡。

[0121] 图38、CD31/PAS双染色结果

[0122] 图A为LS/DOX、DA7R-LS/DOX、cA7R-LS/DOX、LA7R-LS/DOX和DOX抑制新生血管形成的CD31/PAS双染色照片(bar＝100μm)，其中新生血管细胞核呈棕黄色或棕褐色，图B为新生血管数的统计结果，与LA7R-LS/DOX相比，DA7R-LS/DOX和cA7R-LS/DOX能显著抑制新生血管的形成。

[0123] 图39、A7R与DOX联合给药皮下瘤抑制实验

[0124] 图A为各组裸鼠肿瘤体积随时间变化的曲线，图B为各组裸鼠体重随时间变化的曲线，图C为将裸鼠处死取出肿瘤组织后称重的统计分析结果，由图可见，A7R与DOX联合给药显著增强DOX抗肿瘤药效，且DA7R与DOX联合给药比LA7R与DOX联合给药更优(n＝8，***p<0.001，**p<0.01)。

具体实施方式

[0125] 通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

[0126] 实施例1

[0127] A7R、A7R-Fluorescein、A7R-DTPA-Gd、A7R-药物、A7R-PEG-DSPE的合成与表征[0128] 1.LA7R和DA7R、LA7R-Cys和DA7R-Cys的合成与表征

[0129] 采用逆序固相多肽合成法，设计并合成由非天然D构型氨基酸所构成的DA7R(序列为DRDPDPDLDWDTDA)和DA7R-Cys(序列为DCDRDPDPDLDWDTDA)。合成L构型氨基酸所构成的LA7R(序L列为ATWLPPR)和A7R-Cys(序列为ATWLPPRC)。

[0130] 具体方法：将PAM-Boc树脂用三氟乙酸(TFA)脱保护。用Boc保护氨基酸依次反应，反应完成后，三氟乙酸脱Boc保护后，依次用DMF、DCM/MeOH(1:1，v/v)洗涤树脂，真空干燥。将树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入氟化氢，冰浴搅拌反应1h。反应结束后减压抽去管中氟化氢，冰乙醚洗涤沉淀3次，残余沉淀以20％乙腈溶解，收集滤液后旋蒸，得到多肽粗品溶液。多肽粗品用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化；ESI-MS表征DA7R、DA7R-Cys、LA7R及LA7R-Cys的纯度和分子量(Mw)；质谱图如图1、图2、图3及图4所示。

[0131] 2.cA7R的合成与表征

[0132] 先采用固态多肽合成法，设计并合成直链多肽A7R-Mpr(Trt)-Leu。然后采用“Native Chemical Ligation”反应合成目标产物cA7R。将纯化的A7R-Mpr(Trt)-Leu溶解于6M盐酸胍溶液中，浓度为1mg/mL，加入1‰(v/v)的催化剂硫代苯酚，密闭搅拌反应用HPLC检测反应进程，待原料峰消失，产物峰高不再增加时终止反应。反应结束后，反应液稀释2-3倍，用0.22μm滤膜过滤，用制备HPLC分离纯化得到cA7R；ESI-MS表征cA7R的纯度和分子量(Mw)；质谱图如图5所示。

[0133] 3.A7R-Fluorescein的合成与表征

[0134] 将上述步骤得到的LA7R-Cys、DA7R-Cys或cA7R溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，取Fluorescein-5-maleimide溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待DA7R-Cys、DA7R-Cys或cA7R反应完全后停止反应，制备液相纯化，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。冷冻干燥得DA7R-Fluorescein、LA7R-Fluorescein或cA7R-Fluorescein纯品；质谱图u图6、7、8所示。

[0135] 4.A7R-DTPA-Gd的制备

[0136] maleimide-DTPA溶于DMF，同上与LA7R-Cys、DA7R-Cys或cA7R的PBS溶液混合搅拌反应，制备液相纯化，冷冻干燥得DA7R-DTPA、LA7R-DTPA或cA7R-DTPA纯品，螯合Gd即得A7R-DTPA-Gd。

