肺炎球菌溶血素 胆固醇依赖性成孔溶细 胞素 P11990 X52474链球菌溶血素0 胆固醇依赖性成孔溶细 胞素 P21131 M18638热稳定型直接溶血素(神 奈川毒素) 成孔溶细胞素 P19249 D90101钩端螺旋体溶血素 成孔/破裂膜 034095 U89708Cry毒素,例如CrylAc 成孔溶细胞素 P05068 M11068炭疽毒素 靶细胞中激酶的蛋白水 P15917/ M29081/ 解攻击/钙调蛋白依赖 P13423/ M22589/ 性腺苦酸环化酶 P40136 M23179假单胞菌外毒素A NAD-依赖性ADP-核糖基 转移酶 P11439 K01397芽孢杆菌RNA酶 核糖核酸酶 P00648 M14442VIP3 成孔溶细胞素 (J45792 L48811硫素 细胞溶解性植物毒素 P01543 AF004018l型核糖体灭活蛋白,例 rRNA N-糖*酶 P33186 L12243如白树毒蛋白 P -噪呤硫素 细胞溶解性植物毒素 P01543 AF00術8在本发明的实施方案中使用的优选毒素包括粒酶B、 cyt 2A、 P-噤呤硫素、VIP2A、白树毒蛋白和粒溶素。特别优选的毒素选自粒酶B、 cyt 2A、 p-嘌呤石克素、VIP2A和白树毒蛋白。如上所述的蛋白质毒素可以整体引入本发明的融合蛋白中。备选 地,当此类毒素的结构域或片段赋予毒性活性时,那种结构域或片段 可以月作融合蛋白中的第二种蛋白质组分。在另一个实施方案中,本发明融合蛋白中的第二种蛋白质组分是 免疫原,即能够在啮齿类动物中引发免疫应答的多肽或寡肽。在一个 优选实施方案中,本发明的免疫原-融合蛋白将能够充当免疫避孕剂, 并且将因此通过阻止繁殖而充当啮齿类动物防治剂。因此,精子或卵 子特异性抗原,例如,乳酸脱氢酶C、精子抗原PH-20 (Primakoff等 人,1988 Nature 335:543-6 )、受精蛋白(PH-30)和透明带抗原是 在本发明融合蛋白中用作第二种蛋白质组分的合适免疫原。在另外一个实施方案中,本发明融合蛋白中的第二种蛋白质组分 是激素或蛋白质性质的激素模拟物。在这个实施方案中,第二种蛋白 质组分将干扰和阻止啮齿类动物中的繁殖,并且融合蛋白因此通过阻止生育而充当啮齿类动物防治剂。可以在本发明的这个实施方案中使 用的激素的例子包括促性腺激素释放激素。在进一步的实施方案中,如上所述的融合蛋白可以包含至少一种 另外的蛋白质组分。这种(或这些)另外的蛋白质组分可以是如上所 述的毒素、免疫原、激素或蛋白质性质的激素模拟物。因此,可以构建包含抗体组分和至少2种另外的蛋白质组分的融合蛋白,其中另外 的蛋白质组分中的每一种赋予融合蛋白以啮齿类动物防治(即毒性或 避孕,或两者)功能。第二种和另外的蛋白质组分可以各自具有相同 或不同的啮齿类动物防治功能(即它们可以各自独立地是毒性的或避 孕的),并且当它们具有相同功能时,它们可以各自具有相同的或独 立地不同的作用方式。当另外的蛋白质组分具有相同的啮齿类动物防 治功能并且其中至少一种另外的蛋白质组分具有不同于第二种蛋白质 组分的作用方式时,可以增强啮齿类动物防治剂的功效(相对于包含 赋予啮齿类动物防治活性的单一蛋白质组分的啮齿类动物防治剂)。 例如融合蛋白,其中第二种蛋白质组分是细胞破裂性毒素(例如选自 产气荚膜梭菌细胞溶素0、 a溶血素、鞘磷脂酶、5-溶血素、ot毒素、 cyt毒素、粒溶素、蜂毒肽、穿孔素、海葵毒素、李斯特菌溶胞素、 气单胞菌溶素、溶血素A、变形虫通道蛋白、El Tor溶血素、美人鱼 弧菌溶血素、肺炎球菌溶血素、链球菌溶血素0、神奈川毒素、钩端 螺旋体溶血素、cry毒素、VIP3、硫素和P-嘌呤硫素)并且另外的蛋 白质组分可以是为了活性而需要在细胞内内在化的毒素(例如选自粒 酶B、白喉毒素、霍乱内毒素、VIP2、附属肠毒素、大肠杆菌素E1、 CTX IV、 2型核糖体失活蛋白例如蓖麻毒素、炭疽毒素、假单胞菌外 毒素A、芽孢杆菌RNA酶、1型核糖体失活蛋白例如白树毒蛋白),可 以是特别有效的啮齿类动物防治剂,因为由第二种蛋白质组分所赋予部来帮助另外;蛋白质组分的功能活性。在优选的实施方案中,融合 蛋白将包含选自cyt2A、 p-嘌呤硫素和粒溶素的至少一种毒素组分; 和选自粒酶B、 VIP2A和白树毒蛋白的至少一种毒素组分。 本发明的融合蛋白可以如此构建,即使得第一种蛋白质组分(抗体组分)处于第二种蛋白质组分的N-末端,备选地,它们可以如此构 建,即使得第二种蛋白质组分处于第一种蛋白质组分的N-末端。如前 文提及的,在某些实施方案中,希望经由连接体肽间接连接所述两种 蛋白质组分。因此,本发明的融合蛋白从N到C末端可以包括,经由 肽键连接至连接体肽的第一种蛋白质组分,所述连接体肽接着经由肽 键连接至第二种蛋白质组分,或者它们从N到C末端可以包括,经由 肽键连接至连接体肽的第二种蛋白质组分,所述连接体肽接着经由肽 键连接至第一种蛋白质组分。当融合蛋白包含另外的蛋白质组分时,另外的蛋白质组分可以处 于第一种组分的N-末端,即另外的蛋白质组分通过其C-末端残基经由 肽键直接连接至第一种蛋白质组分的N-末端残基,或经由肽连接体 (或另外的蛋白质组分)间接连接至第一种蛋白质组分的N-末端残 基。在一个进一步的实施方案中,另外的蛋白质组分处于第二种蛋白 质组分的N-末端,即另外的蛋白质组分通过其C-末端残基经由肽键直 接连接至第二种蛋白质组分的N-末端残基,或经由肽连接体(或另外 的蛋白质组分)间接连接至第二种蛋白质组分的N-末端残基。在更进 一步的实施方案中,另外的蛋白质组分可以i)处于第一种组分的C-末端,即另外的蛋白质组分通过其N-末端残基经由肽键直接连接至第 一种蛋白质组分的C-末端残基,或经由肽连接体(或另外的蛋白质组 分)间接连接至第一种蛋白质组分的C-末端残基;或ii)处于第二种 蛋白质组分的C-末端,即另外的蛋白质组分通过其N-末端残基经由肽 键直接连接至第二种蛋白质组分的C-末端残基,或经由肽连接体(或 另外的蛋白质组分)间接连接至第二种蛋白质组分的C-末端残基。本发明的抗体组分和/或融合蛋白可以通过在任何合适的蛋白质 表达系统中表达编码它们的核酸来产生。因此,在一个进一步的方面, 本发明提供了编码本发明融合蛋白的核酸。编码本发明融合蛋白的核 酸可以通过将编码第一种蛋白质组分的核酸按阅读框架与编码第二种 蛋白质组分的核酸克隆在一起来获得。当第一种和第二种蛋白质组分 经由肽连接体间接连接时,编码所述连接体的核酸将分隔融合蛋白的 两种蛋白质组分,并且与它们处于阅读框架内。编码抗体组分的核酸可以使用标准分子生物学技术从表达本发明 抗体的杂交瘤细胞中分离。备选地,编码抗体组分的核酸可以再次使 用标准分子生物学技术从编码本发明抗体或抗原结合片段的噬菌体展 示或其他文库克隆中获得。编码第二种蛋白质组分(毒性或避孕组分)的例子的核酸序列是本领域可获得的,参见,例如表2中的EMBL数据库参照符号。编码连接体肽的核酸可以从头合成,例如从编码所述连接体肽序列的寡核苷酸合成。为了使抗体组分或融合蛋白在合适的蛋白质表达系统中表达,将 编码融合蛋白的核酸可操作地连接至合适的启动子,以及任选地连接 至合适的转录终止子。 一般而言,编码融合蛋白的核酸所可操作地连胞中表达的任何启动子。因此,如果需要在细菌细胞中表达抗体组分 或融合蛋白,那么启动子将是在那种细菌细胞中可运作的。类似地, 如果需要在真菌表达系统中表达抗体组分或融合蛋白,那么启动子将 是在真菌细胞中可运作的,并且如果构建体被引入哺乳动物细胞培养 表达系统或植物表达系统中,那么可采用相同的逻辑类推。当抗体组 分或融合蛋白在植物细胞和/或植物中表达时,种子特异性启动子的使 用是特别希望的。当本发明的核酸可操作地连接至合适的转录终止子 区域时,所述转录终止子区域将是介导在其中待表达本发明抗体组分 或融合蛋白的宿主细胞中的转录终止的转录终止子区域。适合用于这 个目的的转录终止子区域在本领域中进行了描述。用于表达本发明抗体组分和/或融合蛋白的合适表达系统包括,微 生物表达系统例如细菌系统(例如大肠杆菌(A co//)、芽孢杆菌 表达系统),和真菌系统如酵母(例如酿酒酵母 (Sacc力aro迈/ces cere7/siae)、粟酒裂歹直酵母(Sc力/zc^accAaro迈/ces /70边6e)、毕赤酵母属(P/c力/a)物种、汉逊酵母属(^3/^e/zw/a)物 种)和其他真菌表达系统(例如来源于曲霉属(J"e^/7"s)物种、 里氏木霉(7Wc力c^/er鹏reese/)和粗糙脉孢菌(勘"rospora "as^s) 的丝状真菌表达系统);哺乳动物表达系统例如CHO细胞;和植物表 达系统。在表达本发明融合蛋白中使用的优选植物和植物细胞包括小 麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、水稻和粟。技术人员会熟悉在本领域 中充分描述的这些表达系统。本文所述的新型啮齿类动物防治剂还可以是蛋白质缀合物的形 式。因此,在一个进一步的方面,本发明提供了包含化学缀合至毒性 组分或避孕组分的本文所述的本发明抗体组分的蛋白质缀合物。在一 个实施方案中,毒性组分或避孕组分将是小的化学实体,而在一个进 一步的实施方案中,毒性组分或避孕组分将是上文在关于本发明融合 蛋白时所描述的蛋白质或肽。当毒性组分是小的化学实体时,在本发 明的这个方面中使用的合适毒性化合物的例子包括秋水仙素;多柔比 星;加利车霉素;非类固醇抗炎药(NSAID)类的分子;松胞菌素;抗 凝剂例如溴鼠灵、鼠得克、溴敌隆、氟鼠灵、噻鼠灵、羟基香豆素类 和茚满二酮类;麦角钙化固醇;溴鼠胺;氟鼠啶;磷化锌;红海葱糖 普;(单)氟乙酸钠;氟乙酰胺;a氯醛糖;硫酸铊。当避孕组分是小的化学实体时,在本发明的这个方面中使用的合 适的激素和激素样化合物包括例如黄体酮和雌激素(合成的和天然的) 和diazacon(即,20, 25-二氮杂胆固醇)。蛋白质缀合物的抗体组分可以如前文所述获得,并且可以直接化 学缀合至毒性组分或避孕组分。通常,这种缀合物将涉及导致二硫键 或硫醚键的异双功能试剂的使用,如本领域中所述的(参见,例如 Hermanson, G.T. "Bioconjugate Techniques" Academic Press, London, 1996, for standard methodologies relating to the use of cross-linking reagents)。在一个进一步的实施方案中,当毒性或避孕组分是小的化学实体 时,毒性化合物、激素或激素样化合物可以包入胶囊,并且胶囊可以 连接至本发明的抗体或抗原结合片段。在一个具体实施方案中,胶囊 可以如上文所讨论的经由化学缀合进行连接。在另一个具体实施方案 中,本发明的抗体或抗原结合片段可以经由肽键而化学缀合或融合至 结合胶嚢的第二种结合性组分。例如,本发明的抗原结合片段可以用 于提供双特异性或甚至多特异性结合分子中的一种特异性,其中第二 种(或另外的)特异性是对于胶嚢的,并且这种第二种(或另外的特 异性)由特异性地结合胶嚢的分子(例如抗原结合片段)来提供。在一个进一步的方面,将蛋白质缀合物的抗体组分化学缀合至两种或更多种毒性或避孕组分。另外的毒性或避孕组分可以是蛋白质或 肽部分的形式或者是小化学实体的形式。当至少一种另外的毒性或避 孕组分是蛋白质或肽部分时,所述另外的组分可以是如前文所述的毒 素、免疫原、激素或蛋白质性质的激素模拟物。当至少一种另外的毒 性或避孕组分是小的化学实体时,它可以是如上文所述的毒性化合物 或激素或激素样化合物。在本发明这个方面的某些实施方案中,制备包含化学缀合至至少 两种另外组分的、如本文所述的抗体组分的蛋白质缀合物,所述至少 两种另外组分中的每一种赋予所述蛋白质缀合物以啮齿类动物防治(即毒性或避孕,或两者)功能。第二种另外组分(和另外的组分) 可以(各自)具有与第一种另外组分相同或不同的啮齿类动物防治功 能,并且当它(它们)具有相同功能时,它(它们)可以具有相同或 不同(独立地不同)的作用方式,如上文关于本发明融合蛋白时所述 的。在一个具体实施方案中,蛋白质缀合物将包含如上文所述的抗体 组分,其化学缀合至第二种毒性或避孕组分中的一种或多种分子。缀 合位点将取决于用于缀合反应的化学作用。当希望将两种不同的另外 组分缀合至第一种(抗体)组分时,可能希望对于每种另外组分使用 不同的化学缀合方法,以便确保不同的另外组分不会互相竟争缀合第 一种组分上的相同位点。在本发明的更进一步的方面,提供了包含如上文所述的融合蛋白 或蛋白质缀合物的啮齿类动物防治剂,其中所述融合蛋白或蛋白质缀 合物包含至少两种抗体组分。在一个实施方案中,每种抗体组分结合
相同的靶蛋白,从而增加啮齿类动物防治剂结合其耙组织的概率并还 可能增加啮齿类动物防治剂的结合亲合力。在此类实施方案中,抗体 组分可以是相同或不同的。当抗体组分不同时,这包括,结合耙蛋白
中相同RSE或RSPE的不同抗体组分,或更优选地其中每种抗体组分结 合相同靶蛋白内的不同RSE或RSPE的不同抗体组分。在一个进一步的 实施方案中,啮齿类动物防治剂将包含结合至少两种不同靶蛋白的抗 体组分。包含结合单个靶蛋白内的不同RSEs或RSPEs的抗体组分和/ 或包含结合不同靶蛋白的抗体组分的实施方案,在延迟针对所述啮齿 类动物防治剂而出现的抗性发作中或在抵制于潜在靶位点之一上的抗 性中可能特别有用。
本发明的抗体、抗原结合片段、融合蛋白和蛋白质缀合物可用于 防治啮齿类动物,例如它们可以在杀死啮齿类动物的方法中或在阻止 啮齿类动物生育的方法中使用。因此,在一个进一步的方面,提供了 包含或由本文所述的抗体、抗原结合片段、融合蛋白或蛋白质缀合物
组成的啮齿类动物防治剂。
