蜂毒肽在治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物中的应用
阅读：856发布：2020-05-24
专利汇可以提供蜂毒肽在治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 蜂毒 肽的新用途，即 蜂毒肽 作为 治疗 高危型HPV 病毒感染 及 宫颈 癌 药物的活性成分。本发明发现蜂毒肽具有抑制HPV16、HPV18两种 宫颈癌 高危病毒E6/E7蛋白的表达及抑制宫颈癌细胞生长，促进其凋亡等作用，达到抗HPV病毒的效果，使其可以应用于由于HPV病毒引起的宫颈癌的 预防 及治疗，开拓了蜂毒肽的一个新的应用领域。，下面是蜂毒肽在治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物中的应用专利的具体信息内容。
1.本发明的目的是提供一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：即蜂毒肽作为治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物的活性成分。
2.如权利要求1所述的一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：所述的高危型HPV为感染Hela细胞的HPV18、感染caski细胞的HPV16。
3.如权利要求1所述的一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：所述的高危型HPV致瘤蛋白为E6、E7蛋白。
4.如权利要求1所述的一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：所述的宫颈癌来自于宫颈癌细胞系Hela(HPV18)、Caski(HPV16)。
5.如权利要求1所述的一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：所述的蜂毒肽治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物的活性成分可以制成阴道给药制剂，所述的制剂可以为栓剂，软膏剂、胶囊剂、泡腾片、凝胶剂、洗剂、膜剂或泡沫剂。
6.如权利要求1所述的一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：所述的治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物中作为活性成分的蜂毒肽所占比例为0.05-2‰。
7.如权利要求1所述的一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：所述的阴道给药制剂包含如下成分及其含量：蜂毒肽0.05-2‰；卡波姆1.0-6.0％；三乙醇胺1.0-5％；冰片3-6％；葡萄糖1-5％；甘油0.5-5％；其余为水。
8.如权利要求1所述的一种蜂毒肽的新用途，其特征在于：所述的冰片选自天然冰片和/或合成冰片。
蜂毒肽在治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，为全球女性第四大高发病率和高致死率肿瘤，尤其在发展中国家发病率和致死率在女性恶性肿瘤中分别居第二位和第三位(Torre，L.A.et al.Global cancer statistics，2012.CA Cancer J Clin 65，87-108，doi：10.3322/caac.21262(2015))。近年来，宫颈癌的发病率不断提高，10年间提升近3倍，且年轻化态势非常明显，严重危害了女性的身心健康。据不完全统计，全球2012年新发宫颈癌528000例，致死266000例，东亚人群的宫颈癌发病率为7.9/10万(Torre，L.A.et al.Global cancer statistics，2012.CA Cancer J Clin 65，87-108，doi：10.3322/caac.21262(2015)，Koh，W.J.et al.Cervical Cancer，Version 2.2015.Journal of the National Comprehensive Cancer Network：JNCCN 13，395-404；quiz 404(2015))。我国每年癌症新发病例居世界首位，其中宫颈癌每年新发13.5万余人，占全球发病总数的1/3。宫颈癌的发病与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续性感染密切相关，所有的侵袭性宫颈癌及95％的宫颈上皮内瘤变、原位癌病理组织中均可检测出HPV(Vaccarella，S.，Lortet-Tieulent，J.，Plummer，M.，Franceschi，S.&Bray，F.Worldwide trends in cervical cancer incidence：impact of screening against changes in disease risk factors.Eur J Cancer 49，3262-3273，doi：10.1016/j.ejca.2013.04.024(2013)，Bosch，F.X.&de Sanjose，S.The epidemiology of human papillomavirus infection and cervical cancer.Dis Markers 23，213-227(2007))。高危型HPV主要为HPV16及HPV18，HPV表达的主要致瘤蛋白E6、E7在由HPV感染发展为宫颈癌的过程中发挥关键作用(Biological agents.Volume 100 B.A review of human carcinogens.IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum 100，1-441(2012))。70～80％的女性一生都感染过HPV，其中10％的女性面临持续性HPV感染的危险状态。早期有效抑制HPV及病毒蛋白E6、E7的表达成为预防宫颈癌的有效途径。