[0137] 5.A7R-药物复合物的制备

[0138] 以A7R-阿霉素偶联物制备作为A7R连接含酮或醛基药物的实施例。9.4mg巯基化A7R多肽溶于磷酸盐3mL缓冲液(0.1mM，pH 7.0)，于4℃搅拌20min。然后加入4倍摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h。反应液用C18制备柱进行分离(色谱柱：waters X bridge 19×300mm；流动相：A 0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液，B乙腈；洗脱方法：
100％A～100％B线性梯度)，收集相应组分，脱盐后冷冻干燥得LA7R或DA7R-阿霉素偶联物；
质谱图如图9、10所示；

[0139] 以A7R-紫杉醇复合物作为A7R以二硫键连接药物的实施例。200mg紫杉醇溶于10mL氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入39.99mg DCC及60.4mg 3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜。反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝50:1-15:1，V/V洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物。紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在5mL DMF中，1.5倍摩尔量的A7R-Cys溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至巯基多肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相制备冻干得多肽-紫杉醇复合物；

[0140] 以A7R-硼替佐咪复合物作为A7R氮端修饰药物的实施例，依照A7R的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的Boc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以HBTU/DIEA为缩合剂，于室温反应1h。树脂用HF切割，并经制备型HPLC纯化得多肽-多巴胺衍生物，在pH7.4的缓冲液中，多肽-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得多肽-硼替佐咪复合物；

[0141] 以A7R-p53激活肽PMI复合物作为A7R融合多肽药物的实施例。直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定A7R-PMI多肽序列后，按与制备A7R相同的方法依次接入氨基酸，经HF切割并纯化后得A7R-PMI融合多肽；

[0142] 6.A7R-PEG-DSPE的合成与表征

[0143] 将DA7R-Cys、LA7R-Cys或cA7R溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，取Mal-PEG-DSPE溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待Mal-PEG-DSPE反应完全后停止反应，过量的DA7R-Cys、LA7R-Cys、cA7R和DMF透析(截留分子量3.5kDa)除去，冷冻干燥得DA7R-PEG-DSPE及cA7R-PEG-DSPE，NMR表征其结构(如图11所示)。

[0144] 实施例2

[0145] A7R的血清稳定性考察

[0146] 将DA7R、cA7R及LA7R配成1mg/mL水溶液，取0.1mL加入0.9mL的25％小鼠血清中，37℃孵育，分别于0和15min，0.5、1、2和4h取出100μL反应液，加入20μL乙腈沉淀血清中蛋白，4℃静置20min，12000转/分钟离心10min，取上清液20μL进行HPLC分析。血清稳定性结果(如图12所示)表明，DA7R与cA7R具有比LA7R更好的血清稳定性。

[0147] 实施例3

[0148] A7R与受体蛋白结合活性实验

[0149] 1.A7R与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的结合活性实验

[0150] 通过biacore系统进行预结合分析，选取pH4.5为最佳VEGFR2蛋白与CM5芯片结合pH。将重组人VEGFR2蛋白偶联至CM5芯片上，RU值达到目标值。将DA7R、cA7R及LA7R分别配置成浓度为5、10、20、40、80和160nM的样品溶液。从低到高依次进样，用Biacore D LT200Evaluation software 软件分析A7R、cA7R及A7R与VEGFR2蛋白的结合活性，并分别计算其KD值(如图13所示)；

[0151] 2.A7R与神经纤毛蛋白-1(NRP-1)的结合活性实验

[0152] 通过biacore系统进行预结合分析，选取pH4.5为最佳NRP-1蛋白与CM5芯片结合pH。将重组人NRP-1蛋白偶联至CM5芯片上，RU值达到目标值。将DA7R、cA7R及LA7R分别配置成浓度为2.5、5、10、20、40和80nM的样品溶液。从低到高依次进样，用Biacore T200Evaluation software软件分析DA7R、cA7R及LA7R与NRP-1蛋白的结合活性，并分别计算其KD值(如图14所示)。

