猪圆环病毒2型SYBRGreen荧光PCR诊断试剂盒及其应用
阅读：1016发布：2020-06-24
专利汇可以提供猪圆环病毒2型SYBRGreen荧光PCR诊断试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于检测猪 圆环病毒 2型的 试剂 盒 及其应用，属于分子 生物 学领域。所述的特异性引物组包括：PCV2-Fgggctccagtgctgttattc SEQIDNO：1；PCV2-Rtagcgggagtggtaggagaa SEQIDNO：2。本发明应用 荧光 PCR的原理，建立了 猪圆环病毒 2型的SYBR Green荧光PCR检测方法。该试剂盒具有特异性强、敏感性高、 稳定性 好等特点，适合进行高通量样品的分析。，下面是猪圆环病毒2型SYBRGreen荧光PCR诊断试剂盒及其应用专利的具体信息内容。
1.一种用于检测猪圆环病毒2型的特异性引物组，其特征在于：
PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQ ID NO：1
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO：2。
2.一种含有权利要求1所述猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于它是由下述成分组成：
（1）荧光PCR反应液：
每个反应液中含有：
Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μL
阳性对照标准品：含有圆环病毒2型CAP基因的克隆质粒PMD-18T-CAP,质粒的最终浓
10
度为1×10 拷贝/μL；
阴性对照标准品：猪圆环病毒2型阴性猪的组织DNA，通过PCR检测为阴性的样本。
3.一种采用权利要求2所述试剂盒进行猪圆环病毒2型的检测方法，其特征在于：按如下的步骤进行：
（1）扩增反应体系：在反应体系中加入样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL体系；
（2） 扩增反应过程：在荧光PCR仪上，95℃预变性 3min；95℃变性 10s，63℃退火/延伸30s，共40 个循环；
（3）扩增反应结束，根据荧光定量PCR分析软件的数据确定检测样品是否含有猪圆环病毒2型。
4.权利要求1所述用于检测猪圆环病毒2型的特异性引物组在制备用于检测猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒中的应用。
猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 猪圆环病毒(Porcine circovirus ,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属的成员，根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列可将其分为PCV1和PCV2两个基因型。PCV1广泛存在于猪源肾细胞中，人们广泛认为PCV1不具有感染性；而PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎-肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、母猪流产与繁殖障碍等密切相关, 常发生混合感染造成猪的免疫失败。目前，该病在世界各主要养猪国家均有发生，给养猪业造成了十分严重的经济损失。迄今，国内外学者已经建立了病毒分离鉴定、PCR、间接免疫荧光（IFA）、免疫组化（IHA）等多种方法用于PCV2的检测，但以上方法都不能对PCV2 进行定量检测。实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR)是近几年发展起来的一种新的核酸检测技术，该技术可实现对病毒的实时定量检测，己在人类和畜禽传染病的诊断中得到越来越广泛的应用。
发明内容
[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于检测猪圆环病毒2型的特异性引物组，其特征在于：PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQ ID NO：1
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO：2
（1）它是针对猪圆环病毒2型CAP基因的保守区域设计的。
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO：2
（1）它是针对猪圆环病毒2型CAP基因的保守区域设计的。
[0005] （2）可检测出猪圆环病毒2型。
[0006] 本发明的另一个目的是提供含有上述引物组的试剂盒。所述的试剂盒包括：（1）荧光PCR反应液：
每 个 反 应 液 中 含 有：Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，
PCV2-F引物(10 μmol/L )1μL，PCV2-R 引物(10 μmol/L)1μ L。
每 个 反 应 液 中 含 有：Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，