其中第二种蛋白质组分是毒素或其中将抗体或抗原结合片段缀合
至毒性化合物或蛋白质/肽毒素的本发明融合蛋白和蛋白质缀合物,将 通过杀死啮齿类动物来达到啮齿类动物防治(即,此类融合蛋白和蛋 白质缀合物在其作用方式方面是杀啮齿类的)。当抗体或抗原结合片 段组分识别在啮齿类动物GI道上皮中表达的蛋白质时,融合蛋白或蛋
白质缀合物将结合上皮。取决于融合蛋白/蛋白质缀合物中存在的毒素 或毒性化合物的类型,毒素或毒性化合物可以破裂细胞膜。GI道上皮 的完整性因此受损,并且在GI道中出现的损伤将导致啮齿类动物死 亡。备选地,当毒素或毒性化合物通过细胞内作用方式介导中毒时, 结合的融合蛋白或蛋白质缀合物依赖于通过内吞作用的内在化。 一旦 融合蛋白或蛋白质缀合物进入细胞,毒素/毒性化合物将能够介导中 毒,这将最终导致啮齿类动物死亡。
其中第二种蛋白质组分是免疫原的融合蛋白也需要摄入到啮齿类 动物细胞中。 一旦存在于啮齿类动物细胞内,就激起针对该免疫原的
免疫应答。因此,当免疫原是卵子或精子特异性抗原时,这导致产生 阻止繁殖发生的免疫应答。有利地,融合蛋白的抗体或抗原结合片段 将增加吸收到啮齿类动物中(通过内吞作用)的免疫原的量,并且还
可充当佐剂,从而增加激起合适的免疫应答的可能性。
其中第二种蛋白质或缀合的组分是激素或激素样组分的本发明融
合蛋白和蛋白质缀合物同样需要摄入到啮齿类动物细胞中。 一旦存在 于啮齿类动物细胞中,激素/激素样化合物就会干扰繁殖的激素调节, 并因而通过阻止生育来防治啮齿类动物。
本文描述的融合蛋白和蛋白质缀合物的抗体/抗原结合部分的啮 齿类动物特异性赋予了本发明啮齿类动物防治剂几个优点。对于啮齿 类动物组织的高特异性意味着,啮齿类动物防治剂特异地被靶向啮齿 类动物组织,从而促进毒性/免疫原性/激素组分的摄入/活性。反过来, 这种特异性靶向意味着,对于有效防治可能需要更少的啮齿类动物防 治剂,在环境中存在更少的啮齿类动物防治剂,以及在环境中存在的 啮齿类动物防治剂对非靶标物种不是特异性的,并因此较不可能被其 吸收和对其造成损害。
本发明的啮齿类动物防治剂可以配制成包括本发明融合蛋白或蛋 白质缀合物作为有效成分以及至少一种添加剂、稀释剂和/或载体的组 合物。合适的添加剂例如包括充当啮齿类动物引诱剂的化合物,使得 所述组合物对啮齿类动物来说更可口的化合物,另外的啮齿类动物防 治剂,和用于稳定或保护所述啮齿类动物防治剂的化合物。合适的引 诱剂化合物包括食物材料例如小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、水稻 和粟。在本发明中使用的合适的可口性增强化合物包括增甜剂(例如
乙酰舒泛钾、阿力坦、阿斯巴甜、brazzein、环己烷氨基磺酸盐、糖 精、三氯蔗糖(sucralose)、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、木 糖醇、奇异果甜蛋白、莫内甜蛋白、益寿糖(isomalt)和异麦芽酮糖 (isomaltulose))、植物或动物油(例如玉米、大豆和花生油,鱼 油)和干酵母。合适的稳定性增强/保护性化合物包括保护或防护啮齿 类动物防治剂在被啮齿类动物摄食后免于蛋白水解或水解的那些化合 物,例如anatacids,和可以在pH释放胶嚢的形成中使用的化合物。 在本发明组合物中使用的合适稀释剂和载体包括在已知啮齿类动 物防治剂中用作稀释剂和/或载体的那些,例如蜡,和结合剂例如纤维 素醚、淀粉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、角叉菜聚糖、明 胶、刺梧桐树胶、黄原胶、阿拉伯胶、槐豆胶、黄蓍胶、果胶和聚丙 烯酸酯。
本发明组合物可以包括除了上述添加剂、稀释剂或栽体中任何一 种以外的和/或代替其的另外啮齿类动物防治剂,例如上文在本发明引 言中提及的那些。特别地,本发明还包括本文描述的一种或多种新型 啮齿类动物防治剂与至少 一种第 一代抗凝剂和/或至少 一种第二代抗 凝剂相組合的混合物。在本发明这个方面中使用的优选第 一代抗凝剂 包括羟基香豆素类和茚满二酮类,其中杀鼠灵、氯灭鼠灵、克鼠灵和 杀鼠醚是特别优选的羟基香豆素,和鼠完、敌鼠和氯鼠酮是特别优选 的茚满二酮。在本发明这个方面中使用的优选第二代抗凝剂包括溴敌
隆、溴鼠灵、鼠得克、氟鼠灵和噻鼠灵。
本发明还包括至少两种上文描述的新型啮齿类动物防治剂的混合 物,以及包含此类混合物的组合物(如上文所述)。例如,当啮齿类 动物防治剂是结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位的抗体 组分(即抗体组分本身是功能性啮齿类动物防治剂)时,该啮齿类动 物防治剂可以与一种或多种另外的啮齿类动物防治剂相组合,其中另 外的啮齿类动物防治剂包含抗体组分以及一种或多种毒性或避孕组分 (即一种或多种另外的啮齿类动物防治剂是本文所述的融合蛋白或蛋 白质缀合物)。在进一步的实施方案中,混合物将包括如本文所述的 两种或更多种融合蛋白和/或蛋白质缀合物。
在一个实施方案中,在植物中生产本发明的融合蛋白,并将包含 表达的融合蛋白的植物材料用作用于啮齿类动物防治的饰。根据本发 明的这个方面,优选地,生产融合蛋白的植物将是能够充当啮齿类动 物食物来源的植物,例如小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、水稻和粟 都是用于表达本发明融合蛋白的合适植物。在一个实施方案中,特别
优选地,融合蛋白将在植物种子中表达。以这种方式,来自表达本发 明融合蛋白的植物的谷粒可以直接用作辨。
如上文所提及的,本发明组合物以及包含本发明融合蛋白的植物 和/或谷粒可以用作啮齿类动物防治剂。因此,在一个更进一步的方面, 本发明提供了杀死啮齿类动物的方法,包括将啮齿类动物防治剂置于 啮齿类动物经常出现的区域,从而使得在所述啮齿类动物防治剂被所 述啮齿类动物摄食后,所述啮齿类动物被杀死。技术人员还将意识到, 本发明还提供了阻止啮齿类动物生育的方法,包括将啮齿类动物防治 剂置于啮齿类动物经常出现的区域,从而使得在所述啮齿类动物防治 剂被所述啮齿类动物摄食后,所述啮齿类动物的生殖能力被抑制。
为了测试本发明啮齿类动物防治剂的功效,可以进行各种体外和
体内研究。合适的体外测试的例子是如Heylings 1991 (Toxicol. Appl. Pharmacol. 107: 482-293 )和实施例9中所述的肠环测定法(gut loop assay)。
用于体内评估本发明啮齿类动物防治剂的杀啮齿类特性的典型策
略基于下列要求:1)最小化测试中使用的动物数量,2)使成本下降, 3)快速产生有用信息,4)不拒绝可能有希望的活性物质。
最初的测试通常将在实验室中进行,因为可以小心地控制测试条 件。使用级联测试程序。这个级联允许通过使用顺次决定过程来接受 或拒绝活性物质。通常的测试受试者是褐家鼠和家鼠。屋顶鼠是另一 种重要的测试受试者,但因为它不能作为实验室品系获得,所以它只 在评估程序的较后阶段进行测试。对于抗凝剂具有抗性的啮齿类动物 品系也可在实验室程序的较后阶段中使用,以便测试针对这些动物的 功效。
然后,可以在野外评估在实验室测试中具有活性并且显示出希望
的本发明啮齿类动物防治剂。野外试验在各种自然环境中针对所有重 要有害啮齿类动物物种进行。
技术人员可参考容易获得的指导性文献,所述文献阐述了在实验 室中(EPP0/0EPP. 1999. Laboratory tests for evaluation of the
toxicity and acceptability of rodenticides and rodenticide preparations; OEPP/EPPO PP 1/113( 2 ): 89-101 )和在野外(EPPO/OEPP. 1999. Guidelines for the Efficacy Evaluation of Plant Protection Products: Field—tests against synanthropic rodents 肠颜cw/ws, Aa〃i/"or^/,, i?. r"to; OEPP/EPPO PP 1/114 (2) : 102-113)的用于杀啮齿类剂的合理测试程序。还可以获得对于 满足英国 (Anonymous. 2005. Guidelines on the Efficacy Data Requirements for Approval of Non-agricultural Pesticide Products Rodenticides. Health and Safety Executive, Bootle, UK.第30页)、欧盟(Anonymous. 2002. Technical notes for guidance in support of the Annex VI of Directive 98/8/EC of the European Parliament and the Council concerning the placing of biocidal products on the market. Coimnon principles and practical procedures for the authorisation and registration of products. European Commission, July 2002.第215页)和美国的 规章要求的测试程序的建议。
在实验室可以遵循以便评估本发明啮齿类动物防治剂功效的典型 级联测试可以包括口部插管测试、无选择饲养测试和选择祠养测试。 这些测试的进一步细节在下文概述。
口部插管:用于确定活性物质效力的最初测试涉及使用管饲法将 在惰性液体例如聚乙二醇中携带的活性物质直接递送至测试受试者的 胃中。可以以这种方式递送准确的剂量,以便确定致死剂量百分位数 统计学。该测试提供了关于活性物质在受试者物种的肠中存在的条件 下保持活性的能力以及关于其穿过肠膜进行转移的信息。该测试还提 供了关于活性物质的固有毒性的信息。
无选择饲养测试:事实上所有市售杀啮齿类剂产品都作为配制好 的斜呈现。测试级联的下一个阶段涉及制备包含活性物质(在这种情 况下是本发明的啮齿类动物防治剂)的饰。首先进行其中个别笼养的 测试受试者只有给予它们的实验饵的'无选择,测试,以确定活性物
质在作为可食用的辨进行递送时是否具有活性。测试斜通常可随意获 得。除了如在口部插管测试中获得的信息外,无选择饲养测试提供了 关于活性物质通过受试者物种的消化过程从饰中移出的能力的信息。
选择饲养测试:为了能够被在配制饰中的活性物质控制,啮齿类 动物必须消耗足够量的斜以在可替代的天然食物存在下获取致死剂 量。因此,活性物质(即本发明的啮齿类动物防治剂)的可口性是评 估的重要方面。进行选择测试,其中将活性物质以计量浓度加入斜基 质中。然后,向个别笼养的测试受试者提供在包含活性物质的测试斜 和不含活性物质的相同饰之间的选择。进行一 系列此类测试以确定被 测试受试者所察觉的活性物质的浓度。通常地,此类检测通过厌恶包 含活性物质的仵来证明。评估中的重要考虑是,被测试受试者所察觉 和引发明显厌恶的浓度低于在测试辨中递送致死剂量所需的浓度。
进一步的选择测试对在商业制剂开发中生产的实验辨来进行。这 些选择测试涉及实验制剂的呈现和'挑战饮食(challenge diet),。 挑战饮食如此构成,即使得它呈现为实验制剂的适度可口的可替代物。 在此类测试中使用的典型'挑战饮食,是'EPA餐,。这是包含固定 量的燕麦、粗碾玉米、糖和油的制剂。符合通常实践的是,其的消耗 包括最少30 %的组合挑战饮食的实验制剂以及由测试受试者所消耗 的实验制剂将被考虑为用于野外试验的潜在候选物。
实验室测试后,可以在野外环境中测试功效。啮齿类动物具有复 杂和高度适应性行为,这些行为只在天然条件下才完全展现。因此, 可以进行野外试验以便评估杀啮齿类的活性物质和配制的产品在野外 条件下的效果。通常地,野外试验在各种天然环境下针对一系列靶物 种进行,所述天然环境是在其中可能进行实际的啮齿类动物防治处理 的那些环境的典型代表。
野外试验可以在产品开发的早期阶段使用不希望用于商业化的实 验制剂来进行,以便研究当它们以包含活性物质的典型辨进行呈递时 靼啮齿类动物物种中的天然行为过程。
随后,野外试验还可对商业辨产品来进行,以证实其在实际条件
下的功效。
本发明的各个方面和实施方案现在将通过实施例更详细地举例说 明。应当理解,可进行细节修饰而不背离本发明的范围。
为了避免疑问,在本申请文本中引用了书面参考文献、专利申请 或专利,所述引用的完整文本引入本文作为参考。
附图简述
图1:重组白树毒蛋白对萤光素酶翻译的抑制。
图2:抗CNT2多克隆抗体-重组白树毒蛋白缀合物对萤光素酶翻 译的抑制。库A样品对应于来自IMAC纯化、确定包含游离抗体的合并 级分。库B样品对应于来自IMAC纯化、确定包含抗体-毒素缀合物的 合并级分。
实施例
实施例1: RSPEs的产生和制备
1. 1.肽的选择和合成
在啮齿类动物肠上皮上存在的潜在蛋白质靶通过文献和生物信息 学方法来鉴定。基于下列标准在这些蛋白质中鉴定出啮齿类动物特异 性肽表位(RSPEs):在小鼠和大鼠序列之间的高序列同一性(优选 80 - 100 %的同一性)以及在啮齿类动物和人序列之间的低序列同一性 (优选0-40%的同一性),并且使用BLAST比对与其他物种没有显 著命中;其亲水性特征(表面可能性(surface probability )的指征); 弹性和二级结构的预测。用于预测亲水性、弹性和二级结构的算法由 DNAstar和Vector NTI程序套件中的程序提供。