[0153] 实施例4

[0154] A7R的体外细胞靶向性验证

[0155] 1.A7R对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性

[0156] 取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(U87细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度D条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的FAM、A7R-
Fluorescein、cA7R-Fluorescein及LA7R-Fluorescein溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图15A。另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图15B所示；

[0157] 2.A7R对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性

[0158] 取对数生长期的单层培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的FITC、DA7R-Fluorescein、cA7R-Fluorescein及LA7R-Fluorescein溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图16A。另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图16B所示；

[0159] 3.A7R对U87体外拟态血管模型的体外靶向性

[0160] 取24孔培养板每孔加入50μL基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化U87细胞，用含10％FBS的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养12h后血管样结构形成。用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的FITC、DA7R-Fluorescein、cA7R-Fluorescein及LA7R-Fluorescein溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，荧光显微镜观察，结果如图17所示。

[0161] 实施例5

[0162] A7R体内肿瘤靶向性验证

[0163] 首先构建皮下瘤动物模型。将处于对数生长期的U87细胞胰酶消化，调整细胞浓度7
为3×10个/mL，接种100μL至裸小鼠右背侧近腋部皮下。接种后饲养于SPF级，定期观察肿瘤大小，待肿瘤大小为200mm3时，筛选出无坏死、肿瘤形状规则的荷瘤裸鼠，分组进行试验。
以0.15μmoL/只的剂量将FITC、DA7R-Fluorescein、cA7R-Fluorescein及LA7R-Fluorescein溶液通过尾静脉注入荷瘤裸鼠动物模型体内，1h后处死裸鼠，取出肿瘤，用活体成像仪检测肿瘤的荧光分布(如图18A所示)并进行荧光半定量计算(如图18B所示)。

[0164] 实施例6

[0165] A7R-Aldoxorubicin的体外细胞靶向性验证

[0166] 1.A7R-Aldoxorubicin对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性

[0167] 取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(U87细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的DOX、Aldoxorubicin、DA7R-Aldoxorubicin及LA7R-Aldoxorubicin溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图19A。另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图19B所示；

[0168] 2.A7R-Aldoxorubicin对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性

[0169] 取对数生长期的单层培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，同上试验，细胞内化照片见如图20A所示；流式细胞仪结果如图20B所示。

[0170] 实施例7

[0171] A7R-Aldoxorubicin的稳定性考察

[0172] 1.A7R-Aldoxorubicin在不同pH下的稳定性

[0173] 将DA7R-Aldoxorubicin及LA7R-Aldoxorubicin分别配成1mg/mL的磷酸盐溶液(pH 5.5、6.5、7.4)，37℃孵育，分别于0、0.5、1、2、4、8、12和24h取出20μL溶液，进行HPLC分析。pH稳定性结果表明，LA7R-Aldoxorubicin(如图21A所示)与DA7R-Aldoxorubicin(如图21B所示)在pH7.4时最稳定，pH5.5时水解最快，而弱酸性条件(pH6.5)也能很好地降解，说明腙键连接的A7R-Aldoxorubicin在弱酸性环境下能可释放游离阿霉素；

[0174] 2.A7R-Aldoxorubicin在血清中的稳定性

[0175] 将DA7R-Aldoxorubicin及LA7R-Aldoxorubicin配成1mg/mL水溶液，取0.1mL加入0.9mL的25％小鼠血清中，37℃孵育，分别于0、0.25，0.5、1、2、4、8和12h取出100μL反应液，加入20μL乙腈沉淀血清中蛋白，4℃静置20min，12000转/分钟离心10min，取上清液20μL进行HPLC分析。血清稳定性结果(如图22所示)表明，DA7R-Aldoxorubicin具有比LA7R-Aldoxorubicin更好的血清稳定性。

