猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒
阅读：952发布：2020-05-14
专利汇可以提供猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种猪 圆环病毒 2型LAMP 诊断 试剂 盒 ，它包括250μL 的LAMPmix缓冲液，20μL Bst DNA聚合酶，150μL超纯 水 ，40μL浓度为40pmol/L的混合内引物1和内引物2及40μL浓度为5pmol/L的混合外引物1和外引物2，20μL阴性对照以及20μL阳性对照；根据GenBank中的 猪圆环病毒 2型（PCV-2）ORF2基因序列，设计合成2对引物，通过对LAMP条件的优化，敏感性、特异性试，建立猪圆环病毒2型LAMP诊断方法，为猪圆环病毒2型的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法，从而满足 基层 现场快速检疫需要。，下面是猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，其特征在于：它包括250μL 的LAMPmix缓冲液，
20μL浓度为0.5U/μL的 Bst DNA聚合酶，150μL超纯水，内引物1及内引物2的体积均为40μL，浓度均为40pmol/L，外引物1和外引物2的体积均为40μL，浓度均为5pmol/L， 20μL阴性对照以及20μL阳性对照；外引物1的序列为：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，；外引物2的序列为：
5 ，- G C C C C A C A A T G A C G T G T A C - 3 ，；内 引 物 1 的 序 列 为 ：5 ，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；内引物2的序列为：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，其特征在于：阳性对照为猪圆环病毒2型毒株DNA。
4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，其特征在于：LAMP mix缓冲液中包括3 mmol/ul的MgCl2，500pmol/ul的 dNTP 2.0μL以及25mmol/μL的Tris-HCl，其PH值为8.3。
猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 猪圆环病毒2型是目前发现的最小的动物病毒，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、怀孕母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪呼吸道疾病、猪皮炎和肾炎综合征、幼龄仔猪先天性震颤等疾病，给我国养猪生产造成了较大的经济损失。
[0003] 目前，主要的检测方法有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA、PCR方法。而且常规的病原学分离和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足，PCR方法则需要昂贵的PCR仪。环介导等温扩增针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，也不需要昂贵PCR仪，只需要很简单的设备，如水浴锅或保温杯。
发明内容
[0004] 本发明的目的是：提供一种猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，它可以快速检测猪圆环病毒2型，并且简便、灵敏、准确、特异性强。
[0005] 本发明是这样实现的：猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，它包括250μL 的LAMPmix缓冲液，20μL浓度为0.5U/μL的 Bst DNA聚合酶，150μL超纯水，内引物1及内引物2的体积均为40μL，浓度均为40pmol/L，外引物1和外引物2的体积均为40μL，浓度均为5pmol/L， 20μL阴性对照以及20μL阳性对照；外引物1的序列为：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，；外引物2的序列为 ：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，；内引物1的序列为 ：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；内引物2的序列为：5，-
AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，。
AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，。
[0006] 阴性对照为超纯水。
[0007] 阳性对照为猪圆环病毒2型毒株DNA。
[0008] LAMP mix缓冲液中包括3 mmol/ul的MgCl2，500pmol/ul的 dNTP 2.0μL以及25mmol/μL的Tris-HCl，其PH值为8.3。
[0009] 本试剂盒根据GenBank中的猪圆环病毒2型（PCV-2）ORF2基因序列，设计合成2对引物，通过对LAMP条件的优化，敏感性、特异性试，研发猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，为猪圆环病毒2型的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法，从而满足基层现场快速检疫需要。