一旦鉴定出合适的RSPE,就可以4吏用Fmoc固相合成来合成肽并 纯化至约90%的纯度。已经合成了下表3中显示的肽。
合适时,向所述序列加入N-末端半胱氨酸以使得能够定向缀合至
载体蛋白。备选地,合适时,合成N-末端氨基酸保持未封闭的序列, 以使得能够定向缀合至载体蛋白。当不需要缀合时,N-末端氨基酸通 过乙酰化封闭。另外,C-末端氨基酸用酰胺基团封闭。表3.已合成的RSPEs
table see original document page 351. 2.肽与BSA的缀合使用异双功能交联剂间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯 将包含N-末端半胱氨酸残基的肽偶联至BSA。如Kitagowa和Aikawa. J. Biochemistry第79巻:第233-236页(1976 )所述,偶联经由 BSA中赖氨酸残基上的伯胺和所述肽中半胱氨酸残基上的巯基。在0. 2M磷酸钠(pH7. 0)中制备25 mg/ml的BSA(Sigma, Poole, Dorset)溶液,并在二甲基甲酰胺(Sigma)中制成25 mg/ml的MBS (Perbio, Cheshire)溶液。在进行混合的情况下将30 pl MBS溶液 逐滴加入l ml BSA溶液中,并在黑暗中于室温下孵育45分钟。随后 将经活化的BSA溶液向下经过PD10凝胶过滤柱(GE Healthcare, Buckinghamshire),所述柱先前已用G. 2 M砩酸钠(pH7. 0 )平衡。 包含BSA的级分通过280 nm处的吸光度来鉴定,并合并在一起。将2 mg肽溶解于1迈l 50 mM磷酸钠(pH 7. 5 )中。将足够的经活化的BSA 溶液加入肽中以达到肽:BSA为30:1的摩尔比。该混合物在室温下孵 育4小时,随后于41C在黑暗中在进行混合的情况下孵育过夜。将缀 合的肽贮存于-20"C。使用2-步戊二醛法将在N-末端包含赖氨酸残基或伯胺的肽偶联 至BSA。基于Bio-conjugate Techniques, Academic Press 1996,第 583-584页中的方法来进行BSA和肽中的伯胺基团之间的偶联。在0. 1 M磷酸钠,0. 15 M氯化钠(pH 6. 8)中制成10 mg/ml的 BSA溶液。加入戊二醛(Sigma )至1. 25 %的最终浓度,并将混合物在 进行混合的情况下在室温下孵育12小时。将经活化的BSA溶液向下经 过PD10凝胶过滤柱,所述柱先前已用PBS平衡。包含BSA的级分通过 280 nm处的吸光度来鉴定,并合并在一起。将2 mg肽溶解于1 ml 0. 5M 碳酸钠(pH 9.5)中,并向肽中加入足够的经活化的BSA溶液以达到 肽:BSA为至少10: 1的摩尔比。混合物于4匸孵育过夜。过量的反应位 点通过加入40jal 1M乙醇胺(Sigma)来封闭。将缀合的肽贮存于-20 。C。实施例2:抗体组分的产生将如上面实施例1中所述已合成并缀合至BSA的肽用于产生结合 在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位的抗体。2.1,兔免疫接种方案
新西兰白兔用于多克隆抗体生产。对于第一剂,使用弗氏完全佐剂(Sigma),通过皮下施用100 ng蛋白质来免疫接种兔。在这之后 为在第28、 56和84天时的3次加强免疫接种,包括在弗氏不完全佐 剂(Sigma)中的皮下施用的IOO jug蛋白质。在初次免疫接种前获取 预放血获得物(Pre-bleeds ),在第三剂后10 - 14天获取测试放血获 得物(test bleeds),和在第四剂后10 - 14天获取收获放血获得物 (harvest bleeds )。对于下列RSPEs中的每一种,免疫接种2只兔子并产生多克隆抗 体血清:SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO:12、 SEQ ID NO: 15。对于下列RSPEs中的每一种,免疫接种1只兔子:SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 34。2.2.小鼠/仓鼠免疫接种方案小鼠和仓鼠用于单克隆抗体生产,对于第一剂,通过皮下施用在 弗氏完全佐剂中的20pg蛋白质来进行免疫接种。在这之后为在第28 和56天时皮下施用20 蛋白质的2次免疫接种。在第28天时在弗 氏不完全佐剂中施用剂量,和在第56天时在磷酸盐緩冲盐水(PBS) 中施用剂量。在第三剂后7天获取测试放血获得物。在第三剂后至少 6周,小鼠通过在PBS中静脉内施用20 pg蛋白质来进行加强。4天 后收获脾以用于融合。小鼠已用下列RSPEs中的每一种进行免疫接种,并产生了多克隆 抗体血清:SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29。2.3.单克隆抗体的生产4吏用基于KohlerG.和MilsteinC. Nature 256, 495-497 ( 1975 ) 的方法产生单克隆抗体。使用由具有20号针头的注射器递送的 Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM, Invitrogen, Paisley)从收 获的脾脏中洗涤出淋巴细胞。NSO骨髓瘤细胞(European Collection of Cell Cultures, Porton Down, Salisbury)在包含10% (v/v) 胎牛血清(PAA, Yeovil , Somerset) 、 2 mM L-谷氨酰胺、1 x HT补 充物以及50单位/ml青霉素和50 ug/ml链霉素(全都来自Invi trogen ) 的DMEM中,于37"€在5% C02中培养至5 x 105/ml的密度。将来自单 个脾脏的淋巴细胞(大约2xl08)与2xl(TNS0骨髄瘤细胞混合。在 2000 xg下离心4分钟后,将细胞沉淀轻轻地重悬浮,并通过经过1 分钟逐滴加入1 ml在75 mM HEPES緩沖液pH8 (Roche, Lewes, East Sussex)中的50% (w/v)聚乙二醇(1500 )而进行融合。在数分钟 内緩慢加入补充有HI克隆补充物(Roche )的完全培养基(如上所述), 至50 ml的最终体积。所得到的融合溶液在5个无菌微量滴定细胞培 养板(Nunclon, Fisher, Loughborough, Leicestershire)中以100 ul/孔在37t:和5% C02下培养4小时,在这之后,加入包含4。/。(v/v) lxHAT选择培养基(Invitrogen)的100 ul/孔的完全培养基。融合 后14天,基于Engvall E.和Perlmann P. I咖unochemistry 8, 871-874( 1971 ); Harlow E.等人,Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988,第182-183页描述的方法,特异性抗体。经由至少2轮通过有限稀释的克隆以及随后的再测定来 获取所选择的杂交瘤细胞,以确保杂交瘤的克隆性(clonality)和稳 定性。冷冻的杂交瘤文库在由在胎牛血清中的10% ( v/v )DMSO( Sigma, Poole, Dorset)构成的冷冻培养基中以1C/分钟的冷冻速率经过80 分钟来制备,随后贮存于液氮中。所选择的单克隆抗体的生产通过按 比例扩大的组织培养来完成。使用来自用SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 11、 SEQ
ID NO: 6和SEQ ID NO: 27免疫接种的小鼠脾脏的淋巴细胞已获得了 杂交瘤融合物。已分离、培养和冷冻了产生针对来自小鼠GLUT7的RSPE(SEQIDNO: 11)的抗体的4个稳定的单克隆细胞系。已分离了产生 针对来自大鼠CFTR的RSPE ( SEQ ID NO: 5 )的抗体的4个稳定的单 克隆细胞系。已分离、培养和冷冻了产生针对来自大鼠PepTl的RSPE(SEQ ID NO: 1)的抗体的7个阳性单克隆细胞系。2.4.来自噬菌体展示文库的抗体组分的鉴定和分离 2.4.1.首次用于实验的骆驼科VHH噬菌体展示文库的筛选如上文实施例1. 2中所述,通过化学合成和随后缀合至BSA来制 备RSPEs以用于篩选首次用于实验的驼羊(Wfl鹏^a则)VHH MU丝 状噬菌体展示储库。噬菌体所展示的免疫结合结构域储库的筛选遵循 已建立的程序,例如由McCafferty和Johnson所描述的那些("Phage Display of Peptides and Proteins",第98-100页,Eds. Kay, Winter和McCafferty, 1996, Academic Press, Inc.) 。 RSPE: :BSA 缀合物通过以100 jig/ml的浓度施加在50mM碳酸氢钠pH9. 6緩冲液 中并过夜赙育而粘附至Maxisorb Immunotubes (Nunc)的内表面。游 离的RSPE:: BSA缀合物通过在PBS中漂洗3次而去除,然后通过加入 PBS/2 %脱脂牛奶蛋白(PBSM)并于37X:孵育2小时来封闭表面。在 免疫管(immunotube)用所需RSPE敏化后,通过加入在4 ml PBSM 中的1012-1013噬菌体并在室温下孵育2小时来进行"淘选"。这个步 骤后,抽吸出管内容物并使用PBS/0. 1% Tween M将管洗涤20次, 随后使用PBS再洗涤20次。随后通过加入1 ml 100 mM甘氨酸pH 3. 0 并经过10分钟来洗脱免疫管所结合的噬菌体(代表大多数RSPE::BSA-特弄性Vhh結合物)。将溶液转移至包含0.5 ml 1M Tris-HCl pH 7.4 的新试管中以进行中和。然后,将洗脱的噬菌体用于通过混合并于37 匸孵育30分钟来感染对数期TGI大肠杆菌细胞,随后涂布在"x 24cm 2x TY/2。/。葡萄糖/100 jig/ml氨千青霉素平板(Nunc BioAssay Dish) 上,其随后于371C孵育过夜。第二天,刮板以取出包含对RSPE:: BSA 缀合物具有结合特异性的序列的细胞(其代表了富集的、增加的噬菌粒克隆群体)。为了进一步筛选/选择来自该群体的展示出对于RSPE 的高亲和力的克隆,通过加入辅助噬菌体例如M13-K07或VCS-M13来 "营救"噬菌体颗粒。简言之,将来自最后一个步骤的细胞接种到在 250 ml锥形烧瓶中的50 ml 2x YT/2 %葡萄糖/100 p g/ml氨爷青霉素 中,并于30r孵育直至0D6。。为约0. 5。然后,加入辅助噬菌体以提供 1: 1的辅助噬菌体与细菌比率,通常为2xl01。 pfu/50 ml,随后于37 。C孵育l小时。接下来,细胞通过在3000g下离心IO分钟来沉淀,弃 去上清液,将细胞沉淀重悬浮并用于接种在2升烧瓶中的新鲜培养基: 500 ml 2x YT/100 p g/ml氨苄青霉素/50 y g/ml卡那霉素(无葡萄糖)。 这种培养物于30TC伴随剧烈振荡来孵育过夜,随后通过于4TC加入100 ml 20% PEG/2. 5M NaCl 30分钟来收获噬菌体-VHH颗粒。然后,通过 在4000g下离心10分钟来收集沉淀的噬菌体,并重悬浮于5 ml PBS 中,准备用于下一轮筛选。选择过程的效率可以通过减少在每轮淘选 中用于敏化免疫管的RSPE::BSA缀合物的量来改进。另外,选择过程 可以调整至包括偏向选择显示出某些物理化学特征例如蛋白水解稳定 性的噬菌体-VHH颗粒的步骤。例如,已知M13噬菌体颗粒对由某些蛋 白水解酶例如胰蛋白酶和糜蛋白酶所进行的蛋白水解有抗性(Schwind 等人,1992, Eur. J. Biochem. 210: 431-436 ),并且这个特性可 以在噬菌体展示中用于选择结构上稳定的变体(Kristensen和 Winter, 1998, Folding & Design, 3:321-328)。为了选择显示出所需的对于RSPE的亲和力和选择性的单个颗粒, 挑选在2x TY/2o/。葡萄糖/100pg/ml氨千青霉素板上的独特克隆(从 在淘选步骤后被洗脱的噬菌体感染的TG1大肠杆菌的系列稀释样品中 获得),并排列在每孔包含150]ul 2xTY/2y。葡萄糖/100pg/ml氨苄 青霉素的96孔培养区块中,并且伴随振荡于30t:进行孵育直至0D6。。 达到约0.5。然后,将辅助噬菌体加入每个孔中以提供1:1的辅助噬 菌体:细菌比率,随后伴随振荡于37X:再孵育1小时。然后,在通过 以3000g离心来沉淀细胞后去除培养基,并用1. 5 ml 2x YT/100 jig/ml