[0176] 实施例8

[0177] A7R-Aldoxorubicin体内肿瘤靶向性验证

[0178] 以10mg/Kg的剂量将DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin及DOX通过尾静脉注入荷瘤裸鼠动物模型体内，1h后处死裸鼠，取出肿瘤，用OCT包埋剂(Tissue-Tek)包埋，液氮中快速冷冻，制作10μm的冰冻切片，并在4℃丙酮中固定10min，PBS洗涤，牛血清白蛋白(BSA)孵育封闭1h。将切片与rat anti-mouse CD31(1:10)孵育1h，然后与FITC标记的goat anti-rat IgG(1:100)孵育以定位肿瘤血管，最后切片用DAPI复染以显示细胞核。封片后，用激光共聚焦显微镜观察(如图23所示)。

[0179] 实施例9

[0180] A7R-Aldoxorubicin体内外药效学试验

[0181] 1.A7R-Aldoxorubicin体外药效试验

[0182] 以4.0×103个/孔将U87细胞或HUVEC细胞接种于96孔板，24h后，将培养液吸出，加入200μL一系列浓度的DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin及DOX，培养72h后加入MTT溶液继续培养4h，弃去培养液，加入150μL DMSO，振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在590nm处测定吸光度值。采用MTT法测定细胞存活率，计算细胞存活率和半数致死剂量(如图24所示)；

[0183] 2.A7R-Aldoxorubicin对皮下移植瘤抑制试验

[0184] 构建U87皮下瘤动物模型，定期观察肿瘤大小，待肿瘤大小为100mm3时，分组进行试验，分别尾静脉注射DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin、DOX以及生理盐水。给药组阿霉素总给药剂量为2.5mg/kg，分为五次，每次给药间隔为两天。隔天以游标卡尺测量肿瘤的长径(a)及短径(b)。根据公式计算各组裸鼠肿瘤体积，绘制肿瘤体积随时间的变化曲线，计算各组统计学差异。按照以下公式计算肿瘤体积：

[0185] V瘤体积＝0.5(a×b2)

[0186] 给药14天后，断颈处死所有裸鼠，取下皮下肿瘤并称重，计算各组统计学差异(如图25所示)；

[0187] 3.A7R-Aldoxorubicin抑制肿瘤血管及促凋亡作用

[0188] DA7R-Aldoxorubicin、LA7R-Aldoxorubicin、Aldoxorubicin、DOX组经过五次尾静脉注射后，处死取出皮下瘤固定，石蜡包埋切片。进行CD31免疫组化染色与PAS双染考察血管抑制效果。采用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡程度。主要步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水；PBS漂洗3次，每次3min；0.3％H2O2溶液室温处理20min；20μg/mL蛋白酶K 37℃消化20min；PBS漂洗3次，每次3min；每张切片滴加TUNEL混合液(TDT和biotin-dNTP)30μL置于湿盒中37℃孵育60min；PBS漂洗3min共3次；Streptavidin-HRP(1:200)37℃孵育30min；PBS漂洗3次，每次3min；0.04％DAB+0.03％H2O2溶液显色10min，水洗；苏木素衬染1min，水洗蓝化；吹干后常规树脂封片。阳性结果为细胞核呈棕黄色或棕褐色。细胞核内棕色颗粒阳性即判定为凋亡细胞，结果如图26所示；

[0189] 4.A7R-Aldoxorubicin的全身毒性考察

[0190] 将皮下瘤药效学试验的各给药组小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织解剖后固定于4％多聚甲醛的PBS溶液中，石蜡包埋切片，进行HE染色，在显微镜下观察、拍摄图片(如图27所示)。

[0191] 实施例10

[0192] A7R-PEG-脂质体体外细胞靶向性验证

[0193] 1.脂质体/FAM的制备

[0194] PEG-脂质体膜材料处方组成为HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE(52:43:5,mol/mol)，多肽修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE/多肽-PEG-DSPE(52:43:3:2，mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24h。加入5-FAM水溶液水化，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。在60℃温度下，使用高压均质机(若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50柱分离除去未包封的5-FAM，得到包载5-FAM的脂质体；

