质膜囊泡及其制备和使用方法
阅读：501发布：2020-07-26
专利汇可以提供质膜囊泡及其制备和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种质膜囊泡，该质膜囊泡的制备方法和使用该质膜囊泡的方法。，下面是质膜囊泡及其制备和使用方法专利的具体信息内容。
1.一种用于制备质膜囊泡的方法，其包括：
将细胞与囊泡形成剂接触；
从而制备质膜囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括机械搅动所述细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是粘附细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞在悬浮液中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述囊泡形成剂含有巯基封闭剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述巯基封闭剂选自由以下组成的组：甲醛、丙酮醛、乙醛、乙二醛、戊二醛、丙烯醛、异丁烯醛、吡哆醛、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、马来酰亚胺、氯汞基苯甲酸盐(酯)、碘醋酸盐(酯)、亚砷酸钾、亚硒酸钠、乙基汞硫代水杨酸钠(硫柳汞)、过氧化苯甲酰、氯化镉、过氧化氢、亚碘酰基苯甲酸、美拉鲁莱钠、(汞希德林)、氯化汞、氯化亚汞、氯汞丙脲(汞丙脲)、苯肼、亚碲酸钾、丙二酸钠、对亚砷酰苯甲酸、5，5′-二氨基-2，2′-二甲基偶砷苯、N，N′-二亚甲基磺酸二钠盐、碘乙酰胺、氧苯胂(马法胂)、氯化金、对氯汞基苯甲酸、对氯汞基苯磺酸、氯化铜、碘汞溴红(红汞)、卟啉啶、高锰酸钾、汞撒利(撒利甘)、硝酸银、强银蛋白(强蛋白银)和乙酸双氧铀。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述囊泡形成剂含有二硫苏糖醇(DTT)和甲醛。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述囊泡形成剂是细胞毒素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞毒素是细胞松弛素B或蜂毒素。
11.根据权利要求1所述的方法，其中通过摇动器机械搅动所述细胞。
12.根据权利要求1所述的方法，其中通过超声破碎机械搅动所述细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在将细胞与所述囊泡形成剂接触之前洗涤细胞以除去培养基。
14.根据权利要求1所述的方法，进一步包括纯化所述质膜囊泡。
15.根据权利要求14所述的方法，其中通过过滤、密度梯度离心或透析中的任何一种或多种纯化所述质膜囊泡。
16.一种用于制备高纯度质膜囊泡的方法，其包括以下步骤中的一个或多个：
将权利要求1-15任一项所述的质膜囊泡与烷基化剂和还原剂接触；
将权利要求1-15中任一项所述的质膜囊泡与碱性溶液接触；
对权利要求1-15中任一项所述的质膜囊泡使用超声破碎以释放囊泡内污染物；
对权利要求1-15中任一项所述的质膜囊泡使用超速离心以清洁所述质膜囊泡；和用缓冲溶液洗涤权利要求1-15中任一项所述的质膜囊泡。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述烷基化试剂是碘乙酰胺。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述碱性溶液的pH至少为11。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述碱性溶液为Na2CO3或NaOH。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述质膜囊泡的直径为20μm以下。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述质膜囊泡的直径为10μm以下。
22.根据权利要求1-21任一项所述的方法，其中所述质膜囊泡含有跨膜蛋白。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述跨膜蛋白选自跨膜α-螺旋蛋白、跨膜β-桶形蛋白、脂质锚定膜蛋白和外周膜蛋白。
24.根据权利要求22所述的方法，其中跨膜蛋白选自由酶、转运蛋白、受体、通道、细胞粘连蛋白、G蛋白、GTP酶组成的组。
25.根据权利要求1-21任一项所述的方法，其中所述质膜囊泡含有脂质锚定蛋白。
26.一种用于分析细胞的膜蛋白质组的方法，其包括：
将权利要求1-25中任一项所述的质膜囊泡与一种或几种蛋白酶接触；或与几种连续蛋白酶接触；
分析由所述蛋白酶产生的肽；
从而分析细胞的膜蛋白质组。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
29.根据权利要求26所述的方法，进一步包括分离蛋白片段。
30.根据权利要求26所述的方法，其中通过质谱分析所述肽片段。
31.一种鉴定跨膜蛋白的调节因子的方法，其包括：
用编码目标蛋白的核酸分子转化细胞；
通过权利要求1-25中任一项所述的方法制备质膜囊泡；
将所述质膜囊泡与候选调节因子接触；
测定候选调节因子是否能够调节跨膜蛋白；
从而鉴定跨膜蛋白的调节因子。
32.根据权利要求31所述的方法，其中通过测量报告基因的活性来测定所述候选调节因子调节跨膜蛋白的能力。
33.一种测定化合物对跨膜蛋白质组的效果的方法，其包括：
将细胞与化合物接触；
通过权利要求1-22中任一项所述的方法制备质膜囊泡；
分析存在于所述质膜囊泡中的多肽；
从而测定化合物对所述跨膜蛋白质组的效果。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述化合物是小分子、多肽、肽、核酸分子、RNAi、shRNA或miRNA。
35.根据权利要求31所述的方法，进一步包括将所述质膜囊泡与蛋白酶接触。
36.根据权利要求35所述的方法，进一步包括通过质谱法分析由所述蛋白酶产生的肽。
37.一种分析权利要求1-22中任一项所述的质膜囊泡中的蛋白质的方法，其包括：
将所述质膜囊泡粘附到表面；
将所述质膜囊泡与一种或多种蛋白酶接触；
分析产生的肽以测定蛋白质的特性。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述表面在微流体设备中。
39.根据权利要求37所述的方法，其中通过质谱分析所述肽。
40.一种从细胞膜中提取脂质的方法，其包括：
诱导一种或多种细胞形成囊泡；
分离所述膜囊泡；
用有机溶剂提取所述膜囊泡；
从所述有机溶剂中分离所述脂质；
从而从所述细胞膜中提取所述脂质。
41.根据权利要求40所述的方法，进一步包括分析所述脂质。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述分析包括鉴定存在的脂质和/或对存在的一种或多种脂质的量进行量化。
43.根据权利要求40所述的方法，进一步包括将细胞与化合物接触以检验对细胞膜中的脂质含量或脂质量的效果。
44.一种单分散质膜囊泡种群。
45.根据权利要求44所述的质膜囊泡，其中所述质膜囊泡的直径为5μm至25nm。
46.根据权利要求44所述的质膜囊泡，其中所述质膜囊泡的直径为50μm至500μm。
47.根据权利要求44所述的质膜囊泡，其中所述质膜囊泡的直径为100μm至200μm。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的种群，其中所述种群已富集了给定膜蛋白。
49.根据权利要求48所述的种群，其中所述膜蛋白是跨膜蛋白。
50.根据权利要求48所述的种群，其中所述膜蛋白是脂质锚定蛋白。
51.根据权利要求50所述的种群，其中通过免疫组织化学富集所述种群。
52.根据权利要求44-51中任一项所述的质膜囊泡种群，其中所述质膜囊泡没有细胞器或细胞骨架结构。
53.根据权利要求40所述的方法，进一步包括将提取的脂质用于重构目的。
质膜囊泡及其制备和使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2008年4月21日提交的美国临时申请61/046,479的权益，通过参考将其全部内容清楚地并入本文。
背景技术
[0003] 生物膜(biomembranes)或生物性膜(biological membranes)是将细胞从周围环境(即，质膜)中分离开以及构造细胞内部结构，如细胞器(例如，高尔基复合体、内质网和线粒体)和细胞核的壁。这种壁结构的功能包括用于细胞的以下方法：调节和控制物质进出、细胞内不同细胞器间物质的包装和运输，为某些试剂或信号物质提供特定运输通路，以及当然通过形成细胞体内的区室(compartments)提供容积(containment)(Lehninger等，1993)。
[0004] 由于质膜蛋白占所有已知药物靶点(如，离子通道和G蛋白偶联受体)的～70％，有效的质膜蛋白质组和脂质组分析(lipidomic analysis)对于阐明其功能和发现药物研发的新靶点极其重要。分析膜蛋白质组的方法正在不断地发展中，并会定期出现新的方法，当前趋势是对膜的脂质构成及其功能的兴趣正在增加。
[0005] 膜蛋白质组和脂质组分析中的困难主要由亚细胞区室内以及质膜内的脂质和膜蛋白的分布引起。为了将识别的蛋白质和脂质分配到它们原来的位置，必须能辨别膜亚定位(sub location)。为了达到该目的，通常需要典型地通过细胞裂解，随后通过差示和/或密度梯度离心来分离亚细胞器。该方法依赖主要由脂质：蛋白质比和组成决定的细胞器的固有密度的分离。能够达到将细胞器富集到一定程度，但是由于不同细胞器的膜可以具有非常相似的密度，级分(fraction)之间经常存在组成重叠。因此，利用该方法，物理学规律不能使不同膜蛋白材料完全分离。另外的困难是以下事实：内膜系统是互相联系的。囊泡和细管运输通过分泌和内吞途径交换物质，再次导致膜蛋白和脂质分布的重叠。因此正如已通过蛋白相互关系分析法(protein correlation profiling)等观察到的，许多膜蛋白被分配到多个细胞位置。已开发用于蛋白质组研究的分离质膜的各种方法，如亲和性富集，但是这些方法普遍存在其它细胞器仍占鉴定的膜蛋白～30-40％的污染问题，这阻碍了独特质膜蛋白的鉴定。同样的情况自然也适用于质膜脂质的分析。如果有人检测出不同细胞类型甚至是相同细胞类型内的细胞器之间的生物膜组成，则不同脂质种类的变化性和数量是惊人的(Schmidt和MacKinnon，2008)。生物膜中脂质种类的多样性在某种程度上与膜的功能相关联，如某些蛋白质仅在某些脂质存在时发挥功能。另外，许多过程涉及到通过生物膜内的带电脂质来静电控制蛋白质吸附，这种带电脂质本身能够调节生物膜表面上发生的反应。更进一步进行生物膜检测，还可推断出质膜的两个单层之间各种脂质种类分布的不对称性。例如，磷脂酰胆碱主要发现于质膜的外单层，而大部分磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸位于内单层(Langner和Kubica，1999)。这最可能反映出单层功能的两重性，外单层或多或少地提供了对周围环境的惰性屏障，而内表面通过由如磷脂酰丝氨酸组分产生的净电荷提供发生反应的位点。
[0006] 因此，存在发现有助于研究和表征质膜内膜蛋白和脂质的方法和组成的需求。发明内容
[0007] 本发明至少部分地基于本发明人的发现，即制备高纯度质膜囊泡的方法及其使用方法。一方面，本发明提供用于生产质膜囊泡的方法，其包括，将细胞与囊泡形成剂(vesiculation agent)接触，由此生产质膜囊泡。在一个实施方案中，该方法进一步包括机械搅动细胞。
[0009] 在一个实施方案中，囊泡形成剂包含巯基封闭剂，如甲醛、丙酮醛、乙醛、乙二醛、戊二醛、丙烯醛、异丁烯醛、吡哆醛、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、马来酰亚胺、氯汞基苯甲酸盐(酯)、碘醋酸盐(酯)、亚砷酸钾、亚硒酸钠、乙基汞硫代水杨酸钠(硫柳汞)、过氧化苯甲酰、氯化镉、过氧化氢、亚碘酰基苯甲酸、美拉鲁莱钠、(汞希德林(mercuhydrin))、氯化汞、氯化亚汞、氯汞丙脲(汞丙脲)、苯肼、亚碲酸钾、丙二酸钠、对亚砷酰苯甲酸、5，5′-二氨基-2，2′-二甲基偶砷苯、N，N′-二亚甲基磺酸二钠盐、碘乙酰胺、氧苯胂(马法胂)、氯化金、对氯汞基苯甲酸、对氯汞基苯磺酸、氯化铜、碘汞溴红(红汞)、卟啉啶(1-羟基-2-[(E)-(1-羟基-4-亚氨基-5，5-二甲基咪唑-2-基)二氮烯基]-5，5-二甲基咪唑基-4-亚胺(porphyrindin))、高锰酸钾、汞撒利(撒利甘)、硝酸银、强银蛋白(强蛋白银)和乙酸双氧铀。
