重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白
阅读：513发布：2020-05-18
专利汇可以提供重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发提供了用大肠杆菌系统原和昆虫杆状病毒系统生产的重组改构猪 圆环病毒 衣壳蛋白。它们可被用作 抗原 制成 疫苗 ，诱导对 猪圆环病毒 特别是2型b亚类猪圆环病毒(PCV2b)的免疫 力 ，在接种后可 预防 或减轻猪圆环病毒相关性 疾病 。此外，它们也能被用来检测猪圆环病毒特别是2型b亚类圆环病毒的特异性 抗体 。，下面是重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白专利的具体信息内容。
1.一种具有如序列表<400>2所示的脱氧核糖核酸分子。
2.一种具有如序列表<400>3所示的改构圆环病毒衣壳蛋白，它由如权利要求1所述脱氧核糖核酸分子编码。
3.如权利要求2所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，它含有两个氨基酸序列相同的肽段，其中一个肽段取代了圆环病毒衣壳蛋白的诱骗表位。
4.如权利要求3所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，其中的诱骗表位也可被也可被圆环病毒衣壳蛋白上的其它肽段或任一肽段取代。
5.如权利要求1，2，3，4所述的重组蛋白，可作为抗原被配制成疫苗来预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病。
6.如权利要求1，2，3，4所述的重组蛋白，它作为抗原来检测圆环病毒特别是PCV2b特异性抗体，其特点是可排除圆环病毒衣壳蛋白诱骗抗体的干扰。
7.一种具有如序列表<400>5所示的脱氧核糖核酸分子。
8.一种具有如序列表<400>6所示所示的改构圆环病毒衣壳蛋白，由权利要求7所述脱氧核糖核酸分子编码。
9.如权利要求8所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，它含有两个序列相同的肽段，其中一个肽段取代了圆环病毒衣壳蛋白的诱骗表位。
10.如权利要求8所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，其中的诱骗表位也可被也可被圆环病毒衣壳蛋白上的其它肽段或任一肽段取代。
11.如权利要求7，8，9，10所述的重组蛋白，可作为抗原被配制成疫苗来预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病。
12.如权利要求7，8，9，10所述的重组蛋白，它作为抗原来检测圆环病毒特别是PCV2b特异性抗体，其特点是可排除圆环病毒衣壳蛋白诱骗抗体的干扰。
13.如权利要求2，3，4，8，9，10所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，它们可在大肠杆菌、昆虫杆状病毒系统生产，也可在酵母和哺乳动物细胞系统生产。
14.如权利要求2，3，4，8，9，10所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，它们的编码基因可被克隆到具有生物功能的质粒载体或病毒载体上制成疫苗来预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病。
15.如权利要求2，3，4，8，9，10所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，用它们制成的疫苗可和猪圆环病毒疫苗或其它猪用疫苗联合应用。
16.如权利要求2，3，4，8，9，10所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，它们可用佐剂和药学可接受的载体配成疫苗或疫苗组合物来预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病。
17.如权利要求16所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，在被用于预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病时使用免疫有效剂量(immunologically effective amount)。
18.如权利要求16，17所述的改构圆环病毒衣壳蛋白，在被用于预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病时可经腹腔、肌肉、皮下、皮内等给药途径应用。
重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白
技术领域：
背景技术
[0002] 猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是无包膜、单股负链环状DNA病毒[Tischer I，et al.Nature.1982Jan 7；295(5844)：64-6]，包括PCV1和PCV2[Allan G，2012]两个型。PCV1对猪无致病性，PCV2是猪圆环病毒相关性疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的病原体，可在世界范围内引起PCVAD。PCVAD也被称为猪圆环病毒疾病(porcine circovirus disease，PCVD)或断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。PCVAD是猪的系统性的疾病，可累及呼吸系统(引起肺炎)、肠道(引起肠炎)、皮肤(引起坏死性皮炎)、肾脏(引起肾病综合征)和生殖系统[Opriessnig T，et al.J Vet Diagn Invest.2007Nov；19(6)：591-615；
Segalés J.et al.Res Vet Sci.2012Dec；93(3)：1231-40]，也可表现为消耗、淋巴结肿大、黄疸和体重下降。PCV2能破坏猪的淋巴组织，造成淋巴组织缺失。淋巴组织缺失是PCVAD的一种标志性病理变化[Ramamoorthy S，et al.Anim Health Res Rev.2009Jun；10(1)：1-
20]。PCVAD的另一特征是发生免疫功能缺陷[Darwich L，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：61-7；Meng XJ.Annu Rev Anim Biosci.2013Jan；1：43-64]。这种免疫缺陷使感染PCV2的猪易伴发多种病原体感染，这些病原体包括原虫、真菌、细菌和病毒等[Opriessnig T，et al.Vet Microbiol.2012Jul 6；158(1-2)：69-81]。
Segalés J.et al.Res Vet Sci.2012Dec；93(3)：1231-40]，也可表现为消耗、淋巴结肿大、黄疸和体重下降。PCV2能破坏猪的淋巴组织，造成淋巴组织缺失。淋巴组织缺失是PCVAD的一种标志性病理变化[Ramamoorthy S，et al.Anim Health Res Rev.2009Jun；10(1)：1-
20]。PCVAD的另一特征是发生免疫功能缺陷[Darwich L，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：61-7；Meng XJ.Annu Rev Anim Biosci.2013Jan；1：43-64]。这种免疫缺陷使感染PCV2的猪易伴发多种病原体感染，这些病原体包括原虫、真菌、细菌和病毒等[Opriessnig T，et al.Vet Microbiol.2012Jul 6；158(1-2)：69-81]。
[0003] PCV2有PCV2a和PCV2b两个基因型。近10年来，在世界范围内流行的PCV2经历了从以PCV2a为主要感染基因型到以PCV2b为主要感染基因型的漂变(shift)[Trible BR，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：68-77]。
[0004] PCV2主要通过猪呼吸道、消化道和泌尿道分泌物传播[Rose N，et al.Vet Microbiol.2012May25；157(1-2)：152-63]。
[0005] PCV2感染可使猪的免疫功能紊乱，表现为免疫功能低下，也可表现为免疫功能亢进(hyperimmunoreactivity)。在发生PMWS的个体，其B细胞和T细胞可被清除殆尽，使其不能产生PCV2保护性抗体[Chae C.Vet.J.2004 168：41-49]；在发生皮炎和肾病综合征的猪可出现免疫复合物在皮肤和肾脏的大量沉积[Chae C.Vet.J.2005 169：326-336]。
[0006] PCV2的基因组有三个开放阅读框架(open reading frame，ORF)：ORF1、ORF2和ORF3。ORF2编码衣壳蛋白(capsid protein，CP)。PCV1和PCV2的ORF2之间序列的同源性为67％[Allan G，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：4-9]。CP是PCV2的唯一结构蛋白，可自组装成病毒样颗粒(Virus like particles，VLPs)。CP可被用作PCV2疫苗的抗原。
[0007] PCV2疫苗可以诱导针对PCV的保护性免疫反应，预防或减轻PCVAD(Fachinger et al.Vaccine.2008Mar10；26(11)：1488-99； et al.Vaccine.2008Jun 25；26(27-28)：3443-51；Segal é s et al.Vaccine.2009Dec 9；27(52)：7313-21；Pejsak et al.Pol J Vet Sci.2012；15(1)：37-42]。已有的商品化PCV疫苗是PCV2a疫苗，包括PCV2a灭活疫苗、PCV2a全长衣壳蛋白亚单位疫苗和灭活的减毒PCV1-2a嵌合病毒疫苗[Beach NM，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：33-42]。PCV1-2a嵌合病毒是采用PCV1的基因骨架和PCV2a衣壳蛋白基因制成的病毒。处于研制阶段的PCV2b疫苗有多种[Beach NM，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：33-42]，包括经反复传代或基因修饰获得的PCV2b减毒病毒疫苗、PCV1-2b嵌合病毒疫苗、携带嵌合PCV1-2基因组的质粒DNA疫苗、PCV2衣壳蛋白细菌噬菌体展示疫苗、PCV2衣壳蛋白展示杆状病毒载体疫苗、PCV2衣壳蛋白伪狂犬病毒载体疫苗、PCV2衣壳蛋白腺病毒载体疫苗和PCV2衣壳蛋白支气管鲍特杆菌(Bacterium Bordetella bronchiseptica)载体疫苗。
[0008] 由PCV2ORF2-编码的衣壳蛋白(CP)诱导出的免疫力可以抵抗PCV2的攻击，这种免疫力主要由PCV2的中和抗体(neutralizing antibodies，NA)介导[Blanchard P，et al.Vaccine 2003；21：4565-75；Segale′s J.Expert Rev.Vaccines 2015 14(3)，473-487]。
[0009] 在筛查PCV2感染和检测PCV2疫苗效力时，多根据猪血循环中PCV2总抗体(total anti-PCV2antibodies，TA)的水平来判定。TA是PCV2特异性抗体。田间观察和临床研究表明，在高滴度TA存在的 情况下，PCV2仍可在宿主的组织和血液中存在[ guez-Arrioja GM，et al.Am J Vet Res2002；63：354-7；Larochelle R，et al.Can J Vet Res 2003；67：114-20；Sibila M，et al.Am J Vet Res2004；65：88-92；McIntosh Ka，et al.Can J Vet Res 2006；70(1)：58-61；Segale′s J.Expert Rev.Vaccines 2015 14(3)，473-487]。这说明，在这类高滴度TA中缺乏中和抗体(neutralizing antibodies，NA)、存在大量的非中和抗体(non-neutralizing antibodies，N-NA)[Meerts P，et al.BMC Vet Res2006；2：6；
Fort M，et al.Vet Microbiol 2007；125：244-55]。在实验条件下，PCV2NA可在疫苗接种后的10到28天出现[Meerts P，et al.BMC Vet Res 2006；2：6；Fort M，et al.Vet Microbiol2007；125：244-55；Pogranichnyy RM，et al.Viral Immunol 2000；13：143-53]。
PCV2NA的水平和PCV2复制和PCV2-SD的发生呈负相关关系[Meerts P，et al.BMC Vet Res
2006；2：6；Fort M，et al.Vet Microbiol 2007；125：244-55]。产生了高水平PCV2TA的猪体内的PCV2NA水平可能不足以保护其抵抗PCV2的感染[Meerts P，et al.BMC Vet Res 2006；