[0010] 为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验：
[0011] 猪圆环病毒2型LAMP诊断方法的建立
[0012] 1 材料与方法
[0013] 1.1 病毒
[0014] PRV闽-1株、PCV-1、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株F114、PRRSV美洲株 CH-1a株均由贵州省畜禽重大疫病防制重点实验室保存。
[0015] 主要试剂
[0016] TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、硅胶模型TMPCR纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒、环介导等温扩增法荧光检测试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司；Goldview、Tris、EDTA、DL2000、TaqDNA Polymerase（1U/μL）及相应10×TaqBuffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司。
[0017] 引物设计
[0018] 根据GenBank中的猪圆环病毒2型（PCV-2）ORF2基因序列，根据LAMP引物设计的原则，用在线PrimerExplorer 4.0软件在这些序列的保守区域设计4条特异性引物，包括外引物和内引物(F3、B3、FIP、BIP)。引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。
[0019] F3：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，;B3：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，[0020] FIP：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，
[0021] BIP：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，
[0022] 1.4 病毒核酸的抽提
[0023] 临床样品：取0.1g病猪淋巴结加入0.5mL 0.1mol/L PBS -80℃反复冻融3次，研磨制成悬液，然后转移至1.5 mL离心管中。12000 r/ min离心5min，取上清液用于病毒核酸的提取。PRV、PCV-1、PCV-2、PPV、CFSV、PRRSV美洲株病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于－70℃保存。
[0024] 反应条件的优化
[0025] 对LAMP反应条件，反应温度（60℃、63℃、65℃），反应时间（30min、45min、60min），F3、B3引物浓度（5pmol/L、10pmol/L、20 pmol/L），FIP、BIP引物浓度（20pmol/L、40pmol/L、80 pmol/L），进行优化，以确定最佳反应条件，同时以ddH2O作为空白对照。LAMP反应在25 μL反应体系中进行，引物F3、B3 2μL（5pmol/L、10pmol/L、20 pmol/L）、引物4μL FIP、BIP（20pmol/L、40pmol/L、80 pmol/L），Bst DNA聚合酶（0.5U、1U、2U），LAMP反应缓冲液12.5μL，模板1μL，加入环介导等温扩增法荧光检测试剂盒中荧光显色液1μL，用ddH2O补足至25 μL。
反应条件为：反应温度（60℃、63℃、65℃）30min，94℃灭活2min。扩增产物用肉眼在日光下直接观察，或在紫外光下进行观察。扩增产物送宝生物（大连）工程有限公司测序。
反应条件为：反应温度（60℃、63℃、65℃）30min，94℃灭活2min。扩增产物用肉眼在日光下直接观察，或在紫外光下进行观察。扩增产物送宝生物（大连）工程有限公司测序。
[0026] 敏感性试验
[0027] 应用PCV-2 ORF2基因F3、B3引物进行PCR扩增，将扩增的PCR产物用硅胶模型TMPCR纯化试剂盒回收DNA片段，与pMD18-T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD18T-PCV-2。通过质粒DNA小量提取试剂盒抽取重组菌体质粒，酶切和PCR鉴定。用该重组菌体质粒核酸用核酸蛋白仪测定浓度后，经10倍系列稀释的病毒核酸用于LAMP、PCR反应，以确定建立的LAMP反应的敏感性。
[0028] 特异性试验
[0029] 以PRV、PCV-1、PCV-2、PPV DNA为模板分别进行LAMP反应，CFSV、PRRSV病毒反转录为cDNA进行LAMP反应，用ddH2O作为空白对照，以确定建立的LAMP反应的特异性。
[0030] 重复性试验
[0031] 应用建立LAMP方法，重复检测PCV-2 DNA 3次以检验结果的可靠性。
[0032] 对临床样品的检测
[0033] 对2012年至2013年贵州省贵阳市养猪场和养猪专业户采集的95份病料应用建立的LAMP诊断方法进行检测，同时应用PCR诊断方法进行检测。
[0034] 结果
[0035] 2.1 LAMP检测方法的建立
[0036] LAMP检测方法反应在25 μL反应体系中最佳反应条件为，反应温度63℃，反应30min，94℃灭活2min。引物F3、B3（5pmol/L）各1μL，引物FIP、BIP（40pmol/L）各2μL，Bst DNA聚合酶（1U）1μL，LAMP反应缓冲液12.5μL，模板1μL，加入环介导等温扩增法荧光检测试剂盒中荧光显色液1μL，用ddH2O补足至25 μL。反应结束后，在紫外光下，阳性反应管颜色变为绿色，阴性反应管不发生颜色变化，为无色（图1）。扩增产物送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段为PCV-2的特异性条带。