[0010] 在具体实施方案中，囊泡形成剂包含二硫苏糖醇(DTT)和甲醛。
[0011] 在可选实施方案中，囊泡形成剂是细胞毒素，如细胞松弛素B或蜂毒素。
[0012] 在其它实施方案中，通过摇动器或通过超声破碎机械搅动细胞。
[0013] 在其它实施方案中，该方法进一步包括在将细胞与囊泡形成剂接触之前，洗涤细胞以除去培养基。
[0014] 在其它实施方案中，该方法进一步包括如通过过滤、密度梯度离心或透析中的任意一种或多种纯化质膜囊泡。
[0015] 在其它实施方案中，本发明的方法进一步提供包括一个或多个以下步骤的制备高纯度质膜囊泡的方法：
[0016] 将质膜囊泡与烷基化剂和还原剂接触；
[0017] 将质膜囊泡与碱性溶液接触；
[0018] 对质膜囊泡施用超声破碎来释放囊泡内的污染物；
[0019] 对质膜囊泡施用超速离心来清洁质膜囊泡；和
[0020] 用缓冲溶液洗涤质膜囊泡。
[0021] 在相关实施方案中，烷基化试剂是碘乙酰胺。在更相关实施方案中，碱性溶液的pH至少为11。在又一实施方案中，碱性溶液是Na2CO3或NaOH。
[0022] 在其它实施方案中，质膜囊泡的直径为20μm以下，或10μm以下。
[0023] 在有些实施方案中，质膜囊泡含有跨膜蛋白，如跨膜α-螺旋蛋白、跨膜β-桶形蛋白、脂质锚定膜蛋白和外周膜蛋白。
[0024] 在示例性实施方案中，跨膜蛋白选自由酶、转运蛋白、受体、通道、细胞粘连蛋白、G蛋白、GTP酶组成的组。
[0025] 在其它实施方案中，质膜囊泡含有脂质锚定蛋白。
[0026] 在其它实施方案中，质膜囊泡含有与质膜囊泡来源的细胞类型相关的特定组成的脂质。
[0027] 在另一方面，本发明提供通过以下步骤来分析细胞的膜蛋白质组的方法：将本文所述的质膜囊泡与一种或多种蛋白酶，或多种连续蛋白酶接触，分析由所述蛋白酶产生的肽，由此分析细胞的膜蛋白质组。
[0028] 在具体实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
[0029] 在另外的实施方案中，该方法进一步包括分离蛋白片段。在示例性实施方案中，通过质谱法分析肽片段。
[0030] 在另一方面，本发明提供通过以下步骤来鉴定跨膜蛋白的调节因子的方法：用编码目标蛋白的核酸分子转化细胞，通过本文所述的方法生产质膜囊泡，将质膜囊泡与候选调节因子(modulator)接触，测定该候选调节因子是否能够调节跨膜蛋白，由此鉴定跨膜蛋白的调节因子。在相关实施方案中，通过测量报告基因的活性测定候选调节因子调节跨膜蛋白的能力。
[0031] 在另一方面，本发明提供通过以下步骤来测定化合物对跨膜蛋白质组效果的方法：将细胞与化合物接触；由本文描述的方法生产质膜囊泡，分析存在于质膜囊泡的多肽，由此测定化合物对跨膜蛋白的效果。在示例性实施方案中该化合物是小分子、多肽、肽、核酸分子、RNAi、shRNA或miRNA。
[0032] 在相关实施方案中，该方法进一步包括将质膜囊泡与蛋白酶接触。在另外的实施方案中，该方法进一步包括通过质谱法分析由蛋白酶产生的肽。
[0033] 在另一方面，本发明提供通过以下步骤分析本文所述质膜囊泡中的蛋白质的方法：将质膜囊泡粘附到表面，将质膜囊泡与一种或多种蛋白酶接触，和分析产生的肽，以确定蛋白质特性。
[0034] 在一个实施方案中，表面在微流体设备中。在另外的实施方案中，通过质谱法分析肽。
[0035] 在另一方面，本发明提供通过以下步骤分析质膜脂质组分的方法：将细胞与化合物接触；通过本文所述的方法产生质膜囊泡，和提取脂质组分用于进一步分析。
[0036] 在相关方面，脂质成分的提取可以根据脂质靶标成分通过多种方法进行。
[0037] 在另一方面，本发明提供测定当在提取的质膜脂质中重构跨膜蛋白时脂质组成效果的方法。在这方面，化合物接触细胞，由本文所述的方法产生质膜囊泡，同样通过本文所述的方法提取脂质组分，并最终将膜蛋白重构于提取的脂质中。在相关方面，重构涉及到借助于如去污剂将膜蛋白从其天然膜中提取出来，并将它们插入脂质膜环境中。
[0038] 在另一实施方案中，本发明提供用于研究跨质膜运输的方法和应用、吸收研究以及物质与质膜的膜相互作用研究。在相关方面，所述物质可以是，但不限于肽、蛋白质、糖、胆固醇和各种形式的DNA和RNA。
[0039] 在另一方面，本发明提供单分散质膜囊泡的种群(populations)。在示例性实施方案中，质膜囊泡的直径为5μm至25nm，50μm至500μm，或100μm至200μm。
[0040] 在相关实施方案中，所述种群已富集了给定膜蛋白，如跨膜蛋白或脂质锚定蛋白等。在相关实施方案中，通过免疫组织化学或亲和纯化富集所述种群。
[0042] 图1：将细胞培养物生长至汇合(A)后，通过吸取(aspiration)除去生长培养基并洗涤2次以除去残余生长培养基污染物(B)。(C)将囊泡形成溶液添加到细胞层，(D)质膜囊泡在细胞表面形成，并在孵育过程中出芽进入溶液。搅动烧瓶促进PMV脱落。(E)小心地从细胞层中吸取质膜囊泡溶液，并转移到锥形管(F)以获得粗质膜囊泡液。
[0043] 图2：(A-B)将2M蔗糖溶液铺在收获的含有细胞的质膜囊泡溶液下面以提供高密度相。(C)用摆动式转子(swing-out rotor)将溶液低速离心。在离心过程中只有分开的细胞和细胞碎片粒状沉淀(pelleted)在高密度蔗糖相中，而质膜囊泡留在低密度缓冲相中。(D)小心地吸取含有质膜囊泡的上层相，转移到大截留透析膜内，放入HEPES缓冲液中透析。(F)透析过程中，除去囊泡形成剂和低MW蛋白，得到超纯质膜囊泡溶液。
[0044] 图3：(A-B)将纯化的质膜囊泡暴露于还原剂和烷基化剂以暴露切割位点并防止蛋白聚集。(C)用Na2CO3在高pH下洗涤质膜囊泡溶液以破坏非共价蛋白-蛋白相互作用，从膜中解离细胞质蛋白。声处理(sonication)破坏质膜囊泡并释放它们的细胞溶质内含物。(D)超速离心质膜囊泡，并吸取上清液(E-F)以除去由PMV内含物释放的污染物。(G)漂洗膜粒状沉淀并在缓冲液中声处理以得到超纯小尺寸质膜囊泡溶液。
[0045] 图4：(A-B)通过入口管嘴注射质膜囊泡溶液而将处理的质膜囊泡固定到流式细胞表面。(C-D)注射蛋白酶后，切割膜蛋白表面暴露的结构域，产生确定的一组肽。将这些经出口管嘴从芯片中洗脱掉(D)。(E)通过LC-MS/MS分析和处理洗脱出的肽样品。
[0046] 图5：比较纯化的质膜囊泡和微粒体中鉴定的膜蛋白。与微粒体中79种中仅17种相比，在质膜囊泡中，43种膜蛋白中有32种独特地与质膜相关。总之，～44％的微粒体膜蛋白是质膜相关的，而PMV分析得到93％的PM相关蛋白。
[0047] 图6：质膜囊泡中发现的质膜蛋白类型。GTP酶包含最多级分，之后是G蛋白和与细胞粘附功能相关的蛋白。质膜囊泡的膜蛋白组装知识允许在单个质膜囊泡中开展活性检测。
[0048] 图7：具有独特定位的锚定膜蛋白的亚细胞分布的比较。(A)质膜囊泡膜中的分布(B)微粒体膜中的分布。
[0049] 图8：甘油磷脂的结构。这些结构的主链是通过酯键连接到两个烷基链或各种饱和度的脂肪酸的丙三醇分子。通过磷酸脂分子的第三种连接限定了脂质的头基(head-group)。该图还指出了脂质在pH7时的净电荷。磷脂酰胆碱是两性离子脂质，意思是该脂质含有在中性pH值时互相抵消的正负两种电荷。
[0050] 图9：鞘脂类的结构，其含有作为主链的长链胺醇鞘氨醇，和长链脂肪酸以及极性头部醇，其还能够进一步经例如磷酸二酯键连接到其它极性头基。在该组中最简单的化合物是神经酰胺，该图还示出来自三个不同族的鞘脂类的实例：鞘磷脂、糖脂和神经节苷脂。该图中使用的糖符号是：Glc，D-葡萄糖；Gal，D-半乳糖；GalNAc，N-乙酰基-D-半乳糖胺；
NeuNAc，N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。
NeuNAc，N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。
具体实施方式
[0051] 本发明提供质膜囊泡以及制备质膜囊泡的方法。本文提供的该方法允许本领域技术人员从他们所选的任何细胞类型中制备质膜囊泡。在某些实施方案中，本文所述的质膜囊泡可以和WO 2006/068619所述的设备(通过参考将该专利的内容清楚地并入本文)使用。
[0052] 质膜囊泡的制备
[0053] 本发明提供含有膜蛋白的质膜囊泡的生产和应用。在一个实施方案中，质膜囊泡没有细胞器或细胞基质物质。
[0054] 在一方面，本方法允许生产高纯度和/或单分散质膜囊泡。
[0055] 关于“单分散”是指具有相似大小的质膜囊泡种群。在优选实施方案中，本发明的质膜囊泡种群的成员直径在彼此的大约20％、15％、10％、5％、4％、3％或2％之内。
[0056] 质膜囊泡又称作泡(bleb)。泡是形成于细胞的细胞壁、外膜、细胞质和/或质膜内的小芽状突起。当在本文所述的选定条件下培养时，膜囊泡摆脱整个细胞进入培养基。膜囊泡通常是圆球形，具有双层并具有约1μm至约100μm的直径。
[0057] 本方法依赖于细胞与诱导形成囊泡的试剂的接触。在某些实施方案中，囊泡形成剂包含巯基封闭剂，如甲醛、丙酮醛、乙醛、乙二醛、戊二醛、丙烯醛、异丁烯醛、吡哆醛、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、马来酰亚胺、氯汞基苯甲酸盐(酯)、碘醋酸盐(酯)、亚砷酸钾、亚硒酸钠、乙基汞硫代水杨酸钠(硫柳汞)、过氧化苯甲酰、氯化镉、过氧化氢、亚碘酰基苯甲酸、美拉鲁莱钠、(汞希德林)、氯化汞、氯化亚汞、氯汞丙脲(汞丙脲)、苯肼、亚碲酸钾、丙二酸钠、对亚砷酰苯甲酸、5，5′-二氨基-2，2′-二甲基偶砷苯、N，N′-二亚甲基磺酸二钠盐、碘乙酰胺、氧苯胂(马法胂)、氯化金、对氯汞基苯甲酸、对氯汞基苯磺酸、氯化铜、碘汞溴红(红汞)、卟啉啶、高锰酸钾、汞撒利(撒利甘)、硝酸银、强银蛋白(强蛋白银)或乙酸双氧铀。在其它实施方案中，囊泡形成剂是这些试剂的组合，如二硫苏糖醇(DTT)和甲醛一起的作用。
[0058] 在其它实施方案中，囊泡形成剂是细胞毒素，如细胞松弛素B或蜂毒素。
[0059] 在本发明的某些实施方案中，机械搅动细胞以增加囊泡形成的数量。机械搅动可以是例如，摇动器或超声破碎。
[0060] 一旦形成质膜囊泡，如果需要可以纯化它们。有许多纯化质膜囊泡的方法，包括但不限于过滤、密度梯度离心或透析。在某些实例中，这些方法中几种的组合是期望的。
[0061] 为了制备超纯质膜囊泡，可以进行以下一个或多个纯化和操作步骤：膜蛋白的烷基化和还原，碱洗以破坏非共价蛋白-蛋白的相互作用和，超声破碎以释放囊泡内污染物并形成小囊泡，超速离心以清洁质膜囊泡级分，漂洗和分散于碳酸氢铵缓冲液中。
[0062] 膜蛋白的还原可以通过将其与例如，二硫苏糖醇(DTT)、代替DTT的三(羧乙基)膦(TCEP)或三丁基膦(TBP)，或碘乙醇和三乙基膦的组合的接触来实现，烷基化可以用碘乙酰胺破坏二硫键来进行。这允许获得更多的消化切割位点和减少蛋白聚集。
[0063] 质膜囊泡可以用高pH溶液或高盐溶液洗涤，以破坏非共价蛋白-蛋白的相互作用。这一步骤同样将细胞质蛋白从膜分离。
[0065] 为了除去这种额外的污染源，可以通过超速离心粒状沉淀PMV膜并除去上清液。
[0066] 还可以通过在缓冲液，如碳酸氢铵缓冲液中的声处理来漂洗和分散膜粒状沉淀。
[0067] 也可以通过过滤器过滤质膜囊泡以制备均一大小的质膜囊泡种群。
[0068] 质膜囊泡种群可以通过例如，亲和纯化或免疫纯化富集给定膜蛋白。
[0069] 可以使用各种细胞制备质膜囊泡。细胞或细胞系可以附着于表面或游离于生长培养基中来生长。细胞可以来自于任何有机体，优选来自哺乳动物，如人类。在一个实施方案中，用于制备质膜囊泡的细胞是与疾病状况，如癌症相关的细胞。在另外的实施方案中，转化或转染细胞以产生目标蛋白。在示例性实施方案中，目标蛋白是一种或多种膜蛋白，如跨膜蛋白或脂质锚定蛋白。
[0070] 利用本领域技术人员熟知的普通分子生物学技术可以将编码外源性蛋白的核苷酸序列引入细胞以制备膜囊泡。根据所选细胞可以选择对于插入的核苷酸序列的转录和翻译必要的元件，并可以由本领域一般技术人员容易地完成。有助于筛选用核苷酸序列转化或转染的细胞的报告基因也可以并入微生物中。(参见，如Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，for transfection/transformation methods and selection of transcription and translation elements，and reporter genes)。编码外源蛋白的序列通常可以从各种来源获得，包括例如，含有编码序列的质粒的保藏机构，包括美国模式培养物中心(ATCC，Rockville Md.)和英国生物技术有限公司(Cowley，Oxford England)。