[0195] 2.A7R-PEG-脂质体对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性

[0196] 取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(U87细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的mPEG-脂质体/FAM、D LA7R-PEG-脂质体/FAM、cA7R-PEG-脂质体/FAM和A7R-PEG-脂质体/FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图28A。另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图28B所示；

[0197] 3.A7R-PEG-脂质体对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性

[0198] 取对数生长期的单层培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，同上试验，细胞内化照片见附图29A，流式细胞仪结果如图29B所示；

[0199] 4.A7R-PEG-脂质体对U87体外拟态血管模型的体外靶向性

[0200] 取24孔培养板每孔加入50μL基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化U87细胞，用含10％FBS的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养12h后血管样结构形成。用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的mPEG-脂质体/FAM、DA7R-PEG-脂质体/FAM、cA7R-PEG-脂质体/FAM和LA7R-PEG-脂质体/FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，荧光显微镜观察，照片如图30所示。

[0201] 实施例11

[0202] A7R-PEG-脂质体体内靶向性验证

[0203] 1.脂质体/DiR的制备

[0204] 脂质体膜材料处方同上，将上述膜材料及DiR溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24h。加入生理盐水溶液水化，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。在60℃温度下，使用高压均质机(若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50柱分离除去未包封的DiR，得到包载DiR的脂质体；

[0205] 2.A7R-PEG-脂质体体内靶向性验证

[0206] U87皮下瘤模型裸鼠分别尾静脉注射100μL包载DiR的脂质体mPEG-脂质体/DiR、D LA7R-PEG-脂质体/DiR、cA7R-PEG-脂质体/DiR和A7R-PEG-脂质体/DiR溶液，分别在注射后
2、4、8、12及24h时麻醉小鼠，用活体成像仪记录DiR荧光在裸鼠体内的分布情况并进行荧光半定量计算(如图31所示)。

[0207] 实施例12

[0208] 载阿霉素的A7R-PEG-脂质体体外药效学试验

[0209] 1.载阿霉素脂质体的制备及表征

[0210] 脂质体膜材料处方同上，采用硫酸铵梯度法制备包载阿霉素(DOX)的各脂质体。动态光散射法测定粒径分布(附图32A)，负染色电镜法观察脂质体形态(如图32B所示)；

[0211] 2.载阿霉素的A7R-PEG-脂质体体外药效试验

[0212] 以4.0×103个/孔将U87细胞或HUVEC细胞接种于96孔板，24h后，将培养液吸出，加入200μL一系列浓度的mPEG-脂质体/DOX、DA7R-PEG-脂质体/DOX、cA7R-PEG-脂质体/DOX、LA7R-PEG-脂质体/DOX及游离DOX，共培养4h后吸出药液，PBS洗涤后加入含10％FBS的DMEM培养液，继续培养68h，后加入MTT溶液继续培养4h，弃去培养液，加入150μLDMSO，振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在590nm处测定吸光度值。采用MTT法测定细胞存活率，计算细胞存活率和半数致死剂量(如图33所示)；

[0213] 3.载阿霉素的A7R-PEG-脂质体对新生血管形成的抑制试验

[0214] 取24孔培养板每孔加入50μL基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化HUVEC细胞，用含1μM阿霉素脂质体或游离阿霉素药液的DMEM培养5
液配成单细胞悬液，以每孔1×10个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养12h后观察血管样结构形成(附图34A)并计算血管样结构的形成率(如图34B所示)；

[0215] 4.载阿霉素的A7R-PEG-脂质体对拟态血管形成的抑制试验

[0216] 取24孔培养板每孔加入50μL基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化U87细胞，用含1μM阿霉素脂质体或游离阿霉素药液的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养12h后观察血管样结构形成(附图35A)并计算拟态血管结构的形成率(如图35B所示)。

