一种制备猪圆环病毒的工艺
专利汇可以提供一种制备猪圆环病毒的工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种制备猪 圆环病毒 的工艺，该方法包括制备PK15细胞液、采用 生物 反应器 技术与灌注工艺培养 猪圆环病毒 2型(PCV2)。与 现有技术 相比，本发明具有病毒产量高、操作方便、病毒效价高、操作空间小、工艺参数控制精确等优点，可用以最终提高PCV2 疫苗 免疫原性和研制高效的PCV2疫苗。，下面是一种制备猪圆环病毒的工艺专利的具体信息内容。
1.一种制备猪圆环病毒的工艺，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1)制备密度为2×105个/毫升的PK15细胞液； (2)于7.5升生物反应器内接种5升细胞液，微载体浓度为5mg/ml； (3)加入细胞液体积8％的胎牛血清和1％的双抗，并同步加入10％的猪圆环病毒2型(PCV2)种毒； (4)于37℃培养48小时，生物反应器的参数为：转速50rpm，溶氧量30～60％，二氧化碳浓度5％，pH值7.2； (5)24小时后将生物反应器内的细胞用PBS洗涤三次，加入200mM氨基葡萄糖作用30分钟； (6)弃去氨基葡萄糖，将细胞用PBS洗涤三次； (7)加入细胞生长液继续培养细胞，生物反应器的参数与步骤(4)中相同； (8)24小时后，采用灌注工艺培养10天，灌注体积为2.5升/天，在生物反应器出口处放置4℃冰箱收集病毒； (9)10天后停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒与生物反应器内的病毒混合，于-20℃冻融两次，冻融过程中不停摇晃，得到猪圆环病毒。
2. 根据权利要求1所述的一种制备猪圆环病毒的工艺，其特征在于，所述 的微载体包括Cytodex3。
一种制备猪圆环病毒的工艺
技术领域
20世纪70年代Tischer等首次发现猪圆环病毒（PCV) ， PCV分为PCV1 和PCV2两种基因型，其中PCV2有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合 征（PMWS)，还是育肥猪的猪皮炎和肾病综合征（PDNS)的主要病因，并且 与怀孕母猪的繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤（CT)、增生性和坏死性肺 炎（PNP)的发生密切相关。由于该病属于免疫抑制疾病，可引发严重的继发 感染从而危害猪群健康，是继猪繁殖呼吸道综合征之后又一个严重危害全球养 猪业的重大疾病，在我国规模化猪群中PCV2感染率超过90X。近两年在国际 上已获得批准的猪圆环病毒疫苗有4个，这些疫苗中有的是通过基因工程技术 手段研制得到，也有采用常规病毒培养技术制备得到，但无论哪种技术手段均 获得了严格的国际专利保护，这给研发新型PCV2疫苗设置了较高的门槛。在 我国还未有确实有效并经过农业部批准的PCV2疫苗。
目前国内兽用细胞疫苗的生产基本采用大方瓶和滚瓶技术，这些技术在规 模化生产细胞和病毒时劳动强度高、占地大、批间差异大，难于进行标准化生 产的质量控制。我国兽用疫苗市场中由于批间差异问题和病毒效价不高引起的 质量不稳定的问题时有发生。在细胞疫苗生产行业中大规模生产动物细胞和病 毒是疫苗产业化生产的前提。提高病毒效价和产量，是提升疫苗产业化生产的 必由之路。
生物反应器技术高密度发酵工艺生产细胞和病毒是1970年代新开发的技 术，利用此技术的连续培养工艺生产非裂解型病毒（PCV2属此类病毒）具有 良好的商业开发前景，国际上最成功的例子是狂犬病疫苗，采用该技术可以连 续收获病毒30天以上，病毒效价提高5倍，增加病毒产量5倍以上，成本降低50%。利用生物反应器规模化生产动物细胞和病毒基本上可以克服方瓶和滚 瓶技术的以上缺陷，它具有操作方便、占地小、节省人工、可控程度高、病毒 效价和产量高、易于进行标准化控制，是新一代兽用细胞疫苗生产的必由之路。
目前，国际上采用的技术得到的PCV2的病毒效价在10"左右，还没有解 决猪圆环病毒2型疫苗研究过程中存在的如何提高病毒产量和病毒效价的难点 问题。