PCV2-F引物(10 μmol/L )1μL，PCV2-R 引物(10 μmol/L)1μ L。
[0007] （2）用于试剂盒的引物为：PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQ ID NO：1
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO：2
（3）阳性对照标准品：含有圆环病毒2型CAP基因的克隆质粒PMD-18T-CAP,质粒的最
10
终浓度为1×10 拷贝/μL；
（4）阴性对照标准品：猪圆环病毒2型阴性猪的组织DNA，通过PCR检测为阴性的样本。
PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa SEQ ID NO：2
（3）阳性对照标准品：含有圆环病毒2型CAP基因的克隆质粒PMD-18T-CAP,质粒的最
10
终浓度为1×10 拷贝/μL；
（4）阴性对照标准品：猪圆环病毒2型阴性猪的组织DNA，通过PCR检测为阴性的样本。
[0008] 本发明所述用于检测猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤：（1）待检样品的DNA提取
（2）荧光PCR检测：根据待检样品的数量将荧光定量PCR反应液分装到PCR管中，每管
12.5μL；PCR管中加入样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL体系；并设立阳性对照、阴性对照和空白对照的荧光PCR检测。
（2）荧光PCR检测：根据待检样品的数量将荧光定量PCR反应液分装到PCR管中，每管
12.5μL；PCR管中加入样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL体系；并设立阳性对照、阴性对照和空白对照的荧光PCR检测。
[0009] （3） 扩增反应过程：PCR管放入荧光PCR仪，扩增程序为95℃预变性 3min；95℃变性 10s，63℃退火/延伸30s，共40个循环。
[0010] （4）结果判定：动力学曲线呈指数扩增，Ct值≤34，且阴性和空白对照无扩增，阳性对照成立，检测样品的Tm值在81℃至82℃之间，判定为猪圆环病毒2型阳性。
[0011] 本试剂盒的荧光PCR优化过程：（1） 引物浓度的优化将引物PCV2-R，PCV2-F稀释至浓度均为 10μmol/L，分别取
0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL的上下游引物，以标准品质粒为模板，采用矩阵法，进行荧光 PCR扩增，结果表明：当PCV2-F和PCV2-R均为1μl时，对质粒标准品的检测可获得较小的Ct值和较大的△Rn值。
0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL的上下游引物，以标准品质粒为模板，采用矩阵法，进行荧光 PCR扩增，结果表明：当PCV2-F和PCV2-R均为1μl时，对质粒标准品的检测可获得较小的Ct值和较大的△Rn值。
[0012] （2） 循环条件的优化为了获得荧光PCR引物的最佳工作条件，使用筛选的最佳引物工作浓度，分别按照以下程序进行PCR反应，每个样品作3个平行重复，同时以无菌三蒸水作空白对照。
[0013] 两步法：95℃预变性 10s；94℃变性 5s，60℃退火/延伸20s，共40 个循环。
[0014] 三步法：95℃预变性 10s；95℃变性 5s，55℃退火20s，72℃延伸15s，共40 个循环。反应特异性较低时，可适当提高退火/延伸温度（~66℃），扩增效率较差时，可适当延长退火/延伸时间（~30s)。结果表明，双温循环及退火温度为63℃为最佳的循环条件。
[0015] 本发明进一步公开了用于检测猪圆环病毒2型的特异性引物组在制备用于检测猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒中的应用。实验结果表明：所建立的荧光定量PCR检测方法的检出率比传统PCR方法的检出率高，说明其敏感性更好。
[0016] 本发明公开的用于检测猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果在于：（1）本发明的试剂制备简单、方法简便快捷，特异性强，敏感性好，可以区分猪圆环病毒
1型和2型。
1型和2型。
[0018] 图1为试剂盒特异性试验结果；自左向右，依次为从左至右的曲线依次为阳性对照、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪流感病毒H3N2亚型（SIV）、猪瘟病毒（CSFV）及阴性对照，直线为空白对照水；9 8 7
图2为试剂盒敏感性试验结果；从左至右依次为6.84×10、6.84×10、6.84×10、
6 5 4 3 2
6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10拷贝/μl质粒标准品，直线为6.84拷贝/μl质粒准品和空白对照；
9 8 7
图3为常规PCR敏感性试验结果；从左至右依次为6.84×10、6.84×10、6.84×10、
6 5 4 3 2
