[0001] 本申请是分案申请，其母案的申请号是：201180024467.4，国际申请号是PCT/US2011/028665，申请日是：2011年3月16日。

[0002] 相关申请的引用本专利申请要求2010年3月16日申请的美国临时专利申请号61/314,362的权益，其说明书本文通过引用以其整体结合到本说明书中。

[0003] 本发明涉及猪圆环病毒(PCV) (特别是PCV1和PCV2 (特别是亚型PCV2b)的嵌合病毒)的感染性DNA克隆、活的减毒疫苗和灭活疫苗以及用于针对PCV感染和猪圆环病毒相关的疾病(PCVAD)进行保护的方法。

[0004]猪圆环病毒(PCV)是一种小的、无包膜的DNA病毒，其属于圆环病毒科(Circoviridae) (Todd, D. 等, 2005, Circoviridae, 第327-334页. 载于C. M. Fauquet 等 (主编), Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier Academic Press, San Diego)。1型PCV (PCV1)在七十年代中期作为猪肾PK-15细胞系的污染物被发现(Tischer, I. 等, 1974, Characterization of papovavirus-and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines(永久猪肾细胞系中的乳多空病毒和小RNA病毒样颗粒的表征), Zentralbl Bakteriol Orig A 226:153-67)。

[0005] PCV1被认为是非致病的病毒，因为用来源于PK-15细胞系的PCV1病毒接种猪不引起猪的任何疾病(Tischer,  I. 等, 1986, Studies on  epidemiology  and pathogenicity of porcine circovirus(对猪圆环病毒的流行病学和致病性的研究), Arch Viroi 91:271-6)。在1997年，在加拿大的患有萎缩病的小猪中发现了PCV的变异株(命名为2型PCV  (PCV2))  (Allan,  G. M. 等, 1998, Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe(从美国和欧洲的患有萎缩病的猪中分离猪圆环病毒样病毒). J Vet Diagn Invest 10:3-10；Clark, E. G., 1997, 报告于美国猪医师协会(American Association of Swine Practitioners)第28届年会；Ellis, J. 等, 1998, Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning muitisystemic wasting syndrome(从患有断奶后多系统衰竭综合征的猪的损害中分离圆环病毒), Can Vet J 39:44-51；Meehan, B. M. 等, 1998, Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs(与猪的衰竭综合征相关的新的圆环病毒DNA的表征), J Gen Virol 79 (Pt 9):2171-9)。目前，PCV2是猪圆环病毒相关的疾病(PCVAD)的主要病原体，猪圆环病毒相关的疾病包括消瘦、死亡、呼吸征、肠炎、不能繁殖和猪皮炎肾病综合征(PDNS) (Opriessnig, T. 等, 2007, Porcine circovirus type 2 associated disease: update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies(2型猪圆环病毒相关的疾病：对目前术语、临床表现、病理、诊断和介入策略的更新), J Vet Diagn Invest 19:591-615)。PCV2目前被认为是全球猪群中最经济上重要的病毒病原体之一，并在世界的每个主要产猪国家发现(Gillespie, J. 等, 2009, Porcine circovirus Type 2 and porcine Circovirus-Associated Disease(2型猪圆环病毒和猪圆环病毒相关的疾病), J Vet Intern Med)。在用PCV2单独实验感染的常规猪中观察到重度临床PCVAD是不常见的，并通常需要与其他猪病原体(例如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV))共感染以诱导全谱的临床PCVAD  (Allan, G. M. 等, 2000, Experimental infection of colostrum deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication(用猪圆环病毒2 (PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)实验感染剥夺初乳的小猪增强PCV2复制), Arch Virol 145:2421-9；Opriessnig, T. 等 2007. 同上；Roca, M. 等, 2004, In vitro and in vivo characterization of an infectious clone of a European strain of porcine circovirus type 2 (2型猪圆环病毒欧洲株的感染性克隆的体外和体内表征), J Gen Virol 85:1259-66；Rovira, A. 等, 2002, Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus2 (用猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2实验接种常规猪), J Virol 76:3232-9；Tomas, A. 等, 2008, A meta-analysis on experimental infections with porcine circovirus type 2 (PCV2) (对2型猪圆环病毒(PCV2)实验感染的综合分析), Vet Microbiol 132:260-73)。然而，用PCV2单独感染剖腹产来源剥夺初乳的(CD/CD)猪已引起重度临床PCVAD和死亡(Allan, G. 等 2003, Reproduction of postweaning muitisystemic wasting syndrome in  pigs 
experimentally inoculated with a Swedish porcine circovirus 2 isolate (在用瑞典猪圆环病毒2隔离群实验接种的猪中再现断奶后多系统衰竭综合征), J Vet Diagn Invest 15:553-60；Allan, G. M. 等, 2004, PMWS: experimental model and co-infections (PMWS：实验模型与共感染), Vet Microbiol 98:165-8；Bolin, S. R. 等, 
2001, Postweaning multisystemic wasting syndrome induced after experimental inoculation of cesarean-derived, colostrum-deprived piglets with type 2 porcine circovirus (在用2型猪圆环病毒实验接种剖腹产来源剥夺初乳的小猪后诱导断奶后多系统衰竭综合征), J Vet Diagn Invest 13:185-94；Harms, P. A. 等, 2001, Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (在用2型猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同时感染的CD/CD猪中实验再现重度疾病), Vet Pathol 38:528-39；Kennedy, S. 等, 2000, Reproduction of lesions of postweaning muitisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus(通过用2型猪圆环病毒单独或与猪细小病毒联合感染常规猪来再现断奶后多系统衰竭综合征的损害), J Comp Pathol 122:9-24)。PCV2的数篇病理、免疫学和分子生物学综合综述是可得的(Allan, G. M. 和 J. A. Ellis, 
2000, Porcine circoviruses: a review(猪圆环病毒：综述). J Vet Diagn Invest 12:
3-14；Ellis, J. 等, 2004, Porcine circovirus-2 and concurrent infections in the field(猪圆环病毒-2和野外并发感染), Vet Microbiol 98:159-63；Finsterbusch, T. 和 A. Mankertz, 2009, Porcine circoviruses-small but powerful(猪圆环病毒-小但有力), Virus Res 143:177-83；Gillespie, J. 等, 2009, 同上；Mankertz, A. 等, 
2004, Molecular biology of Porcine circovirus: analyses of gene expression and viral replication(猪圆环病毒的分子生物学：基因表达和病毒复制的分析), Vet Microbiol 98:81-8；Opriessnig, T. 等 2007, 同上；Ramamoorthy, S. 和 X. J. Meng, 
2009, Porcine circoviruses: a minuscule yet mammoth paradox(猪圆环病毒：一个微小但庞大的悖论), Anim Health Res Rev 10:1-20；Segales, J. 等, 2005, porcine circovirus diseases(猪圆环病毒疾病), Anim Health Res Rev 6:119-42)。

[0006] 虽然致病的PCV2与非致病的PCV1的基因组组构类似，但是PCV1与PCV2的基因组享有仅大约68-76%的核苷酸序列同一性(Fenaux, M. 等, 2004, Detection and in vitro and in vivo characterization of porcine circovirus DNA from a porcine-derived commercial pepsin product(来自猪来源的商业胃蛋白酶产品的猪圆环病毒DNA的检测以及体外和体内表征), J Gen Virol 85:3377-82；Hamel, A. L 等, 1998, Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning muitisystemic wasting syndrome in pigs(与猪的断奶后多系统衰竭综合征有关的猪圆环病毒的核苷酸序列), J Virol 72:5262-7；Tischer, I. 等, 1982, A very small porcine virus with circular single-stranded DNA (具有圆形单链DNA的非常小的猪病毒), Nature 295:64-6)，并且已报道了转录模式和衣壳蛋白的抗原概况中的差异(Cheung, A. K. 
2003, Comparative analysis of the transcriptional patterns of pathogenic and nonpathogenic porcine circoviruses(致病与非致病的猪圆环病毒的转录模式的比较分析), Virology 310:41-9；Lekcharoensuk, P. 等, 2004, Epitope mapping of the major capsid proteins of type 2 porcine circovirus (PCV2) by using chimeric PCV1 and PCV2 (通过使用嵌合PCV1和PCV2来对2型猪圆环病毒(PCV2)的主要衣壳蛋白进行表位作图), J Virol 78:8135-45；Shang, S. B. 等, 2009, Fine mapping of antigenic epitopes on capsid protein of porcine circovirus, and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2 (猪圆环病毒的衣壳蛋白上的抗原表位的优良作图和2型猪圆环病毒的抗原表型), Mol Immunol 46:327-34)。由病毒基因组编码的两个主要基因包括942 bp复制酶(rep)基因(Mankertz, A. 和 B. Hillenbrand, 2001, Replication of porcine circovirus type 1 requires two proteins encoded by the viral rep gene (1型猪圆环病毒的复制需要由病毒rep基因编码的两种蛋白), Virology 
279:429-38)和702 bp衣壳基因(cap) (Nawagitgul, P. 等, 2000, Open reading frame 
2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein(2型猪圆环病毒的开放阅读框2编码一种主要的衣壳蛋白), J Gen Virol 81:2281-7)。Rep基因在PCV1与PCV2之间是高度保守的，具有约83%的核苷酸序列同一性，而cap基因享有仅约67-70%的同一性(Mankertz, A.等, 2004, 同上)。目前，在全世界猪群中已鉴定了至少3种PCV2的亚型：PCV2a、PCV2b和PCV2c (Dupont, K. 等, 2008, Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case-control study supports a shift in genotypes with time(来自丹麦档案与当前PMWS病例的PCV2隔离群的基因组分析-对照研究支持基因型随时间转变), Vet Microbiol 128:56-64；Segales, J. 等, 2008, PCV-2 genotype definition and nomenclature (PCV-2基因型定义和命名), Vet Rec 
162:867-8)。PCV2a和PCV2b两者都与不同严重程度的临床PCVAD相关(An, D. J. 等, 
2007, Phylogenetic characterization of porcine circovirus type 2 in PMWS and PDNS Korean pigs between 1999 and 2006 (1999-2006年之间的PMWS和PDNS韩国猪的2型猪圆环病毒的系统发育表征), Virus Res 129:115-22；Ciacci-Zanella, J. R. 等, 
2009, Detection of Porcine Circovirus type 2 (PCV2) variants PCV2-1 and PCV2-
2 in Brazilian pig population(巴西猪群的2型猪圆环病毒(PCV2)变体PCV2-1和PCV2-2的检测), Res Vet Sci 87:157-60；Lager, K. M 等, 2007, Mortality in pigs given porcine circovirus type 2 subgroup 1 and 2 viruses derived from DNA clones(给予来源于DNA克隆的2型猪圆环病毒亚型1和2病毒的猪的死亡率), Vet Rec 161:428-9；
Madson, D. M. 等,2008, Characterization of shedding patterns of Porcine circovirus types 2a and 2b in experimentally inoculated mature boars(实验接种的成熟野猪中的2a和2b型猪圆环病毒的释放模式表征), J Vet Diagn invest 20:725-
34；Opriessnig, T. 等, 2006, Genetic and experimental comparison of porcine circovirus type 2 (PCV2) isolates from cases with and without PCV2-associated lesions provides evidence for differences in virulence(来自有和没有PCV2相关损害的病例的2型猪圆环病毒(PCV2)隔离群的基因和实验比较为毒力差异提供证据), J Gen Virol 87:2923-32；Opriessnig, T. 等, 2008, Differences in virulence among porcine circovirus type 2 isolates are unrelated to cluster type 2a or 2b and prior infection provides heterologous protection(2型猪圆环病毒隔离群之间的毒力差异与簇类型2a或2b不相关且感染之前提供异种保护), J Gen Virol 89:2482-91)。
2005年之前，在美国和加拿大的猪群中仅发现PCV2a，而在欧洲和中国存在PCV2a和PCV2b两者(Chae, J. S. and K. S. Choi, 2009, Genetic diversity of porcine circovirus type 2 from pigs in Republic of Korea(来自韩国的猪的2型猪圆环病毒的遗传多样性), Res Vet Sci；Dupont, K. 等, 2008, 同上)。自2005年以来，新的PCV2b株在美国被识别，且在猪群中存在的全球性变化是PCV2b的占优势盛行，同时临床PCVAD的严重性增加(Carman, S. 等, 2008, The emergence of a new strain of porcine circovirus-2 in Ontario and Quebec swine and its association with severe porcine 
circovirus associated disease-2004-2006 (安大略和魁北克猪中出现的猪圆环病毒-2的新毒株及其与重度猪圆环病毒相关的疾病的关系-2004-2006), Can J Vet Res 72:
259-68；Chae, J. S. 和 K. S. Choi, 2009, 同上；Cheung, A. K.等, 2007, Detection of two porcine circovirus type 2 genotypic groups in United States swine herds(在美国猪群中检测到两种2型猪圆环病毒基因型的类型), Arch Virol 152:1035-
44；Ciacci-Zanella, J. R. 等, 2009, 同上；Dupont, K.等, 2008, 同上；Gagnon, C. A. 等, 2007, The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada(在加拿大的猪中出现猪圆环病毒2b基因型(PCV-2b)), Can Vet J 48:
811-9；Lipej, Z. 等, 2005, Postweaning muitisystemic wasting syndrome(PMWS) in pigs in Croatia: detection and characterisation of porcine circovirus type 2 (PCV2)  (克罗地亚猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)：检测和表征2型猪圆环病毒(PCV2)), Acta Vet Hung 53:385-96；Wang, F. 等, 2009, Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2 (2型猪圆环病毒的中国株的遗传变异分析), Virus Res 145:151-6；Wiederkehr, D. D. 等, 2009, A new emerging genotype subgroup within PCV-2b dominates the PMWS epizooty in Switzerland (PCV-2b中新出现的基因型亚型控制瑞士的PMWS病), Vet Microbiol 136:
27-35)。PCV2c的致病性不清楚，因为它仅在1980、1987和1990年在丹麦的无疾病猪群中被报道(Dupont, K. 等, 2008, 同上)。