[0037] 敏感性试验
[0038] 用该重组菌体质粒核酸用核酸蛋白仪测定浓度后，经10倍系列稀释的病毒核酸用于LAMP、PCR反应，建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为0.30 pg/ L（图2），而PCR诊断方法最低核酸检测量为30 pg/L（图3）。
[0039] 特异性试验
[0040] 以PRV、PCV-1、PCV-2、PPV DNA为模板分别进行LAMP反应，CFSV、PRRSV病毒反转录为cDNA进行LAMP反应，PRV、PCV-1、PPV DNA；CFSV、PRRSV cDNA为紫外光下均为无色，而PCV-2 DNA 显示为绿色（见图4）。
[0041] 重复性试验
[0042] 应用建立的LAMP方法，重复检测PCV-2 DNA样品3次，结果均一致。
[0043] 对临床样品的检测
[0044] 2012年至2013年贵州省贵阳市养猪场和养猪专业户采集的95份病料应用建立的LAMP诊断方法进行检测，95份病料中有24份为阳性，阳性率为25.2%（24/95）。同时应用PCR诊断方法进行检测，95份病料中有23份为阳性，阳性率为22.1%（23/95）。建立的PCV-2 LAMP诊断方法与PCR诊断方法符合率为95.8%。
[0045] 讨论
[0046] 目前检测猪圆环病毒2型病毒的方法很多，如电镜观察、病毒分离、接种试验、血清学、琼脂免疫扩散法，但这些方法费事费力。传统的PCR、荧光定量PCR需要昂贵的专业设备，虽然我国县级畜牧兽医站基本都配备了PCR检测相关仪器设备，且操作技术要求高。环介导等温扩增法的技术优势除了高特异性、高灵敏度外，操作简单，使用水浴锅或保温杯就能实现反应，不需要像PCR那样进行凝胶电泳。
[0047] 何选民等建立的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法其敏感度可以达到10个拷贝的DNA 分子，LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率符合率为94%，其在反应结束后，加入2 μL SYBR Green I荧光染料，在紫外光下进行结果判定。但LAMP的反应产物开盖后，易形成气溶胶，容易污染实验室，如果试剂、移液器、枪头、超净台等受到污染，将会出现假阳性，这对用于生产实践造成不利影响，限制了它的应用范围。所以需在反应前加入适合的染料。SYBR Green I在反应前加入容易影响LAMP反应，本研究在反应前将钙黄绿素染料加入反应体系中，反应完成后阳性管在紫外光下颜色变成绿色，而阴性管由于没有产物，依然无颜色变化。
[0048] 建立LAMP诊断方法的关键是引物的设计。引物GC含量最好介于50%～60%。所有引物的3，FIP、BIP的5，自由能改变值(△G)需小于﹣4，△G越小，引物与模板之间的反应越容易发生。本发明根据猪圆环病毒2型(PCV-2) ORF2基因序列，设计2对引物，通过反应条件的优化，建立LAMP诊断方法。结果表明，敏感性结果显示，建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为0.3 pg/ L，而PCR诊断方法最低核酸检测量为30pg/L，LAMP比普通PCR灵敏度高100倍。对95份自然感染病猪样品的检测结果表明，该LAMP方法检测结果与PCR检测结果符合率为
95.8%，表明建立的诊断方法适合基层现场快速检疫。
附图说明
95.8%，表明建立的诊断方法适合基层现场快速检疫。
附图说明
[0049] 图1 为LAMP检测方法的建立；
[0050] 图1中，1：PCV2 LAMP产物；2：阴性对照；
[0051] 图2为PCV-2 LAMP敏感试验；
[0052] 图2中，1～6：3.0 ng/L×100～10－5稀释的病毒DNA LAMP结果；
[0053] 图3为PCV-2 PCR敏感试验；
[0054] 图3中，M: D2000；1～8：30 mg/L×100～10－7稀释的病毒DNA PCR结果；
[0055] 图4为PCV2 LAMP特异性试验；
[0056] 图4中，1：PCV-2 LAMP产物；2：PRV LAMP产物；3：PCV-1 LAMP产物；4: PPV LAMP产物；
[0057] 5: CFSV LAMP产物；6: PRRSV LAMP产物。
具体实施方式
[0058] 本发明的实施例：猪圆环病毒2型LAMP诊断试剂盒，它包括250μL 的LAMPmix缓冲液，20μL浓度为0.5U/μL的 Bst DNA聚合酶，150μL超纯水，内引物1及内引物2的体积均为40μL，浓度均为40pmol/L，外引物1和外引物2的体积均为40μL，浓度均为5pmol/L， 20μL阴性对照以及20μL阳性对照；外引物1的序列为：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，；外引物2的序列为 ：5 ，- G C CC C AC A AT G AC G TG T A C- 3，；内 引物 1的 序列 为 ：5 ，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；内引物2的序列为：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，；阴性对照为超纯水；阳性对照为猪圆环病毒2型毒株DNA；LAMP mix缓冲液中包括3 mmol/ul的MgCl2，500pmol/ul的 dNTP 2.0μL以及25mmol/μL的Tris-HCl，其PH值为8.3。
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