2：6；Fort M，et al.Vet Microbiol 2007；125：244-55]；PCV2NA产生不足的猪，即便存在高滴度的PCV2特异抗体也可能不具备清除PCV2的免疫力[Segale′s J.Expert Rev.Vaccines
2015 14(3)，473-487]。
Fort M，et al.Vet Microbiol 2007；125：244-55]。在实验条件下，PCV2NA可在疫苗接种后的10到28天出现[Meerts P，et al.BMC Vet Res 2006；2：6；Fort M，et al.Vet Microbiol2007；125：244-55；Pogranichnyy RM，et al.Viral Immunol 2000；13：143-53]。
PCV2NA的水平和PCV2复制和PCV2-SD的发生呈负相关关系[Meerts P，et al.BMC Vet Res
2006；2：6；Fort M，et al.Vet Microbiol 2007；125：244-55]。产生了高水平PCV2TA的猪体内的PCV2NA水平可能不足以保护其抵抗PCV2的感染[Meerts P，et al.BMC Vet Res 2006；
2：6；Fort M，et al.Vet Microbiol 2007；125：244-55]；PCV2NA产生不足的猪，即便存在高滴度的PCV2特异抗体也可能不具备清除PCV2的免疫力[Segale′s J.Expert Rev.Vaccines
2015 14(3)，473-487]。
[0010] PCV2NA主要由PCV2CP上中和表位刺激产生。研究表明，在PCV2CP上即存在B细胞表位，也存在T细胞表位[Meerts P，et al.Viral Immunol 2005；18：333-41；Fort M，et al.Vet Immunol Immunopathol2009；129：101-7；Steiner E，et al.BMC Vet Res 2009；5：45]；B细胞表位包括可刺激NA产生的中和表位(neutralizing epitopes)和可刺激N-NA的非中和表位(Non neutralizing epitopes)；有的非中和表位是诱骗表位(decoy epitope)[Trible BR，et al.Clin.Vaccine Immunol.2011，18：749-757；Trible BR，et al.Virus Res.2012.164：68-77]。PCV2CP上由169-180氨基酸残基组成的肽段[CP(169-180)]是一个诱骗表位。CP(169-180)也被称为免疫优势寡肽(immunodominant oligopeptide epitope)[Trible BR，et al.Clin.Vaccine Immunol.2011.18：749-757]。对基因库中的462PCV2序列分析揭示，CP(169-180)的序列高度保守[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，
2012，86，13508-13514]。X线衍射分析显示，CP(169-180)所在的功能区形成了一个外袢结构(external loop structure)。该结构突在CP亚单位的外面，其中的173-Tyr，174-Phe和
175-Glu均为抗体结合的关键氨基酸残基。该结构是CP(169-180)被抗体识别、结合的基础。
然而，当形成PCV2颗粒的时候，CP(169-180)不暴露于病毒颗粒的表面。因此，在完整的病毒颗粒中，抗体不能接近CP(169-180)[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，
13508-13514]。用PCV2CP单体[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，
13508-13514]和由PCV2CP形成的VLP(PCV2CP VLP)[Khayat，R.，et al.Journal of Virology，2011，85(15)，7856-7862]分别免疫猪后发现，用PCV2CP VLP免疫的猪产生了高水平的抗PCV抗体(anti-PCV2antibodies)，其中包括高水平的PCV2NA和低水平的CP(169-
180)抗体。受到PCV2攻击后，在经PCV2CP VLP免疫的猪的血清中检测不到PCV2。相比之下，在PCV2CP单体免疫的猪的血清中，可检测出高水平的PCV抗体和高水平的CP(169-180)抗体，几乎检测不出PCV2中和活性。此外，在用PCV2攻击后，经PCV2CP单体免疫的猪的PCV2病毒血症和未免疫的猪的没有差别。这说明，CP(169-180)抗体是N-NA；高水平抗CP(169-180)抗体不能控制PCV2的复制[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，13508-
13514]。
2012，86，13508-13514]。X线衍射分析显示，CP(169-180)所在的功能区形成了一个外袢结构(external loop structure)。该结构突在CP亚单位的外面，其中的173-Tyr，174-Phe和
175-Glu均为抗体结合的关键氨基酸残基。该结构是CP(169-180)被抗体识别、结合的基础。
然而，当形成PCV2颗粒的时候，CP(169-180)不暴露于病毒颗粒的表面。因此，在完整的病毒颗粒中，抗体不能接近CP(169-180)[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，
13508-13514]。用PCV2CP单体[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，
13508-13514]和由PCV2CP形成的VLP(PCV2CP VLP)[Khayat，R.，et al.Journal of Virology，2011，85(15)，7856-7862]分别免疫猪后发现，用PCV2CP VLP免疫的猪产生了高水平的抗PCV抗体(anti-PCV2antibodies)，其中包括高水平的PCV2NA和低水平的CP(169-
180)抗体。受到PCV2攻击后，在经PCV2CP VLP免疫的猪的血清中检测不到PCV2。相比之下，在PCV2CP单体免疫的猪的血清中，可检测出高水平的PCV抗体和高水平的CP(169-180)抗体，几乎检测不出PCV2中和活性。此外，在用PCV2攻击后，经PCV2CP单体免疫的猪的PCV2病毒血症和未免疫的猪的没有差别。这说明，CP(169-180)抗体是N-NA；高水平抗CP(169-180)抗体不能控制PCV2的复制[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，13508-
13514]。
[0011] 存在诱骗表位是能建立长期感染的病原体的一个普遍特征。诱骗表位是非保护性表位(non-protective epitopes)，为免疫优势表位(immunodominant epitope)。诱骗表位可强力、持续性刺激B细胞发生体液免疫应答，因而会启动抑制抗体生成的负反馈调控，该调控可抑制对中和表位发生的体液免疫应答，因而抑制NA的产生。在完整PCV2粒子，作为免疫优势表位的CP(169-180)藏于抗体不能到达的位置，不能刺激诱骗抗体的产生。针对完整PCV2粒子发生的免疫应答产生大量的NA，可使宿主控制PCV2的复制。PCV2感染细胞可产生游离的CP或CP片段。没组装好的重组PCV2CP VLP可暴露CP(169-180)，因而能刺激大量的CP(169-180)抗体。感染PCV2的猪易感染其它病原体。这的伴随感染可刺激PCV2的复制使感染细胞产生PCV2CP单体和PCV2CP片段。针对PCV2游离CP或PCV2CP片段发生的免疫应答产生大量的N-NA，这种抗体不能中和PCV2，不能控制PCV2的复制，因而可使PCV2逃逸免疫系统的攻击。逃逸了免疫系统攻击的PCV2可持续在感染细胞中复制，产生更多的PCV2CP单体和PCV2CP片段，使PCVAD迁延进展。患PCVAD猪体内的抗体主要是免疫优势寡肽(immunodominant oligopeptide epitope，CP(169-180)的抗体[Trible BR，et al.Clin.Vaccine Immunol.2011.18：749-757]。CP(169-180)抗体的功能是免疫诱骗(immunological decoy)，使免疫反应从保护性的表位偏离，因此PCV2利用此诱骗表位作为一种防御机制，以此来抵抗、逃逸宿主的免疫系统[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，13508-13514]。
发明内容：
发明内容：
[0012] 1、本发明提供一种的重组改构PCV2b衣壳蛋白，其特点是去除了PCV2b衣壳蛋白的逃逸表位并将其代之以PCV2b衣壳蛋白的另一个肽段(含中和表位)。
[0013] 2、本发明提供了在大肠杆菌系统和昆虫细胞杆状病毒系统生产这种重组改构PCV2b衣壳蛋白的方法，在大肠杆菌系统生产的重组改构PCV2b衣壳蛋白被命名为C2，在昆虫细胞杆状病毒系统生产的重组改构PCV2b衣壳蛋白被命名为Cβ。
[0014] 3、本发明提供了编码C2的核苷酸序列(序列表<400>2)和C2的氨基酸序列(序列表<400>3)，也提供了编码Cβ的核苷酸序列(序列表<400>5)和Cβ的氨基酸序列(序列表<400>6)。
[0015] 4、本发明提供了的C2和Cβ可被用作抗原用于疫苗的制备和用于圆环病毒特别是PCV2b特异性抗体的检测。C2和Cβ作为制备疫苗抗原的特点是：它可以诱生高滴度的圆环病毒特别是PCV2b特异性抗体，而不诱生针对圆环病毒衣壳蛋白逃逸表位的抗体。C2和Cβ作为特异性抗体检测抗原的特点是：用它检测到的圆环病毒特异性抗体不包含由圆环病毒衣壳蛋白逃逸表位诱生的非中和抗体。
[0016] 5、本发明提供的重组改构PCV2b衣壳蛋白，包括但不限于C2和Cβ.可被制成疫苗来预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病。
[0017] 6、本发明提供的重组改构PCV2b衣壳蛋白可和佐剂、药学可接受的载体配成疫苗或疫苗组合物来预防由猪圆环病毒感染引起的猪圆环病毒相关疾病。
[0018] 7、本发明提供的重组改构PCV2b衣壳蛋白，包括但不限于C2和Cβ.可被用作抗原来检测猪圆环病毒的特异性抗体，而不检测由猪圆环病毒衣壳蛋白逃逸表位诱生的抗体。
[0019] 发明中的术语：
[0020] 除非特别强调，本发明中的术语具有可以被本发明所属领域内技术人员所理解的通常意义。若出现含义上的冲突，应遵从本发明中的解释、界定或说明。
[0021] “重组猪圆环病毒衣壳蛋白”：是用含有携带猪圆环病毒衣壳蛋白编码基因的重组质粒的大肠杆菌生产的猪圆环病毒衣壳蛋白(PCV CP)，也指用携带PCV CP编码基因的秆状病毒感染的昆虫细胞生产的PCV CP，也包括用酵母细胞或哺乳动物细胞生产的PCV CP。重组PCV CP单体可自组装成病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，该VLP可被用作抗原制备对猪圆环病毒感染有预防作用的疫苗。重组PCV CP单体中的诱骗表位可刺激猪圆环病毒非中和抗体的产生。这种抗体也被称为诱骗抗体，可干扰猪圆环病毒中和抗体的产生。PCV CP代表猪圆环病毒衣壳蛋白，包括在PCV2颗粒上的猪圆环病毒衣壳蛋白，也代表重组猪圆环病毒衣壳蛋白。PCV CP含诱骗表位。本发明提供的PCV CP编码基因采用了优化设计的密码子。
[0022] “重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白”是用含有携带PCV CP的改构编码基因的重组质粒的大肠杆菌生产的PCV CP，也指用携带PCV CP编码基因的秆状病毒感染的昆虫细胞生产的PCV CP，也包括用酵母细胞或哺乳动物细胞生产的改构PCV CP。改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白是去除了诱骗表位并在诱骗表位的部位代之以中和表位的重组猪圆环病毒衣壳蛋白。改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白可被用作抗原制备对猪圆环病毒感染有预防作用的疫苗。改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白不诱生抗CP(169-180)抗体，且增加了诱生PCV中和抗体的的中和表位。用C2代表在大肠杆菌生产的改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白。C2和用大肠杆菌生产的改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白有相同的含义。用Cβ代表在昆虫杆状病毒系统生产的改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白，Cβ和在昆虫杆状病毒系统生产的改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白有相同的含义。C2工程菌是指转化有pET28a-C2的大肠杆菌，可被用来生产C2。pET28a-C2是携带C2编码基因的pET28a(+)质粒。pET28a(+)质粒是原核细胞表达质粒。重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白和改构猪圆环病毒衣壳蛋白可有相同的含义。