[0007] 目前可得的商业疫苗都为基于PCV2a亚型的死疫苗或重组疫苗(Opriessnig, T. 等 2007, 同上；Ramamoorthy, S.和 X. J. Meng, 2009, 同上)。发明人之前已成功开发了基于PCV1-2a嵌合病毒(在PCV1的骨架中具有PCV2a的衣壳基因)的灭活疫苗Suvaxyn ® ™PCV2 One dose (Fenaux, M. 等, 2004A, A chimetic porcine circovirus (PCV) with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type 2 (PCV2) cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs(致病的2型PCV (PCV2)的免疫原性衣壳基因克隆到非致病的PCV1的基因组骨架中的嵌合猪圆环病毒(PCV)诱导针对猪的PCV2感染的保护性免疫), J Virol 78:6297-303；Fenaux, M. 等, 2003, Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs(断奶猪的致病的2型猪圆环病毒(PCV2)和非致病的PCV1的嵌合感染性DNA克隆的免疫原性和致病性), J Virol 77:11232-43；Gillespie, J. 等, 2008, A genetically engineered chimeric vaccine against porcine circovirus type 2 (PCV2) is genetically stable in vitro and in vivo(针对2型猪圆环病毒(PCV2)的基因工程嵌合疫苗在体外和体内遗传稳定), Vaccine 26:4231-6)。然而，因为PCV2b亚型现在在商品猪中已成为与重度临床PCVAD相关的全球主要基因型，且因为PCV2a和PCV2b有多达10%核苷酸序列同一性的差异(Fenaux, M. 等, 2000, Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning muitisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a 
differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2 (遗传表征来自北美不同地理区域的患断奶后多系统衰竭综合征的猪的2型猪圆环病毒(PCV-2)以及开发差异PCR-限制性片段长度多态性测定以检测和区分PCV-1与PCV-2之间的感染), J Clin Microbiol 
38:2494-503；Olvera, A. 等, 2007, Molecular evolution of porcine circovirus type 2 genomes: phylogeny and clonality(2型猪圆环病毒基因组的分子进化：系统发育和克隆形成能力), Virology 357:175-85)，所以是否当前基于PCV2a亚型的死疫苗或重组疫苗针对全新识别的PCV2b亚型提供全面保护是未知的。一些研究已证明目前市售疫苗针对PCV2b攻击的有效性(Fort, M. 等, 2008, Porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccination of conventional pigs prevents viremia against PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins(2型猪圆环病毒(PCV2)疫苗接种常规猪针对不同基因型和地理来源的PCV2隔离群预防病毒血症), Vaccine 26:1063-71；Fort, M. 等, 2009, One dose of a porcine circovirus 2 (PCV2) sub-unit vaccine administered to 3-week-old conventional piglets elicits cell-mediated immunity and significantly reduces PCV2 viremia in an experimental model(将单剂量的猪圆环病毒2 (PCV2)亚单位疫苗给予3周龄常规小猪引起细胞介导的免疫并显著降低实验模型中的PCV2病毒血症), Vaccine 27:4031-7；Opriessnig, T. 等, 2009, Comparison of efficacy of commercial one dose and two dose PCV2 vaccines using a mixed PRRSV-PCV2-SIV clinical infection model 2-3-months post vaccination(疫苗接种后2-3月使用混合的PRRSV-PCV2-SIV临床感染模型来比较商业单剂量和双剂量PCV2疫苗的功效), Vaccine 27:1002-7)，然而开发针对PCVAD的基于PCV2b亚型的疫苗是必要的，优选为活减毒疫苗。基于新的PCV2b亚型的活减毒疫苗在本领域可能比当前可得的基于PCV2a亚型的死疫苗和亚单位疫苗提供更大的保护。

[0008]本发明提供一种猪圆环病毒(PCV)的核酸分子，其包含编码非致病的嵌合PCV的核酸分子，所述嵌合PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2) (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列。

[0009] 在本发明的一个实施方案中，PCV2的衣壳蛋白的编码序列选自亚型PCV2a、PCV2b和PCV2c。

[0010] 在本发明的另一个实施方案中，PCV2的衣壳蛋白的编码序列为亚型PCV2b的。

[0011] 在本发明的另一个实施方案中，PCV2的衣壳蛋白的编码序列为PCV2 (优选为亚型PCV2b)的至少一部分开放阅读框2 (ORF2)。

[0012] 在本发明的又一个实施方案中，核酸分子编码超过一份拷贝的非致病的嵌合PCV，所述嵌合PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2) (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列。

[0013] 本发明还提供一种生物功能质粒或病毒载体，其包含编码非致病的嵌合PCV的核酸分子，所述嵌合PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2) (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列。

[0014] 本发明还提供一种被载体转染的合适宿主细胞，所述载体包含编码非致病的嵌合PCV的核酸分子，所述嵌合PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2) (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列。

[0015] 本发明还提供一种由合适宿主细胞产生的无毒感染性嵌合PCV，所述宿主细胞被包含编码非致病的嵌合PCV的核酸分子的载体转染，所述嵌合PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2) (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列。

[0016] 本发明还提供一种灭活的嵌合PCV，其包含2型PCV (PCV2) (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分。

[0017] 在本发明的一个实施方案中，PCV2的衣壳蛋白的编码序列选自亚型PCV2a、PCV2b和PCV2c。

[0018] 在本发明的另一个实施方案中，PCV2的衣壳蛋白的编码序列为亚型PCV2b的。

[0019] 在本发明的另一个实施方案中，PCV2的衣壳蛋白的编码序列为PCV2的至少一部分开放阅读框2 (ORF2)。

[0020] 本发明还提供一种病毒疫苗，其包含生理上可接受的载体和免疫原性量的选自以下的成员：(a) 猪圆环病毒(PCV)的核酸分子，其包含编码嵌合非致病的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，(b) 生物功能质粒或病毒载体，其包含含有编码嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于PCV1的基因组序列和PCV2的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，(c) 无毒感染性非致病的嵌合PCV，其包含含有编码嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于PCV1的基因组序列和PCV2的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，和(d) 灭活的嵌合PCV，其包含PCV2 (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分。

[0021] 在本发明的一个实施方案中，疫苗包含活的嵌合PCV病毒。

[0022] 在本发明的一个实施方案中，疫苗包含灭活的嵌合PCV病毒。

[0023] 在本发明的另一个实施方案中，疫苗另外包含佐剂。

[0024] 在本发明的另一个实施方案中，疫苗针对PCV2a和PCV2b感染保护。

[0025] 本发明还提供一种针对PCV2病毒感染免疫猪的方法，其包括将免疫有效量的病毒疫苗给予猪，所述病毒疫苗包含生理上可接受的载体和免疫原性量的选自以下的成员：(a) 猪圆环病毒(PCV)的核酸分子，其包含编码嵌合非致病的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，(b) 生物功能质粒或病毒载体，其包含含有编码嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于PCV1的基因组序列和PCV2的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，(c) 无毒感染性非致病的嵌合PCV，其包含含有编码嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于PCV1的基因组序列和PCV2的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，和(d) 灭活的嵌合PCV，其包含PCV2 (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分。

[0026] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将核酸分子或活的减毒嵌合PCV病毒给予猪。

[0027] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将灭活的嵌合PCV病毒给予猪。

[0028] 在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括将将疫苗胃肠外、鼻内、皮内或经皮给予猪。

[0029] 在本发明的又一个实施方案中，所述方法包括将疫苗淋巴内或肌内给予猪。

[0030] 本发明还提供一种针对猪圆环病毒相关的疾病(PCVAD)保护猪的方法，其包括将免疫有效量的病毒疫苗给予猪，所述病毒疫苗包含生理上可接受的载体和免疫原性量的选自以下的成员：(a) 猪圆环病毒(PCV)的核酸分子，其包含编码嵌合非致病的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于1型PCV (PCV1)的基因组序列和2型PCV (PCV2)的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，(b) 生物功能质粒或病毒载体，其包含含有编码嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于PCV1的基因组序列和PCV2的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，(c) 无毒感染性非致病的嵌合PCV，其包含含有编码嵌合非致病的PCV的核酸分子的PCV的核酸分子，所述嵌合非致病的PCV来源于PCV1的基因组序列和PCV2的衣壳蛋白的至少一部分编码序列，和(d) 灭活的嵌合PCV，其包含PCV2 (优选为亚型PCV2b)的衣壳蛋白的至少一部分。附图说明

[0031]结合附图阅读下述发明详述，可更清楚地理解本发明的上述特征，其中：
图1阐明全长PCV2b和嵌合PCV1-2b DNA克隆的结构和基因组组构。图1(A)显示PCV2b单体DNA克隆。在用PCR引物A (SEQ ID No: 3)和B (SEQ ID No: 4) (表1)扩增后，使用独特的Sac II位点，在pBSK+载体中克隆野生型PCV2b的完整基因组。图1(B)显示嵌合PCV1-2b单体DNA克隆。使用PCR引物C-H (SEQ ID No: 5-10) (表1)，通过重叠延伸PCR来构建嵌合PCV1-2b DNA克隆。

[0032] 图2阐明用嵌合PCV1-2b病毒和野生型PCV2b病毒实验接种的剖腹产来源剥夺初乳的(CD/CD)猪中的PCV2衣壳特异性抗体反应。贯穿实验对各处理组绘制平均值血清S/P比+/- SEM，其中(*)表示在那天显著不同。由于死亡或早期安乐死一些PCV2b感染的猪，在35-42 dpi的组中采样的猪少于5只。具有不同字母的组在那天为显著不同。