[0003] 目前我国宫颈癌的防治主要通过推广HPV疫苗和普及HPV筛查实现，但这些措施在短期内收效甚微。目前临床诊治中存在以下瓶颈问题：1、在我国HPV疫苗刚刚兴起，适用人群较窄、抗HPV型别有限，且价格昂贵阻碍了疫苗推广；2、尽管我国卫生政策对宫颈癌筛查给予了极大的支持，但民众HPV检测、宫颈癌筛查意识不强使得宫颈癌预防和早期诊断覆盖率并不理想；3、临床上女性生殖道抗HPV传统治疗手段有限，多为使用干扰素等非特异性药物治疗，呈现治疗周期长、副作用明显、经济负担重等缺陷；4、就宫颈癌治疗而言，主要方案有保留或不保留生育功能的手术治疗、放疗以及化疗，但多数方案的临床治疗效果欠佳，甚至出现保留生育功能手术治疗后HPV水平仍居高不下的现象。
[0004] 蜂毒肽是蜂毒的主要成分，占蜂毒干重的45％-50％。蜂毒作用广泛，主要有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、降压、镇痛、缓解风湿以及抗凝等作用。蜂毒肽是分子量为2840的多肽链(甘-异亮-甘-丙-缬-亮-赖-缬-亮-苏-苏-甘-亮-脯-丙-亮-异亮-丝-色-异亮-赖-精-赖-精-谷-谷)，因其独特的结构而具有两亲性：N-端(1-20aa)是疏水性，C-端(21-26aa)是亲水性(Raghuraman，H.&Chattopadhyay，A.Melittin：a membrane-active peptide with diverse functions.Biosci Rep 27，189-223，doi：10.1007/s10540-006-9030-z(2007))。在碱性溶液中或随离子浓度增强时，蜂毒肽自我交联呈α-螺旋四聚体结构，具有膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征，因此既可溶于水，又可溶解细胞发挥细胞毒活性(Andersson，A.，Danielsson，J.，Graslund，A.&Maler，L.Kinetic models for peptide-induced leakage from vesicles and cells.European biophysics journal：EBJ 36，621-635，doi：10.1007/s00249-007-0131-9(2007)，Bello，J.，Bello，H.R.&Granados，E.Conformation and aggregation of melittin：dependence on pH and concentration.Biochemistry 21，461-465(1982))。与目前临床应用的抗肿瘤药物相比，蜂毒肽具有分子量相对较小，免疫原性略低，不易产生过敏反应等优势。因此，蜂毒肽作为抗肿瘤药物近年来获得关注，但蜂毒肽在抗HPV病毒及宫颈癌治疗中的应用没有发现，已经有研究领域如胃癌(Mahmoodzadeh，A.，Zarrinnahad，H.，Bagheri，K.P.，Moradia，A.&Shahbazzadeh，D.First report on the isolation of melittin from Iranian honey bee venom and evaluation of its toxicity on gastric cancer AGS cells.J Chin Med Assoc 78，574-583，doi：10.1016/j.jcma.2015.06.008(2015))、肝癌(Song，C.C.et al.[Effects of melittin on growth and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cell xenografts in nude mice].Ai Zheng 26，1315-1322(2007))、乳腺癌(Jeong，Y.J.et al.Melittin suppresses EGF-induced cell motility and invasion by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in breast cancer cells.Food Chem Toxicol 68，218-225，doi：10.1016/j.fct.2014.03.022(2014))、卵巢癌(Jo，M.et al.Anti-cancer effect of bee venom toxin and melittin in ovarian cancer cells through induction of death receptors and inhibition of JAK2/STAT3 pathway.Toxicol Appl Pharmacol 258，72-81，doi：10.1016/j.taap.2011.10.009(2012))等。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种蜂毒肽的新用途，即蜂毒肽作为治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物的活性成分。
