蜂毒肽的提纯方法
专利汇可以提供蜂毒肽的提纯方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种 蜂毒 肽的分离提纯方法，是将粗蜂毒用 水 浸洗，滤液用 乙醇 沉淀，沉淀物用氢 氧 化铵和正丁醇萃取，萃取液以丙 酮 沉淀，使沉淀物溶于脲的 醋酸 盐缓冲液A中，在离子交换柱上作洗脱层析，柱下收集溶血活性最强吸收蜂V的层析馏份浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶G－10柱脱盐，丙酮沉淀，再溶解、脱盐沉淀处理，沉淀物溶于醋酸盐缓冲液B中，在葡聚糖凝胶G－25柱上以缓冲B液作梯度洗脱，柱下收集吸收蜂II时层析馏份浓缩、脱盐 冷冻干燥 即得到 电泳 级 蜂毒肽 。本 发明 工艺减化后生产周期缩短1.5～2天，蜂毒肽收率比现有方法提高7～8％，提纯成本降低约30％，实现了蜂毒肽的工业化生产。，下面是蜂毒肽的提纯方法专利的具体信息内容。
1、蜂毒肽的提纯方法，是将粗蜂毒用水浸洗，溶媒萃取、凝胶过滤柱层析的方法，从蜂毒中提取蜂毒肽，其特征是：1)将粗蜂毒加水浸洗，去除不溶物杂质，滤液用乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1加入氢氧化铵与正丁醇溶液萃取，弃除沉淀，蒸馏回收正丁醇，浓缩物加丙酮沉淀得沉淀物2；2)将沉淀物2溶解于脲的醋酸盐缓冲液A中，在离子交换凝胶CM-Sephrose.FF柱上，用缓冲液A梯度洗脱层析；3)在离子交换凝胶柱下收集溶血活性最强的吸收峰V时的层析馏份进行浓缩，浓缩液通过葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，脱盐浓缩物用丙酮沉淀得到沉淀物3；4)将沉淀物3溶于盐酸胍、亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸混合溶液中，再将溶液浓缩，通过葡聚糖凝胶柱脱盐，用丙酮沉淀得沉淀物4；5)将沉淀物4溶解于醋酸盐缓冲液B中，在葡聚糖凝胶G-25柱上，用缓冲液B梯度洗脱层析，在柱下收集溶血活性最强的吸收峰II时的层析馏份进行浓缩，于葡聚糖凝胶柱G-10上脱盐、冷冻干燥即得到蜂毒肽。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征是缓冲液A和缓冲液B的 PH=4.2〜5. 0,盐酸胍、亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸混合溶液用0. 15M氢氧化铵调 整PH达7. 0。
3、 按照权利要求1所述的方法，其特征是浸洗粗蜂毒滤液用20倍无水乙 醇沉淀，中间过程中脱盐、沉淀釆用3倍量的丙酮进行沉淀。
蜂毒肽的提纯方法
技术领域
背景技术
该方法为分离方法，蜂毒肽纯度达不到电泳级纯度，因此应用领域大大受到限 制。
发明内容
本发明方法是将粗蜂毒用水浸洗，溶媒萃取、凝胶过滤柱层析的方法，从 蜂毒中提取蜂毒肽，其特征是1) 将粗蜂毒加水浸洗，去除不溶物杂质，滤液用乙醇沉淀，去除乙醇水液， 沉淀物1加入氢氧化铵与正丁醇溶液萃取，弃除沉淀，蒸馏回收正丁醇，浓缩
物加丙酮沉淀得沉淀物2;
2) 将沉淀物2溶解于脲的醋酸盐缓冲液A中，在离子交换凝胶 CM-Sephrose.FF柱上，用缓冲液A梯度洗脱层析；
3) 在离子交换凝胶柱下收集溶血活性最强的吸收峰V时的层析馏份进行浓 缩，浓缩液通过葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，脱盐浓缩物用丙酮沉淀得到沉淀物3;
4) 将沉淀物3溶于盐酸胍、亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸混合溶液中，再将溶 液浓缩，再通过葡聚糖凝胶柱脱盐，用丙酮沉淀得沉淀物4;
5) 将沉淀物4溶解于醋酸盐缓冲液B中，在葡聚糖凝胶G-25柱上，用缓 冲液B梯度洗脱层析，在柱下收集溶血活性最强的吸收峰II时的层析馏份进行 浓缩，于葡聚糖凝胶柱G-10上脱盐、冷冻干燥即得到蜂毒肽。
在离子交换凝胶柱及葡聚糖凝胶柱上进行层析时使用的缓冲液A和缓冲液B 的PH为4. 2-5.0，使用梯度混合仪进行梯度洗脱。盐酸胍、亚硫酸钠和对氯汞 苯甲酸混合溶液用0. 15M的氢氧化铵调整PH值达7. 0，盐酸胍、亚硫酸钠和对 氯汞苯甲酸的浓度分别为3M、 0. 055M和0. 0023M。在浸洗粗蜂毒时的滤液用20 倍的无水乙醇沉淀；中间过程中的脱盐、沉淀，釆用3倍量的丙酮进行沉淀。
采用本方法生产的蜂毒肽纯度可达电泳级纯度，满足了更多领域特别是临 床应用的技术要求；蜂毒肽的提取率比现有方法均高出7~8%，工艺步骤减化， 提纯生产周期比原来减少1.5~2天，提纯成本比原来降低约30%。
下面结合实施例对本发明作详细描述。
取粗蜂毒20g加入100ml蒸馏水分三次浸洗，用中性滤纸过滤，蜜蜂蛰针 等不溶物杂质弃除。滤液用20倍无水乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1溶于1200ml 0. 15M的氢氧化铵中，再加入800ml正丁醇振摇2hr。用分液漏斗分离， 沉淀物弃除，蒸馏回收萃取液中正丁醇，浓缩物用三倍的丙酮沉淀；沉淀物2 溶解于1000 mL含有4mol/L脲的醋酸盐缓冲液中，PH为4.75，此为缓冲液 A,上离子交换凝胶CM-Sephrose. FF柱，用缓冲液A+0. 5mol/L氯化钠进行梯 度洗脱。洗脱液以溶血试验进行蜂毒肽的生物活性跟踪，在离子凝胶柱下收集 溶血活性作用最强的吸收峰V时的层析馏份共1000ml,蒸发浓缩至100mi。浓 缩液通过葡聚糖凝胶G-IO柱脱盐，脱盐浓缩物用三倍的丙酮沉淀。沉淀物3溶 解于2000 mL的含有3 mol/L盐酸胍、55咖ol/L亚硫酸钠和2. 3咖ol/L对氯 汞苯甲酸的溶液中，整个溶液用NH, OH调到pH 7.0，在37 土2。C下保温2hr， 蒸发浓缩溶液至200ml,再通过葡聚糖凝胶柱G—10脱盐，用3倍的丙酮沉淀。 沉淀物4溶解于500 mL醋酸铵缓冲液（O. 05 mol /L ， pH 4. 75,此为缓冲液B) 中，上葡聚糖凝胶G-25柱，用缓冲液B进行梯度洗脱（用梯度混合器），洗脱 液以溶血试验进行蜂毒肽的活性跟踪，柱下收集溶血活性作用最强的吸收峰II 时的层析馏份共800ml，浓缩至100ml，用葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，冷冻干燥, 最后得到冻干物蜂毒肽9.4g。产物蜂毒肽的收率为47% 。
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