[0033] 图3显示用PBS缓冲液、嵌合PCV1-2b病毒和野生型PCV2b病毒接种的剖腹产来源剥夺初乳的(CD/CD)猪中的总体淋巴损害评分在21 dpi的比较。比较处理之间的淋巴结、脾和扁桃体的组合的淋巴萎缩(lymphoid depletion)、组织细胞置换和PCV2特异性抗原评分。在18 dpi死亡的PCV2b接种的猪包括在该分析中。圆圈表示中位数，箱是第1和第3四分位数，和箱须(whisker)表示全部的数据范围。具有不同字母的处理是显著不同的。

[0034] 图4阐明用嵌合PCV1-2b病毒和PCV2b病毒实验接种的剖腹产来源剥夺初乳的(CD/CD)猪的血清和淋巴组织中的病毒DNA载量的定量。图4(A)显示使用qPCR来定量血清中的病毒血症和病毒DNA载量。对各处理组绘制每ml血清的组平均值log病毒基因组拷贝+/- SEM，其中(*)表示在那天显著不同。0 dpi的所有样品以及来自PBS接种的猪的所有样品为阴性。由于死亡或早期安乐死一些PCV2b感染的猪，在35-42 dpi的组中采样的猪少于5只。图4(B)显示使用qPCR来定量TBLN组织中的病毒DNA载量。在猪死亡或被安乐死的那天绘制对各猪所测定的淋巴结组织病毒DNA载量，其中在21和42 dpi绘制组平均值+/- SEM。来自PBS接种的猪的所有样品为阴性，由于PCVAD而死亡或被早期安乐死的PCV2b感染的猪(实心圆圈)不包括在组平均值的分析中。(*)表示在那天显著不同。

[0035] 图5阐明用嵌合PCV1-2b病毒疫苗接种并随后用PCV2a或PCV2b野生型病毒攻击的常规无特异性病原体猪中的PCV2特异性抗体反应。贯穿实验对各处理组绘制平均值血清S/P比+/- SEM，其中(*)表示接种疫苗组(vax)与未接种疫苗组(PBS)之间显著不同。用PCV2a或PCV2b在56 dpv攻击所有猪。77 dpv(或21 dpc)的具有不同字母的组在那天是显著不同的。

[0036] 图6显示用PCV1-2b疫苗或PBS缓冲液接种并随后用PCV2a或PCV2b攻击的常规SPF猪中的总体淋巴损害评分的比较。通过攻击PCV2病毒亚型，比较接种疫苗猪与未接种疫苗猪之间的淋巴结、脾和扁桃体的组合的淋巴萎缩、组织细胞置换和PCV2特异性抗原评分。圆圈表示中位数，箱是第1和第3四分位数，和箱须表示数据范围。具有(*)的处理对为显著不同。

[0037] 图7阐明用PBS缓冲液或PCV1-2b疫苗接种并随后用PCV2a或PCV2b攻击的常规猪的血清和淋巴组织样品中的PCV2病毒DNA载量的检测和定量。图7(A)显示使用qPCR来定量血清中的病毒血症和病毒载量。对各处理组绘制每ml血清的组平均值log病毒基因组拷贝+/- SEM。56 dpv (或0 dpc)的所有样品以及来自接种疫苗猪的所有样品对PCV2a或PCV2b DNA为阴性。图7(B)显示使用qPCR来定量TBLN组织中的病毒DNA载量。绘制对各猪所测定的淋巴组织中的中位数病毒DNA载量。圆圈表示中位数，箱是第1和第3四分位数，和箱须表示全部的数据范围。在用PCV2a或PCV2b攻击时，在所有未接种疫苗的猪的淋巴结中检测到病毒DNA，但是仅1/10的vax/PCV2b猪和5/10的vax/PCV2a猪具有可检测的病毒DNA。(*)表示基于攻击病毒亚型，接种疫苗对与未接种疫苗对之间显著不同。

[0038] 发明详述PCV2感染和PCVAD持续对全球猪群形成主要威胁。PCVAD可能是如今猪工业面临的最经济上重要的疾病。消瘦、淋巴萎缩与组织细胞浸润的显微损害以及损害中存在PCV2抗原或DNA是诊断猪的PCVAD的三个特征标准(Segales, J. 等, 2005, 同上)。然而，据知不是所有感染PCV2的猪将发生临床PCVAD，共感染病毒和细菌病原体对诱导全谱的临床PCVAD通常是必需的(Albina, E. 等, 2001, An experimental model for post-weaning muitisystemic wasting syndrome (PMWS) in growing piglets(一种发育小猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的实验模型), J Comp Pathol 125:292-303；Magar, R. 等, 
2000, Experimental transmission of porcine circovirus type 2 (PCV2) in weaned pigs: a sequential study(断奶猪的2型猪圆环病毒(PCV2)的实验传递：序贯研究), J Comp Pathol 123:258-69)。在2005年之前，从美国和加拿大的PCVAD病例中检测的病毒几乎排他地为PCV2a亚型。因此，四种全部基于PCV2a亚型的商业疫苗被开发且目前在全世界猪群中使用。全世界分离的PCV2a株是密切相关的并享有95-99%的核苷酸序列同一性，并因此这些商业疫苗已有效针对全球猪群中的PCV2a和PCVAD。

[0039] 最近，美国和加拿大的某些地区爆发的更严重的PCVAD病例已归因于出现的一种新PCV2b亚型(Gagnon, C. A. 等, 2007, 同上)。PCV2a与PCV2b亚型之间的核苷酸序列相差多达10%，并已鉴定区分两种亚型的独特氨基酸序列基序(Cheung, A. K. 等, 2007, 同上)，从而提出是否目前完全基于PCV2a亚型的商业疫苗可针对新的PCV2b亚型感染进行全面保护的问题。在最近几年，全球猪群的PCV2盛行已主要转移至PCV2b亚型，事实上，美国大多数的最近PCVAD病例与新的PCV2b亚型相关(Cheung, A. K. 等, 2007, 同上；Firth, C 等, 2009, Insights into the evolutionary history of an emerging livestock pathogen: porcine circovirus 2 (洞察新兴家畜病原体的进化史：猪圆环病毒2), J Virol 83:12813-21)。基于PCV2a亚型的疫苗仍在全世界使用，因为PCV2a疫苗已显示提供交叉保护(Fort, M. 等, 2008, 同上；Fort, M. 等 2009, 同上；Opriessnig, T. 等, 2009, 同上；Segales, J. 等, 2008, 同上)。然而，基于PCV2a的疫苗所提供的针对流通的新PCV2b亚型的交叉保护程度是未知的，全球猪工业将必定获益于能够使用基于目前流通的主要PCV2b亚型的疫苗。因此，本发明的目的之一在于开发一种基于新的PCV2b亚型的新一代疫苗并评价基于PCV2b的疫苗针对PCV2a和PCV2b攻击两者的功效。

[0040] 本发明提供一种减毒的活的PCV1和PCV2的嵌合病毒。在一个特定实施方案中，构建了表达PCV2亚型PCV2b的衣壳蛋白的PCV1病毒。作为例示性方法，发明人首先产生了PCV2b亚型的感染性DNA克隆，然后构建了新的嵌合病毒PCV1-2b，其在非致病的PCV1的基因组骨架中包含PCV2b亚型的免疫原性衣壳基因。首先在CD/CD猪中评价新的嵌合PCV1-2b病毒的致病性和免疫原性。随后，在常规猪中进行攻击和交叉攻击研究以确定PCV1-2b嵌合疫苗病毒的疫苗功效。发明人证实，嵌合PCV1-2b疫苗病毒在猪中是减毒的并诱导针对PCV2b的保护性免疫和针对PCV2a的交叉保护性免疫。因此，该新的嵌合PCV1-2b疫苗应该是作为针对PCV2b和PCV2a感染两者以及PCVAD的活的减毒疫苗的优秀候选物。

[0041] 下述实施例展示本发明的某些方面。然而，将理解，这些实施例仅是为了例示说明，并不意在完全限制本发明的条件和范围。应当认识到，当给出典型的反应条件(例如，温度、反应时间等)时，尽管通常较不合宜，但还是可使用高于和低于特定范围的条件。在室温(约23℃-约28℃)和大气压下进行实施例。除非另外指定，否则本文涉及的所有份数和百分比以重量为基础，所有温度以摄氏度表示。

[0042] 实施例1PCV1和PCV2病毒隔离群：
在之前的研究中构建了PCV1感染性DNA克隆并在猪中显示为非致病的(Fenaux, M. 等, 2002, Cloned genomic DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions(当直接注射到猪的肝和淋巴结中时，2型猪圆环病毒的克隆的基因组DNA是感染性的：临床疾病、病毒分布和病理损害的表征), J Virol 76:541-51；Fenaux, M. 等 2004A, 同上；Fenaux, M. 等, 
2003, 同上)。PCV2a隔离群ISU-40895 (SEQ ID No:1, Genbank登录号AF264042)于1998年在爱荷华州农场的患有PCVAD的猪中发现(Fenaux, M. 等, 2000, 同上)，并已广泛用于PCV2致病性研究(Fenaux, M. 等, 2002, 同上；Fenaux, M. 等, 2004, 同上；Fenaux, M. 等, 2003, 同上；Opriessnig, T. 等, 2006, Evidence of  breed-dependent differences in susceptibility to porcine circovirus type-2-associated disease and lesions(易患2型猪圆环病毒相关的疾病和损害的品种依赖性差异的证据), Vet Pathol 43:281-93；Opriessnig, T. 等, 2006, Effects of the timing of the administration of Mycoplasma hyopneumoniae bacterin on the development of lesions associated with porcine circovirus type 2 (猪肺炎支原体菌苗的给药时机对发生与2型猪圆环病毒相关的损害的影响), Vet Rec 158:149-54；Opriessnig, T. 等, 
2004, Experimental reproduction of postweaning muitisystemic wasting syndrome in pigs  by dual infection with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine circovirus type 2 (通过用猪肺炎支原体和2型猪圆环病毒双重感染来实验再现猪的断奶后多系统衰竭综合征), Vet Pathol 41:624-40；Opriessnig, T. 等, 2003, Effect of vaccination with selective bacterins on conventional pigs infected with type 2 porcine circovirus(用选择性菌苗接种对用2型猪圆环病毒感染的常规猪的影响), Vet Pathol 40:521-9)。PCV2a-40895在实验条件下能够引起PCVAD显微损害和临床疾病(Opriessnig, T. 等, 2006, 同上；Opriessnig, T. 等, 2004, Effect of porcine parvovirus vaccination on the development of PMWS in segregated early weaned pigs coinfected with type 2 porcine circovirus and porcine parvovirus(猪细小病毒疫苗接种对在用2型猪圆环病毒和猪细小病毒共感染的隔离早期断奶猪中发生PMWS的影响), Vet Microbiol 98:209-20；Opriessnig, T. 等, 2004, 同上)。通过测序完整的病毒基因组(SEQ ID No: 2, Genbank登录号GU799576)，证实了研究中使用的PCV2b株为真正的PCV2b亚型。PCV2b的基因组DNA被用作用于构建PCV2b的感染性DNA克隆以及嵌合PCV1-
2b感染性DNA克隆的来源。在本发明之前，未在实验感染中测定PCV2b病毒的致病性。

[0043] 实施例2PCV2b和嵌合PCV1-2b的感染性DNA克隆的产生：
之前已报道了用于构建PCV2a-40895的感染性DNA克隆的方法(Fenaux, M. 等, 2002, 同上)，在本发明中使用类似的方法来产生PCV2b的感染性DNA克隆(图1a)。简言之，使用一对具有包含存在于所有PCV2株中的Sac II限制酶位点的重叠区的引物A (SEQ ID No: 3)和B (SEQ ID No: 4) (表1)，通过PCR来扩增PCV2b的全长基因组。然后用Sac II (New England Biolabs)消化PCR产物并连接到pBluescript II SK(+) (pBSK+) (Stratagene)中以产生PCV2b的感染性DNA克隆。