[0006] 所述的高危型HPV为感染Hela细胞的HPV18、感染caski细胞的HPV16。
[0007] 所述的高危型HPV致瘤蛋白为E6、E7蛋白。
[0008] 所述的宫颈癌来自于宫颈癌细胞系Hela(HPV18)、Caski(HPV16)。
[0010] 所述的治疗高危型HPV病毒感染及宫颈癌药物中作为活性成分的蜂毒肽所占比例为0.05-2‰。
[0012] 所述的冰片选自天然冰片和/或合成冰片。
[0013] 针对目前宫颈癌防治进程中的瓶颈问题及蜂毒肽研究中的空白，本发明根据蜂毒肽抗病毒、抗肿瘤等广泛的生物学特性，发现蜂毒肽具有抑制HPV16、HPV18两种宫颈癌高危病毒E6/E7蛋白的表达及抑制宫颈癌细胞生长，促进其凋亡等作用，达到抗HPV病毒的效果，使其可以应用于由于HPV病毒引起的宫颈癌的预防及治疗，开拓了蜂毒肽的一个新的应用领域。附图说明
[0014] 图1为Hela细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，HPV18E7、HPV18E6表达量下降；
[0015] 图2为Caski细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降；
[0016] 图3为经过各给药组处理后的Hela宫颈癌荷瘤小鼠瘤体E6、E7的表达情况：随着蜂毒肽浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降，E6尤为明显，且蜂毒肽8mg/kg给药组E6、E7的表达量明显低于干扰素及顺铂组；
[0017] 图4为经过各给药组处理后的Caski宫颈癌荷瘤小鼠瘤体E6、E7的表达情况：随着蜂毒肽浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降，E6尤为明显，且蜂毒肽8mg/kg给药组E6、E7的表达量明显低于干扰素及顺铂组；
[0018] 图5为Hela细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，细胞数量减少，间隙增大，体积缩小，形态皱缩变圆；
[0019] 图6为Caski细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，细胞数量减少，间隙增大，体积缩小，形态皱缩变圆。
[0020] 图7为不同质量浓度(0，2，4，8，16ug/ml)蜂毒肽作用Hela，Caski 24h，48h。其对Hela，Caski生长抑制作用随着浓度和作用时间的增加而增加；蜂毒肽对Hela，Caski作用24h时的IC50分别为5.008ug/ml，4.327ug/ml；
[0021] 图8为hela细胞经过蜂毒肽处理24h，随着药物浓度的增加，早期凋亡及中晚期凋亡均增加；
[0022] 图9为Caski细胞经过蜂毒肽处理24h，随着药物浓度的增加，早期凋亡及中晚期凋亡均增加，且以早期凋亡增加为主；
[0023] 图10为在各组给药浓度下，宫颈癌荷瘤小鼠瘤体积随时间增加而增大，蜂毒肽对瘤体体积增大的抑制作用呈剂量依赖性增强，其中8mg/kg蜂毒肽对瘤体体积增长的抑制作用明显优于顺铂。
具体实施方式
[0025] 在本发明中提供了蜂毒肽通过抑制高危型HPV16、18型病毒蛋白的表达在抗HPV治疗中的应用和在预防及治疗由HPV感染引起的宫颈癌中的应用，可选地证明蜂毒肽抑制高危型HPV致瘤蛋白的表达，进而提供了蜂毒肽作为活性成分有效抑制宫颈癌生长、促进宫颈癌细胞凋亡的药物。
[0026] 试验例1：蜂毒肽对HPV18 HPV16 E6/E7表达的影响
[0027] (1)细胞培养及总蛋白提取
[0029] b.选取生长至融合率达到80％以上的Hela和Caski细胞，向其加入含终浓度为2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml蜂毒肽的培养基，对照组加入正常培养基继续在5％CO2及37℃条件下培养48小时。
[0030] c.弃废液，PBS冲洗1次，各加入含有EDTA的胰酶消化至细胞变圆。收集各组细胞至离心管，1000rpm×5min离心。弃上清，PBS重悬沉淀，离心1000rpm×5min。弃上清。
[0032] (2)宫颈癌荷瘤小鼠模型的建立及瘤体总蛋白提取。
[0033] a.Balb/c-nu裸鼠，雌性，鼠龄6-8周，体重18-22g，于SPF级环境下饲养，共60只。取处于对数生长期的HeLa、Caski细胞，0.25％胰蛋白酶消化后用无血清培养液离心洗涤2次，并用无血清培养液调整细胞浓度为10^7个/ml。无菌条件下用带6号针头的注射器抽取0.2m1细胞悬液接种于经75％酒精消毒的裸鼠皮下，将Hela、Caski分别接种至右侧腋窝皮下。约4天后被接种裸鼠皮下均出现结节或至肿瘤组织生长至约150mm3时，裸鼠移植瘤模型建立.