[0071] “跨膜结构域”穿过膜，“膜锚定结构域”位于内部，但没有穿过膜。“胞外”或“显露”结构域存在于细胞或质膜囊泡外面，并因此与细胞或质膜囊泡外界环境接触。
[0073] “真核生物膜”是发现于真核生物内的膜。作为非限制实例，真核生物膜可以是细胞质膜、核膜、核仁膜、内质网(ER)膜、高尔基体膜、溶酶体膜、过氧化物酶体膜、细胞膜穴样内陷膜或者是线粒体、叶绿体或质体的内膜或外膜。
[0074] “膜蛋白”是发现于整个或部分膜中的蛋白。膜蛋白可以具有至少一个膜锚定结构域或至少一个跨膜结构域。
[0075] “表达载体”是可插入编码蛋白的外源核酸分子的人工核酸分子，所述插入以将所述外源核酸分子可操作地连接到指导其表达的适当表达序列的方式进行。
[0076] 关于术语“可操作地连接”是指由非载体核酸序列编码的基因产物通过体内表达元件产生。
[0077] “表达构建体”是一种表达载体，在其中可以以可操作地连接到存在于表达载体内的表达序列而定位的方式来插入目标核苷酸序列。
[0078] 本发明提供用于研究和鉴定存在于质膜内或质膜上的蛋白质的方法和组成。可以用于本发明的方法和组成的示例性蛋白质如下所述。
[0079] 膜蛋白
[0080] 通常膜蛋白由两种类型组成，外周膜蛋白和整体膜蛋白。
[0081] 整体膜蛋白可以跨越脂质双层膜的两层(或“小叶”)。因此，该蛋白可以具有胞外、跨膜和胞内结构域。胞外域暴露于细胞的外界环境，而胞内结构域面向细胞的细胞质。穿过膜的整体膜蛋白的部分是“跨膜结构域”。“跨膜结构域”通常通过典型地包含15至25个疏水性氨基酸(预测采用α-螺旋构象)的一个或多个区域穿过细胞膜。
[0082] 整体膜蛋白分为双跨膜(bitopic)或多跨膜(polytopic)(Singer，(1990)Ann u.Rev.Cell Biol.6：247-96)。双跨膜蛋白质跨越膜一次，而多跨膜蛋白质包含多个膜跨越片段。
[0083] 外周膜蛋白是结合到膜表面并且未整合入膜区域疏水层的膜蛋白。外周膜蛋白没有跨越膜，但结合到膜表面、形成膜的脂双层的一层或整体膜蛋白的胞外结构域。
[0084] 本发明可适用于任何膜蛋白，包括但不限于以下示例性受体和膜蛋白。蛋白包括但不限于受体(例如，GPCR、鞘脂类受体、神经递质受体、感觉受体、生长因子受体、激素受体、趋化因子受体、细胞因子受体、免疫受体和补体受体、FC受体)，通道(例如，钾通道、钠通道、钙通道)，孔蛋白(例如，核孔蛋白、水通道)，离子及其它泵(例如，钙泵、质子泵)，交换蛋白(例如，钠/钾交换蛋白、钠/氢交换蛋白、钾/氢交换蛋白)，电子传递蛋白(例如，细胞色素氧化酶)，酶和激酶(例如，蛋白激酶、ATP酶、GTP酶、磷酸酶、蛋白酶)，结构/连接蛋白(例如，窖蛋白、网格蛋白)，衔接蛋白(例如，TRAD、TRAP、FAN)，趋化/粘着蛋白(例如，ICAM11、选择蛋白、CD34、VCAM-1、LFA-1、VLA-1)和磷脂酶例如PI特异性PLC以及其它磷脂酶等。
[0085] 本发明范围内的其它膜蛋白包括但不限于通道(例如，钾通道、钠通道、钙通道)，孔蛋白(例如，核孔蛋白、水通道)、离子以及其它泵(例如、钙泵、质子泵)，交换蛋白(例如、钠/钾交换蛋白、钠/氢交换蛋白、钾/氢交换蛋白)，电子传递蛋白(例如，细胞色素氧化酶)，酶和激酶(例如，蛋白激酶、ATP酶、GTP酶、磷酸酶、蛋白酶)，结构/连接蛋白(例如，窖蛋白、网格蛋白)，衔接蛋白(例如，TRAD、TRAP、FAN)。
[0086] 细胞粘着分子
[0087] 本发明的方法和组成中可以使用细胞粘着分子。示例性细胞粘着分子包括人鼻病毒受体(ICAM-1)、ICAM-2、ICAM-3和PECAM-1，并且趋化/粘着蛋白(例如，选择蛋白、CD34、VCAM-1、LFA-1、VLA-1)在本发明的范围内。另外参见Alpin等，″Signal Transduction and Signal Modulation by Cell Adhesion Receptors：The Role of Integrins，Cadherins，Immunoglobulin-Cell Adhesion Molecules，and Selectins″，Pharmacological Reviews，Vol.50，No.2。
[0088] 除了上述非限制性实例外，本发明可以适用于以下美国专利中所述的膜蛋白：美 国 专 利 6,335,018(High molecular weight major outer membrane protein of moraxella)；美 国 专 利6,264,954(Haemophilus outer membrane protein)；美国 专 利6,197,543(Human vesicle membrane protein-like proteins)；美 国 专 利6,121,427(Major outer membrane protein CD of branhamella)；美国专利6,083,743和6,013,514(Haemophilus outer membrane protein)；美 国 专 利 6,004,562(Outer membrane protein Bl of Moraxella catarrhalis)；美 国 专 利 5,863,764(DNA encoding a human membrane protein)；美国专利5,861,283(DNA encoding a limbic system-associated membrane protein)；美国专利5,824,321(Cloned leptospira outer membrane protein)；美国专利5,821,085(Nucleotide sequences of a T.pallidum rare outer membrane protein)；美国专 利5,821,055(Chlamydia major outer membrane protein)；美 国 专 利 5,808,024(Nucleic acids encoding high molecular weight major outer membrane protein of moraxella)；美国专利5,770,714(Chlamydia major outer membrane protein)；美国专利5,763,589(Human membrane protein)；美国专利
5,753,459(Nucleotide sequences of T.pallidum rare outer membrane protein)；
美 国 专利 5,607,920(Concanavalin a binding proteins and a 76kD chondrocyte membrane protein(CMP)from chondrocytes and methods for obtaining same)；和美国专利5,503,992(DNA encoding the 15kD outer membrane protein of Haemophilus influenzae)。
5,753,459(Nucleotide sequences of T.pallidum rare outer membrane protein)；
美 国 专利 5,607,920(Concanavalin a binding proteins and a 76kD chondrocyte membrane protein(CMP)from chondrocytes and methods for obtaining same)；和美国专利5,503,992(DNA encoding the 15kD outer membrane protein of Haemophilus influenzae)。
[0089] 已知跨膜结构域的各种类型和实例。本发明的方法和组成还适合以下类型的跨膜蛋白。
[0090] 作为非限制性实例，穿过膜一次的单跨膜(“通过一次”)结构域包括发现于表皮生长因子(EGF)受体和肿瘤坏死因子(TNF)受体等内的那些。多跨膜(“通过多次”)蛋白穿过膜两次或多次。多跨膜蛋白的非限制性实例如下。
[0091] 双跨膜(“通过两次”)膜蛋白包括，但不限于：大肠杆菌的EnvZ；过氧化物酶体膜蛋白Pexl 1-lp(Anton等，ARF-and coatomer-mediated peroxisomal vesiculation，Cell Biochem Biophys 2000；32Spring：27-36)；酿酒酵母的多向性(pleitropic)药物ABC转运蛋白(Rogers等，The pleitropic drug ABC transporters from Saccharomyces cerevisiae，J Mol Microbiol Biotechnol 2001 3：207-14)；以及人和大鼠尿酸盐转运蛋 白 hUAT和rUAT(Lipkowitz 等，Functional reconstitution，membrane targeting，genomic structure，and chromosomal localization of a human urate transporter，J Clin Invest 2001 107：1103-15)。
[0092] 三跨膜(“通过三次”)膜蛋白包括，但不限于：拟南芥的乙烯受体ETR1；Cauliflower Card表达蛋白CC 1(Palmer等，A Brassica oleracea Gene Expressed in a Variety-Specific Manner May Encode a Novel Plant Transmembrane Receptor，Plant Cell Physiol 2001 42：404-413)；和线粒体膜蛋白hMRS3/4的剪接变体(Li等，Characterization of a novel human putative mitochondrial transporter homologous to the yeast mitochondrial RNA splicing proteins 3 and 4，FEBS Lett 2001 494：
79-84)。
79-84)。
[0093] 四旋蛋白(tetraspanins)或四跨膜蛋白(tetraspans)是具有四个跨膜结构域的膜蛋白的非限制性实例(Levy等，J.Biol.Chem，226：14597-14602，1991；Tomlinson等，J.1mmol.23：136-40，1993；和Barclay等，(In)The Leucocyte antigen factbooks，Academic press，London，1993)。这些蛋白由于它们穿过质膜四次，所以统称作跨膜4超家族(TM4)。已知属于该家族的蛋白质包括，但不限于：哺乳动物抗原CD9(MIC3)，一种参与血小板活化和凝集的蛋白；在B淋巴细胞上表达的哺乳动物白细胞抗原CD37；哺乳动物白细胞抗原CD53(OX-44)，其可能参与造血细胞中的生长调节；哺乳动物溶酶体膜蛋白CD63(黑素瘤相关抗原ME491；抗原ADI)；哺乳动物抗原CD81(细胞表面蛋白TAPA-1)，其可能在淋巴瘤细胞生长的调节中起重要作用；哺乳动物抗原CD82(蛋白R2；抗原33；Kangai 1(KAI1))，其与CD4或CD8相关并为TCR/CD3途径递送共刺激信号；哺乳动物抗原CD151(SFA-1)；血小板内皮四跨膜蛋白抗原3(PETA-3)；哺乳动物TM4SF2(细胞表面糖蛋白A15；TALLA-1；MXS1)；哺乳动物TM4SF3(肿瘤相关抗原CO-029)；哺乳动物TM4SF6(Tspan-6；TM4-D)；哺乳动物TM4SF7(新抗原2(NAG-2)；Tspan-4)；哺乳动物Tspan-2；哺乳动物Tspan-3(TM4-A)；哺乳动物四跨膜蛋白NET-5；和曼氏血吸虫和日本血吸虫23Kd表面抗原(SM23/SJ23)。