氨苄青霉素/50jug/ml卡那霉素(无葡萄糖)替换,并且伴随剧烈振 荡于30X:继续孵育过夜。然后通过使用20% PEG/2. 5M NaCl于41C 下30分钟而从每个孔中收获噬菌体颗粒,随后在4000g下离心并重悬 浮于PBS中。这些克隆噬菌体样品用于ELISA中以使用抗噬菌体抗体 -HRP复合物来测定对于固定的RSPE的相对结合亲和力,或者备选地, 通过用所述噬菌体感染非琥珀阻抑子大肠杆菌宿主(例如菌株 HB2151)来表达可溶性VHH。然后,使用IPTG诱导使得能够进行可溶 性的、分泌的V冊的96孔培养和表达,并且将粗培养基(包含可溶性 VHH)或IMAC-纯化的VHH (借助于完整的六组氨酸标签)用于ELISA中 以测定与固定的RSPE的结合。在这种情况下,合适的检测抗体是 9E10-HRP (Roche Molecular Biochemicals ),其检测在可溶性VHH 蛋白上存在的c-Myc标签。最初,作为针对如上所述的首次用于实验的骆驼科噬菌体展示文 库的RSPE:: BSA缀合物来筛选下列RSPEs;具有SEQ ID NO 5的RSPE, 具有SEQ ID NO 6的RSPE,具有SEQ ID NO 11的RSPE和具有SEQ ID N0 27的RSPE。随后,将从这种筛选中鉴定出的V冊克隆用于生产本文 所述的融合蛋白和抗体缀合物。2.5.重组抗体结合结构域的克隆和表达为了举例说明形成单链抗体(更特别地scFv)的过程,将来自杂 交瘤HB-8766 (美国典型培养物保藏中心;Rettig等人,1989, US4851332 )的SV63小鼠单克隆抗体(MAb )(识别来自由某些结肠直 肠胂瘤表达的人碱性磷酸酶的细胞表面表位)用作模型细胞表面抗原 结合蛋白质。为了从这种IgGl MAb衍生scFv分子,用在文献(例如 Dubel等人1994, Journal of Immunological Methods 175: 89-95; McCafferty和Johnson "Phage Display of Peptides and Proteins", 第95页,Eds. Kay, Winter和McCafferty, 1996, Academic Press, Inc.)中所述的啮齿类动物Fv和恒定结构域特异性引物组,采用 RT-PCR从所述杂交瘤中克隆出Fv序列,釆用了在文献中说明的对于
个别引物的修饰。在这个实施例中使用的引物序列在下表4中给出。 表4.在从杂交瘤ATCC HB-8766中克隆SV63 scFvs之中使用的引物引物 序列5'至3' SEQ ID RoPro-9 AGGTSCAGCTGCAGSAGTCWGG SEQ ID NO: 37RoPro-28 CCAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTT SEQ ID NO: 38RoPro-6 GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGACCTAGCCTGGTG SEQ ID NO: 39RoPro-25 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC SEQ ID NO: 40RoPro-3 GGTGATATCGTKCTCACYCARTCTCCAGCAAT SEQ ID NO: 41RoPro-4 GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC SEQ ID NO: 42scFv oligo 1 AGCCCGCCATGGCCGATATCGTTCTCACTCAATC SEQ ID NO- 43scFv oligo 2 CGCCAGAGCCACCGCCACCGCTACCGCCACCGCCCTTGAT CTCCAGTTTGGTGCCTC SEQ ID NO: 44scFv oligo 3 AGCGGTGGCGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTCC AGCTGCAGGAGTCTGG SEQ ID NO: 45scFv oligo 4 CTATGAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTCGTCGT CGTCCTTGTAGTCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC SEQ ID NO- 46scFv oligo 5 AGCCCGCCATGGCCGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTG SEQ ID NO: 47scFv oligo 6 CGCCAGAACCACCTCCGCCGCTTCCGCCACCGCCTGAGGA GACTGTGAGAGTGGTGCC SEQ ID NO: 48scFv oligo 7 AGCGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGAAGCGATATCG TTCTCACTCAATCTC SEQ ID NO: 49scFv oligo 8 GTATGAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTCGTCGT CGTCCTTGTAGTCCTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTC SEQ ID NO: 502.5.1.杂交瘤RNA的分离和cDM的合成离心杂交瘤细胞(107)并重悬浮于l ml TrizorM和200|u 1氯仿 中。将样品在室温下剧烈混合15分钟,随后在12000g和4T下离心 15分钟。移去水层并加入等量的异丙醇。样品在12, 000 rp迈和4匸下 离心15分钟以沉淀RNA,其在70%乙醇中洗涤并随后重悬浮于不含 RNA酶的水中。通过在包含5 n 1 RNA、 0. 1U不含RNA酶的DNA酶I ( Ambion)和 1U RNasin的10 jj 1反应体系中用不含RNA酶的DNA酶进行处理而从 RNA中去除痕量的基因组DNA。将混合物置于371c下30分钟,随后于 80匸孵育5分钟。然后,在制造商的标准条件(1. 5nl RNA, 50 nl总反应体积, oligo-dT引物)下,将经DNA酶I处理的RNA用于Accuscript (Stratagene)反应中以产生第一条链cDNA。2. 5. 2. SV63 Vh区的分萬和克隆使用1 ju 1来源于SV63 RNA的经oligo-dT引发的第一条链cDNA 作为模板以及寡核苷酸RoPro-9 (SEQ ID NO: 37)和RoPro-28 ( SEQ ID NO: 38 )来进行PCR。采用Roche GC-RICH PCR System,其中以在25 p 1反应体积中 0.5 M的浓度使用GC-RICH解析緩冲液(resolution buffer)。在Stratagene Robocycler中使用下列循环条件进行反应: 循环l-5 循环6-35 最后延伸94X: 30秒 94"C 30秒30秒 60X: 30秒72°C 60秒 72*C 60秒 72X: 300秒从这个反应中,PCR产物的产量非常低。因此,进行第二次PCR 以进一步扩增所产生的分子。使用来自上述反应的2ju 1 PCR产物作为模板,使用下列寡核苷酸 引物对来建立2个反应:U RoPro-6 (SEQ ID NO 39,特异性低于 RoPro-9 ( SEQ DI NO 37 )和RoPro-25 ( SEQ ID NO: 40, 3'嵌套的); 和ii) RoPro-9 (SEQ: ID NO 37)和RoPro-28 (SEQ ID NO: 38)。 如上所述进行PCR。当上述反应的样品在1 %琼脂糖/TBE凝胶上电泳并用溴化乙锭染 色时,2个PCRs包含大约400 bp的DM片段。使用Geneclean Spin 试剂盒来分离和纯化由上述反应2产生的PCR产物,并克隆到pCRTOPO BluntII ( Invitrogen )中。8个TOPO克隆通过DM测序进行充分表征,这些克隆中的一个具 有通过UniProt/IPI数据库的BLASTP分析所测定的典型(但独特的)Vh序列的特征。2. 5. 3. SV63 Vl区的分萬和克隆使用2 jn 1来源于SV63 RNA的经oligo-dT引发的第一条链cDNA
作为模板以及寡核苷酸RoPro-3 ( SEQ ID NO: 41)和RoPro-4 ( SEQ ID NO: 42)来进行PCR。在50 ja 1反应体积中l吏用Stratagene Pfu Ultra DNA聚合酶,并且反应在MJ Research Dyad热循环仪中4吏用下列循环 条件来进行:95*C, 1分钟,随后[95X:, 1分钟;52X:, 1分钟;68 formula see original document page 44, 3分钟]40个循环,随后为68C, IO分钟的最后延伸。上述反应的样品在1 %琼脂糖/TBE凝胶上进行分析并用溴化乙锭 染色,观察到大约350 bp的片段。使用QiaQuick (Qiagen)凝胶洗 脱来分离和纯化这个PCR产物,并克隆到pCRT0P0 BluntII (Invitrogen )中。5个T0P0克隆通过DNA测序进行充分表征,这些克隆中的4个是(但独特的)Vl序列的特征。所述5个克隆中的1个包含与M0PC21 k 轻链可变序列(Swissprot: P01634 )相同的序列,从在杂交瘤制备中 所使用的骨髓瘤融合伙伴扩增出的无关序列。2.5.4.将Vh和W序列装配到scFv构建体中PCR-重叠延伸(也称为"剪接-重叠延伸,,;SOE)用于制备2个 方向的SV63 scFv:( i ) VH-[Gly4Ser] 3连接体-VL,和(ii ) VL-[Gly4Ser] 3 連接体-Vh ),每个在大肠杆菌表达载体pDGF(来源于NEB载体pMALc-2, pDGF包括pMALc-2的所有特征,除了编码麦芽糖结合蛋白的序列外, 其已被切除)和pIMS147 (Hayhurst和Harris, 1999 , Protein Expression and Purification 15: 336-343 )中包含N-末端PelB前 导序列以及C-末端FLAG和六组氨酸标签。下表5说明了所使用的寡 核苦酸引物及其目的。表5.用于将Vh和Vl序列装配到scFv构建体中的引物引物 目的 SEQ ID NO:scFv ol igo 1 SV63 scFV VL: :VH方向PelB:Vl正向引物 43scFv ol igo 2 SV63 scFv VL: :VH方向Vl:GlySer反向引物 44scFv ol igo 3 SV63 scFv VL: :VH方向GlySer: Vh正向引物 45scFV ol igo 4 SV63 scFv VL: :VH方向Vh: FLAG: His反向引物 46
scFv oligo 5 SV63 scFv VH::VLscFv oligo 6 SV63 scFv VH::VLscFv oligo 7 SV63 scFv VH::VLscFv oligo 8 SV63 scFv VH::VL方向PelB: Vh正向引物 47方向Vh:GlySer反向引物 48方向GlySer: VI正向引物 49方向VI: FLAG: His反向引物 50为了制各Vl- [Gly4Ser〗3連接体-Vh scFv序列,以2个步骤进行PCR。 第一个步骤由2个反应组成,使用i) scFv oligo's 1和2 (分别为 SEQ ID NO: 43和44)和作为模板的pCRTOPOBluntll SV63 W克隆, 以扩增构建体的5'—半;ii) scFv oligo、 3和4(分别为SEQ ID NO: 45和46)和作为才莫板的pCRTOPOBluntll SV63 Vh克隆,以扩增 构建体的3'—半。第二个步骤使用S0E以通过下列方法来连接来自(i) 和(ii )的2个片段:退火其互补的3'和5'末端(分别地),并通过 加入聚合酶而延伸成全长产物,随后使用scFv oligo's l和4 (分别 为SEQ ID NO: 43和46 )进行扩增。Vf[Gly4Ser]3连接体-、scFv序列以类似方法制备。第一个步骤 由2个反应组成,使用i ) scFv oligo's 5和6 (分别为SEQ ID NO: 47和48)和作为模板的pCRTOPOBluntll SV63 Vh克隆,以扩增构建 体的5'—半;ii) scFv olig(Z s 7和8 (分别为SEQ ID NO: 49和 50)和作为模板的pCRTOPOBluntll SV63 Vl克隆,以扩增构建体的3' 一半。第二个步骤使用S0E以通过下列方法来连接来自(i)和(ii) 的2个片段:退火其互补的3'和5'末端(分别地),并通过加入聚合 酶而延伸成全长产物,随后使用scFv oligo's 5和8 (分别为SEQID NO: 47和50)进行扩增。使用Roche GC RICH试剂盒和制造商的条件,用在25pl反应体 积中0.5 M浓度的GC-RICH解析緩冲液来进行第一个步骤反应。在 Stratagene Robocycler中使用下列循环条件进行反应:循环l-2 循环3-27 最后延伸94°C 30秒 94X: 30秒54*C 30秒 65t: 30秒60秒 72匸60秒 300秒上述反应的样品在1 %琼脂糖/TBE凝胶上进行分析并用溴化乙锭染色,这些揭示出已产生了所有4个预期的DNA片段。第二个步骤SOE反应通过下列方式来进行:使用制造商的条件, 用在25 p 1体积中0. 5 M浓度的GC-RICH解析緩沖液,在Roche GC RICH 试剂盒反应中以大约相等的量混合合适的片段。使用下面的2步循环 条件来进行反应: 循环l-2 941C 30秒 65。C 30秒 72°C 60秒这个反应充当用于产生全长融合物的引物延伸。然后加入寡核苷 酸引物以使用下列循环条件来PCR扩增全长分子。 循环3-15 最后延伸 94。