[0034] 分组如下：将接种Hela，Caski的鼠分别设置为A，B组，每组分别设置以下6组，每组5只。
[0035] 空白对照组：生理盐水
[0036] 阳性对照组1：顺铂2.5mg/kg
[0037] 阳性对照组2：干扰素250万U/kg
[0038] 低剂量组：2mg/kg
[0039] 中剂量组：4mg/kg
[0040] 高剂量组：8mg/kg
[0041] b.将上述各组剂量的蜂毒肽及对照组试剂多点注射至各组荷瘤小鼠肿瘤部位，每24h给药一次，连续20天。停药后24h，处死动物，剥离瘤块。
[0042] c.干净的剪刀将组织块剪碎。裂解液裂(含PMSF)于组织碎块中，10min漩涡震荡一次，裂解30min后，用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管保存。
[0043] (3)Western blot检测HPV18 E7、HPV16 E7表达
[0044] a.用Pierce BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的蛋白浓度。计算蛋白及loading buffer上样量。
[0045] b.配置上样液，100℃×10min煮样。
[0046] c.SDS-PAGE凝胶电泳：选用4％浓度浓缩胶(80V×30min)、12％浓度分离胶(120V×60min)分离蛋白。
[0047] d.转膜：将目的蛋白及B-actin转印至PVDF膜(300mA×30min)。
[0048] e.5％脱脂奶粉封闭1h。
[0049] f.孵育：一抗(小鼠单克隆HPV18 E7、HPV16 E7一抗，Santa Cruz；兔多克隆B-actin一抗，索莱宝)4℃过夜，二抗(小鼠及兔二抗(索莱宝))室温孵育45min。
[0050] g.ECL法显色。
[0051] 结果见图1至图4，Hela细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，HPV18E7、HPV18E6表达量下降。Caski细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降。经过各给药组处理后的Hela宫颈癌荷瘤小鼠瘤体E6、E7的表达情况：随着蜂毒肽浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降，E6尤为明显，且蜂毒肽8mg/kg给药组E6、E7的表达量明显低于干扰素及顺铂组。经过各给药组处理后的Caski宫颈癌荷瘤小鼠瘤体E6、E7的表达情况：随着蜂毒肽浓度升高，HPV16E7、HPV16E6表达量下降，E6尤为明显，且蜂毒肽8mg/kg给药组E6、E7的表达量明显低于干扰素及顺铂组。
[0052] 对给予不同剂量蜂毒肽的HPV16、HPV18进行体外研究和体内研究，以Western Blotting检测致瘤蛋白E6、E7的表达量。不同剂量分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。体外研究为宫颈癌细胞系Hela(HPV18)、Caski(HPV16)细胞培养。体内研究对象为宫颈癌荷瘤小鼠模型。该方法发现随着蜂毒肽浓度的增加，HPV18 E6/E7及HPV16 E6/E7表达量逐渐降低，说明以蜂毒肽为活性成分的药物可以有效抑制高危型HPV 18及HPV16致瘤蛋白的表达，从而达到抗HPV18、HPV16的效果，进一步预防宫颈癌。
[0053] 试验例2：蜂毒肽对宫颈癌细胞Hela和Caski的影响
[0054] (1)细胞培养及细胞形态学观察
[0055] a.Hela和Caski(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)分别用添加了10％胎牛血清的高糖DMEM和RPMI-1640培养基在5％CO2及37℃条件下培养。
[0056] b.选取生长至融合率达到80％以上的Hela和Caski细胞，向其加入含终浓度为2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml蜂毒肽的培养基，对照组加入正常培养基继续在5％CO2及37℃条件下培养48小时，置于倒置显微镜下观察。