[0023] “猪圆环病毒感染”：猪圆环病毒感染由猪圆环病毒(PCV)引起，所致的疾病被称为猪圆环病毒相关性疾病。
[0024] “猪圆环病毒相关疾病”猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)也称猪圆环病毒疾病(Porcine circovirus diseases，PCVD)。PCVAD最初被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。根据病理状况的不同，PCVAD也被称为PCV系统疾病(PCV-systemic disease，PCV-SD)、PCV2亚临床感染(PCV2-subclinical infection，PCV2-SI)、PCV2生殖系统疾病(PCV2-reproductive disease，PCV2-RD)、猪皮炎(porcine dermatitis)和猪肾病综合征(nephropathy syndrome，PDNS)[Segale′s J.Expert Rev.Vaccines 2015 14(3)，473-487]。PCVAD的主要临床、病理和诊断指标如文献[Segale′s J.Expert Rev.Vaccines 2015
14(3)，473-487]的表一(TABLE 1)所述。
14(3)，473-487]的表一(TABLE 1)所述。
[0025] “抗感染”：本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可发挥抗PCV2感染的作用。抗感染和对微生物感染产生治疗或预防作用是可以互换的术语。抗PCV2感染也指预防或减轻猪圆环病毒相关疾病。本发明提供的改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白具有抗感染作用。
[0026] “抗原”是能被B细胞受体或T细胞受体识别而激发个体适应性免疫应答(adaptive immune response)的物质或分子。抗原可以来自个体的外部，如微生物抗原；也可来自个体的内部，如肿瘤抗原。微生物抗原是来自微生物的可被B细胞受体或T细胞受体识别而激发个体适应性免疫应答的物质或分子。采用微生物抗原制备成的疫苗在给个体应用后能使其获得对该病原体的免疫力，使其在再次接触到同样或相似病原体时受到保护。抗原可以从微生物或肿瘤细胞提取、可以采用重组DNA技术在大肠杆菌系统、昆虫杆状病毒系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统生产、也可用化学方法合成。本发明提供的改构重组猪圆环病毒衣壳蛋白是一种微生物抗原。抗原是疫苗的主要成分，也可被用来检测抗原特异性抗体。
[0027] “免疫应答”：免疫应答(immune response)和免疫反应具有相似的意义。免疫应答是个体的免疫细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、树突细胞、巨噬细胞和粒细胞等对抗原或其它刺激[如病原体相关的模式分子(pathogen associated molecular pattern，PAMP)和损伤相关的模式分子(damage associated molecular pattern，DAMP)做出的反应。免疫应答的结果是选择性破坏或清除入侵的病原微生物或内生的肿瘤细胞。免疫应答包括固有免疫应答和适应性免疫应答。适应性免疫应答括细胞免疫应答和体液免疫应答。由采用微生物抗原制成的疫苗所激发的免疫应答可以使被免疫的个体获得抵抗微生物感染的能力。促进对个体对微生物的免疫应答可发生抗感染作用。具有抗感染作用的免疫应答是保护性免疫应答。本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白可诱导个体产生保护性免疫应答。
[0028] “个体”：在本发明中的个体(subject或individual)指包括猪、小鼠在内的脊椎动物，也包括人。
[0029] “淋巴细胞”：淋巴细胞(lymphocyte)指在血液、淋巴液和淋巴组织中存在的没有吞噬能力的单个核白细胞，包括B淋巴细胞(也称B细胞)和T淋巴细胞(也称T细胞)。T细胞可被分为表面表达CD4分子的T细胞(CD4+T细胞)和为表面表达CD8分子的T细胞(CD8+T细胞)。
[0030] “抗病毒适应性免疫应答”病毒基因编码的胞膜蛋白、衣壳蛋白、酶类等病毒抗原均能激发个体发生适应性免疫应答，该应答包括抗病毒体液免疫应答和抗病毒细胞免疫应答。在抗病毒体液免疫应答过程中产生的抗体可发挥下述功效：①阻止病毒吸附、侵入感染细胞；②限制病毒在体液中播散；③通过激活补体、调理作用、抗体依赖的细胞介导的细胞素效应破坏病毒感染细胞。抗病毒细胞免疫效应主要由CD8+T细胞和CD4+T细胞介导。CD8+T细胞可特异性杀伤病毒感染细胞，也可通过产生肿瘤坏死因子、γ-干扰素和T细胞抗病毒因子(CD8+T-cell anti-viral factor，CAF)发挥非杀伤性抗病毒效应。CD4+T细胞可通过释放细胞因子活化巨噬细胞、促进CD8+T细胞增殖、分化来发挥抗病毒作用，也可特异性杀伤病毒感染细胞。
[0031] “表位”也称抗原表位(antigen epitope)或抗原决定基(antigen determinant)，是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团，为决定免疫应答特异性的物质基础。表位可被淋巴细胞表面的抗原受体识别、结合，进而激活淋巴细胞，引起免疫应答。抗体分子分子在识别、结合抗原表位后发挥免疫效应。表位可被分为线性表位和构象表位。线性表位(linear epitope)是由顺序相连的氨基酸残基组成的表位，也称连续表位。线性表位可被T细胞受体识别、结合，也能被B细胞受体识别、结合。位于蛋白质抗原表面的线性表位能接近抗体并被其结合。位于蛋白质抗原内部的线性表位，不易或不能接近抗体并被其结合。有的线性表位可位于蛋白单体的表面，但当多个(如数十个或数百个)该蛋白单体组成复合物(如组装成了病毒样颗粒)后，该线性表位就会被隐匿到该复合物的内部而不易或不能接近抗体并被其结合。构象表位 (conformational epitope)是由顺序不相连的氨基酸残基折叠出空间构象后形成的表位。PCV2CP上的线性表位的确定可采用PCV感染的猪血清或PCV病毒高免疫的兔血清来检测衣壳蛋白(CP)的叠加肽进行。根据CP的序列合成覆盖全场的和CP叠加的所有12肽。确定的抗体反应区(Antibody reactive regions)中的线性表位为PCV2b CP 3-43，71-85，117-131和171-202[Mahé，D.，et al.The Journal of General Virology，2000，81(Pt 7)，1815-1824]。构象表位[conformational epitopes]的确定可采用嵌合病毒DNA转染的细胞和单克隆抗体进行。用7株抗PCV CP单克隆抗体和转染嵌合PCV的细胞确定的PCV CP构象表位[conformational epitopes]中免疫反应区(immunoreactive regions)在47-85，165-200和200-233[Lekcharoensuk，P.，et al.Journal of Virology，
2004，78(15)，8135-8145]。结合上述研究，可将PCV CP分为4个免疫反应区，被命名为表位A-D[Trible，B.R.，et al.Clinical and Vaccine Immunology：2011CVI，18(5)，749-757]。
2004，78(15)，8135-8145]。结合上述研究，可将PCV CP分为4个免疫反应区，被命名为表位A-D[Trible，B.R.，et al.Clinical and Vaccine Immunology：2011CVI，18(5)，749-757]。
[0032] “B细胞表位”是被B细胞受体(B cell receptor，BCR)或抗体识别、结合的表位。B细胞通过BCR识别、结合B细胞表位后获得激活信号。在其它的激活信号的参与下，获得激活信号的B细胞增殖、分化，进而产生产生可识别、结合B细胞表位的抗体。
[0033] “免疫优势表位”免疫优势表位(immunodominant epitopes)是一个抗原分子上能有效刺激B细胞产生特异性抗体的B细胞表位。就B细胞产生抗体而言，一个抗原分子上的B细胞表位并不是等效的。有的B细胞表位能优先被B细胞的BCR识别，并能强效刺激该B细胞产生高水平的特异性抗体，成为免疫优势表位。有的B细胞表位不具备这种效力。可采用PCV2感染猪血清、PCV2疫苗免疫猪血清或患PCVAD猪血清来确定PCV2CP上免疫优势表位[Trible，B.R.，et al.Clinical and Vaccine Immunology：2011CVI，18(5)，749-757]。本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白含有更多的能诱导保护性免疫反应的优势表位。
[0034] “中和表位”是能刺激中和抗体产生的B细胞表位。病毒颗粒上的中和表位刺激产生的中和抗体能阻止病毒感染宿主细胞、限制病毒在体液中和体液间扩散。病毒疫苗中的抗原应含有中和表位。本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白含有更多的中和表位。
[0035] “T细胞表位”是被T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别、结合的表位。T细胞受体(T cell receptor，TCR)是表达在T细胞表面的抗原受体，为异二聚体跨膜蛋白。TCR由可变(V)区和恒定(C)区组成。V区是TCR识别抗原表位的结构域。TCR不能直接识别T细胞表位，只能识别抗原递呈细胞或靶细胞表面的表位肽-MHC分子复合物。MHC分子是主要组织相容复合体(major histocompatibiltiy complex，MHC)基因编码的蛋白类分子，包括MHC I类分子和MHC II类分子。
[0036] “保护性表位”保护性表位(protective epitopes)是能刺激个体产生保护性免疫反应的表位，可以是B细胞表位，也可以是T细胞表位。保护性表位能刺激个体产生保护性抗病毒免疫反应。针对某一病毒的保护性免疫反应可使个体免于该病毒的感染或减轻该病毒感染所引起的疾病。中和表位是一种保护性表位。本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白含有更多的保护性表位。
[0037] “诱骗表位”诱骗表位(decoy epitope)是一种免疫优势表位，但非保护性表位，主要刺激非中和抗体产生，可减弱或抑制个体对保护性表位的免疫应答。诱骗表位也称逃逸表位。病毒可通过诱骗表位行使免疫诱骗(immunological decoys)，借此逃逸宿主的免疫攻击。典型的免疫诱骗见于猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，FIV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)。FIV包膜蛋白的可变区(variable regions)V3，V4和V5是FIV完成其感染宿主细胞必需的区段，存在免疫优势中和表位，可刺激中和抗体的产生。然而在感染的过程中，这些区域可发生缩短、增长或氨基酸序列的高度变异，进而刺激产生大量的非保护性抗体[Hosie MJ，et al.Viruses 2011 3：1870-1890]。HIV的糖蛋白120(gp120)[Stamatatos L，et al.Nat.Med.2009 15：866-870]也会出现诱骗表位，刺激非中和抗体的产生。PRRSV糖蛋白5(GP5)中的高变区可持续性招募B细胞但不刺激产生中和抗体[Ostrowski M，et al.J.Virol.2002 76：4241-4250]，gammaherpesvirus的糖蛋白150(gp150)是具有免疫优势，刺激非保护性抗体反应[Gillet L，et al.PLoS One.2007Aug 8；2(8)：e705]。猪圆环病毒衣壳蛋白的CP(169-180)肽段是诱骗表位[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，13508-13514]。猪圆环病毒相关疾病的一种标志性变化是宿主的免疫失调，表现为产生大量的非中和抗体(non-neutralizing antibody)。本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白不含诱 骗表位。
[0038] “PCV2衣壳蛋白(169-180)寡肽”是根据猪圆环病毒衣壳蛋白的CP的第169到第180位氨基酸序列合成的肽段，也被称为CP(169-180)。可采用CP(169-180)做包被抗原做酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测由猪圆环病毒衣壳蛋白诱骗表位刺激产生的非中和诱骗抗体[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，13508-13514；Trible BR，et al.2011.Clin.Vaccine Immunol.18：749-757；Trible BR，et al.2012.Vaccine 30：4079-4085]。
[0039] “中和抗体”是在抗病毒体液免疫应答过程中由个体的B淋巴细胞产生的、可通过识别、结合病毒抗原而阻止病毒感染细胞并限制病毒扩散的抗体。一般而言，仅针对表达于病毒或受染细胞表面糖蛋白的抗体(即中和抗体)才具有控制该病毒感染的作用。中和抗体具有抗圆环病毒感染的作用。