C 30秒30秒72"C 60秒 72匸300秒当上述SOE反应的样品在1 %琼脂糖/TBE凝胶上进行分析并用溴 化乙锭染色时,2个反应均显示出包含大约750 bp (预期大小)的DNA 片段。使用Geneclean Spin试剂盒分离并纯化SOE产物,并克隆到 pCRT0P0 BluntII (Invitrogen)中。对于每种S0E产物(VH->VL和 V「>VH) , T0P0克隆通过DNA测序来进行充分表征。然后,通过使用 i^/el和fcoRI从pCRTOPOBluntil中切出scFv序列,并随后连接到类 似制备的pDGF载体主链DNA中来制备pDGF表达构建体 (pDGF-SV63-VHVL和pDGF-SV63-VLVH )。还通过使用和fcoRI 从pCRTOPOBluntII中切出scFv序列,并随后连接到类似制备的 pIMS147载体主链DM中来产生pIMS147表达构建体(pIMS-SV63-VHVL 和pIMS-SV63-VLVH)。根据制造商的说明书将连接反应产物转化到大 肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)中,并鉴定转化体。通过DNA序列 分析来鉴定正确的pIMS147-SV63 scFv和pDGF-SV63 scFv克隆,以 证实阅读框的保留和序列的精确度。2.5.5.重组scFv蛋白质在大肠杆菌中的表达根据Charlton ( "Antibody Engineering: methods & protocols" 第245-254页,Ed. B. K. C. Lo, Humana Press, 2004 )所描述的指 南,就可溶性scFv蛋白质的表达来测试pIMSSV63-scFv大肠杆菌 TOP10克隆。简言之,将所选择的克隆的过夜培养物用于接种在2. 5L 烧瓶中的500 ml 2TY (amp/glu) ( 1升中含16 g细菌用蛋白胨/5 g 酵母提取物/5 g NaCl/2% (w/v)葡萄糖,pH 7.5, + lOOjug/ml氨 苄青霉素),其随后在37C和250rpffl下孵育直至0D,达到约0. 8。 在这个点上,通过在3000g下离心来收获细胞,并转移至在2. 5L烧瓶 中的500 ml新鲜2TY (amp/sue) ( 1升中含16 g细菌用蛋白胨/5 g 酵母提取物/5 g NaCl/0. 4 M蔗糖,pH 7.5, + lOOyg/ml氨苄青霉 素)之中。随后在30X:和250rpm下开始孵育1小时,然后加入IPTG 至1 mM的最终浓度。然后再孵育16小时,在这个点上收获细胞和培 养基,并使用SDS-PAGE和蛋白质印迹程序就重组scFv的存在进行分 析。其中与BM POD生色底物溶液(Roche )相组合地使用抗FLAG MhHRP 抗体(Sigma)的蛋白质分析表明,对于两个方向的scFv,在可溶性 细胞裂解物和培养基样品中均存在重组蛋白质的良好表达水平(具有 大约30kDa的预期大小分子量)。使用IMAC柱色镨法来纯化重组scFv蛋白质,并在使用Caco2Bbel 细胞(CRL-2102,美国典型培养物保藏中心)的免疫细胞化学测定法 中通过与亲本SV63MAb竟争结合抗原来测试功能性。观察两个方向的 scFv以抑制亲本SV63MAb与细胞表面的结合,这表明在经改造的scFv 中保留了抗原结合表面。实施例3:抗体纯化3.1.肽亲和柱的制备 为了从多克隆血清中纯化出肽特异性抗体,制备肽亲和柱。取决于肽的N-末端残基,使用用于柱制备的两种方法中的一种。这些使用 SulfoLink或AminoLink偶联凝胶作为亲和基质。SulfoLink偶联凝胶(Perbio)允许含巯基的肽共价固定至琼脂 糖凝胶支持物以在亲和纯化程序中使用。使用由制造商提供的和下文 概述的方案将RSPEs偶联至这种凝胶。10 ml SulfoLink凝胶浆(5 ml凝胶床体积)平衡至室温。将凝 胶浆倾入柱中,并用20 ml偶联緩冲液(50mMTris, 5 mM EDTA pH8. 5 ) (Sigma )平衡。将1 mg合成肽溶解于5 ml偶联緩冲液中并加入柱中。 密封柱,并在室温下伴随颠倒混合来孵育15分钟,随后允许凝胶稳定 30分钟。排出过量緩冲液,然后用15ml偶联緩冲液洗涤柱。用5 ml 在偶联緩冲液中的50 mM L-半胱氨酸盐酸盐(Sigma)封闭非特异性 结合位点。如上所述,密封柱并在进行混合或不进行混合的情况下进 行孵育。柱用30 ml IM氯化钠(Sigma)洗涤,并通过施加10 ml包 含0. 05%叠氮化钠(Sigma)的除气PBS pH 7. 2进行制备以用于jj^存。 偶联的柱贮存于4r。AminoLink偶联凝胶(Perbio)允许肽经由伯胺共价固定至琼脂 糖凝胶支持物以在亲和纯化程序中使用。使用由制造商提供的和下文 概述的方案将RSPEs偶联至这种凝胶。10 ml AminoLink凝胶浆(5 ml凝胶床体积)平衡至室温。将凝 胶浆倾入柱中,并用20 ml偶联緩冲液(0. 1 M磷酸钠,pH7. 5, 0.05 %叠氮化钠)平衡。将l mg合成肽溶解于5 ml偶联緩沖液中。随后 向肽溶液中加入250 pi在0.01 M氢氧化钠(Sigma)中制成的1M氰 基硼氢化钠,将溶液倾入柱中。密封柱,并在室温下伴随颠倒混合来 孵育6小时。让柱站立,并随后去除上清液。加入5ml 1M Tris-HCl pH7. 4 (Sigma)和250 pi在0. 01 M氢氧化钠中制成的1M氰基硼氢 化钠。密封柱,并在室温下伴随颠倒混合来孵育30分钟。柱用30 ml 1M氯化钠洗涤,并通过施加10 ml包含0. 05%叠氮化钠的除气PBS进行制备以用于贮存。偶联的柱贮存于4x:。 3.2. 从多克隆血清中纯化肽特异性抗体 多克隆兔血清在2500 xg下离心IO分钟,使用0. 45微米膜过滤,并随后用PBS进行1:1稀释。让肽亲和柱达到室温,并随后用4柱体 积的PBS平衡。将制得的血清溶液加入柱,将流出液再施加至柱上。 柱用6柱体积的PBS洗涤。通过将O. 1 M甘氨酸-HC1 pH3. 0 (Sigma) 施加至柱并在包含O. 1 ml 1M Tris-HCl pH8. 0的管中收集1 ml级分 来洗脱肽特异性抗体。随后通过在280nm处的吸光度来鉴定包含蛋白 质的级分,并将它们合并在一起。使用具有10,000分子量截止值的 Slide-a-Lyser盒(Perbio)将纯化的抗体透析到PBS中,并贮存于 -20X:。同时,柱用3柱体积的0.1 M甘氨酸-HCl pH2. 5,随后为8 柱体积的PBS来再生。3.3. 单克隆抗体的纯化使用HiTrap G蛋白HP 1ml柱(GE Healthcare )通过G蛋白亲 和色镨法从培养物上清液中纯化出单克隆IgG。将培养物上清液在 2500 xg下离心IO分钟,并在使用前用0.45微米膜过滤。最大流速 自始至终为1 ml/分钟。柱用10柱体积的PBS pH7平衡,并加载样品。 柱用IO柱体积的PBS洗涤。通过将0.1M甘氨酸-HClpH3.0 (Sigma) 施加至柱上并在包舍O. 1 ml 1M Tris-HCl pH8. O的管中收集l ml级 分来洗脱抗体。随后通过在280nm处的吸光度来鉴定包含蛋白质的级 分,并将它们合并在一起。使用具有io,ooo分子量截止值的 Slide-a-Lyser盒(Perbio)将纯化的抗体透析到PBS中,并贮存于 -20匸。同时,柱用IO柱体积的0. 1M甘氨酸pH2. 5再生,用10柱体 积的PBS洗涤,并于4X:贮存在20%乙醇中。实施例4:抗体表征4.1.通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来滴定抗-肽抗体
基于Engvall E.和Perlmann P. Immunochemistry 8, 871-874 (1971) ; Harlow E.等人,Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988,笫182-183页描述的方法, 通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定从用肽缀合物免疫接种的兔、小鼠或仓鼠获得的血清以测定抗体应答的相对量级。在35 mM碳酸氢钠,15 mM碳酸钠(pH 9.5)中2 pg/ml的肽溶 液以lOOju 1/孔加入96孔微量滴定板中,并于4T孵育至少4小时。 板随后用PBS, 0.05% Tween 20 ( PBST) (Sigma)洗涤3次。剩余 的结合位点用200 ul/孔的包含1%脱脂奶粉Marvel, Premier Foods, St Albans )的PBS在室温下封闭30分钟。如上洗涤后,以100jil/ 孔向板中加入PBST。将最初的血清稀释物加入在第1列中的一式两份 孔中,并随后跨越板的孔进行两倍稀释,留下第12列中的孔只包含 PBST。板在室温下孵育2小时。进一步如上洗涤后,板在室温下与在 PBST中稀释至1/10, 000的合适的经缀合的抗-物种抗体一起孵育1小 时。兔血清样品与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP )缀合物(Sigma ) 一起孵育;仓鼠血清与兔抗叙利亚仓鼠IgG-HRP缀合物(Stratec, Soham, Cambridgeshire )—起孵育;并且小鼠血清样品将与兔抗小鼠 IgG-HRP缀合物(Sigma )和山羊抗小鼠IgG Fc片段-HRP缀合物(Sigma ) 一起孵育。通过在10 ml的24 mM柠檬酸、60 mM磷酸钠pH 5. 0中稀 释包含1 mg 3,3',5,5'四甲基联苯胺二盐酸盐(Sigma)的一个药片 并加入2 pi 30%过氧化氢溶液(Sigma)来制备底物溶液。进一步洗 涤后,将新鲜底物溶液以lOO]u 1/孔加入板中,并将板置于黑暗中和 室温下30分钟。所得到的颜色形成通过加入50ju 1/孔的3M硫酸来中 止。随后使用微量滴定板阅读器在450nm处读取板的光密度。4.2. EILSA结果4.2.1.来自兔的多克隆抗血清如上文实施例4. 1中所述,通过肽EILSA来测定在第3剂后从用 来自下列靶蛋白的RSPEs免疫接种的兔(参见上文实施例2.1)中获
取的血清:大鼠寡肽转运蛋白PepTl、大鼠CD155 (PVR-脊髓灰质炎 病毒受体;Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、 小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-异麦芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GTR5、大鼠 0ATP-B、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL和大 鼠SCAB。来自每只兔的测试和免疫前血清通过针对它们的免疫接种肽 (immunising peptide)的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50% 结合滴度值(减少最大信号至50%所需的稀释度)来评估。结果概述 于下表6中。表6. ELISA结果,显示出已产生了针对指定RSPEs的兔多克隆抗体来源蛋白质 免疫接种RSPE~~50 %结合滴度(稀释倍数)
table see original document page 51table see original document page 52 测试 18, 000来自每一种测试放血获得物的血清如实施例3.2中所述进行亲和 纯化,并随后如先前所述通过ELISA进行测试。结果在下表7中给出。表7.关于从兔测试血清获得的经亲和纯化的抗体的ELISA结果 table see original document page 53用来自大鼠CNT2核苷转运蛋白的RSPE免疫接种的兔的收获放血 获得物也进行亲和纯化,并通过ELISA进行测试。来自兔l的收获放 血获得物以0. 86 mg/ml的浓度在36. 5 ml中洗脱,并测得50%结合 滴度为1/47, 000。来自兔2的收获放血获得物以0.57 mg/ml的浓度 在27. 5 ml中洗脱,并测得50%结合滴度为1/44, 000。使用A蛋白柱(Amersham)进一步纯化来自兔1的经亲和纯化的 多克隆抗体,逆着磷酸盐緩冲盐水(PBS)进行透析,并通过ELISA 进行测试。这产生13 ml的经进一步纯化的针对CNT2来源的RSPE( SEQ ID NO: 6)的多克隆IgG,其具有1. 97 mg/ml的浓度和1/90, 000的 50%结合滴度。4.2.2.来自小鼠的多克隆抗血清如上文实施例4. 1中所述,通过肽EILSA来测定在第3剂后从用 来自下列靶蛋白的RSPEs免疫接种的小鼠(参见上文实施例2. 2)中 获取的血清:大鼠寡肽转运蛋白PepTl、大鼠CD155 (PVR-脊髓灰质 炎病毒受体;Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、 小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-异麦芽糖酶、小鼠GLUT 7、大鼠GCC、大鼠 PLB和大鼠LPH。来自每只小鼠的测试血清通过针对它们的免疫接种肽 的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50%结合滴度值(减少最大信 号至50%所需的稀释度)来评估。