[0057] 结果见图5至图6，Hela细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，细胞数量减少，间隙增大，体积缩小，形态皱缩变圆。Caski细胞经过4个浓度蜂毒肽处理24小时后，随着蜂毒肽浓度升高，细胞数量减少，间隙增大，体积缩小，形态皱缩变圆。
[0058] (2)细胞培养及CCK-8方法检测蜂毒肽对宫颈癌细胞增殖抑制作用
[0059] a.取对数生长期的Hela和Caski细胞3.0*104/ml加入96孔板内，100ul/孔。
[0060] b.常规培养24小时后，分为组，每组3个平行孔，分别加入不同浓度的蜂毒肽，使其终浓度分别达到；对照组加入正常培养液，继续培养48小时。
[0061] c.向各孔内加入CCK-8溶液10ul，避光孵育1小时，用酶标仪测定450nm波长的吸光度(OD值)计算细胞生长抑制率。
[0062] 生长抑制率＝(1-加药组细胞A值/对照组细胞A值)*100％，实验重复三次，以细胞生长抑制率及药物浓度做曲线。
[0063] 结果见图7，不同质量浓度(0，2，4，8，16ug/ml)蜂毒肽作用Hela，Caski 24h，48h。其对Hela，Caski生长抑制作用随着浓度和作用时间的增加而增加；蜂毒肽对Hela，Caski作用24h时的IC50分别为5.008ug/ml，4.327ug/ml。
[0064] (3)细胞培养流式细胞术检测宫颈癌促进细胞凋亡作用
[0065] a.用终浓度为0ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml的蜂毒肽处理Hela和Caski细胞48小时
[0066] b.弃废液，PBS冲洗1次，各加入含有EDTA的胰酶消化至细胞变圆。收集各组细胞至离心管，1000rpm×5min离心。弃上清，PBS重悬沉淀，离心1000rpm×5min，弃上清，重复2次。
[0067] c.吸取100ul Binding Buffer悬浮细胞，加入5ul Annexin V/FITC混均后于室温避光孵育5分钟，加入10ul 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI)，并加400ul PBS，立刻进行流式检测。
[0068] 结果见图8和图9，hela细胞经过蜂毒肽处理24h，随着药物浓度的增加，早期凋亡及中晚期凋亡均增加。Caski细胞经过蜂毒肽处理24h，随着药物浓度的增加，早期凋亡及中晚期凋亡均增加，且以早期凋亡增加为主
[0069] 试验例3：蜂毒肽对宫颈癌荷瘤小鼠瘤体的影响
[0070] (1)宫颈癌荷瘤小鼠模型的建立
[0071] Balb/c-nu裸鼠，雌性，鼠龄6-8周，体重18-22g，于SPF级环境下饲养，共60只。取处于对数生长期的HeLa、Caski细胞，0.25％胰蛋白酶消化后用无血清培养液离心洗涤2次，并用无血清培养液调整细胞浓度为10^7个/ml。无菌条件下用带6号针头的注射器抽取0.2m1细胞悬液接种于经75％酒精消毒的裸鼠皮下，分别将Hela、Caski接种至右侧腋窝皮下。约4天后被接种裸鼠皮下均出现结节或至肿瘤组织生长至约150mm3时，裸鼠移植瘤模型建立.[0072] 分组如下：将接种Hela，Caski的鼠分别设置为A，B组，每组分别设置以下6组，每组5只。
[0073] 空白对照组：生理盐水
[0074] 阳性对照组1：顺铂2.5mg/kg
[0075] 阳性对照组2：干扰素250万U/kg
[0076] 低剂量组：2mg/kg
[0077] 中剂量组：4mg/kg
[0078] 高剂量组：8mg/kg
[0079] (2)蜂毒肽给药检测荷瘤小鼠瘤体变化。
[0080] a.将上述各组剂量的蜂毒肽及对照组试剂多点注射至各组荷瘤小鼠肿瘤部位，每24h给药一次，连续20天。
[0081] b.期间每4天测量瘤体的生长情况，计算瘤体积，绘制瘤体生长曲线。
[0082] 体积V＝长径*短径*纵径
[0083] c.停药后24h，处死动物，剥离瘤块，称重计算。