[0040] “保护性抗体“保护性抗体(protective antibody)是能保护个体免受病毒感染的抗体，也指能减轻病毒感染所引起疾病的抗体。中和抗体是一种保护性抗体。本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白可以诱导保护性抗体的产生。
[0041] “非中和抗体”非中和抗体(non-neutralizing antibody)是不能阻断病毒进入宿主细胞的抗体。
[0042] “非保护性抗体”非保护性抗体(nonprotective antibody)是对个体没有保护作用的病毒特异性抗体。诱骗表位诱导个体产生的抗体是非保护性抗体。
[0043] “诱骗抗体”诱骗抗体和逃逸抗体是可以互换使用的术语，具有相同的含义。在本发明中，诱骗抗体(逃逸抗体)是由猪圆环病毒(PCV)诱骗表位(逃逸表位)在个体诱生的PCV特异性抗体，它属于非中和抗体，也属于非保护性抗体，不具备抗PCV感染的作用，且可干扰PCV中和抗体和保护性抗体的产生。另，诱骗(逃逸)抗体可被PCV来借用来逃逸免疫反应对其感染的限制。因此，能诱导PCV中和抗体和保护性抗体、但不刺激诱骗(逃逸)抗体的PCV衣壳蛋白是更具免疫效力的抗原，更适合被用于PCV疫苗的制备。
[0044] “PCV2特异抗体”是可以识别、结合PCV2或其组分的抗体，包括中和抗体、保护性抗体、非中和抗体和非保护性抗体。PCV2特异抗体可以用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹(Western blot)等方法检测。本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白可被用来检测PCV2特异抗体，且可避免由PCV2CP诱骗表位诱生的非保护性抗体的干扰。
[0045] “具有生物功能的质粒载体”具有生物功能的质粒载体(biologically functional plasmid or viral vector)是能在真核细胞表达所携带的外源基因的质粒。将可表达蛋白抗原编码基因克隆到具有生物功能的质粒上，该质粒载体在被注射到个体后能表达出相应的蛋白抗原使个体免疫。这种能表达抗原的质粒被称为核酸疫苗或DNA疫苗。
可将本发明所述的重组改构圆环病毒衣壳蛋白编码基因克隆到具有生物功能的质粒载体上制成表达改构圆环病毒衣壳蛋白的核酸疫苗。
可将本发明所述的重组改构圆环病毒衣壳蛋白编码基因克隆到具有生物功能的质粒载体上制成表达改构圆环病毒衣壳蛋白的核酸疫苗。
[0046] “具有生物功能的病毒载体”具有生物功能的病毒载体(biologically functional plasmid or viral vector)是能转染/感染真核细胞后表达所携带的外源基因的病毒。将可表达蛋白抗原编码基因克隆到具有生物功能的病毒载体上，该病毒载体在被注射到个体后能转染/感染细胞并表达出相应的蛋白抗原使个体免疫。这种具有转染/感染真核细胞活性且能表达蛋白抗原的病毒被称为活病毒载体，它可被用做疫苗。可将本发明所述的重组改构圆环病毒衣壳蛋白编码基因克隆到具有生物功能的病毒载体上制成表达改构圆环病毒衣壳蛋白的活病毒载体疫苗。具有生物功能的病毒载体本身也可以是一种作为疫苗的减毒病毒，如疫苗病毒减毒PCV1-2a嵌合病毒疫苗[Beach NM，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：33-42]。可被用作本发明所提供的改构圆环病毒衣壳蛋白编码基因具有生物功能的病毒载体的病毒包括但不限于腺病毒、痘病毒、噬菌体、杆状病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征)病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪流感病毒和猪副流感病毒等。
[0047] “疫苗”：疫苗(vaccine)是用减毒或杀死的病原生物或其组份为抗原制成的用于人工主动免疫的生物制品。抗原和佐剂是疫苗的主要成分。接种疫苗的目的是使个体获得对病原体的免疫力进而使其再接触到相应的病原体时受到保护。本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白是抗原，这种抗原能被用于预防猪圆环病毒感染的疫苗，也能和其它的猪用疫苗联合应用。这些猪用疫苗包括但不限于下述猪传染性疾 病预防用疫苗：猪口蹄疫、猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征)、猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒感染、猪细小病毒感染、猪链球菌病、猪传染性胃肠炎、猪气喘病、副猪嗜血杆菌感染、猪丹毒、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎、猪传染性胃肠炎、猪乙脑、猪流感、猪布鲁氏病、仔猪腹泻、猪副流感病毒感染、猪流感、猪肺炎支原体感染、仔猪水肿病、猪霍乱沙门氏菌、猪流行性腹泻和猪肺疫。疫苗的免疫效力是指其诱导保护性免疫应答的活性。疫苗的免疫效力也可指疫苗中抗原的免疫效力，佐剂可提高抗原的免疫效力。
[0048] “猪圆环病毒疫苗”本发明提供的重组改构圆环病毒衣壳蛋白可和猪圆环病毒疫苗[Beach NM，et al.Virus Res.2012Mar；164(1-2)：33-42]联合应用，这些疫苗包括但不限于PCV2a灭活疫苗、PCV2a全长衣壳蛋白亚单位疫苗、PCV2b全长衣壳蛋白亚单位疫苗、灭活的减毒PCV1-2a嵌合病毒疫苗、经反复传代或基因修饰获得的PCV2b减毒病毒疫苗、PCV1-2b嵌合病毒疫苗、携带PCV基因的质粒DNA疫苗、PCV2衣壳蛋白细菌噬菌体展示疫苗、PCV2衣壳蛋白展示杆状病毒载体疫苗、PCV2衣壳蛋白伪狂犬病毒载体疫苗、PCV2衣壳蛋白腺病毒载体疫苗和PCV2衣壳蛋白支气管鲍特杆菌(Bacterium Bordetella bronchiseptica)载体疫苗等。
[0049] “佐剂”本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可以和一种或多种佐剂联合使用来增强其诱导保护性免疫的效力。佐剂(adjuvant)是在疫苗中和抗原一起应用的物质，具有下述活性(1)减少疫苗的接种次数；(2)延长疫苗的免疫持续期；(3)通过激动固有免疫应答促进体液免疫应答和细胞免疫应答；(4)扩展抗原诱导的交叉保护免疫应答；(5)增强弱免疫应答个体如老龄个体或免疫缺陷个体对抗原的免疫应答；(6)减少抗原的用量。可和本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白联合应用的佐剂[Stanley A.Plotkin，Walter A.Orenstein，Paul A.Offit，Vaccines，Sixth Edition，An imprint of Elsevier Inc.2013，ISBN-13：9781455700905]包括但不限于：铝盐佐剂(由氢氧化铝或磷酸铝为主要成分的疫苗佐剂)、AS04佐剂[吸附MPL的磷酸铝佐剂(MPL是经化学减毒的革兰氏阴性菌脂多糖)]、MF59佐剂(一种水包油型乳化剂，其中的油相是角鲨烯)、AS03佐剂(一种采用角鲨烯为油相的水包油乳化剂)、AF03佐剂(一种采用角鲨烯为油相的水包油型乳化剂)、Montanide ISA 51佐剂(以矿物油为油相的油包水乳化剂)、弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂、病毒小体佐剂(virosome adjuvant)、N-氧化聚乙烯对二氮己环衍生物(polyoxidonium)佐剂、白油佐剂、MontanideTM ISA-206佐剂、polylactide co-glycolide、病毒(Adenovirus，vaccinia，fowlpox)载体佐剂、卡介苗(BCG，bacillus Calmette-Guérin)、包括QS21在內的皂素、包括TDB在内的C-type lectin ligands、包括α-galactosylceramide在内的CD1d配体、AS01(MPL，QS21，liposomes)、AS02(MPL，QS21，乳化剂)、AS15(MPL，QS21，CpG ODN，脂质体)、GLA-SE(GLA，emulsion)、IC31(CpG ODN，阳离子多肽)、CAF01(TDB，阳离子脂质体)和ISCOMs(皂素，磷脂)[Reed SG，et al.Nat Med.2013Dec；19(12)：1597-608；Melero I，et al.Nat Rev Clin Oncol.2014Sep；11(9)：509-24]。能和本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白联合应用的佐剂还包括病原体相关模式分子及其模拟物、Toll样受体激动剂、损伤相关模式分子及其模拟物、环二核苷酸及其模拟物、免疫卡点抑制物、共刺激受体激活剂和细胞因子等。
[0050] “病原体相关的模式分子”：本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可以和病原体相关的模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及其类似物联合应用来增强其免疫效力。PAMPs是微生物的各种保守成分，如细菌细胞壁成分、真菌细胞壁成分和病毒核酸等。固有免疫细胞通过模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)识别PAMPs而被激活。PRR包括Toll-like receptors(TLRs)、nucleotide-binding oligomerization domain(Nod)-，leucine-rich repeat-containing receptors(NLRs)、RIG-I-like receptors(RLRs)、C-type lectin receptors(CLRs)和AIM-2like receptors；也包括细胞内识别核酸的细胞内核酸感受器(intracellular sensors of nucleic acids)、OAS蛋白和cGAS[Iwasaki A et al.Nat Immunol.2015Apr；16(4)：343-53]。
[0051] “Toll样受体激动剂”：本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可以和一种或多种Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)激动剂联合应用来增强其免疫效力，表现抗圆环病毒感染活性。能和本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白联合应用的TLR激动剂包括但不限于：包括Imiquimod和R848在内的Imidazoquinolines类TLR7/TLR8激动剂；包括852A在内的TLR7激动剂；包括VTX-2337在内的TLR8激动剂；包括IMO-2055、CPG 7909、MGN1703和其它CpG ODN(含CpG脱氧寡核苷酸)在内的TLR9激动剂；包括卡介苗(BCG)在内的TLR2/TLR4激动剂；包括OM-174、monophosphoryl lipid A(MPL)、 aminoalkyl glucosamine phosphates和其它类脂A(lipid A)类似物在内的TLR4激动剂；包括病毒核酸、细菌核酸在内的TLR9激动剂；包括细菌鞭毛蛋白在内的TLR5激动剂；包括酵母多糖在内的TLR2/TLR6激动剂；包括聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(poly IC)、病毒双链RNA或其模拟物在内的TLR3激动剂和包括病毒单链RNA或其模拟物在内的TLR7/TLR8激动剂[Adams JL et al Nat Rev Drug Discov.2015Sep；14(9)：603-22]。
[0052] “损伤相关的模式分子”：损伤相关的模式分子(damage-associated molecular patterns，DAMPs)可以做本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的佐剂。DAMPs是由损伤细胞释放的、能激发固有免疫应答自身细胞成分。DAMPs能通过PRR激发机体的固有免疫应答。这些DAMP包括但不限于：热休克蛋白、HMGB1(high-mobility group box 1)、hyaluronan片段、glycans、glycoconjugates、ATP(Adenosine5’-triphosphate)、腺苷酸、尿酸、S100蛋白、heparin sulfate、Galectins、细胞核DNA、N-formylated peptides、Antimicrobial peptides、线粒体DNA和calreticulin[Krysko DV et al.Nat Rev Cancer.2012Dec；12(12)：860-75；Pouwels SD et al.Mucosal Immunol.2014Mar；7(2)：215-26]。