结果概述于下表8中。表8. ELISA结果,显示出已产生了针对指定RSPEs的小鼠多克隆抗体来源蛋白质 免疫接种RSPE 小鼠血清样品 5 0 %结合滴度 (稀释倍数) 大鼠寡肽转运蛋白 PepTl SEQ ID NO: 1 1 >100, 000 2 70, 000 3 70, 000 4 〉100, 000大鼠寡肽转运蛋白 PepTl SEQ ID NO: 2 1 - 2 10, 000 3 4 一大鼠CD155 (PVR, Tage4 ) SEQ ID NO: 3 1 3, 000 2 62, 000 3 41, 000 4 —大鼠GTR2 (GLUT2)葡萄糖SEQ ID NO: 4 1 2,000转运蛋白 2 2,0003 -4 一6 7,0007 7,0008 4,000 table see original document page 55table see original document page 564. 2. 3.针对来自大鼠寡肽转运蛋白PepTl的RSPE的单克隆抗体来自7种阳性单克隆细胞系(其产生针对具有SEQ ID NO 1的RSPE 的抗体(参见上文实施例2. 3))中每一种的40 ml培养物上清液如 实施例3. 2中所述进行亲和纯化,并随后如上文实施例4. 1中所述通 过ELISA进行测试。纯化的单克隆抗体通过针对免疫接种肽(SEQ ID NO: 1)的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50%结合滴度值(减少最 大信号至50%所需的稀释度)来评估。结果概括于下表9中。表9.来自杂交瘤细胞系的经亲和纯化的培养物上清液的ELISA结果,所述杂交瘤细胞系从用来自大鼠寡肽转运蛋白PepTl的RSPE免疫接种的小鼠产生_杂交瘤细胞系 洗脱体积(ml ) 浓度(mg/ml ) 50%结合滴度_(稀释倍数)1645. 142. 002 ^ El 300, 0001644.112.040 4 1.1 12,5001645.451.209 2 0.1 -1647.372.245 3 1.2 92, 0001646.461.144 2 0.08 -1647.449. 047 2 0.09 -1646.240.206 2 0.1 -杂交瘤细胞系1645. 142, 002、 1644. 112. 040和1647. 372, 245清 楚地产生了单克隆抗体,其识别具有来源于大鼠PepTl的SEQ ID NO 1 序列的RSPE。4, 2. 4.针对来自小鼠GLUT7转运蛋白的RSPE的单克隆抗体来自4种阳性单克隆细胞系(其产生针对具有SEQ ID NO 11的 RSPE的抗体(参见上文实施例2. 3 ))中每一种的40 ml培养物上清 液如实施例3. 2中所述进行亲和纯化,并随后如上文实施例4. 1中所 述通过ELISA进行测试。纯化的单克隆抗体通过针对免疫接种肽(SEQ ID NO: 11)的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50%结合滴度值 (减少最大信号至50%所需的稀释度)来评估。关于4种抗-GLUT7 单克隆抗体中的2种的结果概括于下表10中。表10.来自杂交瘤细胞系的经亲和纯化的培养物上清液的ELISA结 果,所述杂交瘤细胞系从用来自小鼠GLUT7转运蛋白的RSPE免疫接种 的小鼠产生
table see original document page 574.3.啮齿类动物肠组织切片的免疫组织化学将大鼠肠组织速冻在液氮中,并贮存于-80'C直至使用。所有组织 于-20匸在恒冷切片机上进行切片,并将组织置于带正电荷的载玻片 上,在水冷的丙酮中固定IO分钟并让其风干。载玻片贮存于-20"C并 在切片的l个月内使用。在开始免疫组织化学之前,让所有载玻片升热直至室温。随后将它们加栽到Sequenza上,用于执行手动IHC。所 有载玻片通过在室温下施加过氧化物酶封闭物(在Dako Envision® 试剂盒中提供)6分钟来封闭内源性过氧化物酶。随后,载玻片在具 有吐温20 (0.1% )的TRIS-緩冲盐水(10 mM) ( TBST )中洗涤5分 钟。非特异性蛋白质通过在室温下加入5%牛奶蛋白质(Marvel™) 30 分钟来封闭。栽玻片在TBST中洗涤5分钟。施加一抗(在含1% Marver的TBST中制成,以表中所示的稀释度),并将载玻片在室温 下孵育1小时。随后将载玻片在TBST中洗涤(2x5分钟)。施加 Envision⑧兔聚合物,并在载玻片上于室温下孵育30分钟。在TBST 中洗涤载玻片(2x5分钟)。在室温下施加DAB5分钟。在经蒸馏的 H20中洗涤载玻片,通过分级乙醇和二曱苯进行脱水,并随后置于DPX 中。表11.针对特定RSPE产生的兔多克隆抗体的免疫组织化学数据的概括
table see original document page 599 小鼠MDR1多药抗性 转运蛋白 1: 1: 10-200 无染色 无染色 10 大鼠蔗糖酶-异麦 芽糖酶 1: 1: 10-200 无染色 无染色 11 小鼠GLUT7葡萄糖 1: 25 - 1: 50 十二指肠腺上 隐窝上皮细胞 隐窝上皮细 隐窝上皮细胞 用过量肽成 转运蛋白 200 有染色 染色 胞染色 染色 功地阻断了 染色12 小鼠GLUT7/大鼠 GTR5 (GLUT5)葡萄 糖转运蛋白 1: 1: 10-200 无染色 无染色 15 大鼠OATP-B (SLC2U9)有机阴 离子转运多肽 1: 1: 10-200 可能的隐窝上 皮染色 27 大鼠GCC(鸟苷酸环 1: 25 - 1: 25 隐窝上皮细胞 隐窝上皮细胞 隐窝上皮细 隐窝上皮细胞 用过量肽成 化酶) 1: 200 和绒毛上皮细 胞染色 和绒毛上皮细 胞染色 胞和绒毛上 皮细胞染色 和绒毛上皮细 胞染色 功地阻断了 染色28 大鼠PLB (磷脂酶 1: 25- 1: 50 绒毛和隐窝上 绒毛和隐窝上 绒毛和隐窝 绒毛和隐窝上 用过量肽没 1: 200 皮细胞染色 皮细胞染色 上皮细胞染 色 皮细胞染色 有成功阻断 染色-提示 看到了非特 异性染色29 大鼠LPH (乳糖酶- 1: 25 - 1: 25 可能的隐窝和 可能的隐窝和 无染色 无染色 用过量肽成 根皮苷水解酶) 1: 200 绒毛上皮细胞 染色 绒毛上皮细胞 染色 功地阻断了 在十二指肠 和空肠中的 染色31 大鼠AMPN (氨肽酶 1: 1: 25 -200 无染色 无染色 无染色 无染色 200680013523.3 s s 士-遂「、& 溜步被54/71到table see original document page 61 使用封闭肽(blocking peptide)来评估特异性染色。在产生最 佳染色的稀释度上的一抗与10倍过量的肽一起于室温下在含1% Marvel™的TBS中孵育2小时,然后施加于载玻片上,其余方案如上 所述。结果概述于上表11中。实施例5:重组蛋白质毒素的产生5.1.重组白树毒蛋白的产生编码具有251个氨基酸的白树毒蛋白的基因(参见Nolan等人, 1993, Gene 134: 223-227 )连同/?e/5前导序列和C-末端六组氨酸标 签一起对于大肠杆菌表达进行密码子优化,并在处于混合"c启动子 控制下的条件下克隆到到大肠杆菌表达载体(pDGF-来源于NEB载体 pMALc-2, pDGF包括pMALc-2的所有特征,除了编码麦芽糖结合蛋白 的序列外,其已被切除)中。将重组载体转化到大肠杆菌菌抹TOP10 中。通过在LB培养基中培养转化的TOP10细胞并于28X:用1 mM IPTG 诱导20小时来获得白树毒蛋白的表达。在收获大肠杆菌细胞后,使用 弗氏细胞压碎器(Constant Systems;在20, 000psi下破裂)在lx PBS/30 mM咪唑中破裂细胞。将可溶性提取物施加于GraviTrap柱(GE Healthcare)上,并在用15 ml lxPBS/30 mM咪喳洗涤后,在lx PBS/500 mM咪唑中洗脱白树毒蛋白。作为第二个纯化步骤,洗脱物经 脱盐而进入20 mM磷酸钠緩沖液(pH 8.0)中,并施加于Resource S 阳离子交换柱上,进行0-l M盐梯度洗脱。为确定重组白树毒蛋白是否具有活性(有功能的),将纯化的白 树毒蛋白在蛋白质翻译抑制测定法(TNT T7快速的偶联式转录/翻译 系统,Promega)中进行测试,其中使用T7萤光素酶DNA作为底物。 作为阳性对照,使用环己酰亚胺。这证实,纯化的重组白树毒蛋白抑 制了 T7萤光素酶DNA的翻译。5.2. 重组VIP2A的产生编码具有464个氨基酸的VIP2A蛋白(参见US 5, 849, 870 )的基 因连同C-末端六组氨酸标签一起对于大肠杆菌表达进行密码子优化, 并克隆到pET24a表达栽体(Novagen)中。将重组载体转化到大肠杆 菌菌株BL21 (DE3)中。通过在LB培养基中培养转化的BL21 ( DE3 )细胞并于用1 mM IPTG诱导20小时来获得VIP2A的表达。在收获后,如上文实施例5. 1 中所述使用弗氏细胞压碎器来破裂细胞。将可溶性提取物施加于 HisTrapHP柱(GE Healthcare )上,并在用5柱体积的PBS/20 mM咪 唑洗涤后,用高达50Q mM咪唑的梯度来洗脱VIP2A蛋白。可溶性提取物和来自纯化过程的样品的SDS-PAGE分析揭示出条 带,该条带在对于重组生产的具有组氨酸标签的VIP2A的预期大小处。5.3. 用于产生重组粒酶B的表达构建体人工合成编码具有228个氨基酸的、成熟的、来自大鼠的粒酶B 的基因(关于序列信息参见Genbank登录号M34097 ) ( DNA片段 050031 ),并克隆到pCR-Script中从而得到质粒p050031。采取巢式 PCR方法将粒酶B编码序列导入表达载体pET32a(+) (Novagen)中。使用引物RoPro070 petEK/rGrzB Fl ( SEQ ID NO: 51 )和RoPro067 rGrzB R (SEQ ID NO: 52)从p050031中PCR扩增出成熟的粒酶B编 码序列,以导入与在pET32a(+)中的融合标签之中存在的肠激酶位点 同源的5'尾部。所得到的PCR产物用作巢式PCR的第二部分的模板, 所述巢式PCR的第二部分使用引物RoPro076 petEK/rGrzB F2 ( SEQ ID NO: 53 )和RoPro067rGrzB R ( SEQ ID NO: 52 )来进4亍以导入5' 位点。最终的PCR产物用Kpnl/Notl进行消化,并连接到经类似消化的 pET32a(+)中,从而得到表达载体pET32a(+)::rGrzB。这导致来自宿 主载体的N-末端表达标签和重组粒酶B编码序列之间的整齐融合,从 而允许在表达后通过用肠激酶进行处理来激活重組粒酶B。最终的表达载体pET32a(+)::rGrzB可以转化到任何合适的大肠杆菌表达宿主 (例如RosettaGami (DE3))中。在构建pET32a (+):: rGrzB中使用的引物序列如下(所有引物序列 以5'到给出):RoPro070 petEK/rGrzB Fl ( SEQ ID NO: 51) GGTACCGACGACGACGACAAGATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAGCCAC ; RoPro067 rGrzB R ( SEQ ID NO: 52 ) AGCTGGCGGCCGCCTAGGAC ; RoPro076 petEK/rGrzB F2 (SEQ ID NO: 53) AGATCTGGGTACCGACGACGACGAC。实施例6:抗体组分与毒素的缀合6.1.商购可得的白树毒蛋白与多克隆抗大鼠CNT2抗体的缀合被选择用于执行这个操作的策略为用交联剂SPDP ( N-琥珀酰亚氨 基-3-[2-吡咬基二硫基]丙酸酯;Pierce Chemical Co.)来激活抗体, 所述交联剂SPDP将与硫醇化的毒素形成二硫键。所使用的方法来自: Hermanson 1996 "Bioconjugate Techniques" (Academic Press第 509页),其说明,该缀合不会干扰毒素白树毒蛋白的活性(30kDa)。 使用5: 1和10: 1的白树毒蛋白与抗-CNT2多克隆抗体的摩尔比以获得 最有效的反应混合物。6.1.1. CNT2多克隆抗体的SPDP处理4吏用centricon旋转浓缩器以10kDa的截止值来浓缩经A蛋白纯 化的兔l多克隆IgG(参见实施例4. 2. 1,亲和纯化来自兔l的收获放 血获得物,并随后使用A蛋白柱进行纯化)的lml等分试样。将所得 到的160 ul制成在PBS 10 mM EDTA pH 8中的10 mg/ml溶液。将6 ul SPDP(在DMF中,3 mg/ml)加入200 ul抗体溶液中,并在室温下孵 育30分钟。将反应混合物施加至用PBS + 10 mM EDTA pH 8平衡的 PD10脱盐柱上。收集所有3.5 ml样品体积,并4吏用centricon浓缩 器进行浓缩,从而获得最终浓度为3. 6 mg/ml的经SPDP处理的抗-CNT2 抗体。 6.1.2. 白树毒蛋白的石克醇化作为从多花白树(Ce/o/7/"迈/Z7i7/"77or咖)的种子中纯化出的5 mg 冻干蛋白质样品从AczonSpA获得白树毒蛋白。最初将样品以5mg/ml 的浓度溶解于PBS中。将300 ul的这种溶液在centricon浓缩器中进 行浓缩,并使体积减少至55ul。随后将这在50 mM三乙醇胺,10 mM EDTA pH 8中进行稀释以得到10 mg/ml的白树毒蛋白溶液。溶解 2-Immunothiolane以得到在蒸馏水中的20 mg/ml溶液。将10.5 ul 的2-Immunothiolane溶液加入150 ul白树毒蛋白溶液中,并将混合 物在冰上孵育1小时。将活化的白树毒蛋白施加于用PBS + 10mMEDTA pH 8平衡的PD10脱盐柱上。收集所有3. 5 ml样品体积,并在centricon 浓缩器中进行浓缩,从而获得最终浓度为3 mg/ml的硫醇化的白树毒 蛋白。6.1.3. 抗-CNT2多克隆抗体与白树毒蛋白的缀合为了获得5: 1的白树毒蛋白与抗-CNT2抗体的摩尔比,需要0. 5 mg 石充醇化的白树毒蛋白与0.5 mg抗-CNT2抗体反应。因此,将138 ul 经SPDP处理的抗-CNT2抗体加入167 ul石克醇化白树毒蛋白中。反应还在白树毒蛋白与抗-CNT2抗体的摩尔比为10: 1的情况下进 行(将在333 ul中的1 mg硫醇化白树毒蛋白加入至在138 ul中的 0. 5 mg经SPDP处理的抗-CNT2抗体中)。每个反应体系在氮气下密封, 并于4"C赙育20小时。这个时间后,任何未反应的巯基残基通过加入 碘乙酰胺至2 mM的最终浓度来进行封闭。6.1.4. 缀合物的分析每个反应混合物通过MALDI-TOF质镨法、SDS-PAGE和ELISA来进 行分析。从反应混合物的SDS-PAGE分离和质谱法获得的数据(未显示) 揭示出每个缀合反应都是成功的,并且鉴定出了 1、 2和3分子的白树 毒蛋白缀合至单个抗体分子的种类。尽管质语法数据揭示了某些未缀