[0084] 计算瘤重抑制率(％)＝(1-给药组平均瘤重/空白对照组平均瘤重)*100％[0085] 结果见图10，在各组给药浓度下，宫颈癌荷瘤小鼠瘤体积随时间增加而增大，蜂毒肽对瘤体体积增大的抑制作用呈剂量依赖性增强，其中8mg/kg蜂毒肽对瘤体体积增长的抑制作用明显优于顺铂。表1和表2的数据表明，蜂毒肽瘤重抑制率呈剂量依赖性增强，其中8mg/kg蜂毒肽瘤重抑制率明显大于顺铂及干扰素。对给予不同剂量蜂毒肽的宫颈癌进行体外研究和体内研究，不同剂量分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。体外研究为宫颈癌细胞系Hela(HPV18)、Caski(HPV16)细胞培养，通过用在显微镜下观察及CCK-8方法检测蜂毒肽的增殖抑制作用，通过流式细胞术检测蜂毒肽的促凋亡作用。体内研究对象为宫颈癌荷瘤小鼠模型，通过瘤块生长曲线及瘤重抑制率检测蜂毒肽的生长抑制作用。
该方法发现以蜂毒肽为活性成分的药物可以有效的抑制宫颈癌细胞的增殖，且促进其凋亡，进一步蜂毒肽有明显的抗癌作用。
该方法发现以蜂毒肽为活性成分的药物可以有效的抑制宫颈癌细胞的增殖，且促进其凋亡，进一步蜂毒肽有明显的抗癌作用。
[0086] 表1
[0087] Hela荷瘤小鼠的瘤重抑制率
[0088]
[0089] 表2
[0090] Caski荷瘤小鼠的瘤重抑制率
[0091]
[0092] 制备实施例1
[0093] 蜂毒肽宫颈凝胶，主要由蜂毒肽、卡波姆、甘油、三乙醇胺、苯甲醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、水组成，各种成分的含量是每100克凝胶中含有蜂毒肽0.05-1.0g、卡波姆10克、甘油12克、三乙醇胺0.4克、乙二胺四乙酸二钠0.2克、苯甲醇3克，其余为水。卡波姆为凝胶主要成分，形成凝胶；甘油为保湿剂，起到润滑作用；三乙醇胺为碱性中和剂；苯甲醇为防腐剂，起到消毒防腐作用；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)为抗氧化剂，防止产品氧化变性。制备方法：
[0094] 1)按配方量称取卡波姆加入60％的注射用水浸泡溶胀，静置10-15小时，形成透明水凝胶，调PH5-6，制成基质。
[0095] 2)再加入配方量的甘油、三乙醇胺、苯甲醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，乳化搅拌1-2小时后加入剩余注射用水继续搅拌20-60分钟，搅拌均匀，形成卡波姆凝胶。
[0096] 3)得到的凝胶按照每支5克的规格要求的重量进行灌装包装后得到蜂毒肽宫颈凝胶产品。
[0097] 制备实施例2
[0099] 1)按配方量的乳糖与枸橼酸，进行充分混合，蜂毒肽与碳酸氢钠、十二烷基硫酸钠混合。
[0100] 2)加无水乙醇溶液适量，制湿颗粒，混匀，过20目筛，42～45℃干燥4～6小时烘干，得泡腾颗粒。
[0101] 3)按配方将溶液稀释成适当浓度，过80目筛。
[0102] 4)42～45℃烘干4-6小时；测水分含量，水分含量应在1％以下，得蜂毒肽颗粒。
[0103] 5)加入硬脂酸镁，压片、包装，得蜂毒肽阴道泡腾片。
[0104] 制备实施例3
[0105] 蜂毒肽冲洗剂的基本成份为EDTA二钠、甘油、无味乳浊剂、薄荷、冰片等。
[0106] 配制1kg的洗剂生产流程叙述如下。所述原料的重量比例为：蜂毒肽0.05-1.0g，桉树油1g，EDTA二钠10g，甘油2.5g，无味乳浊剂2.5g，薄荷0.1g，冰片0.5g。
[0107] 制作流程：
[0108] 1)将蜂毒肽、EDTA二钠、甘油、无味乳浊剂加入总量60％的纯净水中搅匀。
[0109] 2)将桉树油、薄荷、冰片(冰片先用95％乙醇1％溶解)，混合后加入＞80℃的纯净水5％，充分溶解搅匀后加入上液。
[0110] 3)最后加入纯净水至要求配制的液体总量充分搅匀后即可灌装。
[0111] 制备实施例4
[0112] 蜂毒肽生物蛋白敷料，成分包括(以制备一千克凝胶敷料为例)分别为蜂毒肽0.05-1.0g、卡波姆20g、绿茶提取物10g、甘油25g，三氯生2.5g。
[0113] 制备方法：
[0114] 1)将甘油和绿茶提取物加入到800～900g纯水中，搅拌溶解后加入卡波姆，用高速分散机使其充分溶解。
[0115] 2)然后将用0.25μm的膜过滤过的蜂毒肽加入上述体系中，继续搅拌使其均匀。
[0116] 3)将三氯生溶于少量碱中加入其中，用纯水将其补足一千克，搅拌均匀。