[0217] 实施例13

[0218] 载阿霉素的A7R-PEG-脂质体体内药效试验

[0219] 1.载阿霉素的A7R-PEG-脂质体对皮下移植瘤抑制试验

[0220] 构建U87皮下瘤动物模型，定期观察肿瘤大小，待肿瘤大小为100mm3时，分组进行试验，分别尾静脉注射mPEG-脂质体/DOX、DA7R-PEG-脂质体/DOX、cA7R-PEG-脂质体/DOX、LA7R-PEG-脂质体/DOX、游离DOX以及生理盐水。给药组阿霉素总给药剂量为10mg/kg，分为五次，每次给药间隔为两天。隔天以游标卡尺测量肿瘤的长径(a)及短径(b)。根据公式计算各组裸鼠肿瘤体积，绘制肿瘤体积随时间的变化曲线，计算各组统计学差异。按照以下公式计算肿瘤体积：

[0221] V瘤体积＝0.5(a×b2)

[0222] 给药18天后(接种后24天)，断颈处死所有裸鼠，取下皮下肿瘤并称重，计算各组统计学差异(如图36所示)；

[0223] 2.载阿霉素的A7R-PEG-脂质体促凋亡试验

[0224] 不同阿霉素脂质体组及游离阿霉素治疗组经过五次尾静脉注射后，处死取出皮下瘤固定，石蜡包埋切片。采用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡程度。主要步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水；PBS漂洗3次，每次3min；0.3％H2O2溶液室温处理20min；20μg/mL蛋白酶K 37℃消化20min；PBS漂洗3次，每次3min；每张切片滴加TUNEL混合液(TDT和biotin-dNTP)30μL置于湿盒中37℃孵育60min；PBS漂洗
3min共3次；Streptavidin-HRP(1:200)37℃孵育30min；PBS漂洗3次，每次3min；0.04％DAB+
0.03％H2O2溶液显色10min，水洗；苏木素衬染1min，水洗蓝化；吹干后常规树脂封片。阳性结果为细胞核呈棕黄色或棕褐色。细胞核内棕色颗粒阳性即判定为凋亡细胞。在普通光学显微镜下连续观察5个高倍视野计数阳性细胞数，视野内细胞中阳性细胞数所占的百分比为凋亡指数，结果如图37所示；

[0225] 3.载阿霉素的A7R-PEG-脂质体对肿瘤血管抑制试验

[0226] 不同阿霉素脂质体组及游离阿霉素治疗组经过五次尾静脉注射后，处死取出皮下瘤固定，石蜡包埋切片，进行CD31免疫组化染色与PAS双染。在普通光学显微镜下连续观察3个高倍视野计数CD31阳性血管数，结果如图38所示。

[0227] 实施例14

[0228] A7R-PEG-脂质体/Gd-DTPA制备

[0229] 称取与脂质体/FAM处方相应的膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24h，加入Gd-DTPA水溶液水化，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液，在60℃温度下，使用高压均质机(若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小，然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-
50柱分离除去未包封的Gd-DTPA，得包载Gd-DTPA的脂质体。

[0230] 实施例15

[0231] A7R与阿霉素联合用药的药效学试验

[0232] 构建U87皮下瘤动物模型，定期观察肿瘤大小，待肿瘤大小为100mm3时，分组进行试验，分别尾静脉注射DA7R、LA7R、DA7R与DOX、LA7R与DOX、DOX以及生理盐水。给药组阿霉素总给药剂量为2.5mg/kg，多肽总给药剂量为20mg/kg，分为五次，每次给药间隔为两天。隔天以游标卡尺测量肿瘤的长径(a)及短径(b)。根据公式计算各组裸鼠肿瘤体积，绘制肿瘤体积随时间的变化曲线，计算各组统计学差异，按以下公式计算肿瘤体积：

[0233] V瘤体积＝0.5(a×b2)

[0234] 给药14天后，断颈处死所有裸鼠，取下皮下肿瘤并称重，计算各组统计学差异(如图39所示)。

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