[0094] 具有六个跨膜结构域的膜蛋白的非限制性实例包括EBV整体膜蛋白LMP-1和线粒体蛋白hMRS3/4的剪接变体(Li等，Characterization of a novel human putative mitochondrial transporter homologous to the yeast mitochondrial RNA splicing proteins 3and 4，FEBS Lett Apr.6，2001；494(1-2)：79-84)。具有六个跨膜结构域的蛋白质还包括STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)蛋白(Afar等，美国专利6,329,503)。STEAP家族的模式成员STEAP-1，似乎是主要表达于正常人类组织的前列腺细胞中的IIIa膜蛋白。在结构上，STEAP-1是339个氨基酸的蛋白质，其特征在于六个跨膜结构域和胞内N端与C端的分子拓扑结构，提示其以“卷曲”方式折叠成三个胞外环和两个胞内环。
[0095] 已知有数百种7跨膜蛋白。特别目标的G蛋白偶联受体(GPCR)包括但不限于β-肾上腺素受体、肾上腺素能受体、EDG受体、腺苷受体、激肽B受体、血管紧缩素受体和阿片受体(opiod receptor)。在本文的其它地方更详细地描述GPCR。
[0096] 具有9个跨膜结构域的蛋白的非限制性实例是脂笼蛋白-1(Lipocalin-1)相互作用膜受体(Wojnar等，Molecular cloning of A novel Lipocalin-1 interacting human cell membrane receptor(LIMR)using phage-display，J Biol Chem 2001，3)。
[0097] 已知存在同时具有跨膜和锚定结构域的蛋白质。例如AMPA受体亚基具有跨膜结构域和一个膜锚定结构域。
[0098] 脂质成分
[0099] 生物膜中最常见的脂质是1，2-二烷基磷酸甘油酯或磷脂(Gennis，1989)。其中包括，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰甘油(PG)。这些磷脂的结构总结于图8。
[0100] 磷脂结构由两个烷基链或通过酯键结合到普通甘油分子的脂肪酸构成。第三个羟基连接到磷酸酯分子，该磷酸酯分子连接到各种脂质的头基。烷基链或碳氢化合物尾部在长度(14-24个碳原子)和饱和度两方面均不同，它们一起决定了如膜的渗透性和流动性等基本性质。在另一方面头基含有分子带电的信息，这也影响膜的性质和功能。最常见的磷脂是磷脂酰胆碱，它的头基由叔胺构成。这种脂质是两性离子的，意思是该结构在中性pH值时具有的净电荷为零。这是通过中和位于磷酸酯(负电荷)和叔胺(正电荷)的电荷产生的。在另一方面磷脂酰丝氨酸在中性pH时获得-1的净电荷，这是由于它在头基上同时含有羧基(负电荷)和胺。
[0101] 生物膜中也常见鞘脂类，它由一分子长链氨基醇(鞘氨醇)或其衍生物、一分子长链脂肪酸和极性头醇构成，该鞘脂类有时具有磷酸二脂键。鞘脂类还可以细分为三个族，鞘磷脂、糖脂和神经节苷脂(图9)。鞘磷脂与磷脂酰胆碱在性质和结构方面相类似，并且鞘磷脂存在于动物细胞的质膜内。糖脂和神经节苷脂也发现于动物细胞质膜中，在神经组织，如脑中大量存在，并具有连接到其头基的糖单元。
[0102] 甾醇(其中胆固醇是动物组织中最常见的)具有极性头基和在展开形式中长度几乎与16个碳原子的脂肪酸相同的非极性碳氢化合物主体。甾醇通常是具有特定生物功能的分子(如甾类激素或在肠内用作去污剂的胆汁酸)的前体。
[0103] 可以使用多种不同的溶剂溶解脂质，然而，如果它们可以破坏脂质和其它细胞成分(如蛋白质和多糖等)之间的连接，则它们仅适于从细胞材料和组织中提取脂质。理想地，溶剂或溶剂混合物应当具有相当的极性以便从它们与细胞膜或脂蛋白的连接中释放所有脂质。提取溶剂在某种程度上还可以防止酶水解。
[0104] 脂质的某些结构特征，例如脂肪酸或其它脂肪族部分的疏水烃链以及任何极性官能团，如磷酸酯或糖基，它们显著地亲水性控制脂质在有机溶剂中的可溶性。缺少极性基团的脂质，例如三酰基甘油或胆固醇酯在碳氢化合物如己烷、甲苯或环己烷以及更具极性的溶剂如二乙醚或氯仿中可溶。虽然这些是相当难溶的极性溶剂，如甲醇。极性脂质，如磷脂和糖鞘脂等，除非通过其它类型的脂质溶解，否则仅在碳氢化合物中微溶，但它们容易地溶解于像甲醇、乙醇或氯仿更具极性的溶剂。这些溶剂的高介电常数和极性克服了离子-偶极相互作用和氢键。
[0105] 多数复合脂质微溶于水，至少形成胶束溶液，脂质例如神经节苷脂、多磷酸肌醇、溶血磷脂、酰基肉(毒)碱和辅酶A酯特别可溶。纯溶剂作为通用脂质提取剂通常无用。溶剂混合物更有用，最广泛使用的混合物之一是2∶1(v/v)比例的氯仿和甲醇。该混合物比其它简单溶剂的组合从组织(动物、植物和细菌)中提取脂质更彻底。在其它一些研究中，发现二氯甲烷(DCM)-甲醇(2∶1，v/v)与氯仿-甲醇混合物一样有效，并且二氯甲烷更低的毒性可以成为优点。
[0106] 异丙醇与己烷的混合物(3∶2，v/v)也已用于从动物组织中提取脂质，并且该混合物具有更低的毒性。甲醇-己烷(1∶1，v/v)已用于从叶子组织中提取脂质。己烷-乙醇(5∶2，v/v)已用于泛醌的提取以及添加有表面活性剂十二烷基硫酸钠的庚烷-乙醇已被推荐用于测定动物组织中的维生素E/脂质比例。已测试对于脂质的可溶性的其它混合物是甲苯-乙醇、苯-乙醇、苯-甲醇、异丙醇-苯-水(2∶2∶1，v/v)、水饱和的丁醇、2-己醇和丁醇-二异丙醚(2∶3v/v)。二乙醚和氯仿单独也是脂质的良好溶剂，然而在从组织提取脂质方面不擅长。不幸的是，当将其用于提取植物组织时，这些溶剂如丁醇那样还增强了磷脂酶D的作用。正丙醇和异丙醇强烈地抑制该反应，并且具有更低沸点的后者特别地作为预提取剂已被推荐用于植物组织。
[0107] 丙酮可以溶解简单脂质(simple lipids)和糖脂，然而它不会容易地溶解磷脂，实际上经常将其用于从其它溶剂的溶液中沉淀磷脂。超临界流体也已被测试用于脂质提取目的，结果表明该工艺对于简单脂质起作用。
[0108] 本发明的质膜囊泡的使用方法
[0109] 本发明的质膜囊泡可用于许多目的。例如，质膜囊泡可用于研究在膜外不可溶的膜蛋白。它们还可用于筛选膜蛋白的调节因子，或还可用于反向筛选以鉴定结合到已知配体的膜蛋白。在其它实施方案中，本发明的质膜囊泡可用于研究细胞相互之间或相似细胞在不同时间点(如，当与配体接触时或当转化为疾病状态，如癌时)的蛋白表达模式。
[0110] 在示例性实施方案中，本发明的质膜囊泡用于研究细胞表面蛋白的表达模式。在一个实施方案中，通过使用本文描述的方法在期望的时间从目标细胞中制备质膜囊泡。
[0111] 质膜囊泡与蛋白酶，如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶接触，鉴定所得蛋白片段。可以通过许多鉴定方法中的任何一种来鉴定多肽片段。
[0112] 可以在溶液中以及在质膜囊泡固定于流式细胞后进行酶消化。对于溶液中的消化，可将蛋白酶添加到处理的质膜囊泡溶液中，并且可以通过尺寸过滤从膜中分离肽。
[0113] 可以通过质谱法分析多肽片段。在示例性实施方案中，使用LC MS/MS分析片段。液相色谱分离包含于样品的单一组分，以便可以鉴定它们。可以将分离的组分加样到质谱仪用于进一步分析以便测定其特性。具有两个质谱仪阶段的系统称为LC-MS/MS系统。质谱仪将样品作为进样，离子化样品以产生或正离子或阴离子。可以使用许多不同的离子化方法，包括使用电喷射离子化。然后，通过质量与电荷比在通常称为MSI的第一阶段分离中来分离离子。可以通过许多方法，包括使用基于离子重量将离子转移至不同程度的磁体来实现质量分离。分离的离子然后行进至碰撞池，在碰撞池中它们接触到碰撞气体或其它与离子相互作用的物质。然后将反应的离子进行通常称为MS2的第二阶段的质量分离。
[0114] 在质谱阶段(或多个阶段)终止时分析分离的离子。在称为质谱的图中，所述分析描绘出离子信号强度与离子的质量-电荷比的关系。质谱分析同时给出到达检测器的离子质量和相对丰度。从信号强度获得丰度。可以使用液相色谱与质谱法的组合来鉴定化学物质如代谢物。当分子与碰撞气体碰撞时，共价键通常断裂，产生一系列带电片段。质谱仪测量片段的质量，随后可能分析所述片段以测定原始分子的结构和/或组成。当使用能够精确测定质量的质谱仪，如混合四极杆垂直TOF(hybrid quadrupole orthoganol TOF)仪或FTICR时，该特征由微小质量MS得到极大的增强，允许得到分析物元素组成信息。该信息可用于分离样品中的特定物质。
[0115] 在示例性实施方案中，本发明的质膜囊泡用于通过从纯化的质膜囊泡中提取脂质组分来研究质膜的脂质组成。
[0116] 在另一实施方案中，可以通过由免疫组织化学分析多肽片段来评价是否存在特定膜蛋白。因此，在另一实施方案中，可以使用免疫分析来检测和分析肽片段。该方法包括：(a)提供特异性结合到目标肽的抗体；(b)将样品与抗体接触；和(c)检测样品中结合到肽的抗体复合体的存在。
[0117] 可以使用纯化的肽或它们的核酸序列来制备特异性结合到肽的抗体。肽的核酸和氨基酸序列可以通过这些标记物的进一步鉴定来获得。可以使用各标记物的消化片段的分子量检索如SwissProt数据库的数据库，得到与通过各种酶产生的消化片段的分子量相匹配的序列。如果这些标记物在数据库中是已知的蛋白质，利用该方法可以鉴定其它肽的核酸和氨基酸序列。
[0118] 检测
[0120] 质膜囊泡可用于筛选药理学试剂的检测。通过非限制性实例，质膜囊泡提供用于膜蛋白表达以及研究和用于鉴定调节因子的环境。
[0121] 用于评价蛋白质表达的另一技术包括蛋白质印迹(western blot)的使用。已产生针对各种目标表达蛋白的抗体，并且许多是可商购的。用于产生抗蛋白质或源自其的多肽的抗体的技术在本领域内是已知的。(参见，如，Cooper等，S ection III of Chapter11 in：Short Protocols in Molecular Biology，2nd Ed.，Ausubel等，eds.，John Wiley and Sons，New York，1992，pages11-22 to 11-46)。可以用于显示来自质膜囊泡内的表达载体和其它表达系统的蛋白质表达的标准蛋白质印迹操作规程在本领域内是已知的(参见，如，Winston等，Unit 10.7 of Chapter 10 in：Short Protocols in Molecular Biology，2nd Ed.，Ausubel等，eds.，John Wiley and Sons，New York，1992，pages 10-32 to 10-35)。
[0122] 高通量筛选(HTS)
[0123] HTS典型地使用自动化检测来通过大量化合物查找所需的活性。典型地，HTS检测用于通过筛选作用于特定酶或分子的化学品发现新药。例如，如果化学品使酶失活，可能证明它在阻止引起疾病的细胞的进程中有效。高通量方法能够使研究人员使用机器人处理系统和结果的自动分析非常快速地对每个药靶进行数以千计不同化学品的试验。
[0124] 本文使用的“高通量筛选”或“HTS”指的是利用机器人筛选检测的大量化合物(文库)的体外快速筛选；通常是几十到几十万种化合物。超高通量筛选(uHTS)通常指的是加速至每天大于100,000个试验的高通量筛选。
[0125] 筛选检测可包括用于校准目的的对照以及检测组分的适当操作的确认。通常包括含有除化学品文库的成分以外所有反应物的空白孔。作为另一实例，待寻找调节因子的已知酶抑制剂(或活化剂)可以与一种检测样品一起孵育，产生根据本文方法测定的酶活性的降低(或增加)。可以理解调节因子也可以与酶激活剂或抑制剂组合以发现调节因子，所述调节因子抑制由已知的酶调节因子的存在引起的酶激活或阻遏。类似地，当寻找鞘脂类靶标的配体时，已知的靶标配体可以存在于对照/校对检测孔中。
[0126] 本发明的质膜囊泡容易地适用于筛选候选化合物以鉴定具有所需活性(如，阻断配体与受体的结合)的那些化合物的高通量筛选检测。因此鉴定的化合物可以用作常规的“先导化合物”或者可将其本身用作治疗剂。
[0127] 本发明的筛选方法包括利用筛选检测从各种分子的文库中鉴定一种或多种具有所需活性的化合物。“筛选检测”是设计为鉴定、分离和/或测定具有预选活性的样本内的化合物结构的选择检测。关于“鉴定”其意思是分离具有所需活性的化合物，确定其化学结构(包括但不限于分别确定核酸和多肽的核苷酸和氨基酸序列，以及另外或可选地，具有所选活性的纯化化合物的结构)。设计生化和生物学检测来测试从蛋白-蛋白相互作用、酶催化、小分子-蛋白质结合、激动剂和拮抗剂到细胞功能的大范围体系的活性。这样的检测包括自动化、半自动化检测和HTS(高通量筛选)检测。
[0128] 在HTS方法中，许多分离的化合物优选通过机器人、自动化或半自动化方法来平行测试，以使大量测试化合物同时或几乎同时筛选所需的活性。使用本发明的集成系统有可能每天检测和筛选达到约6,000至20,000，甚至达到约100,000至1,000,000种不同化合物。