6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10拷贝/μl质粒标准品，直线为6.84拷贝/μl质粒准品B：空白对照，M：TaKaRa Marker 100bp。
图2为试剂盒敏感性试验结果；从左至右依次为6.84×10、6.84×10、6.84×10、
6 5 4 3 2
6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10拷贝/μl质粒标准品，直线为6.84拷贝/μl质粒准品和空白对照；
9 8 7
图3为常规PCR敏感性试验结果；从左至右依次为6.84×10、6.84×10、6.84×10、
6 5 4 3 2
6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10、6.84×10拷贝/μl质粒标准品，直线为6.84拷贝/μl质粒准品B：空白对照，M：TaKaRa Marker 100bp。
具体实施方式
[0019] 为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测猪圆环病毒2型荧光定量PCR试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用的试剂原料均有市售。本发明所述的猪圆环病毒2型引物组序列见表1。
[0020] 对照毒株包括：猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流感病毒H3N2亚型（SIV.）表1
PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQIDNO：1
PCV2-R Tagcgggagtggtaggagaa SEQIDNO：2
表2 对照毒株来源
菌种名称 亚型 来源
猪圆环病毒（PCV1） 1型 哈尔滨兽医研究所赠送
猪圆环病毒（PCV2） 2型 美国明尼苏达大学赠送
伪狂犬病毒（PRV） 购自中国兽药监察所
猪细小病毒（PPV） 购自中国兽药监察所
猪蓝耳病病毒（PRRSV） 美洲型 美国明尼苏达大学赠送
猪瘟病毒（CSFV） 市售猪瘟兔化弱毒疫苗株
猪流感病毒（SIV） H3N2亚型 美国明尼苏达大学赠送
实施例1
1、猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒特异性试验：
（1）对照毒株包括：猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流感病毒H3N2亚型（SIV）
（2）病毒DNA提取：采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书。
PCV2-F gggctccagtgctgttattc SEQIDNO：1
PCV2-R Tagcgggagtggtaggagaa SEQIDNO：2
表2 对照毒株来源
菌种名称 亚型 来源
猪圆环病毒（PCV1） 1型 哈尔滨兽医研究所赠送
猪圆环病毒（PCV2） 2型 美国明尼苏达大学赠送
伪狂犬病毒（PRV） 购自中国兽药监察所
猪细小病毒（PPV） 购自中国兽药监察所
猪蓝耳病病毒（PRRSV） 美洲型 美国明尼苏达大学赠送
猪瘟病毒（CSFV） 市售猪瘟兔化弱毒疫苗株
猪流感病毒（SIV） H3N2亚型 美国明尼苏达大学赠送
实施例1
1、猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒特异性试验：
（1）对照毒株包括：猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流感病毒H3N2亚型（SIV）
（2）病毒DNA提取：采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书。
[0021] （3）病毒RNA提取：采用常规TRizol方法提取病毒RNA，并反转录为cDNA。
[0022] 2、扩增反应：（1）试剂：Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX由Invitrogen公司生产；PCV2-F引物，PCV2-R引物
（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：
Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μ L，样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL。
（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：
Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μ L，样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL。
[0023] （3）扩增反应过程：在荧光PCR仪上，95℃预变性 3min；95℃变性 10s，63℃退火/延伸30s，共40个循环；（4）特异性检测结果表明，经荧光定量PCR 检测， PCV2有特异性扩增曲线且在15个循环前出现，而检测 PRRSV、PCV1、PPV、PRV、SIV及CSFV均在34个循环后有扩增曲线，表明该方法具有良好的特异性，见图1。