[0044] 为了产生嵌合PCV1-2b感染性DNA克隆，使用重叠延伸PCR来将PCV1感染性克隆的骨架中的PCV1衣壳基因代替为来自PCV2b的衣壳基因(图1b)。从3个重叠PCR片段(表1)装配全长嵌合PCV1-2b基因组。使用具有相同扩增参数(95℃ 3分钟；40个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分钟)的Platinum Taq HiFi mastermix (Invitrogen)来产生各扩增子。使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen)来纯化PCR产物。
将由两步组成的融合PCR用于装配嵌合PCV1-2b DNA克隆：使用50ng的各片段作为模板的不需要引物的装配反应(20个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分钟)，然后使用外部引物扩增(40个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分钟)。将用引物G (SEQ ID No: 9)和H (SEQ ID No: 10) (表1)从PCV1克隆扩增的1,043 bp片段首先与包含用引物C (SEQ ID No: 5)和D (SEQ ID No: 6) (表1)从PCV2b扩增的完整衣壳基因的718 bp片段融合。然后加入用引物E (SEQ ID No: 7)和F (SEQ ID No: 8) (表1)从PCV1扩增的122 bp片段，得到侧翼为Kpn I限制性位点的完整嵌合PCV1-2b基因组。随后用Kpn I  (New England Biolabs)消化嵌合融合产物并克隆到pBSK+中。对单体DNA克隆进行完整测序以确认在PCR扩增步骤期间没有引入不需要的突变。

[0045] 实施例3PCV2b和PCV1-2b DNA克隆的二聚化：
之前的研究显示，二聚化PCV2a克隆在PK-15细胞的体外转染和猪的体内转染两者中更有效地产生感染性病毒，其中2份拷贝的全长PCV2a基因组通过首尾串连来连接(Fenaux, M. 等, 2002, 同上；Fenaux, M. 等, 2004A, 同上； Fenaux, M. 等, 2003, 同上)。因此，在本发明中，将PCV2b和PCV1-2b克隆两者二聚化以产生更健壮(robust)和有效的感染性克隆。简言之，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)来提取包含PCV2b和PCV1-2b单体基因组的质粒DNA。使用Sca I (New England Biolabs)来线性化纯化的质粒DNA并通过在37℃孵育30秒来使其经受Kpn I的部分消化以产生大约3,100和3,700 bp的两个片段，这些片段然后通过凝胶提取来纯化。使用T4 DNA连接酶 (Promega)来组合和连接两个片段以产生PCV2b和PCV1-2b两者的串联二聚化感染性DNA克隆。

[0046] 实施例4PCV2b和PCV1-2b感染性DNA克隆在PK-15细胞中的生存力测试：
如之前所述，在使用间接荧光测定(IFA)来转染后，体外测试PCV2b和嵌合PCV1-2b DNA克隆的生存力和感染性(Fenaux, M. 等, 2002, 同上)。简言之，将6.5 µg的各二聚化DNA克隆加入1,250 µl OPTIMEM培养基(Invitrogen)和6.25 µl PLUS试剂(Invitrogen)中，并在室温孵育5分钟。加入16 µl Lipofectamine LTX (Invitrogen)后，将混合物在室温孵育
30分钟，再加入250 µl OPTIMEM培养基。将包含60-70%汇合的PK-15细胞的T25细胞培养瓶(Corning)用MEM培养基(Invitrogen)洗涤，加入转染混合物，然后将瓶在37℃孵育6小时。
孵育后，将8  ml生长培养基(包含10%  胎牛血清和2x抗生素/抗真菌溶液的MEM [Invitrogen])加入各瓶中，并在37℃孵育另外的72小时。然后将各T25瓶中的转染细胞在-
80℃冷冻和解冻3次，将细胞裂解物在4℃以2,500 x g离心10分钟以移除细胞碎片。收获上清液并用于感染以50%汇合接种于48孔板(BD-Falcon)的新鲜PK-15细胞。每孔加入100 µl的转染上清液后，将板在37℃孵育1小时，之后向各孔加入500 µl生长培养基并在37℃孵育
72小时。如之前所述，使用IFA来可视化感染的PK-15细胞的核中的衣壳蛋白(Fenaux, M. 等 2002, 同上)。简言之，使用PBS中的80%丙酮在4℃固定细胞30分钟，用PBS缓冲液洗涤1次，用1:1,000稀释的PCV2单特异性小鼠单克隆抗体(Rural Technologies, Inc.；
Brookings, South Dakota)在37℃孵育45分钟。用PBS缓冲液洗涤3次后，将细胞用1:50稀释的FITC标记的第二山羊抗小鼠IgG (KPL)在37℃孵育45分钟。用PBS缓冲液洗涤后，然后用Fluoromount G (Southern Biotech)盖上细胞并在荧光显微镜下检查。

[0047] 当转染到PK-15细胞中时，PCV2b和嵌合PCVl-2b DNA克隆是感染性的：PCV2b和嵌合PCV1-2b的全长单拷贝和串联二聚化DNA克隆被构建并由全长测序证实。用两种DNA克隆的二聚体转染PK-15细胞引起感染性子代病毒体的产生，如通过IFA与PCV2衣壳特异性单克隆抗体来检测的。PCV2b和嵌合PCV1-2b病毒贮液两者的感染效价为大约104.5 TCID50/ml。

[0048] 实施例5感染性PCV2a、PCV2b和PCV1-2b病毒贮液的产生和滴定：
为了制备用于猪体内研究的接种物，通过用二聚化感染性DNA克隆转染T25瓶中的PK-
15细胞来产生PCV2a-40895、PCV2b和PCV1-2b的感染性病毒贮液(参见上文) (Fenaux, M. 等 2002.同上；Fenaux, M. 等 2003, 同上)。基本上如之前所述进行，通过IFA来滴定这些感染性病毒贮液(Fenaux, M. 等 2002, 同上)。简言之，将PK-15细胞以60%汇合接种于48孔板(BD-Falcon)，并在37℃孵育3小时。在MEM中产生各病毒贮液的系列10倍稀释液，并将各稀释液以100 µl每孔接种于四个单独的孔。将板在37℃孵育1小时，之后向各孔加入500 µl生长培养基并在37℃继续孵育72小时。使用IFA来可视化各孔中感染细胞的核的阳性信号(参见上文)。根据Reed & Muench的方法来计算每ml的50%组织培养感染剂量(TCID50)。

[0049] 实施例6PCV2b和嵌合PCV1-2b在剖腹产来源剥夺初乳的(CD/CD)猪中的致病性研究的实验设计：
CD/CD猪被认为是用于研究PCV2致病性的优秀模型系统，因为可在该模型中再现典型的病理损害和临床PCVAD (Allan, G. 等, 2003, 同上；Bolin, S. R. 等, 2001, 同上；
Harms, P. A. 等, 2001, 同上；Kennedy, S. 等, 2000, 同上；Tomas, A. 等, 2008, 同上)。为了测定嵌合PCV1-2b病毒的致病性并将其与野生型PCV2b病毒比较，将大约9周龄的总计30只CD/CD猪(Struve Labs, Manning, IA)以每个房间10只动物的形式随机分配成三组。接种之前，对各猪称重、出血并确认其对PCV2抗体的存在为阴性。将组1猪用3 ml PBS缓冲液各自模拟接种(2 ml鼻内和1 ml肌内)，并充当未感染的对照。将组2中的猪用3 ml的包含2 x 104.5TCID50嵌合PCV1-2b病毒的接种物各自接种(2 ml鼻内和1 ml肌内)。将组3中的猪用2 x 104.5TCID50野生型PCV2b病毒各自类似接种。接种之前和在此之后每周从各猪中收集血液样品直至21或42天的接种后天数(dpi)尸体解剖。在21 dpi，尸体解剖来自各组的5只随机分配的猪。在42 dpi，尸体解剖各组中剩下的5只猪。

[0050] 实施例7PCV2b和嵌合PCV1-2b在剖腹产来源剥夺初乳的(CD/CD)猪中的致病性研究的实验设计：
CD/CD猪被认为是用于研究PCV2致病性的优秀模型系统，因为可在该模型中再现典型的病理损害和临床PCVAD (Allan, G. 等, 2003, 同上；Bolin, S. R. 等, 2001, 同上；
Harms, P. A. 等, 2001, 同上；Kennedy, S. 等, 2000, 同上；Tomas, A. 等, 2008, 同上)。为了测定嵌合PCV1-2b病毒的致病性并将其与野生型PCV2b病毒比较，将大约9周龄的总计30只CD/CD猪(Struve Labs, Manning, IA) 以每个房间10只动物的形式随机分配成三组。接种之前，对各猪称重、出血并确认其对PCV2抗体的存在为阴性。将组1猪用3 ml PBS缓冲液各自模拟接种(2 ml鼻内和1 ml肌内)，并充当未感染的对照。将组2中的猪用3 ml的包含2 x 104.5TCID50嵌合PCV1-2b病毒的接种物各自接种(2 ml鼻内和1 ml肌内)。将组3中的猪用2 x 104.5TCID50野生型PCV2b病毒各自类似接种。接种之前和在此之后每周从各猪中收集血液样品直至21或42天的接种后天数(dpi)尸体解剖。在21 dpi，尸体解剖来自各组的
5只随机分配的猪。在42 dpi，尸体解剖各组中剩下的5只猪。

[0051] 嵌合PCVl-2b病毒在CD/CD猪中是减毒的，而野生型PCV2b病毒诱导PCVAD的病理损害和临床疾病特征：为了明确评估嵌合PCV1-2b病毒的致病潜能，在CD/CD猪模型中进行致病性研究，该模型已显示为最可重现和高度灵敏的PCVAD疾病模型(Allan, G. 等, 2003, 同上；Bolin, S. R. 等, 2001, 同上；Harms, P. A. 等, 200,1 同上；Kennedy, S. 等 2000, 同上)。

[0052] 临床体征和肉眼损害：用嵌合PCV1-2b病毒或PBS缓冲液实验接种的CD/CD猪贯穿整个研究没有PCVAD的明显临床体征，而用野生型PCV2b实验接种CD/CD猪在10只PCV2b感染的猪的4只中引起PCVAD相关的死亡或早期安乐死：1只猪在18 dpi死亡，另一只在27 dpi死亡，其余两只由于进行性体重减轻在34 dpi不得不被安乐死。

[0053] 来自3个处理组的每一个的猪直至21 dpi都具有类似的体重增加，但野生型PCV2b感染的猪在21 dpi后在5只猪中的4只中具有体重增加的下降(由于体重减轻3只猪死亡或被早期安乐死)。在用嵌合PCV1-2b病毒接种的猪中未观察到肉眼可见的肺损害，而在27 dpi和34 dpi尸体解剖的3只PCV2b接种的猪显示中等的肺损害。与PBS对照相比，PCV1-2b和PCV2b两者感染的猪中的淋巴结扩大。然而，PCV1-2b感染的猪中具有扩大淋巴结的猪数量与扩大量比野生型PCV2b猪中的少(数据未显示)。

[0054] 显微损害：通过以下两组中的处理来分析显微损害：在21 dpi或之前尸体解剖的所有猪(包括在18 dpi死亡的PCV2b感染的猪)，和在42 dpi尸体解剖的所有猪(包括在27 dpi和34 dpi死亡或被安乐死的3只PCV2b感染的猪)。

[0055] 肺、肝、胸腺、心、肾、回肠、结肠、淋巴结、脾和扁桃体中的显微损害在表2中概述。正如预期的，用PBS缓冲液接种的猪中没有显著的显微损害。在21和42 dpi，与用野生型PCV2b实验接种的猪相比，用嵌合PCV1-2b病毒接种的猪的淋巴组织中的典型的PCV2相关显微损害的发生率和严重性都下降(表2)。其他非淋巴组织中的显微损害包括淋巴细胞和巨噬细胞的轻度至严重浸润(表2)。在野生型PCV2b感染的猪中几乎排他地发现了小肠和大肠中的损害。