[0053] “环二核苷酸”环二核苷酸及其模拟物可以作为本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的佐剂。环二核苷酸(Cyclic dinucleotides，CDNs)[Cell，2013 154(5)，962-970]来源于细菌，也可在哺乳动物细胞内合成。细菌CDNs包括但不限于环二鸟苷酸(cyclic di-GMP，cdG)、环二腺苷酸(cyclic di-AMP，cdA)和环腺苷酸-鸟苷酸(cyclic AMP-GMP，cAMP-GMP)。细菌CDN是一类PAMP，可激动固有免疫应答。在哺乳动物细胞中也可出现CDN，如环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP)[Wu J et al.Science.2013Feb 15；339(6121)：826-3]也可激动固有免疫应答。
[0054] “免疫卡点抑制物”：免疫卡点抑制物(immune checkpoint inhibitor)可以作为本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的佐剂。免疫卡点抑制物是能抑制免疫卡点分子功能的物质[Melero I et al.Nat Rev Cancer.2015Aug；15(8)：457-72]。抑制免疫卡点分子的功能使免疫细胞激活的信号得以突显，因而使免疫细胞处于持续的激活状态。处于持续激活状态的CD4+T细胞会辅助B细胞产生抗体，也辅助CD8T细胞杀伤靶细胞如病毒感染细胞。因此，维持T细胞激活状态的制剂如免疫加点抑制物会提高抗原或疫苗在个体的免疫效力。免疫卡点抑制剂抑制的免疫卡点分子包括但不限于CTLA4、PD1、LAG3(Lymphocyte activation gene 3)、2B4(CD244)、BTLA(B and T lymphocyte attenuator)、TIM3(T cell membrane protein 3)和A2aR(adenosine A2a receptor)[Pardoll DM.Nat Rev Cancer.2012Mar 22；12(4)：252-64]。能抑制免疫卡点功能的抗体属免疫卡点抑制物，包括但不限于CTLA-4抗体、CD-1抗体和CD-L抗体。
[0055] “共刺激受体激活剂”：共受体激活剂可以作为本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的佐剂。共刺激受体是表达在免疫细胞表面的受体，在受到激活剂激活后介导免疫细胞激活信号的转导，因而促进个体对抗原或疫苗的免疫反应。共刺激受体激活剂是通过结合共刺激受体后激活免疫细胞的制剂。共刺激受体激活性单克隆抗体(Co-stimulatory receptor activating monoclonal antibody)是共刺激受体激活剂，可增强抗原或疫苗的效力。这类激活性单克隆抗体靶向的共刺激受体(Co-stimulatory receptor)包括但不限于CD137(41BB)、OX40、CD40、GITR、ICOS和CD27(Glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor family-related protein)[Melero I et al.Nat Rev Cancer.2015Aug；15(8)：457-72；Sanmamed MF et al.Semin Oncol.2015Aug；42(4)：640-55]。
[0056] “细胞因子”：细胞因子可作为本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的佐剂。这些细胞因子包括但不限于：白细胞介素2(IL-2)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)GM-CSF)和干扰素α。
[0057] “疫苗组合物”：本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可与药物学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)组成疫苗组合物。该组合物中的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的使用剂量为免疫有效剂量(immunologically effective dosages)。该疫苗组合物可被制成一定的剂型，这些剂型包括但不限于溶液、乳化液、脂质体和冻干粉等。在疫苗组合物中可含有佐剂。
[0058] “联合应用”本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可以和佐剂联合应用，可以和猪圆环病毒疫苗联合应用，也可以和猪用疫苗联合应用。联合应用是指将重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白和佐剂、猪圆环病毒疫苗和其它猪用疫苗指组合成一个制剂(疫苗组合物)一起应用，也指将重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白佐剂、猪圆环病毒疫苗和其它猪用疫苗分开应用。
[0059] “药物学可接受的载体”：本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可与药物学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)组成疫苗组合物。药物学可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)是指一种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质。这类载体适合将本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白应用于个体。该载体可以是有机的、无机的，天然的或合成的。药物学可接受的载体可以是药学可接受的溶剂(水溶液和非水溶液)、分散剂、悬浊剂、乳化剂、粉剂、稀释剂、脂质体、抗菌剂、抗真菌剂、等渗制剂、延缓吸收制剂、冻干保护剂和其他的适合与本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白一起应用提高其免疫效力的制剂。水溶液包括但不限于水、生理盐水、PBS缓冲液、平衡盐溶液和葡萄糖溶液。溶剂或分散剂可包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，也包括由这些溶剂或分散剂组成的混合物。为了维持药物组合物的流动性可应用包括卵磷脂在内的脂类。为了使疫苗组合物处于理想的颗粒状态可以应用表面活性剂。为了有合适的渗透压，可在疫苗组合物中添加糖、包括甘露醇和山梨醇在内的多元醇和氯化钠等。为了延长作用时间，可在药物组合物中加入缓释剂如硬脂酸盐和明胶。乳化剂可包括水包油乳化剂、油包水乳化剂或水包油包水乳化剂。药物学可接受的载体也包括药学可接受的抗氧化剂(pharmaceutically-acceptable antioxidants)，这些抗氧化剂包括水溶性抗氧化剂，如ascorbic acid，cysteine hydrochloride，sodium bisulfate，sodium metabisulfite和sodium sulfite等；油溶性抗氧化剂，如ascorbyl palmitate，butylated hydroxyanisole(BHA)，butylated hydroxytoluene(BHT)，lecithin，propyl gallate和alpha-tocopherol等；金属螯合剂，如枸橼酸、ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)、sorbitol、tartaric acid和phosphoric acid等。
[0060] “免疫有效剂量”：本发明所提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的免疫有效剂量(immunologically effective dosages)是给个体应用后诱导保护性免疫应答剂量。在疫苗和疫苗组合物中应用重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白采用免疫有效剂量。免疫有效剂量的多少决定于本领域技术熟练人员应知的标准，还要参考其他因素，这些因素包括并不限于个体的大小、健康情况和疾病严重程度等。本发明提供的重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白可单次或多次应用于个体，每次的剂量范围可在1μg到1000mg。为了达到理想的效果，本领域技术熟练人员可以对此重组改构猪圆环病毒衣壳蛋白的剂量作调整，其剂量范围可以是前述范围的10倍到1000倍。
[0062] 图1：pET28a(+)质粒图谱及多克隆位点
[0063] 图2：C2编码基因的琼脂糖凝胶电泳
[0064] 图3：重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)工程菌的SDS-PAGE鉴定
[0066] 图5：纯化C2的SDS-PADE分析
[0067] 图6由C2组装成的类病毒样颗粒(电镜下观察)
[0068] 图7重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)在小鼠的免疫效力
[0069] 图8重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)在猪的免疫效力
[0070] 图9 C2和D重组蛋白诱导诱骗抗体的比较
[0071] 图10 Cβ编码基因片段的PCR鉴定
[0072] 图11 pFastBac Dual的图谱
[0073] 图12重组杆状病毒Bac-2Cβ的获取
[0074] 图13重组改构PCV2b衣壳蛋白(Cβ)表达的鉴定(SDS-PAGE/Western blot)[0075] 图14重组改构PCV2b衣壳蛋白(Cβ)组装成的类病毒样颗粒(电镜下观察)[0076] 图15纯化重组改构PCV2b衣壳蛋白(Cβ)的鉴定(SDS-PAGE)
[0077] 图16重组改构PCV2b衣壳蛋白(Cβ)在小鼠的免疫效力
[0078] 图17 Cβ和D重组蛋白诱导诱骗抗体的比较
[0079] 图18 pMD18-T&pMD19-T载体质粒的图谱
[0080] 具体实施方法：
[0081] 实施例1 由大肠杆菌偏好密码子组成的PCV2b衣壳蛋白(CP)编码基因的获取：
[0082] 采用多轮搭接PCR(聚合酶链式反应)构建由大肠杆菌偏好密码子组成的PCV2b衣壳蛋白(CP)编码基因，该基因编码的蛋白质也被称为D蛋白[Fang M，et al.Intervirology.2015；58(5)：318-23]。将PCV2b衣壳蛋白(CP)编码基因克隆到到T载体质粒(Takara，图-18)。PCV2b衣壳蛋白(CP)编码基因具有如序列表<400>1所示的序列。用DNA测序确定了其序列的正确性。
[0083] 实施例2 重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)编码基因的获取：
[0084] 以PCV2b CP编码基因(<400>1)为模板，采用PCR和分子克隆的方法获得获得改构PCV2b衣壳蛋白(C2)编码基因，C2编码基因具有如序列表<400>2所示的序列。获得C2编码基因的基本方法是：
[0085] (1)获取重组改构PCV2b衣壳蛋白编码基因A片段
[0086] 以PCV2b衣壳蛋白(CP)编码基因(序列表<400>1)编码基因为模板，采用PCR获得重组改构PCV2b衣壳蛋白编码基因A片段。采用的特异性PCR上游引物带Nco I限制性内切酶切位点(CCATGG)，下游引物带有BamH I限制性内切酶切位点(GGATCC)。
[0087] (2)获取重组改构PCV2b衣壳蛋白编码基因B片段
[0088] 以PCV2b衣壳蛋白(CP)编码基因(序列表<400>1)为模板，采用PCR获得重组改构PCV2b衣壳蛋白编码基因B片段，采用的特异性PCR上游引物带有Bgl II限制性内切酶切位点(AGATCT)，下游引物带有XHo I限制性内切酶切位点(CTCGAG)。
[0089] (3)获取重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)编码基因
[0090] 将改构PCV2b衣壳蛋白编码基因A片段(A片段)做2％琼脂糖凝胶电泳。采用北京鼎国公司的DNA回收试剂盒回收A片段。将回收的A片段连接入T载体质粒(Takara，图-18)，获得含载有A片段的T载体质粒，简称为T-A。将T-A转化入JM109大肠杆菌(简称为JM109)(Novagen公司)。将转化物划线接种到LB半固体培养板，盖盖，将平板倒置(底朝上)，37℃恒温孵箱培养12-14小时。挑选阳性克隆，扩大培养后，提取T-A。
[0091] 按上述方法将改构PCV2b衣壳蛋白编码基因B片段(简称B片段)连接入T载体质粒(Takara，图-18)，获得含载有B片段的T载体质粒，简称为T-B。将T-B转化入JM109，挑选阳性克隆，扩大培养后，提取T-B。
[0092] 用Nco I和BamHI消化T-A，释放出带Nco I和BamH粘性末端的A片段。以Nco I和BamH I消化pET-28a(+)质粒，回收线性质粒。将带Nco I和BamH粘性末端的A片段和经限制性内切酶以Nco I和BamH I消化pET-28a(+)质粒(图-1，美国Novagen公司)相连接，获得载有改构PCV2b衣壳蛋白编码基因A片段的重组pET-28a(+)质粒(pET-28a(+)-A)。将pET-28a(+)-A转化入大肠杆菌BL21(BL21(DE3)。划线接种到LB半固体培养板，盖盖，将平板倒置(底朝上)，37℃恒温孵箱培养12-14小时。挑选阳性克隆，扩大培养后，提取pET-28a(+)-A质粒。