[0117] 4)用质量浓度为20％的NaOH溶液将得到的一千克凝胶敷料调节pH值至4.5到6.5之间。
[0118] 制备实施例5
[0119] 蜂毒肽软膏，成分包括(每100g)：蜂毒肽0.05-1.0g、蜂胶15g、油相基质10g、乳化剂5g、渗透促进剂2g、防腐剂0.05g和其余为水；所述所述油相基质由凡士林、聚乙二醇400和丙二醇按体积比0.5：1：2组成，所述渗透促进剂由冰片和薄荷醇按重量比1：0.8组成。
[0120] 制备方法：
[0121] 1)取蜂胶原料10g～50g粉碎，放入1000ml锥形瓶中，加入95％乙醇溶液放入超声波内使其溶解，再用95％乙醇溶液在超声波内冲洗至蜂胶完全溶解，将上清液过滤后再移入旋转瓶内将溶液蒸发，剩余液体倒入蒸发皿中，放入真空干燥箱内，加入蜂毒肽1.0-2.0g，将残留乙醇完全去除，得到蜂毒肽-蜂胶粘质备用。
[0122] 2)取油相基质加热至75℃，加入渗透促进剂，搅拌至完全溶解，得油相液；
[0123] 3)将乳化剂加入水中加热至75℃，搅拌至完全溶解，得水相液；
[0124] 4)将步骤1)得到的蜂毒肽-蜂胶粘质与2)得到的油相液和3)得到的水相液中混合，接着加入防腐剂，在1000rpm下搅拌50min，即得蜂毒肽软膏。
[0125] 制备实施例6
[0127] 制法：
[0128] 1)将硬脂酸聚烃氧(40)酯置化料罐中，加热，搅拌直至基质完全溶解并维持温度在76-84℃；
[0129] 2)将(1)步骤所得物步骤所得物经200目筛过滤后，转移至调配罐中；
[0130] 3)取蜂毒肽，加入调配罐中，混合、搅拌使药膏均匀分散，并依次加入白矾、硼酸，保持搅拌；樟脑、冰片用少量乙醇溶解后一并加入调配罐中，搅拌均匀，均质使药膏完全均匀分散；
[0131] 4)控制药液温度在40-50℃，灌装，冷冻，即得蜂毒肽栓剂。
[0132] 临床实施试验
[0133] 此实验为本发明蜂毒肽凝胶实施例1对不伴高级别宫颈病变的HPV持续感染者疗效的的临床记录。研究对象选择：为HPV持续感染(HPV—DNA检测阳性，6个月后复查仍阳性)且不伴高级别宫颈病变。
[0134] 一、入选标准：
[0135] 1既往无宫颈手术史
[0136] 2排除宫颈高级别病变及癌变(行TCT检查，对于TCT结果为ASCUS及以上的患者进一步行阴道镜检查)
[0137] 3无蜂毒肽禁忌症
[0138] 4半年内未使用抗病毒药物及免疫调节制剂
[0139] 5非妊娠期、哺乳期女性
[0141] 7无不规则阴道出血
[0142] 8无免疫功能低下(恶性肿瘤，SLE，艾滋病等)
[0143] 9有随访条件并配合治疗
[0144] 10所有患者签署知情同意书，自愿参加本次临床试验
[0145] 二、排除标准：
[0146] 1免疫功能低下者，如肿瘤术后或放、化疗后，艾滋病及系统性红斑狼疮等；
[0147] 2妊娠和哺乳期妇女；
[0148] 3患有急性生殖道炎症，如淋病、支原体或衣原体感染等；
[0149] 对照组：不使用任何药物干预，观察期间患者使用避孕套避孕；
[0150] 治疗组：睡前清洗外阴后，使用推进器将药物推送至穹窿部，一次1g，一日一次连用10天后停药，下个月经周期重复。月经期停用，下一周期从月经干净后第3-5天开始用药，连续使用3个月经周期后复查HPV，HPV转阴患者停止用药，HPV未转阴患者再继续使用蜂毒肽凝胶3个月经周期：用药期间禁止坐浴及性生活，用药后半年内使用避孕套避孕。
[0151] 疗效判断方法：
[0152] 转阴显效：复查时HPV(-)；
[0153] 有效：于复查HPV感染定量减少，但并未完全清除；
[0154] 无效：复查时，HPV感染定量没有改变或定量增加。
[0155] 结果：治疗3个月治疗组HPV清除率和有效率均比对照组高。6个月后，治疗组HPV清除率和有效率也均比对照组高。用药后3个月及6个月后复查治疗组与对照组的疗效对比详见下表3。
[0156] 表3
[0157]
[0158] 注：清除率＝N转阴/N总人数×100％有效率＝(N转阴+N有效)/N总人数×100％[0159] 以上结果说明本发明蜂毒肽对人HPV感染治疗有显著疗效。
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