[0129] 设计高通量竞争性抑制检测来鉴定抑制特定靶蛋白的试剂。表达和/或展示特定膜蛋白的质膜囊泡可用于所有类型的竞争性抑制检测。
[0130] 本发明的质膜囊泡用于“功能性筛选HTS检测”。功能性筛选检测定义为提供关于特定靶蛋白功能的信息的检测。功能性检测筛选抗特定靶蛋白的试剂以鉴定用作抗蛋白的拮抗剂或用作抗蛋白的激动剂的试剂。功能性检测需要靶蛋白处于允许其执行其本身功能的环境中。该功能包括，但不限于G蛋白与GPCR的偶联，酶活性如磷酸化或蛋白水解，蛋白-蛋白相互作用以及分子和离子的运输。
[0131] 功能性检测筛选抗具有自身功能的蛋白质的试剂。用于功能研究的靶蛋白必须执行可测量的功能。可测量的蛋白功能的实例包括但不限于利用荧光共振能量转移(FRET)测量偶联至GPCR的G蛋白(Ruiz-Velasco等，Functional expression and FRET analysis of green fluorescent proteins fused to G-protein subunits in rat sympathetic neurons，J.Physiol.537：679-692，2001；Janetopoulos 等，Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells，Science 291：2408-2411，2001)；利用生物荧光共振能量转移(BRET)检测偶联至靶GPCR的功能性配体诱导的G蛋 白 (Menard，L.Bioluminescence Resonance Energy Transfer(BRET)：A powerful platform to study G-protein coupled receptors(GPCR)activity in intact cells，Assay Development，Nov.28-30，2001)，使用荧光底物测量蛋白酶的酶活性(Grant，Designing biochemical assays for proteases using fluorogenic substrates，Assay Development，Nov.28-30，2001)；和利用电压敏感染料的离子通道功能的测定(Andrews等，Correlated measurements of free and total intracellular calcium concentration in central nervous system neurons，Microsc Res Tech.46：370-379，
1999)。
1999)。
[0132] 利用质膜囊泡的高通量功能性筛选检测的一种非限制性实例是，GPCR功能性偶联至它们的各自的G蛋白。配体结合、电压极化、离子结合、光相互作用和其它刺激事件使GPCR活化并引起其偶联至它们各自的G蛋白。在质膜囊泡中，可以同时表达GPCR及其各自的G蛋白。当GPCR活化时，将在质膜囊泡内发生偶联事件。因此通过检测质膜囊泡内的这种偶联，可以筛选结合到GPCR的试剂来鉴定拮抗剂和激动剂。利用检测GPCR的功能抑制的抑制检测来鉴定拮抗剂。因此试剂与GPCR以其抑制GPCR激活的方式相互作用。通过筛选在天然活化剂不存在时使GPCR活化的试剂来鉴定激动剂。
[0133] 质膜囊泡用于功能性检测的另一非限制性实例包括筛选离子通道的激动剂/拮抗剂。一个实例是钙通道SCaMPER，其在多顺反子游离质粒(poycistronic episomal plasmid)上编码，其还编码荧光可溶性蛋白质，发光蛋白(aequorin)。在该检测中，质膜囊泡将含有在其细胞质内的发光蛋白和在质膜囊泡上表达的SCaMPER蛋白。因此当SCaMPER由其配体SPC或由其类似物活化时，钙将流入质膜囊泡并将被会发冷光的发光蛋白结合。因此得到钙通道功能性活化的检测信号。
[0134] 质膜囊泡还可用于靶蛋白的表达以及用于筛选检测的膜制品的制备。该蛋白质包括但不限于受体(例如，GPCR受体、神经递质受体、感觉受体、生长因子受体、激素受体、趋化因子受体、细胞因子受体、免疫受体和补体受体、FC受体)，通道(例如，钾通道、钠通道、钙通道)，孔蛋白(例如，核孔蛋白、水通道)，离子及其它泵(例如，钙泵、质子泵)，交换蛋白(例如，钠/钾交换蛋白、钠/氢交换蛋白、钾/氢交换蛋白)，电子传递蛋白(例如，细胞色素氧化酶)，酶和激酶(例如，蛋白激酶、ATP酶、GTP酶、磷酸酶、蛋白酶)，结构/连接蛋白(例如，窖蛋白、网格蛋白)，衔接蛋白(例如，TRAD、TRAP、FAN)，趋化/粘着蛋白(例如，ICAM11、选择蛋白、CD34、VCAM-1、LFA-1、VLA-1)和嵌合/融合蛋白(例如，其中正常可溶性蛋白连接到另一蛋白质的跨膜区域的蛋白质)。在该检测中使用膜制品筛选或拮抗剂或激动剂的试剂。
[0135] 化学品文库
[0136] 组合化学的发展允许快速经济地合成数以十万计的分离化合物(discrete compound)。这些化合物典型地排列于设计用于有效筛选的有机小分子的中型文库中。组合方法可用于产生适于新抑制剂鉴定的无偏文库(unbiased libraries)。另外，可以产生从单个具有预先测定的生物活性的母体化合物遗传的更小、更少变化的文库。在任一情况下，针对由组合化学产生的治疗相关的生物分子如重要酶的抑制剂的特异性靶的有效筛选系统的缺乏阻碍了这些资源的最佳利用。
[0137] 组合化学文库是由或化学合成或生物合成通过组合大量化学“结构单元”，如试剂等产生的各种化合物的集合。例如，直链组合化学文库，如多肽文库是通过以潜在的每种可能方式将一组化学结构单元(氨基酸)以多种组合的形式组合为给定化合物长度(即，多肽化合物中的氨基酸数目)而形成的。通过这样的化学结构单元的组合混合可以合成数百万的化合物。
[0138] “文库”可包含2至50,000,000种不同的成员化合物。优选，文库包含至少48种不同的化合物，优选96种以上不同化合物，更优选384种以上不同化合物，更优选，10,000种以上不同化合物，优选超过100,000种不同成员，并最优选超过1,000,000种不同成员化合物。关于“不同”其意思是文库中大于50％的化合物具有不等同于文库任何其它成员的化学结构。优选，文库中大于75％的化合物具有不等同于集合任何其它成员的化学结构，更优选大于90％并最优选大于约99％。
[0139] 组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的。为了参考，参见Thompson等，Synthesis and application of small molecule libraries，Chem Rev 96：555-600，1996；Kenan等，Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries，Trends Biochem Sci 19：57-64，1994；Janda，Tagged versus untagged libraries：
methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries，Proc Natl Acad Sci USA.91：10779-85，1994；Lebl 等，One-bead-one-structure combinatorial libraries，Biopolymers 37：177-98，1995；Eichler 等，Peptide，peptidomimetic，and organic synthetic combinatorial libraries，Med Res Rev.15：
481-96，1995；Chabala，Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads，Curr Opin Biotechnol.6：632-9，1995；Dolle，Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry，Mol Divers.2：
223-36，1997；Fauchere等，Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries，Can J Physiol Pharmacol.75：683-9，1997；Eichler等，Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries，Mol Med Today 1：174-80，1995；和Kay 等，Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries，Comb Chem High Throughput Screen 4：535-43，2001。
methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries，Proc Natl Acad Sci USA.91：10779-85，1994；Lebl 等，One-bead-one-structure combinatorial libraries，Biopolymers 37：177-98，1995；Eichler 等，Peptide，peptidomimetic，and organic synthetic combinatorial libraries，Med Res Rev.15：
481-96，1995；Chabala，Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads，Curr Opin Biotechnol.6：632-9，1995；Dolle，Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry，Mol Divers.2：
223-36，1997；Fauchere等，Peptide and nonpeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries，Can J Physiol Pharmacol.75：683-9，1997；Eichler等，Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries，Mol Med Today 1：174-80，1995；和Kay 等，Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries，Comb Chem High Throughput Screen 4：535-43，2001。
[0140] 这样的组合化学文库包括，但不限于，肽文库(参见，例如，美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493(1991) 和 Houghton 等，Nature，354：84-881991)。还可以使用其它产生化学多样性文库的化学物质(chemistries)。这样的化学物质包括，但不限于，类肽(PCT公布WO 91/19735)；编码的肽(PCT公布WO 93/20242)；随机生物寡聚体(PCT公布WO 92/00091)；苯并二氮卓类(美国专利5,288,514)；多样体(diversomer)，例如乙内酰尿、苯并二氮卓类和二肽(Hobbs，等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，
90：6909-6913 1993)；烯化(vinylogous)多肽(Hagihara，等，J.Amer.Chem.Soc.114：
6568 1992)；具有β-D-葡萄糖骨架的非肽类拟肽(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc，114：
9217-9218 1992)；小化合物文库的类似有机综合体(Chen等，J.Amer.Chem.Soc，116：2661