[0093] 用BamH I和XHo I消化pET28a-A，回收带BamH I和XHo I粘性末端的pET28a-A线性质粒。用Bgl2和XHo I消化T-B，释放出带Bgl2和XHo I粘性末端的B片段，回收B片段。将此B片段以BamH I和XHo I切点插入到pET28a-A质粒，获得了pET28a-A-B重组质粒。pET28a-A-B重组质粒即为携带改构PCV2b衣壳蛋白(C2)编码基因(具有如<400>2所示的序列)的pET28a重组质粒，被命名为pET28a-C2。在pET28a-C2中，C2编码基因的开放阅读框架始于Nco I切点中的ATG，止于六聚组氨酸编码基因下游的TAA，共729bp，编码由242个氨基酸残基组成的重组改构PCV2b衣壳蛋白，该重组改构PCV2b衣壳蛋白被称为C2。C2具有如序列<400>3所示的氨基酸序列，由242个氨基酸残基组成，分子量约为28.64KD，等电点约为10.55。 C2不含PCV2b衣壳蛋白的诱骗表位，该诱骗表位被PCV2b衣壳蛋白的一保护性抗体诱生表位替代。C2编码基因编码的重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)具有如序列表<400>3所示的氨基序列。
[0094] 将pET28a-C2转化入BL21大肠杆菌(DE3)(Novagen)，将转化物划线接种到LB半固体培养板，盖盖，将平板倒置(底朝上)，37℃恒温孵箱培养12-14小时。挑选阳性克隆，提取pET-28a-C2。将pET28a-C2用NcoI和XhoI消化鉴定，消化条件如下：
[0095]
[0096] 混合后，于37℃温育100分钟。
[0097] 对消化产物做琼脂糖凝胶电泳(图-2)。结果表明：用NcoI和XhoI可以从pET28a-C2中释放出C2编码基因(约729bp)。
[0098] 采用T7启动子引物对pET28a-C2中的C2编码基因进行DNA测序[生工生物工程(上海)股份有限公司]，结果表明：C2编码基因的序列(序列表<400>2)和设计的一致。
[0099] 实施例3 重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)的表达：
[0100] 将经NcoI和XhoI酶切鉴定的pET28a-C2转化BL21大肠杆菌(DE3)(Novagen)制备表达C2(序列表<400>3)的工程菌冻干菌种，具体方法如下：
[0101] 取30mlLB培养基(胰蛋白胨1％，酵母浸出粉0.5％，氯化钠1％)至100ml洁净锥形瓶内，加入琼脂粉0.45g，混匀，透气封口，用线绳缠绕固定，高压灭菌。在超净工作台中，待锥形瓶温度降低(锥形瓶壁刚不烫手背)后，立即加入15μl的100mg/ml卡那霉素(Kan)(Kan的终浓度50μg/ml)，迅速混匀，将液体均分的2个高压过的培养皿中，制成LB半固体培养板。将pET28a-C2按常规方法转化入BL21大肠杆菌。将转化菌液划线接种到LB半固体培养板，盖盖，将平板倒置(底朝上)，37℃恒温孵箱培养12-14小时。
[0102] 用灭菌的吸管分别吸取LB半固体培养板3个划线上的独立的菌落接种到这三个锥形瓶(标为A、B、C)中。瓶中各含53mlLB培养基(加入30μl的卡那霉素(100mg/ml)。放入37℃恒温摇床中，设定转速为200rpm，培养3--5小时。当培养基OD600值达0.6-1.0时，开始制备冻干菌并对其鉴定。在超净台内，自A、B、C摇瓶中，分别用无菌的加样器头吸取200μl菌液至3个1.5ml EP管中，作为诱导前样品；另用无菌的加样器头吸取1ml菌液至3个灭菌的20ml玻璃试管中，加入0.5μl 1M IPTG，在37℃恒温摇床中以200rpm培养3小时。
[0103] 将含诱导前菌液样品的EP管离心1min(11000rpm)，用加样器吸弃上清，用20μl蒸馏水溶解沉淀物，用加样器吹打混匀，加入20μl 2×上样缓冲液，此为诱导前菌液SDS PAGE样品(A，B，C诱导前)。
[0104] 取20μl诱导3小时菌液至3个1.5ml EP管中，加入20μl 2×上样缓冲液，此为诱导后菌液SDS PAGE样品(A，B，C诱导后)。
[0105] 在电泳前，对诱导前、诱导后菌液SDS PAGE样品做煮沸处理：将样品管插在浮漂上(管口应高出＝面至少1cm)，将浮漂置于沸水中，煮沸5min。将样品管离心(11000rpm)5分钟，取10μl上清上样，做SDS PAGE分析(图-3)。
[0106] 将剩余菌液[(A，B，C)各约40ml]，离心(采用久保田离心机)，3000转，10分钟，弃上清。置冰上，在沉淀中分别加入20％脱脂乳1.5ml，10％谷氨酸钠1.5ml，混匀，分装至高压过的3ml西林瓶中，每瓶0.6ml，共15瓶(A，B，C各三瓶)，盖盖(保证盖的通气口透气)。
[0107] 将西林瓶(A1-5，B1-5，C1-5)至-70℃预冻，12小时。迅速将预冻的西林瓶置于冻干机中，冻干24小时。封盖，-20℃贴标签，入库。
[0108] 从C2工程菌种制备甘油菌种，将甘油菌种发酵培养表达C2。发酵在10升的发酵罐中进行。在发酵菌液的OD600达70时加IPTG诱导表达，诱导培养的温度为37℃。诱导开始前取发酵菌液1ml。从中取出20μl菌液，加20μl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，混合，制备诱导前菌体裂解液(用于SDS-PAGE电泳)， 4℃保存。诱导2小时后，取诱导后菌液并离心(8℃，3500rpm，10分钟)收集菌体。收集的菌体于-70℃保存。将诱导后菌液做16倍稀释后，取20μl加2×SDS-PAGE加样缓冲液混合，混匀，此为诱导后(后)样品。
[0109] SDS-PAGE的分析表明，C2工程菌高水平表达了C2蛋白(图-4)。
[0110] 实施例4 重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)的纯化及组装：
[0111] 将发酵获得的C2工程菌置于500ml不锈钢杯中，冰上融化，加入200ml裂菌缓冲液(4℃)，用搅拌器搅拌，调节电动搅拌器保持在低转速，搅拌上述菌体混合物15分钟，使菌体分散均匀，无块状菌体，冰上放置备用。用高压均质机(950-1050bar)裂解菌体，裂10个循环。将裂解物分别移入50ml离心管内，离心分离(11000r/min，4℃，20分钟)。离心后，留取上清，移入500ml玻璃瓶中，立即上柱纯化。采用Sepharose 4B镍亲和层析纯化C2。以4个柱体积用的NiSO4·6H2O溶液(100.0mmol/L)将镍离子吸附到Sepharose 4B上，流速1.0ml/min。以平衡缓冲液1(Tris 0.02M，NaCl 0.5M，咪唑0.5M，pH8.0)平衡Sepharose 4B镍亲和层析柱(简称镍柱)，用4个柱体积，流速1.0ml/min。接着以平衡缓冲液2(Tris 0.02M，NaCl
0.5M，咪唑0.01M，0.01Mβ-巯基乙醇，5％甘油，0.05％Tween 80，pH8.0)平衡镍柱。用4个柱体积，流速1.0ml/min。用平衡2缓冲液将离心收集的C2工程菌裂解物上清稀释1倍，启动恒流泵上样，流速1ml/min。用洗涤缓冲液(Tris 0.02M，NaCl 0.5M，咪唑0.04M，0.01Mβ-巯基乙醇，5％甘油，0.05％Tween 80，pH8.0)过夜洗涤，流速为0.3ml/min。用洗脱缓冲液(Tris
0.02M，NaCl 0.5M，咪唑0.5M，0.05Mβ-巯基乙醇，5％甘油，0.05％Tween 80，pH8.0)洗脱C2。
用于SDS-PAGE检测纯化的C2的纯度、分子量和含量(图-5)。
0.5M，咪唑0.01M，0.01Mβ-巯基乙醇，5％甘油，0.05％Tween 80，pH8.0)平衡镍柱。用4个柱体积，流速1.0ml/min。用平衡2缓冲液将离心收集的C2工程菌裂解物上清稀释1倍，启动恒流泵上样，流速1ml/min。用洗涤缓冲液(Tris 0.02M，NaCl 0.5M，咪唑0.04M，0.01Mβ-巯基乙醇，5％甘油，0.05％Tween 80，pH8.0)过夜洗涤，流速为0.3ml/min。用洗脱缓冲液(Tris
0.02M，NaCl 0.5M，咪唑0.5M，0.05Mβ-巯基乙醇，5％甘油，0.05％Tween 80，pH8.0)洗脱C2。
用于SDS-PAGE检测纯化的C2的纯度、分子量和含量(图-5)。
[0112] 将纯化的C2在4℃条件下，采用组装液(Na2HPO4 50.0mM，NaH2PO4 50.0mM，NaCl 0.50M，Tween80 0.03％，EDTANa2.2H2O，pH＝6.5)透析10小时。在透析后，C2组装成了病毒样颗粒(图-6)。
[0113] 实施例5 重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)在小鼠的免疫效力：
[0114] 采用C2疫苗免疫小鼠。在免疫后分离血清，用灭活圆环病毒(PCV2b)包板做ELISA检测抗体。
[0115] 5.1免疫小鼠
[0116] 5.1.1小鼠
[0117] ICR小鼠(吉林大学医学部动物室)，雌性，体重为17-18克。
[0118] 5.1.2抗原
[0119] C2蛋白
[0120] 5.1.3佐剂
[0121] 水包油(白油)乳化剂
[0122] 5.1.4疫苗的配制
[0123] 用水包油(白油)乳化剂乳化C2制成C2疫苗，每100μl疫苗中含3μg C2。
[0124] 5.1.5免疫小鼠
[0125] 将小鼠随机分成C2疫苗组和PBS组，每组11只。在第0天和第14天各免疫1次，方法是右后肢单点肌肉注射注射100μl C2疫苗或100μl PBS。两组小鼠分笼饲养。接种前采血，确定小鼠为PCV2b特异性抗体阴性。
[0126] 5.1.6免疫后采血
[0127] 在2次免疫后14天自小鼠尾静脉采血，采血量≥100μl。将采集的全血(1.5mlEP管中)室温放置30分钟。11000rpm离心15分钟，收集血清，分装，-20℃保存。
[0128] 5.2小鼠血清中的圆环病毒(PCV2b)特异性抗体检测
[0129] 用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中的PCV 2b特异性抗体。
[0130] 5.2.1包被抗原
[0131] 灭活圆环病毒(PCV2b)(天津瑞普生物技术股份有限公司，TCID50/ml＝7.0)。
[0132] 5.2.2试验器材
[0133] 酶标条(组合式酶标板)，0.5mlEP管，1.5mlEP管，加样器头，移液器，多道移液器，平皿(直径9cm)和刻度玻璃瓶等。
[0134] 5.2.3试剂
[0135] 碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，KCl(北京化工厂)，Na2HPO4·12H2O(国药集团化学试剂有限公司)，KH2PO4(天津市永大化学试剂开发中心)，吐温20(天津市光复精细化工研究所)，脱脂奶粉(Biotopped)，柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)，OPD(上海三浦化工有限公司)，30％H2O2(北京化工厂)，浓硫酸(北京化工厂)和戊二醛(天津市福晨化学试剂厂)。
[0136] 5.2.4实验步骤
[0137] (1)用灭活PCV 2b(1∶50稀释)包被酶标板，包被液是含0.8％戊二醛的PBS，100μl/孔，4℃过夜；
[0138] (2)用含5％脱脂奶粉的洗涤液封闭，200μl/孔，37℃2小时。洗涤液为含0.05％吐温20的PBS(7.3mol/L NaCl，3mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4·12H2O，17.6mmol/L KH2PO4)；
[0139] (3)洗涤，甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，重复洗涤两次；
[0140] (4)加入用封闭液1∶100稀释的小鼠血清，100μl/孔，4℃过夜；
[0141] (5)吸弃液体，洗涤，洗涤液及方法同上；
[0142] (6)加酶标抗体。甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加入用封闭液1∶2500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的(羊抗小鼠)IgG，100μl/孔，37℃1小时；
[0143] (7)显色。甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加入底物液100μl/孔，37℃避光显色15min。10ml底物液(即配即用)的配制方法是：取1ml 10X甲乙液，加双蒸水9ml、OPD 10μg(充分溶解)和15μl 30％H2O2。10X甲乙液由10X甲液(0.914Mol/L柠檬酸)和10X乙液(2Mol/L Na2HPO4.12H2O)按47.2体积：50体积比配成；
[0144] (8)用终止液(硫酸2mmol/L)终止酶显色反应，50ul/孔；
[0145] (9)用酶标仪(492nm)测OD值并拍照。
[0146] 5.3结果
[0147] C2能在小鼠诱导出PCV2b特异性抗体(图-7)，P＜0.01。这说明重组改构PCV2b衣壳蛋白可以作为抗原被用于抗猪圆环病毒感染疫苗的制备，也说明重组改构PCV2b衣壳蛋白可被用做抗原来检测猪圆环病毒特异性抗体。
[0148] 实施例6 重组改构PCV2b衣壳蛋白(C2)在猪的免疫效力：