合抗体的存在,其量不足以在经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上被观察 到。看起来,在2种反应比例之间在缀合效率方面没有差异。如先前所述对每个反应混合物进行ELISA测定法,以便评估抗体 的结合活性是否受到缀合反应的影响。获得的数据概括于下表12中。表12.关于白树毒蛋白与抗-CNT2多克隆抗体的缀合的ELISA数据
table see original document page 66可以看出,结合受到添加SPDP多聚连接体(polylinker )和缀合 至白树毒蛋白这两者的影响。然而,缀合的抗体反应混合物仍显示出 显著的结合。这可以归因于在反应混合物中的缀合和未缀合的抗体。 因为未缀合抗体的量很低,所以假定,所观察到的结合的良好比例可 能归因于缀合的抗体。6.2.重组白树毒蛋白与多克隆抗大鼠CNT2抗体的缀合采用与上文实施例6.1中所概述的相同的策略以便将如上文实施 例5中所述而生产的重组白树毒蛋白缀合至多克隆抗大鼠CNT2抗体。 使用5:1的白树毒蛋白与抗-CNT2多克隆抗体的摩尔比以获得最有效 的反应混合物。6. 2. 1.抗-CNT2多克隆抗体的SPDP处理作为在PBS/10 mM EDTA pH 8中的10 mg/ml溶液将3. 75 mg经A 蛋白纯化的兔1多克隆抗体与11. 25 ul SPDP (在DMF中,3 mg/ml ) 混合,并在室温下孵育30分钟。反应混合物经过用PBS/10mMEDTApH 8预平衡的Zeba (Pierce Chemical Co.)脱盐柱。6.2.2. 重组白树毒蛋白的^t醇化将3. 75 mg重组白树毒蛋白在50 mM三乙醇胺,10 mM EDTA pH 8 中制成10 mg/ml。将2-Iminothiolane( Traut' s试剂;Sigma-Aldrich ) 在除气并氮起泡的去离子H20中溶解至20mg/ml,将26. 25 ul的这种 溶液加入白树毒蛋白溶液中,并在氮气氛中在冰上孵育1小时。硫醇 化的白树毒蛋白经过用PBS/10 mM EDTA pH 8预平衡的Zeba (Pierce Chemical Co.)脱盐柱。6.2.3. 抗-CNT2多克隆抗体与重组白树毒蛋白的缀合将SPDP-反应的抗体溶液与硫醇化的重组白树毒蛋白溶液相混 合,产生等量的每种蛋白质组成成分,提供了 5:1的重组白树毒蛋白 与抗体的摩尔比。反应体系在氮气下密封,并于4X:孵育20小时。这个时间后,通过加入硪乙酰胺至2mM的最终浓度来封闭任何未 反应的巯基,随后为在室温下最少孵育1小时。6.2.4. 缀合物与未缀合的重组白树毒蛋白的分离将使用PBS的凝胶过滤用于分离未缀合的白树毒蛋白分子与缀合 物。使用Akta FPLC设备(Amersham-Pharmacia ),将10/300 Superdex 200柱(Amersham-Pharmacia )在PBS中平衡,进行3个柱体积(CVs )。 通过在PC上运行的Unicorn软件(Amersham-Pha簡cia )来控制色 镨法,所述软件注入样品并随后维持O. 5ml/分钟的流速,在洗脱O. 1 CVs后将0. 5 ml级分收集到96孔区块中。让洗脱进行1. 4 CVs。如制造商所述在非还原性SDS-PAGE凝胶(在MOPS緩冲液中的 4-12%双-三NuPage; Invitrogen)上分析所选择的级分。如制造商 所述,使用SimplyBlue考马斯染料(Invitrogen)来染色凝胶。合并 被确定包含缀合物的级分,并用于下一个纯化步骤。 合的抗-CNT2抗体的分离 在重组白树毒蛋白分子上存在六组氨酸C-末端尾部允许应用固定的金属螯合亲和色谱法(IMAC)作为在缀合物纯化中的第二个色谱 步骤。在未缀合的抗体上缺乏六组氨酸基序(凝胶过滤后仍存在于缀 合物级分中)允许从包含六组氨酸的缀合物中去除游离抗体。因此, 将在上文6. 2. 4中获得的合并的级分经过HisTrap HP lml镍-亲和柱 (通过5 CVs PBS/15 mM咪峻预平衡;Amersham Biosciences),所 述柱连接至受在PC上运行的Unicorn软件(Amersham Biosciences) 控制的Akta FPLC装置。使用PBS/15 mM咪唑作为加载/洗涤緩沖液, 经过5 CVs来进行柱的加栽和洗涤。包含六组氨酸的蛋白质的洗脱通 过应用15 mM- 500 mM咪唑(在PBS中)的梯度经过20 CVs来完成。 级分以O. 5 ml体积收集在96孔区块中。如制造商所述在非还原性SDS-PAGE凝胶(在MOPS緩沖液中的 4-12%双-三NuPage; Invitrogen)上分析所选择的级分。如制造商 所述,使用SimplyBlueTM考马斯染料(Invitrogen)来染色凝胶。凝胶揭示出,通过IMAC步骤基本上将缀合物纯化为不含游离抗 体。合并包含缀合物的级分,并使用具有10kD分子量截止值的 VivaSpin 20ml旋转浓缩器进4亍脱盐而进入PBS中。6.2.6. 缀合物的分析MALDI-T0F质谱法用于分析相对于未缀合的抗-CNT2抗体来说合 并的缀合物样品的组成。获得的质语(未显示)表明了在合并的缀合 物级分(库B)中存在1: 1、 1: 2和1: 3比率的抗体:白树毒蛋白缀合 物种类。没有观察到带单电荷的未缀合的抗体种类,然而鉴定出在光 i瞽上的峰,其与带双电荷的未缀合的抗体种类有关。因此,尽管大多 数未缀合的抗体被从缀合的抗体中纯化出去(如IMAC纯化过程的 SDS-PAGE分析所表明的),但可以推断在合并的纯化样品中残留非常 少量的未缀合的抗体。通过ELISA (以确定缀合物对抗体结合的影响)和通过体外翻译抑制测定法(以确定白树毒蛋白的功能活性是否已受到缀合的影响)来评估在经IMAC纯化的合并样品中缀合物的功能活性。ELISA (数据未显示)揭示出与关于缀合至商业供应的白树毒蛋白 (上文实施例6.1.4)时所观察到的那些类似的结果:抗体结合受到 添加SPDP多聚连接体和缀合至重组白树毒蛋白这两者的影响,但缀合 的抗体反应混合物仍显示出显著的与大鼠CNT2 RSPE的结合。尽管质 i普分析表明,即使在IMAC纯化后仍存在某些未缀合的抗体残留,但由 于IMAC纯化,在经IMAC纯化的样品中未缀合抗体的量将少于在天然 白树毒蛋白/抗-CNT2抗体的缀合反应混合物中的量。因此,观察到的 抗体结合可以归因为主要是由于抗CNT2抗体-重组白树毒蛋白缀合 物。如制造商所述,使用TNT快速的偶联式转录/翻译系统(Promega) 来测定在来自IMAC纯化的合并的包含缀合物的样品中缀合至抗-CNT2 抗体的重组白树毒蛋白的核糖体抑制能力的保留。图2显示了结果。 通过在经IMAC纯化的合并样品(库B)中的缀合物所显示的翻译抑制 等同于最初的重组白树毒蛋白(rGelonin)。因此,在缀合后保留了 核糖体抑制能力。6. 3.商购可得的P -噪呤硫素与多克隆抗大鼠CNT2抗体的缀合选择用于这种缀合的策略采用具有大的间隔臂的TFCS交联剂 (Pierce),以便使得尽可能多地暴露于相对较小的(5kDa ) P-嘌呤 硫素分子。TFCS在一个末端上具有NHS酯基团,其结合抗体上的胺基 团,并且在另一个末端上具有受保护的胺基团,通过将pH升高至8 可将其暴露以用于与经适当处理的P-嘌呤硫素反应。p-嘌呤硫素上 的羧基与EDC反应以形成不稳定的胺反应中间物,其随后与sulfo-NHS 反应以提供更稳定的鍵合。随后将经EDC/sulfo-NHS处理的p-嘌呤硫 素结合至TFCS连接体的胺末端。6.3.1. CNT2多克隆抗体的TFCS处理 使用centricon旋转浓缩器以10kDa的截止值来浓缩经A蛋白纯 化的兔1多克隆IgG(参见实施例4. 2. 1,亲和纯化来自兔1的收获放 血获得物,并随后使用A蛋白柱进行纯化)的lml等分试样。所得到 的样品容量为在O. 1 M磷酸钠緩冲液,0.15 M NaCl pH 7.2中高达5 mg/ml。每500 ji 1抗体加入15 ul TFCS (在DMF中,3 mg/ml ),并 在室温下孵育l小时。将反应混合物施加至用0. 1 M磷酸盐緩冲液pH 8平衡的PD10脱盐柱上。收集所有3. 5 ml样品体积,并使用centricon 浓缩器进行浓缩,从而获得最终浓度为10 mg/ml的经TFCS处理的抗 -CNT2抗体。6. 3. 2. P -嘌呤硫素的EDC和sulfo-NHS处理将来自小麦胚乳的冻干P -嘌呤硫素(Takara )溶解在0. 1 M磷酸 钠緩冲液,0. 15MNaCl pH 7. 2中至10 mg/ml的最终浓度。加入EDC 以得到2mM的最终浓度,同时sulfo-NHS至5 mM的最终浓度,并且 使混合物在室温下反应15分钟。通过加入2-巯基乙醇至20 mM的最 终浓度来中止反应。将活化的嘌呤硫素施加至用O.IM磷酸钠緩沖 液,0. 15 M NaCl pH 7. 2平衡的聚丙烯酰胺脱盐柱(大小排阻极限为 1, 800 Da; Pierce)上。收集级分并在0D 280nm处检测毒素的存在。6. 3. 3.抗-CNT2多克隆抗体与活化的P -噪呤硫素的缀合混合经TFCS处理的抗体和经EDC/sulf o-冊S处理的p -嘌呤石充素 以得到30: 1的p-噤呤硫素:抗-CNT2抗体的摩尔比,并让其于4X3反 应过夜。随后通过加入羟胺至10 mM的最终浓度来中止反应。然后将 反应混合物施加至大小排阻色镨法柱上,以分离游离的P-嘌呤硫素与 抗体-p-嘌呤硫素缀合物。合并包含缀合物的级分。6. 3. 4.缀合物的分析MALDI-TOF质谱法用于分析相对于未缀合的抗-CNT2抗体来说合 并的缀合物样品的组成。获得的质镨(未显示)表明在合并的缀合物
级分中存在1: 1、 1: 2和1: 3比率的抗体:P -嘌呤硫素缀合物种类。还 观察到 一 些带单电荷的未缀合的抗体种类。如先前所述,通过ELISA评估在合并的样品中缀合物的功能活性。 关于缀合物的50%结合滴度经计算为0. 067jig/ml,而关于未缀合的 抗-CNT2抗体为0. 041 ja g/ml。表13.使用抗-CNT2:: P-嘌呤硫素缀合物的大鼠胃肠组织免疫组织 化学分析稀释 存在染色时的 大鼠十^"指 大鼠空肠 大鼠回 大鼠结肠 用封闭肽度范 缀合物的稀释 肠 肠 进行阻断围 度 1: 25 1: 25和1: 50 粘膜肌层染 未测试 未测试 粘膜肌层染 未测试— 色以及械毛 色以及绒毛 1: 50 和隐窝上皮 和隐窝上皮 细胞染色 细胞染色 抗-CNT2:: 0 -嘌呤硫素缀合物的样品用于进行啮齿类动物胃肠组 织的免疫组织化学分析(关于方法参见实施例4. 2)。结果概括于上 表13中。实施例7:融合蛋白表达栽体的构建在识别细胞表面抗原的scFv和3种不同的蛋白质毒素即白树毒蛋 白、粒酶B和cyt2A之间构建融合蛋白表达载体。在这个例示中所使 用的scFvs是上文实施例2. 5中所述的SV63 scFvs。自始至终遵循用 于质粒制备、限制性内切酶消化、连接、大肠杆菌转化等的标准分子 生物学技术。7.1.白树毒蛋白-scFv融合构建体人工合成编码具有251个氨基酸的白树毒蛋白的基因(参见Nolan 等人,同上),5'序列设计为允许按阅读框融合至来自SV63抗体的 VH (产生人工基因054014 )或VL (产生人工基因054013 )编码序列, 并亚克隆到pCR-Script中以得到2个构建体,p054013和p054014。 质粒p054013用S/7el和消化,纯化产生的编码白树毒蛋白 的片段并连接到经类似消化的pDGF-SV63-VHVL中,从而得到载体 pDGF-SV63-VHVLrGel。这形成了在SV63 scFv的N-末端与重组白树毒 蛋白之间的经由单个Gly4Ser连接体的框内融合。