1994)；寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science，261：1303 1993)；和/或肽基膦酸酯(Campbell，等，J.Org.Chem.59：658 1994)；核酸文库(参见，Ausubel，Berger和Sambrook，all supra)；肽核酸文库(参见，如美国专利5,539,083)；抗体文库(参见，如Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US 96/10287)；碳水化合物文库(参见，如Liang，等，Science，274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)；小有机分子文库(参见，如benzodiazepines，BaumC&E News，January 18，page 33(1993))；类异戊二烯(美国专利5,569,588)；噻唑烷酮类和间噻嗪酮类(metathiazanones)(美国专利5,549,974)；
吡咯烷(美国专利5,525,735和5,519,134)；吗啉化合物(美国专利5,506,337)和苯并二氮卓类(美国专利5,288,514)等。
90：6909-6913 1993)；烯化(vinylogous)多肽(Hagihara，等，J.Amer.Chem.Soc.114：
6568 1992)；具有β-D-葡萄糖骨架的非肽类拟肽(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc，114：
9217-9218 1992)；小化合物文库的类似有机综合体(Chen等，J.Amer.Chem.Soc，116：2661
1994)；寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science，261：1303 1993)；和/或肽基膦酸酯(Campbell，等，J.Org.Chem.59：658 1994)；核酸文库(参见，Ausubel，Berger和Sambrook，all supra)；肽核酸文库(参见，如美国专利5,539,083)；抗体文库(参见，如Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US 96/10287)；碳水化合物文库(参见，如Liang，等，Science，274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)；小有机分子文库(参见，如benzodiazepines，BaumC&E News，January 18，page 33(1993))；类异戊二烯(美国专利5,569,588)；噻唑烷酮类和间噻嗪酮类(metathiazanones)(美国专利5,549,974)；
吡咯烷(美国专利5,525,735和5,519,134)；吗啉化合物(美国专利5,506,337)和苯并二氮卓类(美国专利5,288,514)等。
[0141] 反向筛选
[0142] 一方面，本发明提供用于筛选质膜囊泡文库的方法，其中各质膜囊泡包含编码几个，优选一个膜蛋白的表达元件，以便鉴定与预选化合物相互作用的膜蛋白。作为非限制性实例，或通过“鸟枪”克隆或通过定向克隆，例如，通过筛选或选择cDNA克隆，或通过PCR扩增DNA片段(其利用编码蛋白家族高度保守区的一个以上的寡核苷酸编码蛋白质)将编码膜蛋白、融合蛋白或细胞质蛋白的序列克隆到表达载体。关于该技术的非限制性实例，参见Krautwurst，D.，等1998.Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.Cell 95：917-926。作为非限制性实例，表达受体的质膜囊泡结合到可以是药物的预选配体。用于受体结合、酶活和通道事件的各种检测在本领域中是已知的并可以含有可检测化合物；在结合检测情况中，还可使用竞争检测(Masimirembwa，C.M.，等，2001.In vitro high throughput screening of compounds for favorable metabolic properties in drug discovery.Comb.Chem.High Throughput Screen.4：245-263；Mattheakis，L.C，and A.Saychenko.2001.Assay technologies for screening ion channel targets.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.4：124-134；Numann，R.，和P.A.Negulescu.2001.High-throughput screening strategies for cardiac ion channels.Trends Cardiovasc.Med.11：54-59；LePoul，E.，等，2002.Adaptation of aequorin functional assay to high throughput screening.J.Biomol.Screen.7：57-65；以 及 Graham，D.L.，等，2001.Application of beta-galactosidase enzyme complementation technology as a high throughput screening format for antagonists of the epidermal growth factor receptor.J.Biomol.Screen.6：
401-411)。
401-411)。
[0143] 一旦通过检测鉴定了质膜囊泡并且将其分离，即可鉴定膜蛋白。配体、拮抗剂和激动剂可用作治疗膜蛋白起作用的疾病的先导化合物和/或药物。特别地，当预选配体是药物时，希望利用新的配体、拮抗剂和激动剂或由其开发的药物和前体药物治疗疾病(药物对于该疾病是有疗效的)。
[0144] 膜蛋白结构的测定
[0145] 蛋白质的三维(3D)结构可以用于药物发现。然而，膜蛋白对3D结构的测定提出了挑战性的问题。Muller，Towards 3D structures of G protein-coupled receptors：a multidisciplinary approach.(Review)，Curr Med Chem 2000 pp.861-88；Levy 等，Two-dimensional crystallization on lipid layer：A successful approach for membrane proteins，J Struct Biol 1999 127，44-52。虽然已测定了上百种不同球状蛋白质折叠的三维结构，但是只测定了少于20不同的整体膜蛋白结构。对于这种情况的原因有许多。从膜中提取膜蛋白能够容易地破坏其天然结构，并且众所周知膜蛋白难以结晶。
[0146] 有些膜蛋白在膜中容易地形成两维晶体，并且利用电子衍射光谱(ED)代替X-射线晶体学可以用于结构测定。
[0147] 核磁共振(NMR)是测定膜蛋白结构的替代方法，但在本领域的目前状况下，对于高分辨率的NMR大多数膜蛋白太大。另外，对于NMR，膜蛋白需要特殊条件，如必须使用氘化脂质以避免将蛋白质质子的信号与膜脂质质子的噪音混淆。
[0148] 本发明的质膜囊泡可用于测定当从膜分离时不可溶的膜蛋白的结构。
[0149] 差异蛋白表达谱分析
[0150] 本发明还提供通过蛋白表达谱分析鉴定差异表达的蛋白质。蛋白表达谱可以通过任何以下方法产生：该方法允许来自由细胞或细胞系制备的质膜囊泡种群中的样品的蛋白质解析和检测。通常优选具有较高分辨能力的方法，因为增加的分辨率可以允许更多数量的单个蛋白质的分析，增强了谱的能力和用处。可以例如在蛋白分离和检测之前通过如免疫耗竭来预处理样品以从样品中除去大量蛋白质，这是因为大量蛋白质的存在可能掩盖其它蛋白质特别是低丰度蛋白质表达中更细微的变化。也可以将样品进行一个或多个步骤以降低样品的复杂性。例如，可以使用色谱分析将样品分级；每种级分具有降低的复杂性，有利于级分内蛋白质的分析。
[0151] 三类同时解析和检测几种蛋白质的有用方法包括阵列类方法；质谱类方法和双向凝胶电泳类方法。
[0152] 蛋白质阵列通常涉及很多不同的蛋白捕获试剂，如抗体或抗体可变区，每种固定于固体载体上的不同位置。该阵列例如从作为它们的一部分全景线(Panorama line)阵列的Sigma-Aldrich获得。将阵列暴露于蛋白质样品，捕获试剂选择性地捕获特定的蛋白质靶。通过标记的检测检出捕获的蛋白质。例如，蛋白质可以在暴露于阵列之前标记；在阵列上特定位置的标记的检出表明相应蛋白质的检出。如果阵列是不饱和的，检出的标记的数量可能与样品中蛋白质的浓度或量有关。如同在夹心免疫测定形式中，捕获的蛋白质还可通过随后暴露于第二捕获试剂(其本身是标记的或否则是检出的)来检测。
[0153] 质谱类方法包括，例如，基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)，液相色谱/质谱/质谱(LC-MS/MS)和表面增强激光解吸/离子化(SELDI)技术。例如，可以使用电喷射离子化和MALDI产生蛋白质谱。例如在美国专利6,225,047中所述的SELDI并入(incorporates)质谱芯片上的保留表面(retention surface)。蛋白质样品中的亚组(subset)蛋白质保留于表面上，降低了混合物的复杂性。随后的飞行时间质谱产生保留蛋白质的“指纹”。
[0154] 在涉及双向凝胶电泳的方法中，样品中的蛋白质在SDS-PAGE过程中通常在第一向通过等电聚焦以及在第二向通过分子量分离。通过双向解析，可以同时解析和分析数百种或数千种蛋白质。通过采用染色，如银染或通过蛋白质上标记如Cy2、Cy3或Cy5染料的存在检出蛋白质。为了鉴定蛋白质，将凝胶斑点切下并进行凝胶内的胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化可以通过质谱法，如MALDI分析。在序列数据库内检索肽的所得质谱、肽质量指纹或PMF。通过检索程序将PMF与silico中产生的所有理论胰蛋白酶肽的质量相比较。对于数据库检索可以使用程序，如Prospector、Sequest和MasCot(Matrix Science，Ltd.，London，UK)。例如，MasCot产生基于统计的Mowse分数(表明任何配对是否重要)。MS/MS可以用于提高得到数据库配对的可能性。肽的CID-MS/MS(串联MS的碰撞诱导解离)可以用于给出含有氨基酸序列信息的碎片离子的谱。将该信息添加到肽质量指纹允许Mascot增加配对的统计显著性。通过仅提交单个肽的原始MS/MS谱有时还可能鉴定蛋白质。
[0155] 提取的脂质中膜蛋白的重构
[0156] 由于膜中脂质和蛋白质非常复杂，生物膜的原位研究很困难。因此，在许多实例中必须从天然膜中纯化膜蛋白并将膜蛋白重新插入人工膜。该过程称为重构。为了使膜蛋白具有完整的功能在大多数情况下必须重构，所述重构当膜蛋白正确折叠并插入脂质双层中时发生。有许多重构膜蛋白的方法，但似乎没有该过程的通用方法，然而这些方法通常包括以下几种中的一种或多种：机械手段(膜蛋白与脂质一起的声处理或剪切作用)、冻融、有机溶剂和去污剂。去污剂最普遍和广泛的用于重构目的，并且大多数努力在于寻找整个过程中保存膜蛋白活性的合适条件。膜蛋白的取向和插入，重构的蛋白脂质体的形态和大小以及它们的渗透性也是重要因素。
[0157] 重构通常经以下过程进行：纯膜蛋白和过量(磷酸)脂质以及适当去污剂的共胶束化以产生混合的脂质-蛋白质-去污剂以及脂质-去污剂胶束的溶液。然后从胶束溶液中去除去污剂，导致具有结合膜蛋白的闭合脂质双层的形成。许多方法和规程存在于文献中，并且它们的区别主要在于除去去污剂的技术。
[0158] 在几篇文章中注意到，膜蛋白受其周围脂质环境的强烈影响。在有些情况中，已证明某些特定脂质对于有些膜蛋白的功能是必需的。双层性质也可以影响膜蛋白。例如，蛋白质的疏水长度和脂质双层的错配可强烈影响膜蛋白功能。弹性以及包括曲率能和侧压的双层也可影响膜蛋白。
[0159] 因此，本文所述的方法能够从特定细胞类型中纯化质膜脂质以进一步用于重构试验。可保持质膜细胞特异性脂质组分的事实能带来益处。当进行由特定细胞系的质膜释放的膜蛋白的重构时，可以用与天然膜中相同的脂质进行重构。实施例
[0160] 应当理解，本发明不应解释为限定于将描述的实施例；相反，本发明应当解释为包括本文提供的任何和所有应用以及在普通技术人员的技术水平内的所有等同变化。
[0161] 实施例1：高纯度质膜囊泡(PMV)的制备
[0162] 高纯度质膜囊泡的制备由四步组成：
[0163] 1.通过添加PMV形成剂到细胞培养物来形成PMV
[0164] 2.从细胞培养物释放PMV
[0165] 3.通过密度梯度离心纯化PMV
[0166] 4.通过透析纯化PMV
[0167] 步骤1-2产生具有PMV大小在直径范围达到约十微米的粗多分散PMV级分。在几种结构和功能检测中该PMV可存在很大用途。该检测的实施例包括离子通道功能、G蛋白功能和粘着蛋白功能等等。