发明内容
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 一种制备猪圆环病毒的工 艺，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1) 制备密度为2xl()S个/毫升的PK15细胞液;
(2) 于7.5升生物反应器内接种5升细胞液，微载体浓度为5mg/ml;
(3) 加入细胞液体积8%的胎牛血清和1%的双抗，并同步加入10%的猪 圆环病毒2型（PCV2)种毒；
(4) 于37X:培养48小时，生物反应器的参数为：转速50rpm，溶氧量30〜 60%， 二氧化碳浓度5%， pH值7.2;
(5) 24小时后将生物反应器内的细胞用PBS洗涤三次，加入200mM氨 基葡萄糖作用30分钟；
(6) 弃去氨基葡萄糖，将细胞用PBS洗涤三次；
(7) 加入细胞生长液继续培养细胞，生物反应器的参数与步骤（4)中相
同；
(8) 24小时后，采用灌注工艺培养10天，灌注体积为2.5升/天，在生物 反应器出口处放置4"C冰箱收集病毒；
(9) 10天后停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒与生物反应器内的病 毒混合，于-2(TC冻融两次，冻融过程中不停摇晃，得到猪圆环病毒。
所述的微载体包括Cytodex 3。
与现有技术相比，本发明的制备猪圆环病毒的工艺通过新型生物反应器技术高密度发酵工艺生产细胞和PCV2病毒，提高了 PCV2的病毒效价，从而最 终提高PCV2疫苗免疫原性和研制高效的PCV2疫苗，本发明具有以下优点：
(1) 病毒产量高：以5L工作体积为例，本发明灌注培养工艺可以生产病 毒25L，而传统工艺仅能生产5L病毒；
(2) 操作方便：以5L工作体积为例，本发明灌注培养工艺仅需l人就可 完成全部操作，而传统工艺需要100个大方瓶或滚瓶最少需要4人才能完成， 随着工作体积的增加这就优势更加明显；
(3) 病毒效价高：传统工艺生产的病毒效价仅为104D/ml，而本发明灌注 培养工艺生产的病毒效价可以达到105Q/ml;
(4) 操作空间小：以5L工作体积为例，本发明灌注培养工艺仅需3n^的 操作区域，而传统工艺需要30m2以上的操作区域，随着工作体积的增加这就 优势更加明显；
(5) 工艺参数控制精确：本发明采用生物反应器灌注培养工艺生产时可 控参数有温度、pH值、溶氧量、二氧化碳浓度、转速、载体浓度，可实现在线 监测的参数有葡萄糖、乳酸和铵离子浓度，为实现批次质量的稳定性奠定了基 础，而传统工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异大。
具体实施方式
一种制备猪圆环病毒的工艺，该方法包括以下步骤：
(1) 制备密度为2xl()S个/毫升的Dulac系PK15细胞液；
(2) 于7.5升NBS公司的生物反应器内接种5升细胞液，微载体Cytodex 3浓度为5mg/ml;
(3) 加入细胞液体积8%的胎牛血清和1%的双抗，并同步加入10%的猪 圆环病毒2型（PCV2)种毒；
(4) 于37。C培养48小时，生物反应器的参数为：转速50rpm，溶氧量30〜 60%， 二氧化碳浓度5%， pH值7.2;
(5) 24小时后将生物反应器内的细胞用PBS洗涤三次，加入200mM氨基葡萄糖作用30分钟；
(6) 弃去氨基葡萄糖，将细胞用PBS洗涤三次；
(7) 加入细胞生长液继续培养细胞，生物反应器的参数与步骤（4)中相
同；
(8) 24小时后，采用灌注工艺培养10天，灌注体积为2.5升/天，在生物
反应器出口处放置4t:冰箱收集病毒；
(9) 10天后停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒与生物反应器内的病 毒混合，于-2(TC冻融两次，冻融过程中不停摇晃，得到猪圆环病毒。
取样检测病毒效价（细胞培养和PCR结合法）可达10^/ml细胞感染量。
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