[0149] 采用C2疫苗免疫猪。在免疫后分离血清，用科前猪圆环2型ELISA抗体检测试剂盒检测抗体判断疫苗的效力。平行采用瑞普诸元妥疫苗和科前科圆宁进行相同的实验做疫苗效力比较。实验在天津瑞普生物技术股份有限公司完成。
[0150] 6.1免疫猪
[0151] 6.1.1猪
[0152] 14-21日龄健康易感仔猪，PCV2抗体阴性、PCV2抗原阴性。
[0153] 6.1.2疫苗
[0154] 瑞普诸元妥疫苗(效价107 25TCID50/ml)、科前科圆宁、C2蛋白(序列表<400>3)疫苗(运用量100μg/头份，按水油比3∶1的比例用白油乳化剂配制)
[0155] 6.1.3免疫
[0156] 颈部肌肉注射疫苗2ml疫苗。
[0157] 6.1.4观察记录
[0158] 记录猪群健康状况、生长发育情况、比较接种不同疫苗的猪生长均匀度等。
[0159] 6.1.5采血
[0160] 在免疫后第6周采集血清。
[0161] 6.2特异性抗体检测
[0162] 采用科前猪圆环2型ELISA抗体检测试剂盒进行结果判定(阳性：OD450值＞0.43；阴性：OD450值＜0.25)。
[0163] 6.3结果
[0164] 如图-8所示，在免疫后第6周，C2蛋白(序列表<400>3)疫苗诱生的圆环病毒特异性抗体高于诸元妥疫苗诱生的圆环病毒特异性抗体、显著高于科圆宁诱生的圆环病毒特异性抗体。此外，在免疫后第6周观察到的生产性能显示，接种瑞普诸元妥疫苗和接种C2蛋白疫苗组的猪生长均匀、被毛光滑、精神状态好；接种科圆宁组猪略显瘦弱，生长均匀度较差。这说明重组改构PCV2b衣壳蛋白可以作为抗原被用于抗猪圆环病毒感染疫苗的制备，也说明重组改构PCV2b衣壳蛋白可被用做抗原来检测猪圆环病毒特异性抗体。
[0165] 实施例7 C2和D重组蛋白诱导诱骗抗体的比较：
[0166] 采用C2和D重组蛋白抗原疫苗免疫小鼠。在免疫后分离血清，用PCV2衣壳蛋白(169-180)寡肽包板做ELISA检测抗体。
[0167] 7.1免疫小鼠
[0168] 7.1.1小鼠
[0169] ICR小鼠(吉林大学医学部动物室)，雌性，体重为17-18克。
[0170] 7.1.2抗原
[0171] D蛋白(简称D)是采用大肠杆菌表达的PCV2b衣壳蛋白[Fang M，et al.Intervirology.2015；58(5)：318-23]，由如序列表<400>1所示的DNA编码。D蛋白能组装成病毒样颗粒(Virus like particls，VLPs)。采用SDS-PAGE检测，D蛋白(D)显示为分子量为28.9KD的区带。在电镜下(4万倍放大)观察，D蛋白形成的VLP的大小约为17nM，该VLP和圆环病毒颗粒在形态上几乎一样。D蛋白是全长的重组PCV2b衣壳蛋白，含圆环病毒衣壳蛋白的逃逸表位[CP(169-180)]。
[0172] C2蛋白(序列表<400>3)，简称C2。
[0173] 7.1.3佐剂
[0174] 水包油(白油)乳化剂
[0175] 7.1.4疫苗的配制
[0176] 用水包油(白油)乳化剂乳化D或C2，制成D蛋白疫苗和C2疫苗，每100μl疫苗中含2.5μg抗原。
[0177] 7.1.5免疫小鼠
[0178] 于第0天对小鼠进行初次免疫，方法是注射100μl D蛋白疫苗或C2疫苗，注射部位是右后肢肌肉，单点注射。于第14天对小鼠进行加强免疫，方法同上。
[0179] 7.1.6免疫前采血
[0180] 在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。经小鼠尾静脉采血，采血量≥100μl。将采集的全血(1.5mlEP管中)室温放置30分钟。11000rpm离心15分钟，收集血清，分装，-20℃保存。
[0181] 7.1.7.免疫后采血
[0182] 在1免后14天，2免后14、28、42天，采小鼠、分离血清，方法如免疫前采血(8.1.6)。
[0183] 7.2免疫小鼠血清抗体检测
[0184] 采用ELISA检测血清中的特异性抗体
[0185] 7.2.1包被抗原
[0186] 采用PCV2衣壳蛋白(169-180)寡肽[也称CP(169-180)]做包被抗原[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，13508-13514；Trible BR，et al.2011.Clin.Vaccine Immunol.18：749-757；Trible BR，et al.2012.Vaccine 30：4079-
4085]。
4085]。
[0187] 7.2.2试验器材
[0188] 酶标条(组合式酶标板)，0.5mlEP管，1.5mlEP管，加样器头，移液器，多道移液器，平皿(直径9cm)，刻度玻璃瓶。
[0189] 7.2.3试剂
[0190] 碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，KCl(北京化工厂)， Na2HPO4·12H2O(国药集团化学试剂有限公司)，KH2PO4(天津市永大化学试剂开发中心)，吐温20(天津市光复精细化工研究所)，脱脂奶粉(Biotopped)，柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)，OPD(上海三浦化工有限公司)，30％H2O2(北京化工厂)，浓硫酸(北京化工厂)和戊二醛(天津市福晨化学试剂厂)。
[0191] 7.2.4ELISA的基本步骤
[0192] (1)用CP(169-180)(4μg/ml)在碳酸盐缓冲液(15mmol/L碳酸钠和35mmol/L碳酸氢钠水溶液)中包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜包被。
[0193] (2)用含5％脱脂奶粉的洗涤液封闭，150μl/孔，37℃1小时洗涤液为含0.05％吐温20的PBS(7.3mol/L NaCl，3mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4·12H2O，17.6mmol/LKH2PO4)；
[0194] (3)洗涤，甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，重复洗涤两次；
[0195] (4)加入用封闭液1∶10000稀释的小鼠血清，100μl/孔，4℃过夜；
[0196] (5)吸弃液体，洗涤，洗涤液及方法同上；
[0197] (6)加酶标抗体，同实施例5；
[0198] (7)显色。同实施例5；
[0199] (8)用终止液(硫酸2mmol/L)终止酶显色反应，50ul/孔；
[0200] (9)用酶标仪(492nm)测OD值。
[0201] 7.3结果
[0202] 如图-9所示，和D蛋白不同，C2(序列表<400>3)不能诱导针对圆环病毒衣壳蛋白逃逸表位的抗体。这说明，C2可以因避免诱生猪圆环病毒逃逸抗体而作为更有效的抗原被用于制备抗猪圆环病毒感染的疫苗。
[0203] 实施例8 PCV2b衣壳蛋白编码基因的获取：
[0204] 采用PCR(聚合酶链式反应)方法从感染PCV2b猪淋巴结细胞放大出PCV2b全长衣壳蛋白(CP)的编码基因，该基因编码的蛋白被称为P蛋白，该基因也被称为P蛋白编码基因。P蛋白编码基因被克隆到T载体质粒(Takara，图-18)中。克隆有P蛋白编码基因的T-载体质粒(T-P)保存在JM109宿主菌中。P蛋白编码基因具有如序列表<400>4所示的核苷酸序列。
[0205] 实施例9 重组改构PCV2b衣壳蛋白(Cβ)编码基因的获取：
[0206] 以P蛋白编码基因为模板，采用PCR和分子克隆的方法获得改构PCV2b衣壳蛋白(Cβ)编码基因，Cβ编码基因具有如序列表<400>5所示的序列。
[0207] 将Cβ编码基因克隆在T载体质粒(Takara，图-18)，获得携带Cβ编码基因的重组T载体质粒(T-Cβ)，将T-Cβ酶切转化入JM109细胞，获得克隆菌。以5’引物(AGATCTGTCGACAACAAGCCGCCAACATGACGTAT)和3’引物(ACGGCCAAGCTTTCACTTAGGGTTAA)，以T-Cβ为模板做PCR，扩增的产物在琼脂糖凝胶电泳显示长度为743bp的片段(图10)，该长度与预期的一致。
[0208] 以M13+(-47)(AGGGTTTTCCCAGTCACG)为测序引物对T-Cβ中的Cβ编码基因做DNA测序，所测得的序列与预计的完全一致。
[0209] 以T-Cβ为模板，采用5’引物(AGATCTGTCGACA ATGACGTAT)含有SalI切点(GTCGAC)和Kozak序列( )和3’引物(ACGGCCAAGCTTTCACTTAGGGTTAA)含有Hind III切点(AAGCTT)做PCR获得两侧带有SalI切点(GTCGAC)和Hind III切点(AAGCTT)的Cβ编码基因(SalI-Cβ-Hind III)。
[0210] 以T-Cβ为模板，采用用5’引物(CTCGAGAACAAGCCGCCAACATGACGTAT)和3’引物(ACGGCCGGTACCTCACTTAGGGTTAA)做PCR获得两侧带Xho I(CTCGAG)和Kpn I限制性内切酶切点(GGTACC)的Cβ编码基因(Xho I-Cβ-Kpn I)。
[0211] 实施例10、重组供体质粒pFastBac Dual-2Cβ的获取作用：
[0212] 将SalI-Cβ-Hind III克隆入T载体质粒(Takara，图-18)，获得携带SalI-Cβ-Hind III基因的重组T载体质粒(T-SalI-Cβ-Hind III)。将T-SalI-Cβ-Hind III转化入JM109细胞中扩增，提取T-SalI-Cβ-Hind III。用Sal I和Hind III消化T-SalI-Cβ-Hind III，获得两侧带有Sal I和Hind III粘性末端 的Cβ编码基因。用Sal I和Hind III消化pFastBac Dual(图-11)获得线性化的带有Sal I和Hind III粘性末端的pFastBac Dual。pFastBac Dual(Invitrogen)是一种含polyhedrin(PH)启动子(简称PH)和p10启动子(简称p10)的转递质粒[于永利 微生物学免疫学进展，2015年8月第43卷第4期，1-15]，可在大肠杆菌中将PH及其下游的基因(外源基因)和p10及其下游的基因(外源基因)转座到杆状病毒的基因组DNA上。克隆到pFastBac Dual PH和p10下游的外源基因可以是相同的，也可以是不同的。在本发明中，为了提高表达量，将同样的Cβ编码基因分别克隆到pFastBac Dual PH和p10的下游。具体做法是：将两侧带有Sal I和Hind III粘性末端的Cβ编码基因连接入pFastBac Dual PH启动子(图-11)的下游，获得PH-Cβ-pFastBac Dual(PH-Cβ)。将Xho I-Cβ-Kpn I克隆入T载体质粒(Takara，图-18)获得携带Xho I-Cβ-Kpn I基因的T载体质粒(T Xho I-Cβ-Kpn I)，将T Xho I-Cβ-Kpn I转化入JM109细胞中扩增，提取T-Xho I-Cβ-Kpn I。用Xho I和Kpn I消化T-Xho I-Cβ-Kpn I获得两侧带有Xho I和Kpn I粘性末端的Cβ编码基因。用Xho I和Kpn I消化PH-Cβ-pFastBac Dual(PH-Cβ)，获得线性化的带有Xho I和Kpn I粘性末端的PH-Cβ-pFastBac Dual(PH-Cβ)。将两侧带有Xho I和Kpn I粘性末端的Cβ编码基因连接入PH-Cβ-pFastBac Dual(PH-Cβ)P10启动子下游(图-11)，获得P10-Cβ-PH-C β-pFastBac Dual载体(pFastBac Dual-2Cβ)。pFastBac Dual-2Cβ即为携带Cβ编码基因的转递质粒。经DNA测序鉴定，Cβ编码基因已被正确地克隆到了PH和p10的下游。Cβ编码基因具有如序列表<400>5所示的核苷酸序列。
[0213] 实施例11、重组杆状病毒Bac-2Cβ的获取及Cβ的表达：
[0214] 将pFastBac Dual-2Cβ转化至DH10bac感受态细胞(Invitrogen)。DH10bac感受态细胞是携带Bacmid和辅助质粒的大肠杆菌。Bacmid[于永利 微生物学免疫学进展，2015年8月第43卷第4期，1-15]是组装有细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosomes，BACs)的杆状病毒DNA(BV DNA)。由于BACs的存在，Bacmid可以维持在大肠杆菌中，并可随大肠杆菌的生长而扩增。对细菌而言，Bacmid是“大质粒”。有了Bacmid，并在Bacmid上组装有细菌Tn7转座子，这使外源基因重组到杆状病毒(BV)的过程得以在细菌内完成。辅助质粒编码转座酶，其编码的转座酶可将转递质粒上携带外源基因的表达元件借助其两侧的Tn转座子左右“臂”转座入Bacmid。在DH10bac感受态细胞(Invitrogen)中，pFastBac Dual-2Cβ中的Cβ基因表达元件(Expression cassettes)和Bacmid发生了转座重组，生成了重组BV(Bacmid-2Cβ)。Bacmid-2Cβ是具有转染/感染性的重组BV DNA，携带的Cβ基因表达元件主要由Ph启动子和P10启动子及其下游的Cβ编码基因组成。采用含抗庆大霉素半固体培养基对含有Bacmid-2Cβ的大肠杆菌进行蓝白筛选[于永利 微生物学免疫学进展，2015年8月第43卷第4期，1-15]。挑取挑取白色单菌落(图-12)，扩增培养，提取Bacmid-2Cβ。