[0168] 增加步骤3和4产生具有PMV大小在直径范围达约十微米的无细胞超纯多分散PMV级分，其可用于多种结构和功能性检测，包括筛选蛋白表达的蛋白质组检测和靶标鉴定。
[0169] 通过向粘附的细胞培养物添加PMV-形成剂形成PMV。为了以高产量制备和纯化PMV，必须培养足够量的细胞。该方法是规模可变的(scalable)，并且对于甚至从单细胞收集单个PMV的微制备(microprep)直至从数亿计的细胞中收集PMV的大批量制备均工作良好。除了粘附细胞外，也可按照如本文所述的粘附细胞的相同程序使用悬浮细胞。
[0170] 将粘附细胞生长到～80％汇合度以得到～15×106个细胞(参见图1A)。由于血清蛋白将形成蛋白质组检测中的污染源，所以使用含有10mM HEPES和140mM NaCl的缓冲溶液充分洗涤细胞层，以彻底除去培养基(图1B)。
[0171] 然后通过直接向培养瓶中添加含有2mM二硫苏糖醇(DTT)和25mM甲醛(FA)的囊泡形成溶液诱导囊泡形成(图1C)。利用FA和DTT，～15分钟后PMV开始生长。
[0172] 孵育～30分钟后，通过缓慢摇动来机械性搅动烧瓶(图1D)。这使得囊泡从细胞层出芽产生无漂浮的PMV悬浮液。可以手动，即摇动烧瓶或通过使用机械性实验室摇动器或可选的通过使用超声破碎来进行搅动。
[0173] 为了最大化产量，在37℃下进行囊泡形成，并在30分钟直至几小时的时间段内持续进行。利用移液管将形成的囊泡从细胞培养皿转移到(图1E)Eppendorf小瓶(图1F)。
[0174] 单个NG108-15细胞在2小时的时窗内可以产生三个10μm直径的PMV。这相当于2 6
从单个细胞的PM释放的～300μm 的膜面积。因此，容纳～1×10 个粘附细胞的培养瓶将
2
产生3百万个平均直径为10μm的PMV，相当于314mm 的膜面积。
从单个细胞的PM释放的～300μm 的膜面积。因此，容纳～1×10 个粘附细胞的培养瓶将
2
产生3百万个平均直径为10μm的PMV，相当于314mm 的膜面积。
[0175] 我们还通过显微镜观察室温下一个细胞附着的PMV的生长时间来评价膜释放率。假设生产3个PMV，在30分钟内直径扩展5μm(5μm→10μm)相当于每个细胞～8μm/
2
分的膜释放率。相比较，内吞率在每个细胞～5μm/分的范围内。可以推测在更长的孵育期内可以释放更多的PMV。自除去第一代PMV后(～12小时)，利用新鲜囊泡形成溶液的另外12-24小时的孵育循环仍产生大量PMV。然而，第一孵育循环60小时后收获的第三代PMV具有相当程度的更小的平均直径，表明可用膜存储(membrane stores)的耗竭。
2
分的膜释放率。相比较，内吞率在每个细胞～5μm/分的范围内。可以推测在更长的孵育期内可以释放更多的PMV。自除去第一代PMV后(～12小时)，利用新鲜囊泡形成溶液的另外12-24小时的孵育循环仍产生大量PMV。然而，第一孵育循环60小时后收获的第三代PMV具有相当程度的更小的平均直径，表明可用膜存储(membrane stores)的耗竭。
[0176] 该步骤完成后，得到具有PMV大小在直径范围达到约十微米的粗多分散PMV级分(图1F)。这样的PMV在多种结构和功能检测中可以存在很大用途。特别在使用细胞大小的对象的检测中，包括高通量和高内容分析中。
[0177] 对于需要超纯PMV级分的应用，必须纯化含粗PMV的溶液，这是因为它含有大量可能污染如蛋白质组分析的物质。首先，PMV必须从其它膜粒子如分离的细胞和细胞碎片中分离。由于PMV充满细胞质并具有与细胞相似的大小，在离心过程中大量的级分将与细胞材料一起粒状沉淀，妨碍了有效分离。为了避免这种情况，我们利用了PMV相比于细胞的密度差。为此，将PMV溶液(图2A)转移到离心管并在下面铺上高密度蔗糖相(图2B)。通过仔细地在PMV溶液下面添加2M蔗糖完成该步骤。然后在摆动式转子内500×g下离心15分钟。PMV聚集在但未跨越缓冲液/蔗糖相界面，而细胞粒状沉淀于试管底部，确保了细胞与PMV几乎完全的分离(图2C)。
[0178] 也可以通过过滤法，如具有几微米孔径大小的过滤器从PMV溶液中除去细胞。
[0179] 更多的污染物质是可能从囊泡形成步骤中的细胞以及从破裂的PMV释放的可溶性蛋白质。囊泡形成剂FA由于其蛋白交联活性也可能妨碍下游蛋白酶消化的效率。因为相同的理由可能进一步使功能以及结构检测复杂化。因此，吸取样品(图2D)并转移到透析管(图2E)，并利用高截留渗析管(1MDa)透析。在含10mM HEPES和140mM NaCl的缓冲液中进行透析8-12小时。透析完成后将囊泡转移到Eppendorf小瓶(图2F)。
[0180] 如上所述的方法产生具有PMV直径范围达到约十微米大小的适当(fairly)的多分散的PMV级分，这些适当的多分散的PMV级分可用于多种结构和功能检测，特别是下面进一步详细描述的蛋白质组检测以筛选蛋白表达和靶标鉴定等等。
[0181] 然后根据应用可将超纯PMV级分以多种方式进一步处理。因此，对于每种情况可以进行PMV的化学修饰，如糖残基、膜蛋白和膜本身等的修饰。胶粒大小可以是重要的参数，并且常常需要具有膜蛋白质组的某些化学修饰的单分散级分。在下文中，我们为了进行蛋白质组检测的目的而描述超纯PMV级分在芯片上和在溶液中的处理步骤。该处理由五个步骤组成，其中有几个步骤根据特殊应用领域是可选的。
[0182] 1.膜蛋白的烷基化和还原
[0183] 2.碱洗以破坏非共价蛋白-蛋白相互作用
[0184] 3.超声破碎以释放囊泡内污染物并形成小囊泡
[0185] 4.超速离心以纯化PMV级分
[0186] 5.漂洗并分散于碳酸氢铵缓冲液
[0187] 通过下文中的阿拉伯数字提及这些步骤。
[0188] 1.膜蛋白的烷基化和还原。将多分散PMV(图3A)透析样品中的表面暴露的膜蛋白用10mM DTT还原并用50mM碘乙酰胺烷基化以破坏二硫键，以达到产生更多用于消化的有效切割位点和防止蛋白聚集(图3B)。
[0189] 2.碱洗以破坏非共价蛋白-蛋白相互作用。第二，高pH洗涤步骤(pH 11，Na2CO3)破坏非共价蛋白-蛋白相互作用，从膜中解离细胞质蛋白质(图3C)。
[0190] 3.与超声破碎联用进行步骤2以释放囊泡内污染物并形成小囊泡。该步骤还包括引起PMV破坏并重新密封为更小囊泡的广泛声处理，从而将细胞质内含物释放到PMV溶液中。
[0191] 4.超速离心以清洁PMV级分。为了除去这种另外的污染源，通过100,000×g下的超速离心粒状沉淀PMV膜，并除去上清液(图3D)。
[0192] 5.漂洗并分散于碳酸氢铵缓冲液中(图3E-G)。最后，将膜粒状沉淀漂洗并通过声处理分散于20mM碳酸氢铵缓冲液中，并准备消化(图3H)。
[0193] 根据上述步骤1-5处理PMV级分后，我们现在得到小尺寸PMV的超纯单分散级分。该单分散PMV的超纯级分可用于大量应用，包括结构和功能检测。
[0194] 在下文中我们描述通过借助于进行经由LC-MS/MS的膜蛋白质组分析的酶，该级分如何用于蛋白水解的消化。我们使用两种不同的消化方法。如下详细所述，一种在溶液中进行，另一种使用流式细胞中的固定化PMV进行。
[0195] 1.PMV中的膜蛋白溶液内消化
[0196] 2.在固定化PMV上的膜蛋白消化
[0197] 消化可以在溶液中以及PMV固定于流式细胞后进行。对于溶液内的消化，将胰蛋白酶添加到处理的PMV溶液，通过低截留过滤从膜中分离肽。
[0198] 流式细胞的工作原理是基于PMV固相固定化，允许简单缓冲液/试剂交换以及样品处理(图4A-D)。将PMV溶液注入流式细胞，其中膜和蛋白质粘附到表面。胰蛋白酶溶液的注入引发暴露于固定化PMV表面上的蛋白结构域的消化(图4A-D)。由于某些可溶性蛋白污染物被固定化并且在反复洗涤循环中许多被洗出而未损失膜蛋白级分，所以流式细胞也提供清洁肽级分的纯化步骤。最后，洗脱并通过LC-MS/MS分析肽。
[0199] 实施例2：来自NG-108细胞的质膜囊泡的分离和纯化以及随后的LC-MS/MS蛋白质组分析
[0200] 质膜囊泡的分离和纯化。用具有10％FCS的DMEM(4.5g/L葡萄糖、2mM L-谷氨20，29
酰胺)将NG108-15细胞生长至汇合。用有修改的前述方法 进行囊泡形成。简言之，用
10mM HEPES、140mM NaCl，pH 7.4洗涤汇合细胞层两次。用2-4mL囊泡形成缓冲液(含2mM CaCl2、2mM DTT和25mM甲醛的10mM HEPES、140mM NaCl，pH7.4)孵育细胞，其中在37℃伴随缓慢摇动(60-80转/分钟)的孵育时间选在8-16小时之间。从烧瓶中收集上清液，并汇集到15mL锥形管中。为除去已从表面分离的细胞，将2mL2M蔗糖铺在溶液下面并用摆动式转子以500×g在4℃下离心15分钟。收集上清液，注意，发现大多数大泡在接近于蔗糖相的溶液中。然后，透析PMV，其中证明Spectrapor Biotech 1000kDaMWCO CE膜(Spectrum Labs，Breda，NL)是分析之前除去剩余囊泡形成缓冲液成分和低分子量蛋白质的最有效透析材料。注意使用RC(再生纤维素)膜透析后，PMV的回收率低，但使用CE(纤维素酯)膜的PMV产量稳定。我们推测PMV粘附到RC膜上，相当程度地降低了产量。透析通常在2L
10mM HEPES和140mMNaCl，pH 7.4中在4℃下进行8-12小时。
酰胺)将NG108-15细胞生长至汇合。用有修改的前述方法 进行囊泡形成。简言之，用
10mM HEPES、140mM NaCl，pH 7.4洗涤汇合细胞层两次。用2-4mL囊泡形成缓冲液(含2mM CaCl2、2mM DTT和25mM甲醛的10mM HEPES、140mM NaCl，pH7.4)孵育细胞，其中在37℃伴随缓慢摇动(60-80转/分钟)的孵育时间选在8-16小时之间。从烧瓶中收集上清液，并汇集到15mL锥形管中。为除去已从表面分离的细胞，将2mL2M蔗糖铺在溶液下面并用摆动式转子以500×g在4℃下离心15分钟。收集上清液，注意，发现大多数大泡在接近于蔗糖相的溶液中。然后，透析PMV，其中证明Spectrapor Biotech 1000kDaMWCO CE膜(Spectrum Labs，Breda，NL)是分析之前除去剩余囊泡形成缓冲液成分和低分子量蛋白质的最有效透析材料。注意使用RC(再生纤维素)膜透析后，PMV的回收率低，但使用CE(纤维素酯)膜的PMV产量稳定。我们推测PMV粘附到RC膜上，相当程度地降低了产量。透析通常在2L
10mM HEPES和140mMNaCl，pH 7.4中在4℃下进行8-12小时。
[0201] PMV的下游处理和蛋白水解消化
[0202] 处理纯化的PMV溶液以优化下游分析。用DTT(10mM终浓度，56℃，1小时)进行还原。随后用碘乙酰胺(50mM终浓度，RT，1小时)进行烷基化。向PMV溶液中添加Na2CO3至终浓度为100mM(pH 11)，随后通过在冰上浴-声处理～30分钟。然后，通过离心(100,000×g，60分钟)收集膜。除去上清液并仔细漂洗后，通过声处理将粒状沉淀重悬并分散于20mM碳酸氢铵pH8中。然后我们使用两种不同方法中任何一种分析蛋白含量：1)用胰蛋白酶在溶液中消化PMV悬浮液(0.005mg/mL，37℃，16小时)，随后过滤(Anotop，20nmTM过滤器)。通过LC-MS/MS按照以下所述分析过滤的肽溶液；2)处理PMV悬浮液并注入LPI FlowCell(Nanoxis AB， Sweden)，在此囊泡被固定化。通过用300mM NaCl，
10mM Tris，pH 8然后20mM碳酸氢铵，pH 8漂洗流式细胞来洗涤固定化的膜囊泡。通过用胰蛋白酶(20mM碳酸氢铵中0.005mg/mL，pH 8)在37℃孵育样品2小时来消化固定化的囊泡中的膜蛋白。所得肽溶液用20mM碳酸氢铵，pH 8洗脱并通过LC-MS/MS分析。
10mM Tris，pH 8然后20mM碳酸氢铵，pH 8漂洗流式细胞来洗涤固定化的膜囊泡。通过用胰蛋白酶(20mM碳酸氢铵中0.005mg/mL，pH 8)在37℃孵育样品2小时来消化固定化的囊泡中的膜蛋白。所得肽溶液用20mM碳酸氢铵，pH 8洗脱并通过LC-MS/MS分析。
[0203] LC-MS/MS和生物信息学