[0056] 在21 dpi，用嵌合PCV1-2b病毒接种的猪的平均值组总体淋巴损害评分显著(p=0.045)低于用野生型PCV2b病毒接种的猪的评分，并与用PBS缓冲液接种的猪没什么不同(图3)。

[0057] PCV2血清学：将从死亡或被早期安乐死的猪中获得的血清样品与来自下一步预定尸体解剖的血清样品一起分析(例如，在分析来自21 dpi尸体解剖的样品时包括来自在18 dpi死亡的猪的血清)。早在7 dpi就在一些PCV1-2b感染的猪的血清中检测到PCV2衣壳特异性IgG抗体，其中9/10的猪至21 dpi血清转变(图2)。嵌合PCV1-2b病毒接种的猪中的PCV2 IgG抗体效价至28 dpi达到稳定并直至研究结束(42 dpi)保持高的。在用野生型PCV2病毒实验接种的猪中，血清转变较不一致：仅3/10的猪至21 dpi血清转变，而5/10的猪在该研究中不具有可检测的血清转变。然而，仅2/5的PCV2b感染的猪活到dpi 42的预定尸体解剖，且两者在28 dpi进行血清转变，直至研究结束都具有增加的IgG抗体效价。由于临床PCVAD而死亡或被早期安乐死的猪中，在任何时间仅1/4具有可检测的PCV2特异性抗体，没有猪在它们被尸体解剖的那天具有可检测的血清抗PCV2抗体。贯穿该研究在任何PBS缓冲液接种的猪中都未检测到PCV2衣壳特异性抗体。

[0058] 通过IHC确定的组织中的患病率和PCV2特异性抗原的量：不同组织中的患病率和PCV2抗原的平均值组量在表3中概述。一起分析在21 dpi或之前尸体解剖的所有猪(包括在18 dpi死亡的PCV2b感染的猪)，并一起分析在42 dpi尸体解剖的所有猪(包括在27 dpi和
34 dpi死亡或被安乐死的3只PCV2b感染的猪)。通常，与用野生型PCV2b病毒接种的猪相比，用嵌合PCV1-2b病毒接种的猪的发病率和PCV2抗原的量都较低(表3)。在除了扁桃体外的所有21 dpi组织中有1只PCV1-2b接种的猪引起阳性结果，在扁桃体中5只猪中的4只为阳性。
来自PCV1-2b接种的猪的组织在42 dpi大部分为阴性，其中淋巴结除外，在淋巴结中5只猪中的4只检测到少量的PCV2抗原。

[0059] PCV2病毒血症和血清病毒载量：使用扩增部分PCV2b衣壳基因的改良qPCR测定来测定感染的动物的血清中的PCV2病毒载量，已知qPCR测定对PCV2b和PCV1-2b两者起作用(Yang, Z.  Z. 等, 2007, Detection of PCV2 DNA by SYBR Green l-based quantitative PCR(通过基于SYBR绿l的定量PCR来检测PCV2 DNA). J Zhejiang Univ Sci B 8:162-9)。确认在接种前0天和贯穿该研究从PBS缓冲液接种的猪中取得的所有血清样品不具有可检测的PCV2 DNA。将从由于PCVAD疾病而死亡或被早期安乐死的猪中取得的血清样品与来自下一步预定尸体解剖的血清样品一起分析(例如，在分析来自21 dpi的样品时包括来自在18 dpi死亡的猪的血清)。

[0060] 从14 dpi直至研究结束，用嵌合PCV1-2b病毒接种的猪中存在的血清病毒载量显著(p≤0.009)低于PCV2b接种的猪中的血清病毒载量(图4a)。PCV1-2b感染的猪中的平均血清病毒载量在14 dpi达到峰值107基因组拷贝/ml，并平稳下降直至研究结束。对于任何单个PCV1-2b感染的猪所实现的最大值为在14 dpi 的108基因组拷贝/ml。与此相比，PCV2b感染的猪中的平均值血清病毒载量从14 dpi直到28 dpi后都保持高于108基因组拷贝/ml，其12
中单个猪所实现的最大值为10 。由于PCVAD而早期死亡或被安乐死的4只猪比其他PCV2b接种的猪具有较高水平的血清病毒载量。7 dpi后，PCV2b感染的猪的每ml血清的病毒基因组拷贝是PCV1-2b感染的猪的至少10倍，并在21 dpi和28 dpi为100倍。

[0061] 淋巴组织中的PCV2病毒载量：使用如上文的相同qPCR测定来测定在尸体解剖各猪时所收集的TBLN组织中的PCV2病毒DNA的量。确认来自PBS缓冲液接种的猪的所有TBLN组织样品对PCV2 DNA为阴性。为了能够进行21 dpi与42 dpi的组平均值病毒载量的有意义比较，测试但在分析中不包括由于PCVAD疾病而早期死亡或被安乐死的猪。发现在21 dpi PCV1-2b接种的猪中的每mg的TBLN组织中存在的病毒载量显著低于PCV2b接种的猪中的病毒载量(p=0.005) (图4b)。在所有被测试的TBLN组织中，由于PCVAD而死亡或被早期安乐死的猪在TBLN组织中都具有最高的病毒载量。

[0062] 实施例8嵌合PCV1-2b病毒在常规无特异性病原体(SPF)猪中的疫苗接种和免疫原性研究的实验设计：
从商业农场(Virginia Tech Swine Center, Blacksburg, VA)购买总计40只3周龄杂交种SPF猪，已知这些猪不含PCV、PRUSV、PPV、猪肺炎支原体和猪戊型肝炎病毒。将小猪随机分配成2组，每组20只猪并单独圈养。接种之前，对各猪称重、出血并确认其对PCV2抗体为阴性。将组1猪用1 ml的嵌合PCV1-2b病毒各自肌内(IM)接种疫苗(每只猪103.5 TCID50感染性病毒)。将组2猪用1 ml PBS缓冲液各自IM模拟接种疫苗并充当未接种疫苗的对照。每天监控所有动物的临床体征，并在接种之前和在此之后直至56天的接种疫苗后天数(dpv)每周从各猪中收集血液样品。

[0063] 实施例9用野生型PCV2b亚型和PCV2a亚型分别攻击和交叉攻击接种疫苗的猪的实验设计：
在56 dpv，将20只接种疫苗的猪进一步分为每组10只猪的两组，并在单独的房间中圈养：将10只接种疫苗的猪各用2 x 104.5 TCID50野生型PCV2b病毒攻击(2 ml鼻内和1 ml IM)，将另外10只接种疫苗的猪各用2 x 104.5 TCID50野生型PCV2a病毒类似地交叉攻击。亦将20只未接种疫苗的对照猪进一步分为两组，每组10只猪，并分别用PCV2b和PCV2a类似地接种。每周收集血液样品直至21天的攻击后天数(dpc) (或77 dpv)，在那时将所有猪尸体解剖。

[0064] 用嵌合PCV1-2b病毒疫苗接种针对PCV2b亚型攻击和PCV2a亚型交叉攻击赋予常规猪的保护性免疫：因为嵌合PCV1-2b疫苗旨在常规猪的领域使用，所以发明人使用常规SPF猪来进行该疫苗功效和攻击研究。

[0065] 临床体征和肉眼损害：贯穿该研究没有猪发生与PCVAD一致的临床体征，且在处理组之间未观察到体重增加的差异。分配到未接种疫苗/PCV2b攻击组的1只猪在2 dpc死于与PCVAD不相关的细菌性败血症，且不包括在分析中。在尸体解剖时，在任何处理组中都未观察到肉眼可见的肺损害。在所有处理组中都看到了轻微至中等扩大的淋巴结，其中处理之间未观察到显著差异。

[0066] 血清学：研究之前确定所有猪对针对PCV2、PRRSV、PPV和SIV的抗体为阴性。早在14 dpv就在PCV1-2b疫苗接种的猪的血清中检测到了PCV2衣壳特异性抗体，其中在21 dpv 15/20的猪发生血清转变，并至28 dpv 20/20的猪发生血清转变(图5)。PCV2 IgG抗体效价至35 dpv达到稳定并在56 dpv攻击时保持高的。直到在14 dpc攻击后，在未接种疫苗的对照猪中未检测到抗PCV2的抗体(图5)：在14 dpc，与仅2/9血清阳性的PCV2b攻击的猪相比，10/10 PCV2a攻击的猪为血清阳性的。至21 dpc，7/9未接种疫苗的PCV2b攻击的猪血清转变。

[0067] 显微损害：攻击后，与接种疫苗的猪相比，未接种疫苗的猪的淋巴组织中的显微损害评分的发生率和严重性较高(表4)。大体上，与未接种疫苗的对照相比，接种疫苗的猪的典型淋巴萎缩和组织细胞置换评分较低(表4)。对于PCV2a (p=0.0001)和PCV2b (p=0.04)攻击组两者，接种疫苗的猪的总体淋巴损害评分都显著低于未接种疫苗的猪的评分(图6)。

[0068] 通过IHC确定的组织中的PCV2抗原的量：将IHC用于检测各组织类型(表4)中的PCV2特异性抗原。与组织损害类似，与未接种疫苗的对照相比，大体上接种疫苗的猪的组织中的发生率和PCV2抗原的量都降低(表4)。

[0069] 病毒血症和血清病毒载量：使用改良qPCR测定来定量攻击后血清中的PCV2a或PCV2b病毒DNA的量，该测定对检测PCV2a或PCV2b rep基因特异但不能够扩增疫苗病毒PCV1-2b (Mcintosh, K. A. 等 2009. Development and validation of a SYBR green real-time PCR for the quantification of porcine circovirus type 2 in serum, buffy coat, feces, and multiple tissues(开发和验证用于定量血清、棕黄层、排泄物和多种组织中的2型猪圆环病毒的SYBR绿实时PCR). Vet Microbiol 133:23-33)。确认在56 dpv攻击之前收集的血清样品不具有可检测的PCV2 DNA。在攻击后的任何时间点在接种疫苗的猪中没有可检测的PCV2a或PCV2b病毒血症。与此相比，在攻击后的每个时间点在所有未接种疫苗的猪中都检测到了PCV2a或PCV2b病毒血症(图7a)。用PCV2a或PCV2b病毒攻击的未接种疫苗的猪之间在血清病毒载量方面无统计上显著差异。

[0070] 淋巴组织中的PCV2a或PCV2b病毒载量：尸体解剖时TBLN组织中所收集的PCV2a或PCV2b病毒DNA的量在图7b中概述。在PCV2a (p=0.0001)和PCV2b (p<0.0001)攻击组两者中，与未接种疫苗的猪相比，发现接种疫苗的猪中每mg的TBLN组织中的病毒载量显著较低(图7b)。仅1/10的接种疫苗的且PCV2b攻击的猪在TBLN组织中具有可检测的PCV2b病毒DNA，其中病毒载量为105基因组拷贝/mg。5/10的接种疫苗的且PCV2a攻击的猪在TBLN组织中具5 6
有可检测的PCV2a病毒DNA，其中各自的病毒载量为10-10基因组拷贝/mg。未接种疫苗的猪的TBLN组织中的病毒载量范围为108-1010基因组拷贝/mg，而不管PCV2a抑或PCV2b攻击。

[0071] 实验材料和方法细胞：之前通过终点稀释PK-15细胞(ATCC CCL-33)来产生无PCV1污染的PK-15细胞系的亚克隆(Fenaux, M. 等, 2000, 同上；Fenaux, M. 等, 2002, 同上)。将无PCV1的PK-15细胞系用于产生感染性病毒贮液和本发明使用的病毒贮液的感染性滴定。