[0215] 用Bacmid-2Cβ转染的Sf9细胞，以杆状病毒(Baculovirus)感染Sf9细胞和未转/感染Sf9细胞为对照。在第三天，转染Bacmid-2Cβ的和感染杆状病毒的Sf9细胞出现明显的细胞病变(图-12)，提示Bacmid-2C β在Sf9细胞中已组装成转座有Cβ基因表达元件的重组杆状病毒(Bac-2Cβ)，且Bac-2Cβ已在Sf9细胞中大量复制。在第8天，转染Bacmid-2C’的和感染杆状病毒的Sf9细胞几乎全部裂解(图-12)。取Bacmid-2C β转染第3天后的细胞培养上清，此为第一代Bac-2Cβ(Bac-2Cβ-1)。分装4℃保存。同时收取Bacmid-2C β转染细胞沉淀用于Cβ蛋白表达的鉴定(图-13)。
[0216] 用Bac-2Cβ-1感染Sf9细胞，在第5天，细胞出现明显病变，收取上清，此为第二代Bac-2Cβ(Bac-2C β-2)，分装4℃保存，同时收取细胞沉淀(Bac-2Cβ-2细胞沉淀)用于Cβ的表达鉴定(图-13)。用Bac-2C β-2感染Sf9细胞，在第5天，细胞出现明显病变病变，收取上清，此为第三代Bac-2Cβ(Bac-2Cβ-3)，同时收取细胞沉淀(Bac-2Cβ-3细胞沉淀)用于Cβ的表达鉴定(图-13)。对Bac-2Cβ-1，Bac-2Cβ-2和Bac-2C β-3也进行了PCR鉴定，确定了Cβ基因表达元件的存在。
[0217] 将Bac-2Cβ-1，Bac-2Cβ-2和Bac-2Cβ-3细胞沉淀用上样缓冲液裂解做SDS-PAGE电泳和Western blot分析。以P蛋白(昆虫杆状病毒表达系统表达的PCV2b衣壳蛋白)、D蛋白(大肠杆菌表达系统表达的PCV2b衣壳蛋白)[FangM，et al.Intervirology.2015；58(5)：318-23]作为对照。SDS-PAGE结果显示，在Bac-2C β-1，Bac-2Cβ-2和Bac-2Cβ-3细胞中均表达了分子量约为27.7KD的蛋白，分子量大小与预期一致。 Western blot的结果显示，这些蛋白可被D蛋白免疫豚鼠血清(1∶100稀释)识别。这些结果(图13)表明，已获取了Bac-2Cβ，Bac-2Cβ可感染Sf9细胞，并表达Cβ。Cβ具有如序列表<400>6所示的氨基酸序列。
[0218] 用Bac-2Cβ-3感染Sf9细胞，3天后收集细胞，将收集的细胞悬于组装液[(Na2HPO4·12H2O(0.05M)，NaH2PO4·2H2O(0.05M)，NaCl(0.5M)，Tween80(0.03％)，乙二胺四乙酸二钠(0.001M)]中，超声(200W，工作20次，每次5s)裂解细胞，离心后收取上清，在电镜(4万倍放大)下观察，可见到由Cβ组成的颗粒，颗粒的直径约为20nm(图-14)。这说明，可组装成类VLP颗粒。
[0219] 实施例12 重组改构PCV2b衣壳蛋白(Cβ)在小鼠的免疫效力：
[0220] 采用Cβ作为抗原制成的疫苗免疫小鼠。在免疫后分离血清，检测血清中的圆环病毒特异性抗体。
[0221] 12.1免疫小鼠
[0222] 12.1.1小鼠
[0223] ICR小鼠(吉林大学医学部动物室)，雌性，体重为17-18克。
[0224] 12.1.2抗原
[0225] 用Bac-2Cβ-3感染Sf9细胞，3天后收集细胞，将收集的细胞悬于组装液[(Na2HPO4·12H2O(0.05M)，NaH2PO4·2H2O(0.05M)，NaCl(0.5M)，Tween80(0.03％)，乙二胺四乙酸二钠(0.001M)]中，采用高压均质机裂解细胞(700ba，4个循环)超声。离心(4000转，5分钟)收集上清。上清中含纯度＞85％的C β蛋白(图-15)。用此Cβ蛋白(序列表<400>6)做抗原免疫小鼠。
[0226] 13.1.3佐剂
[0227] 水包油(白油)乳化剂
[0228] 13.1.4疫苗的配制
[0229] 用水包油(白油)乳化剂乳化Cβ制成Cβ疫苗，每100μl疫苗中含3μg Cβ。
[0230] 13.1.5免疫小鼠
[0231] 将小鼠随机分成Cβ疫苗组和PBS组，每组11只。在第0天和第14天各免疫1次，方法是右后肢单点肌肉注射注射100μl C2疫苗或100μl PBS。两组小鼠分笼饲养。接种前采血，确定小鼠为PCV2b特异性抗体阴性。
[0232] 13.1.6免疫后采血
[0233] 在2次免疫后14天自小鼠尾静脉采血，采血量≥100μl。将采集的全血(1.5mlEP管中)室温放置30分钟。11000rpm离心15分钟，收集血清，分装，-20℃保存。
[0234] 13.2小鼠血清中的圆环病毒(PCV2b)特异性抗体检测
[0235] 用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中的PCV 2b特异性抗体。
[0236] 13.2.1包被抗原
[0237] 灭活圆环病毒(PCV2b)(天津瑞普生物技术股份有限公司，TCID50/ml＝7.0)。
[0238] 13.2.2试验器材
[0239] 酶标条(组合式酶标板)，0.5mlEP管，1.5mlEP管，加样器头，移液器，多道移液器，平皿(直径9cm)和刻度玻璃瓶等。
[0240] 13.2.3试剂
[0241] 碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，KCl(北京化工厂)，Na2HPO4·12H2O(国药集团化学试剂有限公司)，KH2PO4(天津市永大化学试剂开发中心)，吐温20(天津市光复精细化工研究所)，脱脂奶粉(Biotopped)，柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)，OPD(上海三浦化工有限公司)，30％H2O2(北京化工厂)，浓硫酸(北京化工厂)和戊二醛(天津市福晨化学试剂厂)。
[0242] 13.2.4实验步骤
[0243] (1)用灭活PCV 2b(1∶50稀释)包被(瑞普)酶标板，包被液是含0.8％戊二醛的PBS，100μl/孔，4℃过夜；
[0244] (2)用含5％脱脂奶粉的洗涤液封闭，200μl/孔，37℃2小时。洗涤液为含0.05％吐温20的PBS(7.3mol/L NaCl，3mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4·12H2O，17.6mmol/LKH2PO4)；
[0245] (3)洗涤，甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，重复洗涤两次；
[0246] (4)加入用封闭液1∶100稀释的小鼠血清，100μl/孔，4℃过夜；
[0247] (5)吸弃液体，洗涤，洗涤液及方法同上；
[0248] (6)加酶标抗体。甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加入用封闭液1∶2500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的(羊抗小鼠)IgG，100μl/孔，37℃1小时；
[0249] (7)显色。甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加入底物液100μl/孔，37℃避光显色15min。10ml底物液(即配即用)的配制方法是取1ml10X甲乙液，加双蒸水9ml、OPD 10μg(充分溶解)和15μl 30％H2O2。10X甲乙液由10X甲液(0.914Mol/L柠檬酸)和10X乙液(2Mol/L Na2HPO4.12H2O)按47.2体积∶50体积比配成；
[0250] (8)用终止液(硫酸2mmol/L)终止酶显色反应，50ul/孔；
[0251] (9)用酶标仪(492nm)测OD值并拍照。
[0252] 13.3结果
[0253] Cβ(序列表<400>6)能在小鼠诱导出PCV2b特异性抗体(图-16)，P＜0.01。这说明重组改构PCV2b衣壳蛋白可以作为抗原被用于抗猪圆环病毒感染疫苗的制备，也说明重组改构PCV2b衣壳蛋白可被用做抗原来检测猪圆环病毒特异性抗体。
[0254] 实施例13 Cβ和D蛋白诱导诱骗抗体的比较：
[0255] 采用Cβ和D蛋白作为抗原制成的疫苗免疫小鼠。在免疫后分离血清，检测血清中由圆环病毒衣壳蛋白诱骗表位产生的抗体。
[0256] 13.1免疫小鼠
[0257] 13.1.1小鼠
[0258] ICR小鼠(吉林大学医学部动物室)，雌性，体重为17-18克。
[0259] 13.1.2抗原
[0260] D蛋白(简称D)。D蛋白是采用大肠杆菌表达的PCV2b衣壳蛋白[Fang M，et al.Intervirology.2015；58(5)：318-23]。D蛋白能组装成病毒样颗粒(Virus like particls，VLPs)。采用SDS-PAGE检测，D蛋白(D)显示为分子量为28.9KD的区带。在电镜下(4万倍放大)观察，D蛋白形成的VLP的大小约为17nM，该VLP和圆环病毒颗粒在形态上几乎一样。D蛋白是全长的重组PCV2b衣壳蛋白，含圆环病毒衣壳蛋白的逃逸表位[CP(169-180)]。
[0261] Cβ蛋白。用Bac-2Cβ-3感染Sf9细胞，3天后收集细胞，将收集的细胞悬于组装液[(Na2HPO4·12H2O(0.05M)，NaH2PO4·2H2O(0.05M)，NaCl(0.5M)，Tween80(0.03％)，乙二胺四乙酸二钠(0.001M)]中，采用高压均质机裂解细胞(700ba，4个循环)超声。离心(4000转，5分钟)收集上清。上清中含纯度＞85％的Cβ蛋白(图-15)。用此Cβ蛋白(序列表<400>6)做抗原免疫小鼠。
[0262] 13.1.3佐剂
[0263] 水包油(白油)乳化剂
[0264] 13.1.4疫苗的配制
[0265] 用水包油(白油)乳化剂分别乳化D蛋白或C2，制成D蛋白疫苗和Cβ疫苗，每100μl疫苗中含2.5μg抗原。
[0266] 13.1.5免疫小鼠
[0267] 于第0天对小鼠进行初次免疫，方法是在右后肢肌肉注射100μl D蛋白疫苗或C2疫苗。于第14天对加强免疫，方法同上。
[0268] 13.1.6免疫前采血
[0269] 在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。尾静脉采血，采血量≥100μl。将采集的全血(1.5mlEP管中)室温放置30分钟。11000rpm离心15分钟，收集血清，分装，-20℃保存。
[0270] 13.1.7.免疫后采血
[0271] 在初次免疫后14天，加强免疫后14、28、42天，采小鼠血分离血清，方法如13.1.6。
[0272] 13.2免疫小鼠血清抗体检测
[0273] 采用ELISA检测血清中的特异性抗体
[0274] 13.2.1包被抗原
[0275] 采用PCV2衣壳蛋白(169-180)寡肽，也称CP(169-180)，做包被抗原[Trible，B.R.，et al.Journal of virology，2012，86，13508-13514；Trible BR，et al.2011.Clin.Vaccine Immunol.18：749-757；Trible BR，et al.2012.Vaccine 30：4079-
4085]。CP(169-180)是圆环病毒衣壳蛋白上的诱骗表位。
4085]。CP(169-180)是圆环病毒衣壳蛋白上的诱骗表位。
[0276] 13.2.2试验器材
[0277] 酶标条(组合式酶标板)，0.5mlEP管，1.5mlEP管，加样器头，移液器，多道移液器，平皿(直径9cm)和刻度玻璃瓶等。
[0278] 13.2.3试剂
[0279] 碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，KCl(北京化工厂)，Na2HPO4·12H2O(国药集团化学试剂有限公司)，KH2PO4(天津市永大化学试剂开发中心)，吐温20(天津市光复精细化工研究所)，脱脂奶粉(Biotopped)，柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)，OPD(上海三浦化工有限公司)，30％H2O2(北京化工厂)，浓硫酸(北京化工厂)和戊二醛(天津市福晨化学试剂厂)。
[0280] 13.2.4ELISA的基本步骤
[0281] (1)用CP(169-180)(4μg/ml)在碳酸盐缓冲液(15mmol/L碳酸钠和35mmol/L碳酸氢钠水溶液)中包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜包被。
[0282] (2)用含5％脱脂奶粉的洗涤液封闭，150μl/孔，37℃ 1小时。洗涤液为含0.05％吐温20的PBS(7.3mol/L NaCl，3mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4·12H2O，17.6mmol/LKH2PO4)；
[0283] (3)洗涤，甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，重复洗涤两次；
[0284] (4)加入用封闭液1∶10000稀释的小鼠血清，100μl/孔，4℃过夜；
[0285] (5)吸弃液体，洗涤，洗涤液及方法同上；
[0286] (6)加酶标抗体，同实施例12；
[0287] (7)显色。同实施例12；
[0288] (8)用终止液(硫酸2mmol/L)终止酶显色反应，50μl/孔；
[0289] (9)用酶标仪(492nm)测OD值。
[0290] 13.3结果
[0291] 如图-17所示，和D蛋白不同，Cβ(序列表<400>6)不能诱导针对圆环病毒衣壳蛋白逃逸表位的抗体。
[0292] 这说明，C2可以因避免诱生猪圆环病毒逃逸抗体而作为更有效的抗原被用于制备抗猪圆环病毒的疫苗。
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