[0204] 由在哥德堡大学蛋白质组学中心研究室(Proteomics Core Facility)的LC-MS/MS分析肽。分析之前，将样品真空离心干燥并在20μL水中的0.1％的甲酸中重构。将样品在13,000×g下离心15分钟，并最终将17μL转移至LC-MS/MS系统的自动进样器。对于液相色谱，使用Agilent 1100双泵，并在内部填充有3μmReproSil-Pur C18-AQ微粒(Dr.Maisch，GmbH，Ammerbuch，Germany)的200·0.05mm内径的熔融石英柱上分离胰蛋白酶肽。注入样品(2μL)并在填充有3μm C18-结合粒子的前置柱(45·0.1mm内径)上首先捕获肽。使用由0.2％甲酸中的10-50％乙腈组成的40分钟梯度分离肽，通过柱的流速通过分流降低至大约100nL/分钟。在装配有内部修饰的纳升喷雾源的7-T LTQ-FT质谱仪(混合线性离子阱四极杆-傅立叶变换(Hybrid Linear Trap Quadrupole-Fourier Transform))(Thermo Electron)中进行质量分析。在数据-依赖模式中运行仪器以在MS和MS/MS获取之间自动地转换。当在LTQ-离子阱(trap)中获得MS/MS谱时，在FT-ICR中获得MS谱。对于每次FT-ICR扫描，通过碰撞诱导解离(CID)在线性离子阱内连续断裂六个最强烈的、二重(doubly)或三重质子化离子。对于MS/MS分析排斥已片段化的靶离子6秒。所有串联质谱由MASCOT(Matrix Science)检索SwissProt数据库的啮齿类动物亚型。使用的检索参数为：对于前体离子质量为5ppm质量偏差，对于产物离子质量为0.5Da；用胰蛋白酶消化；最大的一个胰蛋白酶错切；包括甲硫氨酸的氧化和半胱氨酸的氨甲酰甲基化的可变修饰。仅考虑了Mascot期望值小于0.05的肽。蛋白鉴定的标准包括至少2个独特识别肽的检出，但如果肽被重复检出则允许单个肽的鉴定。不包括蛋白鉴定之间共有的肽。基于从UniProt数据库获得的信息，辅以从Chromatin DB(http://www.chromdb.org/)收集的信息、亚细胞定位预测程序Cello(http://Cello.life.nctu.edu.tw/)和ProteomeAnalyst(http://pa.cs.ualberta.ca：8080/pa/)以及通过LC-MS/MS提供蛋白质的蛋白质组和亚细胞分析数据的文献来分配亚细胞定位。基于Uniprot注解(annotate)来识别通过跨膜结构域或脂质修饰锚定到双层的蛋白质。
[0205] 微粒体膜制品
[0206] 用PBS洗涤NG108-15细胞，在1mM NaHCO3中短暂膨胀，并在紧密配合的杜恩斯(Dounce)匀浆器内机械破坏20个冲程。通过离心(400×g，5分钟)除去细胞核和细胞碎片。向含有微粒体膜级分的上清液补充Na2CO3至终浓度100mM(pH 11)。通过离心(100,000×g，60分钟)粒状沉淀膜。除去上清液后，使用顶端声处理器(tip sonicator)(VibraCell Model 501，Sonics&Materials Inc.，USA)重悬膜粒状沉淀并分散于300mM TMNaCl、10mM Tris，pH 8中。将膜囊泡样品注入LPI FlowCell，随后使用相同程序分析微粒体膜制品。
[0207] PMV中鉴定的膜蛋白
[0208] 为了测定PMV膜的亚细胞来源，我们研究了本文发现的膜蛋白的亚细胞定位。已分析了五个独立的PMV样品，产生共计274个蛋白鉴别。根据我们用于注解膜关联和亚细胞定位的来源，43种PMV蛋白质通过至少一个α-螺旋结构域或脂质锚钩而锚定于膜(表1)，44种通过其它相互作用与膜相关。发现锚定的膜蛋白中有40种定位于PM(90％)，其中
32种蛋白质(74％)对于PM是独特的。对于剩余的191种蛋白质，我们不能鉴定任何膜关联，推测这些源自PMV中的可溶性蛋白质。
32种蛋白质(74％)对于PM是独特的。对于剩余的191种蛋白质，我们不能鉴定任何膜关联，推测这些源自PMV中的可溶性蛋白质。
[0209] 为了比较，我们还进行了NG108-15细胞系的微粒体制备。这是通过细胞裂解和除去细胞核以及可溶性蛋白质来分离细胞膜的标准方法。分析了两种微粒体制品，产生共计308种蛋白鉴别。79种蛋白质通过至少一个α-螺旋结构域或脂质锚钩而锚定到膜，57种通过其它相互作用与膜相关。锚定的膜蛋白中有35种发现定位到PM(44％)，其中仅17种蛋白质(20％)对于PM是独特的(图5)。与微粒体制备品相比，PMV膜级分的PM蛋白质含量更高(90％)。
[0210] 在PMV中鉴定的膜蛋白中，发现主要是GTP酶和G蛋白。也存在氨基酸转运蛋白、离子转运蛋白以及负责细胞粘着和生长的蛋白(图6)。特别地，还鉴定了假定的质膜-细胞骨架交联蛋白质，表明囊泡形成过程可能引起这些蛋白质从细胞骨架的解离。图7中发现了关于鉴定的膜蛋白的相对亚细胞分布的更多细节，还比较了微粒体和PMV膜级分。在我们的PMV分析中，我们还可以鉴定191种可溶性蛋白质，它们中的许多是核糖体的和细胞质的(其来源于PMV内含物)。据推测，这些是在PMV样品透析后的处理步骤中释放的。第一次的声处理步骤引起微米大小的PMV破坏并重新密封，释放细胞质内含物。似乎PMV溶液中有很多核糖体，由于它们的尺寸大，不能通过透析除去它们，在超速离心步骤中很可能与处理的PMV膜一起粒状沉淀。此外，由于正好在消化之前对膜粒状沉淀进行另外的声处理步骤，因此，可能发生另外的细胞质蛋白质释放，这可添加到算入所得结果的可溶性蛋白质。如调整离心步骤以除去核糖体蛋白或发现最后声处理步骤的替代方法的进一步优化可能使这些污染源降至最低。
[0211] 实施例3：脂质成分的提取
[0212] 在T175烧瓶内将CHO-K1细胞培养至95％汇合度。从烧瓶中除去培养基，并用150mM NaCl、10mM HEPES、2mM CaCl2，pH7.4洗涤细胞若干次。向各烧瓶中添加25mM甲醛、
2mM DTT、150mM NaCl、10mM HEPES、2mM CaCl2，pH7.4的溶液6mL以诱导质膜囊泡形成。伴随细胞烧瓶的轻柔振动，在37℃下进行囊泡形成2小时。形成囊泡后，从烧瓶中收集含质膜囊泡的溶液并汇集。将溶液通过40μm细孔的过滤器以除去细胞聚集体，并通过5μm的过滤器以除去单细胞。然后在-20℃将溶液冷冻。将来自不同细胞批次的泡溶液汇集成用于提取的较大批次。测量总的泡溶液的体积并用于计算用于提取的有机溶剂的体积。第一步是添加NH4Ac(乙酸铵)至终浓度10mM。使用修改的Bligh-Dyer提取规程，其中将溶剂比率设定为2∶1∶0.8(MeOH∶DCM∶NH4Ac(10mM))。然后将甲醇(MeOH)和二氯甲烷(DCM)添加到泡溶液。未观察到相分离，使用来自Sonics&Materials Inc的装配有13mm探头的Vibra Cell(501型)来顶端声处理溶液。设置为7秒脉冲和5秒间歇以降低样品热量，在
30％振幅下进行声处理2分钟。通过添加40ml DCM和10mlNH4Ac(120mM)诱导相分离，并收集DCM相。再次，添加10mlNH4Ac(120mM)并收集DCM相。然后将50ml DCM添加到MeOH/NH4Ac相并如上所述来顶端声处理(tipsonication)。顶端声处理后，向溶液中添加10ml NH4AC(120mM)和50ml DCM。搅动和相分离后，收集DCM相。向剩余的MeOH/NH4AC相中添加
50ml DCM、50ml MeOH和10ml NH4AC(120mM)。搅动后，收集DCM相。最后，向剩余MeOH/NH4AC相添加10ml NH4AC(120mM)，收集DCM。将汇集的DCM相在-20度过夜贮存后，在DCM相旋转蒸发之前可以从DCM相中分离MeOH/NH4AC相。将DCM相旋转蒸发并称重干燥的残余。估计由大约8千万个细胞产生的泡在提取后给出1mg干脂质。另外，利用SDS-PAGE检查干脂质残余的蛋白污染物。来自由大约1千万个细胞释放的泡的脂质残余首先在2×SDS-PAGE样品缓冲液(4％SDS)中重构。使用来自Sonics&Materials Inc的装配有2mm探头(30秒声处理时间，设置为在5％振幅下2秒脉冲和2秒间歇时间)的Vibra Cell(501型)轻轻地顶端声处理样品。然后将样品水浴加热(＜100摄氏度)，随后涡流5分钟。然后在标准
10％丙烯酰胺凝胶上使样品跑胶1小时之前将重悬脂质用MQ稀释。结果表明脂质提取物没有蛋白污染。
2mM DTT、150mM NaCl、10mM HEPES、2mM CaCl2，pH7.4的溶液6mL以诱导质膜囊泡形成。伴随细胞烧瓶的轻柔振动，在37℃下进行囊泡形成2小时。形成囊泡后，从烧瓶中收集含质膜囊泡的溶液并汇集。将溶液通过40μm细孔的过滤器以除去细胞聚集体，并通过5μm的过滤器以除去单细胞。然后在-20℃将溶液冷冻。将来自不同细胞批次的泡溶液汇集成用于提取的较大批次。测量总的泡溶液的体积并用于计算用于提取的有机溶剂的体积。第一步是添加NH4Ac(乙酸铵)至终浓度10mM。使用修改的Bligh-Dyer提取规程，其中将溶剂比率设定为2∶1∶0.8(MeOH∶DCM∶NH4Ac(10mM))。然后将甲醇(MeOH)和二氯甲烷(DCM)添加到泡溶液。未观察到相分离，使用来自Sonics&Materials Inc的装配有13mm探头的Vibra Cell(501型)来顶端声处理溶液。设置为7秒脉冲和5秒间歇以降低样品热量，在
30％振幅下进行声处理2分钟。通过添加40ml DCM和10mlNH4Ac(120mM)诱导相分离，并收集DCM相。再次，添加10mlNH4Ac(120mM)并收集DCM相。然后将50ml DCM添加到MeOH/NH4Ac相并如上所述来顶端声处理(tipsonication)。顶端声处理后，向溶液中添加10ml NH4AC(120mM)和50ml DCM。搅动和相分离后，收集DCM相。向剩余的MeOH/NH4AC相中添加
50ml DCM、50ml MeOH和10ml NH4AC(120mM)。搅动后，收集DCM相。最后，向剩余MeOH/NH4AC相添加10ml NH4AC(120mM)，收集DCM。将汇集的DCM相在-20度过夜贮存后，在DCM相旋转蒸发之前可以从DCM相中分离MeOH/NH4AC相。将DCM相旋转蒸发并称重干燥的残余。估计由大约8千万个细胞产生的泡在提取后给出1mg干脂质。另外，利用SDS-PAGE检查干脂质残余的蛋白污染物。来自由大约1千万个细胞释放的泡的脂质残余首先在2×SDS-PAGE样品缓冲液(4％SDS)中重构。使用来自Sonics&Materials Inc的装配有2mm探头(30秒声处理时间，设置为在5％振幅下2秒脉冲和2秒间歇时间)的Vibra Cell(501型)轻轻地顶端声处理样品。然后将样品水浴加热(＜100摄氏度)，随后涡流5分钟。然后在标准
10％丙烯酰胺凝胶上使样品跑胶1小时之前将重悬脂质用MQ稀释。结果表明脂质提取物没有蛋白污染。
[0213] 讨论
[0214] 我们的方法开发了细胞从其表面以微米大小的囊泡形式释放PM的能力。其主要优点是膜制品在PM含量方面的高纯度以及简易的处理步骤。PMV不含有细胞器或细胞骨架结构，但充满细胞质组分。由于PMV仅来源于PM的事实，它们为广泛应用，特别是在蛋白质组科学领域提供优异的平台。通过采用预先细胞培养的分子生物技术，例如转染、蛋白的重组或过表达、荧光标记、基因沉默等等，可以控制PMV的膜以及内部蛋白质的组成。这将有益于PM的比较蛋白质组学研究和了解其动态行为。例如，PM蛋白质的时空行为以及膜与内膜系统的动态交换是可以提出的重要议题。通过分析和比较不同的PMV世代(例如，当相对较高的ER/高尔基体蛋白质级分可能在随后的PMV世代中发现时)，我们提出的分析PM蛋白质组的方法可以帮助回答以下问题：在延长的孵育时间(＞24小时)后内膜存储是否被征募用于PMV形成。因为其它哺乳动物细胞系，如HEK293和CHO-K1当暴露于囊泡形成21，22
溶液时也能大量产生PMV(数据未提供)，所以纯化方法可应用于多种细胞系 。这使得该方法成为分析和比较不同细胞系的PM蛋白质组以及比较特定目标细胞系的不同蛋白表达谱的有前景的技术。
溶液时也能大量产生PMV(数据未提供)，所以纯化方法可应用于多种细胞系 。这使得该方法成为分析和比较不同细胞系的PM蛋白质组以及比较特定目标细胞系的不同蛋白表达谱的有前景的技术。
[0215] 由于我们提供的技术是获得相对于膜蛋白含量具有非常高纯度的PM的方法，所以我们认为它是哺乳动物PM蛋白质组分析的有力工具，并且当结合分子生物学技术时，其能提供研究质膜蛋白组动态性质的有力手段。另外，由于在每个单独PMV中膜与细胞质成分是整合的，所以它们构成多功能简单化的细胞模型，使得能够研究更复杂的细胞过程。例如，PMV内含物的蛋白质组分析对于例如与细胞质蛋白质偶联的膜蛋白行为的研究是极其有用的。
[0216] 通过参考并入
[0217] 本申请全文中引用的所有参考引文、专利、未决专利申请和公开专利的内容通过参考清楚地并入本文。
[0218] 等同方案
[0220] 表1
[0221]
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