[0024] 实施例21、猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒敏感性试验:
（1）标 准 品 制 备：将 克 隆 质 粒PMD-18T-CAP进 行 10 倍 梯 度 稀 释，取
9 0
6.84×10~6.84×10 拷贝/μL数量级的标准品作为模板，同时设空白对照，分别进行荧光定量 PCR 实验和常规PCR，测定两种方法的敏感性。
（1）标 准 品 制 备：将 克 隆 质 粒PMD-18T-CAP进 行 10 倍 梯 度 稀 释，取
9 0
6.84×10~6.84×10 拷贝/μL数量级的标准品作为模板，同时设空白对照，分别进行荧光定量 PCR 实验和常规PCR，测定两种方法的敏感性。
[0025] 2、扩增反应：（1）试剂：Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX由Invitrogen公司生产；PCV2-F引物，PCV2-R引物；
（2）荧光PCR反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：
Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μL，质粒DNA模板1μL，加水补充至25μL。
（2）荧光PCR反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：
Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μL，质粒DNA模板1μL，加水补充至25μL。
[0026] 荧光PCR扩增过程：95℃预变性 3min；95℃变性 10s，63℃退火/延伸30s，共40 个循环。
[0027] （3）常规PCR反应体系：10×PCR buffer （含Mg2+）2μL，dNTP 2μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μL，taq DNA聚合酶0.5μL，质粒DNA模板1μL，加水补充至20μL。
[0028] 常规PCR扩增过程：95℃预变性 3min；95℃变性 30s，63℃ 30s，72℃ 30s，共35 个循环；72℃ 10min；4℃ pause。
[0029] （4）敏感性结果表明：荧光定量 PCR检测 PCV2 的敏感性（6.84×10拷贝/μl）4
比普通 PCR的敏感性（6.84×10 拷贝/μl）高 3个数量级，即灵敏1000倍。见图 2和图
3。
比普通 PCR的敏感性（6.84×10 拷贝/μl）高 3个数量级，即灵敏1000倍。见图 2和图
3。
[0030] 实施例3临床样品的检测
1、临床样品采集：
（1）采集临床发病猪的脾脏、淋巴结等脏器，分别在灭菌的乳钵内剪碎，充分研磨后用Hank′s液稀释成5倍混悬液，4℃4000r/min离心30min，取上清液，按DNA提取试剂盒说明书提取组织中的病毒DNA。
1、临床样品采集：
（1）采集临床发病猪的脾脏、淋巴结等脏器，分别在灭菌的乳钵内剪碎，充分研磨后用Hank′s液稀释成5倍混悬液，4℃4000r/min离心30min，取上清液，按DNA提取试剂盒说明书提取组织中的病毒DNA。
[0031] （2）采集临床发病猪的血清样品，按DNA提取试剂盒说明书提取组织中的病毒DNA。
[0032] 2、荧光PCR检测：（1）试剂：Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX由Invitrogen公司生产PCV2-F引物，PCV2-R引物，
（2）扩增反应体系：每个反应液中含有：Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μL，样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL体系。
（2）扩增反应体系：每个反应液中含有：Platinum® SYBR®Green qPCR SuperMix-UDG with ROX (2×)12.5 μL，PCV2-F(10 μmol/L )1μL，PCV2-R (10 μmol/L)1μL，样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL体系。
[0033] （3）扩增反应过程：95℃预变性 3min；95℃变性 10s，63℃退火/延伸30s，共40 个循环；3、结果判定：
（1）阴性和空白对照：Ct值为0 。
（1）阴性和空白对照：Ct值为0 。
[0034] （2）阳性对照：Ct值应≤30。
[0035] （3）待检样品：Ct值≤34，Tm值在81℃与82℃之间，判定为猪圆环病毒2型阳性。
[0036] 4、临床样品的结果表明：30份临床疑似PCV2感染病例的病料样品分别取自脑、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、肠道和淋巴结等组织和器官，检测结果表明，实时荧光PCR方法检测出26份为阳性样品，所建立的荧光定量PCR检测方法的检出率比传统PCR方法的检出率高36.7%，说明其敏感性更好，见表1。
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