因此,在 pDGF-SV63-VHVLrGel中的表达盒在5'到3'方向上包括下列组分:"c 启动子、;?e^前导序列、SV63VH编码序列、[Gly4Ser] 3连接体、SV63 、编码序列、Gly4Ser连接体、重组白树毒蛋白编码序列。SV63VH编码序列、[Gly4Ser]3连接体、SV63VL编码序列、Gly4Ser 连接体和重组白树毒蛋白编码序列可以容易地切割出为/fcoRI 片段,并在需要时连接到备选的表达/克隆载体例如pIMS147或pET32a 中。质粒p054014用BseRI和Notl消化,纯化产生的编码白树毒蛋白 的片段并连接到经类似消化的pDGF-SV63-VLVH中,以得到载体 pDGF-SV63-VHVLrGel。这形成了在scFv的N-末端与重组白树毒蛋白 之间的经由单个Gly4Ser连接体的框内融合。因此,在 pDGF-SV63-VHVLrGel中的表达盒在5'到3'方向上包括下列组分: 启动子、/7eM前导序列、SV63Vt编码序列、[Gly4Ser]3连接体、SV63 VH编码序列、Gly4Ser连接体、重组白树毒蛋白编码序列。SV63VL编码序列、[Gl^Ser]3连接体、SV63VH编码序列、Gly4Ser 连接体和重组白树毒蛋白编码序列可以容易地切割出为iVcol/ A"RI 片段,并在需要时连接到备选的表达/克隆栽体例如pIMS147或pET32a 中。7. 2.粒酶B-scFv融合构建体制备两种构建体,各携带N-末端融合至SV63 scFv的粒酶B: pET32a:: rGrzB:: SV63 VHVL和pET32a:: rGrzB::SV63 VLVH。使用pET32a (+):: rGrzB (上文实施例5. 3 )作为模板并结合引物 重叠延伸法来构建质粒pET32a::rGrzB::SV63 VHVL,以经由单个 Gly4Ser连接体在VJl方向上(N到C-末端)将成熟的粒酶B编码序列 融合至SV63 scFv。(i)通过使用pET32a (+):: rGrzB作为PCR模板,并使用pET F (SEQ ID NO: 54)和RoPro 071 G4S/rGrzB Rl ( SEQ ID NO: 55)引 物,而向成熟的粒酶B编码序列添加编码单个Gly4Ser连接体的3'末 端序列。(ii )通过使用pDGF-SV63-VHVL作为PCR模板,并使用RoPro 074 rGrzB/G4S/VHVL F ( SEQ ID NO: 56)和RoPro 075 pET/VHVL R (SEQ ID NO: 57)引物,而向SV63 VHVL编码序列添加编码单个Gly^Ser连 接体和部分粒酶B编码序列的5'末端序列。纯化来自上文(i )和(ii)的产物并以等摩尔量混合,然后进行 无引物延伸,并随后使用pETF(SEQ IDN0: 54 )和RoPro 075 pET/VHVL R (SEQ ID NO: 57)进行PCR以扩增出全长融合产物,其通过使用独 特Sful和Notl位点而克隆到pET32a(+)中。还使用pET32a (+):: rGrzB (上文实施例5. 3 )作为模板并结合引 物重叠延伸法来构建质粒pET32a::rGrzB::SV63 VLVH,以经由单个 Gly4Ser连接体在VJh方向上(N到C-末端)将成熟的粒酶B编码序列 融合至SV63 scFv。(i)如上文(i)中所描述的,向粒酶B编码序列添加编码单个 Glyjer连接体的3'末端序列。(ii )通过使用pDGF-SV63-VLVH作为PCR模板,并使用RoPro 072 rGrzB/G4S/VLVH F (SEQ ID NO: 58)和RoPro 073 VLVH/pET R (SEQ ID NO: 59)引物,而向SV63 VLVH编码序列添加编码单个Gly4Ser连 接体和部分粒酶B编码序列的5'末端序列。纯化来自上文(i)和(ii)的产物并以等摩尔量混合,然后进行 无引物延伸,并随后使用pETF(SEQ IDN0: 54 )和RoPro 073 VLVH/pET R (SEQ ID NO: 59)进行PCR以扩增出全长融合产物,其随后通过使 用独特和7VWI位点而克隆到pET32a(+)中。在粒酶B-scFv融合构建体的构建中所使用的引物序列如上文实 施例5. 3中和如下所述(所有引物以5'至3'给出):pETF(SEQ ID NO:
54) TCGGTGATGTCGGCGATATAG; RoPro 071 G4S/rGrzB Rl ( SEQ ID NO: 55 ) ACTACCTCCGCCACCGGACTTCTTCATAGTTTTCTTGATCCAGG; RoPro 074 rGrzB/G4S/VHVL F (SEQ ID NO: 56)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGG; RoPro 075 pET/VHVL R (SEQ ID NO: 57)TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTACTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCCACCGAACG; RoPro 072 rGrzB/G4S/VLVH F (SEQ ID NO: 58) GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAGCAATC; RoPro 073 VLVH/pET R (SEQ ID NO: 59) TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTATGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC。7. 3. Cyt2A-scFv融合构建体为了形成SV63 scFv和Cyt2A序列的框内融合,遵循Gurkan和 Ellar ( 2003 Protein Expr. Purif. 29 ( 1 ) :103-16 )的实例。人 工合成编码Cyt2Aal ( EMBL: BTCYTBG )的前237个氨基酸的基因以包 含3'序列,所述3'序列被设计为形成14个氨基酸的Xpress表位(Invitrogen)的框内C-末端添加。这种人工合成的Cyt2A-Xpress 表位序列称为051072,并亚克隆到pCR Script中从而得到p051072。 在2个步骤中改变质粒pDGF-SV63-VHVL (参见实施例2. 5)。首先, 设计并产生人工合成的序列(称为p054247 ),其将会通过包含SV63 VL 序列的3'末端序列的一部分、(Gly,Ser)3连接体和成熟Cyt2Aal蛋白 的5'末端序列的一部分而形成连接片段(如Gurkan和Ellar所述, 同上)。使用S/;el (5')和fcoRI ( 3')从p054247中切割出这个片 段,并连接到经类似制备的pDGF-SV63-VHVL (参见实施例2.5)中。 然后,所得到的质粒通过用S/"I和化/bHI切割并导入来自p051072 的大约520bp ^Y/I/^/dHI片段(代表成熟的Cyt2Aal序列的3'末端 加上 Xpress 表位)来进 一 步修饰。所得到的质粒(pDGF-SV63-VHVL::Cyt2A)包括SV63 VHVL scFv经由柔性连接体与 活性(成熟)形式的Cyt2Aal (氨基酸37 - 237 )以及随后的Xpress
表位的完全框内融合。类似地,质粒pDGF-SV63-VLVH在2步过程中进行修饰以导入 Cyt2Aal序列。首先,设计并产生人工合成的序列(称为p054248 ), 其将会通过包含SV63 VH序列的3'末端序列的一部分、(Gly4Ser)3连 接体和成熟Cyt2Aal蛋白的5'末端序列的一部分而形成连接片段(如 Gurkan和Ellar所述,同上)。将该人工序列亚克隆到pCR Script 中从而得到质粒p05428。然后,使用^eRI ( 5')和化oRI ( 3')从 p054248中切割出这个片段,并连接到经类似制备的pDGF-SV63-VLVH 中。然后,所得到的质粒通过用5TwI和A/z/HI切割并导入来自p051072 的大约520bp ^•wI/A/bHI片段(代表成熟的Cyt2Aal序列的3'末端 加上Xpress表位)来进 一 步修饰。所得到的质粒 (pDGF-SV63-VLVH::Cyt2A)包括SV63 VLVH scFv经由柔性连接体与 活性(成熟)形式的Cyt2Aal (氨基酸37 - 237 )以及随后的Xpress 表位的完全框内融合。实施例8:融合蛋白的表达将携带SV63 scFv-白树毒蛋白融合基因的载体(参见上文实施例 7.1)转化到大肠杆菌T0P1Q细胞中。如下来进行中试表达研究:在 2x YT/2 %葡萄糖培养基中生长经转化的细胞,然后在补充有1 mM IPTG 的2 x YT培养基中在20"C或15"C下诱导16小时。收获少量样品(10 ml)并离心,并且将每个细胞沉淀重悬浮于1 ml裂解緩冲液(PBS) 中。样品进行超声处理,在13, OOOrpm和室温下再离心5分钟,并倾 去上清液(可溶性级分)。将沉淀(不溶性级分)重悬浮于lml裂解 緩冲液中。通过使用针对六组氨酸标签的抗体的蛋白质印迹法来分析可溶性 和不溶性级分。分析揭示出,由所述两种表达载体均产生了 scFv-白 树毒蛋白融合蛋白(即其中scFv在VhVl方向,和其中scFv在VlVh方 向)。然而,scFv的V^h方向得到较高产量的可溶性蛋白质。进行更大规模的培养和诱导,并通过在Gravitrap柱上进行纯化 而从可溶性级分中进一步纯化出scFv-白树毒蛋白融合蛋白。实施例9:蛋白质缀合物和融合蛋白的体外测试本发明的蛋白质缀合物和融合蛋白导致上胃肠道损伤的能力通过 测量粘膜对非可吸收性标记甘露醇的渗透性来评估,其中使用分离的 大鼠十二指肠区段。使用先前公开的方法(Heylings, 1991, Toxicol. Appl. Pharmacol. 107: 482-493 )的修饰, <吏体外分离的组织暴露于这些啮齿类动物防治剂。简言之,在人道终止生命后立即从成年雄性Alderley Park品系 大鼠(Ap:AkfSD)中取出10 cm胃肠道区段(胃的紧远端)。将组织 置于含氧的TC199培养基中,并使用TC199培养基从远离胃的最远端 小心地清洗出肠中的任何食物残渣。制备2个十二指肠区段,每个长 度为2.5cm,近侧区段(紧在胃之后)和远侧区段(紧在胆管入口之 后)。通过结扎拉紧而将所述区段小心附着至连接到贮液器的2个玻璃 管的开放末端。这允许用分开的溶液来浸浴所分离的粘膜的腔(粘膜) 侧和血液侧(浆膜)表面。每个粘膜室中玻璃棒末端之间的间隙为12 mm。设备的图解表示类似于在来自Heylings 1991 (同上)的图1的 上面部分中显示的那种。将附着有粘膜的室用含氧的T199培养基漂洗 几次以去除在组织的腔侧上的过量粘液。腔(粘膜)侧装满包含20 mg 甘露醇/ml的4 ml TC199培养基(TC199-M),并检查粘膜是否渗漏。 将粘膜室浸入装满40 ml TC199培养基(浆膜侧溶液)的外部杯状玻 璃容器中,所述玻璃容器充入95% 02:5% C02气体。安放好所述室以 避免所述两种浸浴溶液之间的流体静力压梯度。所述两种溶液通过连接至外部泵的水套而维持在37±o. ix:。 IO分钟的预孵育期后,取出粘膜室并用T199培养基冲洗以去除任何粘液累积物,最后将腔侧装满 包含浓度为5 x 105 dpm/ml的"C-甘露醇(胃肠道吸收很差的非电解质) 的4 ml TC199-M,并放回玻璃室。为了测量所分离的十二指肠粘膜对甘露醇的渗透性,在将其加入
粘膜侧后,在10、 20、 30、 60、 120、 180和240分钟时获取一式两份 的150 ]Lil浆膜侧溶液等分试样。吸收的甘露醇的量通过液体闪烁计 数来测定。作为阳性对照,将已知为胃肠道的局部刺激剂的百草枯(40 mg百草枯离子/ml)在孵育开始后30分钟加入粘膜室中,以便证实该 模型能够检测粘膜损伤。在孵育开始后30分钟时通过向粘膜室直接加 入少量啮齿类动物防治剂(融合蛋白或蛋白质缀合物,参见例如上文 实施例6-8)来加入其,并监控甘露醇吸收的时间过程特性。将这与 平行进行的大鼠十二指肠近侧和远侧区段的同期阴性对照进行比较。上文描述的方法使用十二指肠组织,然而,胃肠道的其他区域可 以代替并使用如上所述的相同程序进行测试。实施例10:蛋白质缀合物和融合蛋白的体内测试10.1.通过在小鼠中的口部管饲法来测试功效小鼠(总共18只,每组9只)通过管饲法用i )蛋白质缀合物或 融合蛋白(特别参见上文实施例6-8;组1的小鼠)或ii )惰性媒介 物(例如聚乙二醇;组2的小鼠)经口服给药。动物在给药后24、 48 和72小时被终止生命,在研究中自始至终定期进行临床观察。终止生 命后,将十二指肠、空肠、回肠和结肠组织在福尔马林緩沖盐水中固 定,进行加工,并包埋到蜡中和使用H&E进行染色以用于病理学评估。融合蛋白/蛋白质缀合物以下列测试浓度进行使用(以mg化合物 /kg体重给出):8 mg/kg、 5 mg/kg和3 mg/kg。
高效检索全球专利
专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。
申请试用
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。
申请试用
该功能需要专业版企业版VIP权限,您可以:
您也可以联系官方QQ: 2157717237 电话: 13264338900