[0072] 血清学：如之前所述，将ELISA用于检测各血清样品中的抗PCV2  IgG (Nawagitgul, P. 等, 2002, Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV (用于检测抗PCV的抗体的改良的间接的基于2型猪圆环病毒(PCV)和基于重组衣壳蛋白(ORF2)的酶联免疫吸附测定), Clin Diagn Lab Immunol 9:33-40)。血清样品具有样品：阳性(S:P)比大于0.2被认为对抗PCV2抗体阳性。在开始动物实验之前通过ELISA来确认所有猪为PCV2血清阴性的。

[0073] 临床评价：接种、接种疫苗或攻击后，每天评价猪的PCVAD的临床体征，PCVAD的临床体征包括消瘦、呼吸窘迫和行为变化(例如嗜睡和食欲不振)。

[0074] 肉眼可见病理学和组织病理学：以盲方式在指定时间对所有猪进行尸体解剖用于致病性(dpi 21和42)或攻击实验(dpc 21或dpv 77)。进行肉眼可见的肺损害(感染的肺范围为0-100%)和淋巴结大小(范围为0 [正常]-3 [4倍正常大小])的估算，并对各猪评分(Halbur, P. G. 等, 1995, Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus(两种US猪繁殖与呼吸综合征病毒隔离群与莱利斯塔德病毒的致病性的比较), Vet Pathol 32:648-60；Opriessnig, T. 等, 2004, 同上)。

[0075] 在各尸体解剖期间收集肺、淋巴结(腹股沟表面的、纵膈的、气管支气管的和肠系膜的)、扁桃体、心、胸腺、回肠、肾、结肠、脾和肝的切片，并固定在10%中性缓冲福尔马林中和常规处理用于组织学检查和免疫组织化学(IHC)。同样，从各猪收集气管支气管淋巴结(TBLN)样品用于DNA提取并通过实时PCR来定量病毒基因组。如之前所述，以盲的方式对肺、心、肝、肾、回肠和结肠中的显微损害评分(Opriessnig, T. 等, 2004, 同上)。基于淋巴萎缩和滤泡的组织细胞置换评价了包括淋巴结、脾和扁桃体在内的淋巴组织，范围为0 (正常)-3 (严重) (Opriessnig, T. 等, 2004, 同上)。

[0076] 免疫组织化学(IHC)：使用兔多克隆抗血清对福尔马林固定石蜡包埋的肺、淋巴结(腹股沟表面的、纵膈的、气管支气管的和肠系膜的)、扁桃体、心、胸腺、回肠、肾、结肠、脾和肝的切片进行用于检测PCV2特异性抗原的IHC (Sorden, S. D.等 1999. Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue(开发基于多克隆抗体的免疫组织化学方法用于检测福尔马林固定石蜡包埋的组织中的2型猪圆环病毒). J Vet Diagn Invest 11:528-30)。以盲的方式估算各组织中的PCV2抗原的评分，评分范围为0 (无抗原)-3 (淋巴组织中超过50%淋巴滤泡含有阳性PCV2抗原染色的细胞或者其他组织切片中的PCV2抗原量高) (Opriessnig, T. 等, 2004, 同上)。

[0077] 总体显微淋巴损害评分：如之前所述，对各猪计算总体显微淋巴损害的平均评分(Opriessnig, T. 等, 2004, 同上)。这些损害评分是基于淋巴组织中存在的组合的淋巴萎缩(LD)、组织细胞置换(HR)和PCV2抗原，如通过IHC测定的。

[0078] 定量实时PCR测定病毒DNA载量：根据由制造商提供的“血液和体液”方案，使用QIAamp DNA minikit (Qiagen Inc)来从血清样品中提取总DNA。将尸体解剖期间所收集的TBLN组织匀浆化以产生无菌PBS缓冲液中的10%组织匀浆悬浮液，并根据制造商(Qiagen Inc)提供的“组织”方案，使用QIAamp DNA minikit来提取总DNA。将所有TBLN DNA提取物在无菌水中至少以1:100稀释，以便消除来自与猪基因组DNA结合的SYBR绿的背景荧光。由于一些样品中极其高的病毒DNA浓度，将一些血清和TBLN提取物稀释达1:106，以便使它们在qPCR检测的线性范围内。将两种基于SYBR绿I的qPCR测定改良用于本发明，以定量TBLN和血清DNA提取物中存在的PCV2基因组(Mcintosh, K. A. 等, 2009, Development and validation of a SYBR green real-time PCR for the quantification of porcine circovirus type 2 in serum, buffy coat, feces, and multiple tissues(开发和验证用于定量血清、棕黄层、排泄物和多种组织中的2型猪圆环病毒的SYBR绿实时PCR), Vet Microbiol 133:23-33；Yang, Z. Z. 等, 2007, 同上)。

[0079] 在CD/CD猪致病性研究中，发明人使用一种之前公布的qPCR测定，该测定扩增部分PCV2b衣壳基因以定量血清和TBLN中存在的病毒基因组(Yang, Z. Z. 等, 2007, 同上)。

[0080] 修改方案以使得能够使用Sensimix SYBR和荧光素试剂盒(Quantace)。各25 µl反应包括200 nM各引物(P1 (SEQ ID No: 11): 5'-ATAACCCAGCCCTTCTCCTACC-3')；P2 (SEQ ID No: 12): 5'-GGCCTACGTGGTCTACATTTCC-3')、200 µM dNTP、3mM MgCl2和5 µl DNA提取物。使用修改的程序(95℃ 10分钟；35个循环的95℃ 15秒、59℃ 30秒、72℃ 30秒)，在MyIQ qPCR循环变温器(BioRad)中对各样品运行一式三份的反应。使用相对Ct法，针对PCV2b感染性DNA克隆的重复标准品定量病毒基因组，具有6-log线性范围的定量(103-108拷贝)。

[0081] 在攻击和交叉攻击常规SPF猪研究中，发明人使用一种之前公布的qPCR测定，该测定扩增PCV2复制酶基因区的高度保守区以定量血清和TBLN组织中存在的病毒基因组的量(Mcintosh, K. A. 等, 2009, 同上)。该测定不检测疫苗接种中所使用的嵌合PCV1-2b疫苗病毒，并因此允许仅精确定量攻击PCV2a或PCV2b病毒。修改该方案以使得能够使用Sensimix SYBR和荧光素试剂盒。各25 µl反应包括200 nM各引物(PCV2-83F (SEQ ID No: 13):  5'-AAAAGCAAATGGGCTGCTAA-3'；PCV2-83R  (SEQ  ID No:  14): 5'-
TGGTAACCATCCCACCACTT-3')、200 µM dNTP、5mM MgCl2和5 µl DNA提取物。使用修改的程序(95℃ 10分钟；35个循环的95℃ 15秒、60℃ 15秒、72℃ 15秒)，在MyIQ qPCR循环变温器中对各样品运行一式三份的反应。使用相对Ct法，针对PCV2b感染性DNA克隆的重复标准品定量病毒DNA基因组，具有5-log线性范围的定量(5x102-5x106拷贝)。

[0082] 通过qPCR检测的病毒的序列确认：测试从各组所选择的猪中提取的TBLN组织DNA提取物，以确认由qPCR检测的病毒与各研究开始时接种到猪中的病毒相同。使用对PCV1-2b特异的引物(PCV2F (SEQ ID No: 15): 5'-TGTTGAAGATGCCATTTTTCC-3'；PCV1R (SEQ ID No: 16): 5'-GAGGAGTTCTACCCTCTTCC-3')，通过PCR扩增和部分测序来确认CD/CD致病性研究中的PCV1-2b。使用对PCV2特异的引物(PCV2F  (SEQ  ID  No:  17):  5'-TGTTGAAGATGCCATTTTTCC-3'；PCV2R (SEQ ID No: 18): 5'-GAGGTGTTCGTCCTTCCTCA-3')，扩增和测序PCV2a和PCV2b。

[0083] 统计分析：使用重复措施方差分析(ANOVA)来分析血清学和血清qPCR。使用简单ANOVA来分析来自CD/CD致病性研究的TBLN qPCR。对于所有ANOVA模型，使用Glimmix程序的切片选项来研究简单的效果比较，之后使用Tukey的程序用于多重比较。使用精确Wilcoxon 2样品测试来分析来自攻击研究的TBLN qPCR结果。用精确Kruskal-Wallis单向ANOVA评估来自两组实验的淋巴损害、组织病理学损害和IHC的评分，之后将精确Wilcoxon 2样品测试用于所关注的双向比较。使用Bonferroni的程序来调整双向比较用于多重比较。将统计显著性设为α= 0.05。使用市售软件(SAS 版本 9.2, Cary, NC, USA)来进行所有分析。

[0084] 发明人之前基于从PCV2a亚型制备的嵌合疫苗已开发了灭活疫苗Suvaxyn PCV2® One dose™(Fenaux, M. 等 2004, 同上；Fenaux, M. 等 2003, 同上)，该死疫苗是有效的且目前在全球市场上可得。通过使用类似地策略，在本研究中，发明人首先开发了一种新的嵌合病毒PCV1-2b，其中PCV2b亚型的衣壳基因克隆到非致病PCV1的基因组骨架中。在CD/CD和常规猪模型中针对PCV2和PCVAD充分研究了使用该嵌合PCV1-2b病毒作为活减毒的新一代疫苗。

[0085] 对于使用嵌合PCV1-2b病毒作为活减毒疫苗，重要的是确定疫苗病毒是减毒的。虽然PCV2单独很少引起实验模型中的全谱临床疾病，但是使用CD/CD猪已引起临床PCVAD的成功再现(Allan, G. 等, 2003, 同上；Bolin, S. R. 等, 2001, 同上；Harms, P. A. 等, 2001, 同上；Kennedy, S. 等, 2000, 同上；Tomas, A. 等, 2008, 同上)。因此，在本发明中，为了明确确定嵌合PCV1-2b病毒的致病性并将它与其亲代野生型PCV2b病毒比较，发明人选择CD/CD猪模型用于致病性研究。正如预期的，野生型PCV2b单独引起CD/CD猪的重度临床PCVAD，导致4/10的PCV2b感染的猪由于PCVAD的临床表现而死亡或早期安乐死。这与之前的显示PCV2感染的CD/CD猪的25%的死亡率和显著的临床PCVAD的研究一致(Allan, G. 等, 
2003, 同上；Bolin, S. R. 等, 2001, 同上；Harms, P. A. 等, 2001, 同上)。PCV2b感染的猪的总体淋巴损害评分与中等至重度全身性PCVAD一致(Opriessnig, T. 等 2007, 同上)。虽然宿主变异阻止单独明确的诊断截止值(cut-off)，但是重度PCVAD病例的病毒血症的一般可接受阈值为每ml的血清107病毒基因组拷贝(Brunborg, I. M. 等, 2004, Quantitation of porcine circovirus type 2 isolated from serum/plasma and tissue samples of healthy pigs and pigs with postweaning muitisystemic wasting syndrome using a TaqMan-based real-time PCR(使用基于TaqMan的实时PCR来定量从健康猪和患有断奶后多系统衰竭综合征的猪的血清/血浆和组织样品中分离的2型猪圆环病毒), J Virol Methods 122:171-8；Olvera, A. 等, 2004, Comparison of porcine circovirus type 2 load in serum quantified by a real time PCR in postweaning muitisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome naturally affected pigs(由实时PCR定量的断奶后多系统衰竭综合征和猪皮炎肾病综合征天然感染的猪的血清中2型猪圆环病毒载量的比较), J Virol Methods 117:75-80；Segales, J. 等, 2005, Quantification of porcine circovirus type 2 (PCV2) DNA in serum and tonsillar, nasal, tracheo¬bronchial, urinary and faecal swabs of pigs with and without postweaning muitisystemic wasting syndrome (PMWS) (定量患有和不患有断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的猪的血清以及扁桃体、鼻、气管-支气管、尿和粪便的化验标本中的2型猪圆环病毒(PCV2) DNA), Vet Microbiol 111:223-9)。至21 dpi，与仅1/10的嵌合PCV1-2b病毒感染的猪相比，9/10的PCV2b感染的猪超过该阈值。由于PCVAD而死亡或被较早安乐死的4只猪都在血清和淋巴组织中具有较高的PCV2 DNA病毒载量，但不具有可检测的PCV2 IgG抗体，这表明这些PCV2b感染的猪死于不足的免疫反应和较高水平的病毒复制。该结果与之前报道的低抗体反应与增加的PCVAD严重性之间的相关性一致(Meerts, P. 等, 2006, Correlation between the presence of neutralizing antibody against porcine circovirus 2 (PCV2) and protection against replication of the virus and development of PCV2-
associated disease(存在针对2型猪圆环病毒(PCV2)的中和抗体与针对病毒复制和发生PCV2相关疾病的保护之间的相关性), BMC Vet Res 2:6)。数据清楚表明本发明中使用的PCV2b亚型是高毒力的。

[0086] 尽管用至少20倍正常疫苗接种剂量的剂量来接种CD/CD猪，还是发现嵌合PCV1-2b病毒在CD/CD猪模型中为显著减毒的(Fenaux, M. 等, 2004, 同上)。嵌合PCV1-2b病毒的减毒由用于比较嵌合PCV1-2b和野生型PCV2b病毒的所有定量和定性参数清楚证明。与约一半的PCV2b感染的猪中看到的死亡和消瘦相比，用嵌合PCV1-2b病毒感染的猪中未看到死亡或发病。嵌合PCV1-2b感染的猪的淋巴组织中的显微损害评分和PCV2特异性抗原的量显著低于用野生型PCV2b感染的猪，表明嵌合PCV1-2b病毒仅引起亚临床感染。总体上，嵌合PCV1-2b感染的猪的淋巴损害评分与用PBS缓冲液接种的对照猪无显著不同。此外，血清和淋巴组织中较低的PCV2b病毒载量与嵌合PCV1-2b感染的猪中显著较低的典型损害或疾病严重性直接相关，如之前的研究中所观察的(Brunborg, I. M. 等, 2004, 同上；Dupont, K. 等, 2009, Transmission of different variants of PCV2 and viral dynamics in a research facility with pigs mingled from PMWS-affected herds and non-affected herds(PMWS感染的猪群与未感染的猪群混合的研究设施中的不同PCV2变体的传递和病毒动力学), Vet Microbiol 139:219-26；Fenaux, M. 等, 2004, 同上；Harding, J. C 等, 2008, Porcine circovirus-2 DNA concentration distinguishes wasting from nonwasting pigs and is correlated with lesion distribution, severity, and nucleocapsid staining intensity(猪圆环病毒-2 DNA浓度区分消瘦猪和非消瘦猪，且与损害分布、严重性和核衣壳染色强度相关), J Vet Diagn invest 20:274-82；Krakowka, S. 等, 2005, Features of porcine circovirus-2 disease: correlations between lesions, amount and distribution of virus, and clinical outcome(猪圆环病毒-2疾病的特征：损害、病毒的量和分布与临床结果的相关性), J Vet Diagn Invest 
17:213-22；Mcintosh, K. A. 等, 2009, 同上；Olvera, A.等, 2004, 同上；Yang, Z. Z. 等, 2007, 同上)。

[0087] 在证明嵌合PCV1-2b病毒在易受感染和敏感性CD/CD猪模型中为减毒的后，发明人然后在常规SPF猪中进行了组合免疫原性和攻击研究。选择3周龄常规杂交种SPF猪用于免疫原性/攻击实验以便更加密切模拟野外疫苗接种条件，因为这样的活减毒疫苗将最终用于常规猪。虽然基于我们较早公布的研究，在该常规SPF模型中不预期临床PCVAD (Fenaux, M. 等, 2002, 同上；Fenaux, M. 等, 2004, 同上；Fenaux, M. 等, 2004, 同上；Fenaux, M.等, 2003, 同上, Fenaux, M. 等, 2004A. 同上；Opriessnig, T, 等, 2009, Difference in severity of porcine circovirus type two-induced pathological lesions between Landrace and Pietrain pigs(2型猪圆环病毒诱导的病理学损害的严重性在兰德瑞斯猪与皮特兰猪之间的差异), J Anim Sci 87:1582-90； Opriessnig, T. 等, 2008, 同上)，但是预期由PCV2诱导的常规猪模型的淋巴组织中的病毒血症、病毒载量和典型组织学损害的水平是用于评价疫苗功效的充分参数(Fenaux, M. 等, 2004, 同上)。作为活减毒疫苗，重要的是确定是否嵌合PCV1-2b病毒在对猪接种疫苗时可诱导足够水平的保护性抗体反应。4种目前可得的疫苗中的2种是基于重组PCV2a衣壳蛋白，因此已知PCV2衣壳特异性体液免疫反应对保护重要。本发明的结果显示，早在14 dpv就在PCV1-2b疫苗接种的猪的血清中检测到PCV2衣壳特异性抗体，并至28 dpv所有的20只接种疫苗的猪都血清转变为抗PCV2衣壳特异性抗体。抗体效价至35 dpv达到稳定并在56 dpv攻击时保持高的，表明嵌合PCV1-2b疫苗病毒能够引起常规猪中的强体液免疫反应。

[0088] 在用野生型PCV2a或PCV2b亚型攻击时，与未接种疫苗的对照相比，用减毒的嵌合PCV1-2b病毒疫苗接种的常规SPF猪具有在血清和TBLN组织中显著较低的病毒DNA载量、显著减少的典型显微损害的严重性和发生率水平和显著较低的淋巴组织中的PCV2特异性抗原的量，表明嵌合PCV1-2b病毒诱导针对野生型病毒攻击的保护性免疫。结果亦显示，与未接种疫苗的对照相比，用嵌合PCV1-2b病毒疫苗接种的猪针对PCV2b亚型的同源攻击和PCV2a亚型的异源攻击被同等地保护，这由完全没有PCV2a或PCV2b病毒血症、淋巴组织中的病毒7载量的显著减少和接种疫苗的猪中的显著较低的总体淋巴损害评分所证实，而不管攻击病毒亚型。因此，似乎新的活减毒嵌合PCV1-2b疫苗候选物诱导针对两种PCV2亚型的保护性免疫和交叉保护性免疫。

[0089] 一些最近的研究已报道，当与PCV2a亚型相比时，通常PCV2b亚型与更严重的临床疾病相关(Carman, S. 等, 2008, 同上；Chae, J. S. and K. S. Choi, 2009, 同上；Grau-Roma, L 等, 2008, A proposal on porcine circovirus type 2 (PCV2) genotype definition and their relation with postweaning muitisystemic wasting syndrome (PMWS) occurrence(对2型猪圆环病毒(PCV2)基因型定义及其与断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)发生的关系的建议), Vet Microbiol 128:23-35)。然而，是否PCV2b亚型比PCV2a亚型更加有毒力仍然有争议，因为其他研究不能明确显示PCV2a与PCV2b在毒力方面的显著差异(An, D. J. 等, 2007, 同上；Lager, K. M. 等, 2007, 同上；Madson, D. M. 等, 2008, 同上；Opreissnig, T. 等, 2006, 同上；Opreissnig, T. 等, 2008, 同上)。由于PCV2a与PCV2b之间的序列趋异，PCV2的两种亚型在致病性方面可不同是可能的，因为已显示，cap基因中仅两个氨基酸变化足以改变PCV2a的致病性(Fenaux, M. 等, 
2004, Two amino acid mutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus (PCV2) enhanced PCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo(2型猪圆环病毒(PCV2)的衣壳蛋白中的2个氨基酸突变增强体外PCV2复制和体内使病毒减毒), J Viol 78:13440-6)。在当前研究的未接种疫苗的对照组中，其中一半的猪用PCV2a或PCV2b攻击，发明人未观察到组之间在毒力方面的任何显著差异。PCV2a与PCV2b的攻击剂量是等效的，但是血清和TBLN组织中的PCV2病毒载量、典型的显微损害评分或淋巴组织中的PCV2抗原的量在PCV2a与PCV2b攻击组之间无显著差异。在未接种疫苗的猪中，与PCV2a相比，对PCV2b的抗体反应有一些较小的差异，包括稍延迟的血清转变(图5)。在接种疫苗的猪中，PCV2b攻击引起稍高的总体淋巴损害评分，而PCV2a攻击引起较高数量的qPCR阳性的TBLN组织。总体上，结果与其他发现PCV2a与PCV2b致病性在实验条件下无显著差异的研究一致(An, D. J. 等, 2007, 同上；Lager, K. M 等, 2007, 同上；Madson, D. M. 等, 2008, 同上；Opriessnig, T. 等, 2006, 同上；Opriessnig, T. 等, 2008, 同上)。

[0090] 已报道了PCV2a与PCV2b亚型之间的抗原概况的差异，推测目前基于PCV2a的商业疫苗所缺失的足够的交叉保护水平可归因于全球猪群中与PCV2b亚型相关的PCVAD严重性的增加(Cheung, A. K. 等, 2007, 同上；Dupont, K. 等, 2008, 同上；Lekcharoensuk, P. 等, 2004, 同上；Shang, S. B. 等, 2009, 同上)。PCV2a与PCV2b之间的多数序列变异似乎在衣壳基因(包括信号独特的氨基酸基序)中(Cheung, A. K. 等, 2007, 同上；Olvera, A. 等, 2004, 同上)。针对该基序产生的抗体能够体外区分PCV2a和PCV2b，表明抗原性可能不同(Beach 等, 未公布数据)。本发明的结果显示，基于新的PCV2b亚型的衣壳的活减毒疫苗PCV1-2b的确针对PCV2a的异源攻击保护，因此支持之前基于PCV2a的灭活商业疫苗所赋予的PCV2b亚型的交叉保护的证据(Fort, M., 等, 2008, 同上；Fort, M. 等, 
2009, 同上；Opriessnig, T. 等, 2009, 同上；Opriessnig, T. 等, 2008, 同上)。

[0091] 总之，本发明的数据表明，基于新的PCV2b亚型的嵌合PCV1-2b疫苗候选物在CD/CD猪中是减毒的，并针对PCV2b和PCV2a攻击分别在接种疫苗的常规猪中诱导保护性免疫和交叉保护性免疫。本发明的结果将为进一步开发该嵌合PCV1-2b病毒作为第一个针对PCV2感染和PCVAD的活减毒疫苗提供基础。虽然PCV1-2b疫苗病毒单独提供针对PCV2a和PCV2b亚型的交叉保护，但是组合本发明的PCV1-2b疫苗与目前基于PCV2a的商业疫苗用于更完全的保护将来可为更有利。

[0092] 感染性病毒和分子DNA克隆的疫苗以及使用它们的方法亦包括在本发明的范围内。接种的猪被保护免受严重的病毒感染和由PCV2感染或共感染引起的其他疾病。新的方法通过向猪给予免疫有效量的本发明疫苗(例如，包含免疫原性量的感染性PCV DNA、含有PCV的感染性DNA克隆的质粒或病毒载体、重组PCV DNA、多肽表达产物等的疫苗)来针对病毒感染保护需要保护的猪。可向猪同时给予其他抗原(例如PRRSV、PPV)、其他感染性猪病原体和免疫刺激物以针对病毒感染提供广谱的保护。

[0093] 疫苗包含，例如与无毒的生理上可接受的载体和任选一种或多种佐剂组合的感染性病毒和分子DNA克隆、合适质粒或载体(例如pSCK载体)中的克隆的PCV感染性DNA基因组、无毒的活病毒、灭活的病毒等。疫苗亦可包含本文所述的感染性PCV2分子DNA克隆。感染性PCV DNA、包含感染性病毒基因组的质粒DNA和活病毒是优选的，其中活病毒是最优选的。本发明的无毒的活病毒疫苗相对于传统病毒疫苗提供优势，传统病毒疫苗使用有回到有毒状态风险的减毒活病毒或死的细胞培养物繁殖的完整病毒，其可能不诱导足够的抗体免疫反应用于针对病毒疾病保护。

[0094] 疫苗和使用它们的方法亦包括在本发明的范围内。接种的哺乳动物物种被保护免于严重的病毒感染，亦可对涉及PCV共感染的疾病提供保护，所述疾病例如PCVAD和猪皮炎肾病综合征(PDNS)以及其他相关疾病。疫苗包含例如灭活的或减毒的猪TTV病毒、无毒的生理上可接受的载体和任选一种或多种佐剂。

[0095] 佐剂是增加猪对疫苗的免疫反应的物质，其可与本发明的疫苗共同给予。可与疫苗同时并在相同的位点上或者在不同时间(例如，作为加强免疫)给予佐剂。亦可将佐剂以与给予疫苗的方式不同的方式或在与给予疫苗的位点不同的位点上有利地给予猪。合适的佐剂包括但不限于氢氧化铝 (alum)、免疫刺激复合物(ISCOMS)、非离子型嵌段聚合物或共聚物、细胞因子(像IL-1、IL-2、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、皂苷、单磷酰脂质A (MLA)、胞壁酰二肽(MDP)等。其他合适的佐剂包括，例如硫酸钾铝、分离自大肠杆菌(Escherichia coli)的热不稳定或热稳定的肠毒素、霍乱毒素或其B亚基、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐剂等。可将基于毒素的佐剂(例如白喉毒素、破伤风毒素和百日咳毒素)在使用之前灭活，例如通过用甲醛处理。

[0096] 疫苗可进一步包含另外的抗原以促进感染性PCV DNA克隆的免疫活性，所述抗原例如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、其他感染性猪病原体和免疫刺激物。

[0097] 本发明的新疫苗不限于任何特定类型或制备方法。克隆的病毒疫苗包括但不限于感染性DNA疫苗(即使用质粒、载体或其他常规载体来直接注射DNA到猪中)、活疫苗、改良的活疫苗、灭活疫苗、亚基疫苗、减毒疫苗、基因工程疫苗等。这些疫苗由本领域已知的标准方法来制备。

[0098] 作为另外的益处，本发明的优选活疫苗提供一种遗传稳定的疫苗，其比其他类型的减毒疫苗更容易制备、保存和递送。

[0099] 本发明的另一优选疫苗使用合适的质粒来递送非致病的DNA克隆至猪中。与使用活病毒或者死的细胞培养物繁殖的完整病毒的传统疫苗相比，本发明提供用包含感染性病毒基因组的质粒DNA直接接种猪。

[0100] 本发明所期需的另外的基因工程疫苗由本领域已知的技术产生。这样的技术包括但不限于重组DNA的另外操作、重组蛋白的氨基酸序列的修饰或置换等。

[0101] 基于重组DNA技术的基因工程疫苗例如是通过鉴定编码负责诱导猪中的较强免疫反应或保护性反应的蛋白(例如来源于ORF3、ORF4等的蛋白)的病毒基因的备选部分来制备。这样鉴定的基因或免疫显性片段可被克隆到标准蛋白表达载体(例如杆状病毒载体)中，并用于感染合适的宿主细胞(参见例如, O'Reilly 等“, Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual(杆状病毒表达载体：实验室手册),” Freeman &Co., 1992)。宿主细胞被培养，因此表达所需的疫苗蛋白，疫苗蛋白可被纯化至所需的程度并配制成合适的疫苗产品。

[0102] 如果克隆保留引起疾病的任何不合乎需要的本能，那么查明病毒基因组中负责任何残留毒力的核苷酸序列并通过例如定点诱变来将病毒基因改造为无毒的亦是可能的。定点诱变能够增加、缺失或改变一个或多个核苷酸(参见例如, Zoller 等, DNA 3:479-488, 1984)。合成包含所需突变的寡核苷酸并退火为单链病毒DNA的一部分。将从该步骤得到的杂交分子用于转化细菌。然后，将分离的包含合适突变的双链DNA用于通过与随后转染到合适的细胞培养物中的全长DNA的限制性片段连接来产生全长DNA。将基因组连接到用于转移的合适载体中可通过本领域普通技术人员所知的任何标准技术来实现。可使用任何常规方法将载体转染到用于产生病毒子代的宿主细胞中，所述常规方法例如磷酸钙或DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、原生质体融合和其他公知技术(例如，Sambrook 等, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。克隆的病毒于是显示所需的突变。备选地，可合成包含合适突变的两条寡核苷酸。这些核苷酸可退火来形成可插入到病毒DNA中以产生全长DNA的双链DNA。

[0103] 将免疫有效量的本发明疫苗给予需要针对病毒感染保护的猪。通过常规试验可容易测定或容易滴定接种猪的免疫有效量或免疫原性量。有效量是实现足够的针对疫苗的免疫反应以保护暴露于PCV病毒的猪的量。优选地，保护猪至病毒疾病的一种至全部不良生理症状或作用被显著降低、减轻或完全阻止的程度。

[0104] 可以单剂量或重复剂量给予疫苗。剂量范围可为例如约1微克-约1,000微克的包含感染性嵌合DNA基因组的质粒DNA(取决于疫苗的免疫活性成分的浓度)，优选为100-200微克的嵌合PCV1-2 DNA克隆，但不应该包含足以引起不良反应或病毒感染的生理症状的基于病毒的抗原量。用于测定或滴定活性抗原物质的合适剂量以发现基于猪的体重、抗原的浓度和其他典型因素的最小有效剂量的方法是本领域已知的。优选地，感染性病毒DNA克隆被用作疫苗，或者可在体外产生活的感染性病毒并接着将该活病毒用作疫苗。在这种情况下，例如可将活病毒的约50-约10,000的50%组织培养感染剂量(TCID50)给予猪。

[0105] 本发明的新疫苗不限于任何特定类型或制备方法。疫苗包括但不限于改良的活疫苗、灭活疫苗、亚基疫苗、减毒疫苗、基因工程疫苗等。

[0106] 活疫苗的优点在于激活疫苗受者的所有可能免疫反应，包括全身、局部、体液和细胞介导的免疫反应。活病毒疫苗的缺点在于有被活的外来病毒物质污染的可能或者病毒可在野外回复毒力的风险，该缺点可能超过优点。

[0107] 为了制备灭活的病毒疫苗，例如，可在培养的猪细胞系(例如但不限于PK-15细胞)中发生病毒繁殖和病毒生产。然后通过本领域普通技术人员通常所知的方案或优选通过本文所述的方法来优化连续的病毒灭活。

[0108] 可通过用灭活剂(例如福尔马林或疏水溶剂、酸等)、通过用紫外线或X射线辐射、通过加热等处理猪圆环病毒来制备灭活的病毒疫苗。以本领域理解的方式进行灭活。例如，在化学灭活中，将包含病毒的合适病毒样品或血清样品用足够量或浓度的灭活剂在足够高(或低，取决于灭活剂)的温度或pH下处理足够长的时间以灭活病毒。通过加热灭活是在足以灭活病毒的温度和时间长度下进行。通过辐射灭活是使用一定波长的光或其他能量源辐射足以灭活病毒的时间长度来进行。如果病毒不能感染易受感染的细胞，那么该病毒被认为是灭活的。

[0109] 在本发明中亦是合意的基因工程疫苗由本领域已知的技术来产生。这样的技术包括但不限于使用RNA、重组DNA、重组蛋白、活病毒等。

[0110] 例如，纯化后，可通过本领域已知的方法从合适的临床、生物学样品(例如血清、排泄物、唾液、精液和组织样品)中分离野生型病毒，优选通过本文教导的方法，使用感染的猪或感染的合适细胞系。通过本领域已知的方法从生物纯病毒或传染原提取DNA，并通过本领域已知的方法来纯化，优选通过CsCl梯度超速离心法。通过本领域已知的方法来将病毒基因组的cDNA克隆到合适的宿主中(参见Maniatis 等, id.)，然后分析病毒基因组以确定用于产生病毒抗原部分的基因组的必要区域。其后，步骤通常与改良活疫苗、灭活疫苗或亚基疫苗的步骤相同。

[0111] 例如，通过鉴定编码负责诱导猪的较强免疫反应或保护性反应的蛋白(例如免疫病毒蛋白，如来源于ORF2的衣壳蛋白)的病毒基因的一部分来制备基于重组DNA技术的基因工程疫苗。可将这种鉴定的基因或免疫显性片段克隆到标准蛋白表达载体(例如杆状病毒载体)中，并用于感染合适的宿主细胞(参见例如, O'Reilly  等,“Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual(杆状病毒表达载体：实验室手册),” Freeman &Co., (1992))。宿主细胞被培养，因此表达所需的疫苗蛋白，疫苗蛋白可被纯化至所需的程度并配制成合适的疫苗产品。

[0112] 备选地，可将编码一种或多种衣壳蛋白的来自分离的猪PCV的DNA插入活的载体(例如痘病毒或腺病毒)中并用作疫苗。

[0113] 将免疫有效量的本发明疫苗给予需要针对所述感染或综合征保护的猪或哺乳动物物种。通过常规试验可容易测定或容易滴定“免疫有效量”。有效量是实现足够的针对疫苗的免疫反应以保护暴露于猪TTV病毒的猪或其他哺乳动物的量，猪TTV病毒可引起PCVAD、猪皮炎肾病综合征(PDNS)或相关的疾病。优选地，保护猪或其他哺乳动物物种至病毒疾病的一种至全部不良生理症状或作用被发现显著降低、减轻或完全阻止的程度。

[0114] 可以单剂量或重复剂量给予疫苗。剂量可包含，例如1-1,000微克的基于病毒的抗原(取决于疫苗的免疫活性组分的浓度)，但不应该包含足以引起不良反应或病毒感染的生理症状的基于病毒的抗原量。用于测定或滴定活性抗原物质的合适剂量的方法是本领域已知的，其基于鸟类或哺乳动物的体重、抗原的浓度和其他典型因素。

[0115] 可将疫苗给予猪。同样，可将疫苗给予有高风险被病毒剂感染的人(例如养猪场主)。可口服、颊内、鼻内、经皮、胃肠外等合宜地给予疫苗。胃肠外给予途径包括但不限于肌内、静脉内、腹膜内和皮下途径。

[0116] 当作为液体给予时，可将本疫苗以水性溶液剂、糖浆剂、酏剂、酊剂等的形式制备。这样的制剂是本领域已知的并通过将抗原与其他典型的添加剂溶解在合适的载体或溶剂体系中来典型地制备。合适的载体或溶剂包括但不限于水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油等。典型的添加剂是，例如认证染料(certified dye)、食用香料、甜味剂和抗菌性防腐剂(例如硫柳汞(乙汞硫基水杨酸钠))。可例如通过加入部分水解的明胶、山梨糖醇或细胞培养基来稳定这样的溶液，并可使用本领域已知的试剂(例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、它们的混合物等)，通过常规的方法来缓冲这样的溶液。

[0117] 液体制剂亦可包括混悬剂和乳剂，其包含与其他标准助剂(coformulant)组合的助悬剂或乳化剂。这些类型的液体制剂可通过常规方法来制备。混悬剂例如可使用胶体磨来制备。乳剂例如可使用匀浆器来制备。

[0118] 设计用于注射到体液系统的胃肠外制剂需要合适的等张性和缓冲至哺乳动物体液的相应水平的pH值。可视需要用氯化钠和其他盐来合适地调节等张性。合适的溶剂(例如乙醇或丙二醇)可用于增加制剂中的成分的溶解度和液体制剂的稳定性。可在本疫苗中使用的另外添加剂包括但不限于葡萄糖、常规抗氧化剂和常规螯合剂(例如乙二胺四乙酸) (EDTA)。胃肠外剂型使用之前也必须是无菌的。