饮水用或饲料添加用组合物
阅读：505发布：2021-01-23
专利汇可以提供饮水用或饲料添加用组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种饮 水 用或 饲料 添加用组合物，其含有用水或 有机 溶剂 提取包含川芎、防 风 、当归、芍药、连翘、薄荷叶、麻黄、 芒硝 、大黄、 石膏 、桔梗、黄芩、白术、山栀子、荆芥、生姜、滑石、甘草、淫羊藿、金 银 花、远志及木香的药材的生药提取物。本发明的组合物显著提高牲畜的增重率和体重增加量的绝对值，明显提高生命体征分数，因此，可有效提高畜产动物，尤其是虚弱断奶仔猪的 饲料效率 及体重。，下面是饮水用或饲料添加用组合物专利的具体信息内容。
1.生药提取物在制备饮水用或饲料添加用组合物中的用途，所述生药提取物为用水或有机溶剂提取在1重量份的淫羊藿中分别以0.5～5重量份的混合比混合川芎、防风、当归、芍药、连翘、薄荷叶、麻黄、芒硝、大黄、石膏、桔梗、黄芩、白术、山栀子、荆芥、生姜、滑石、甘草、金银花、远志及木香的生药的生药提取物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，
所述有机溶剂选自由C1-C4的醇、C1-C4的酮、C1-C4的醛及所述醇、酮及醛的水溶液构成的组中的一种。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物还包括一种以上的酶制剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，
所述酶制剂选自由脂肪酶、植酸酶、淀粉酶、磷酸酯酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、麦芽糖酶及转化酶构成的组中的一种。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物还包括非致病性的其他微生物。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，
所述微生物选自由乳杆菌属的微生物、米曲霉及酿酒酵母构成的组中的一种。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物还包括一种以上的氨基酸。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的用途，其中所述组合物改善猪繁殖与呼吸综合症病毒或猪圆环病毒2型病毒导致的临床症状。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，
所述临床症状为选自由体重下降、猪繁殖与呼吸综合症、断奶后多系统衰竭综合症、猪皮炎肾病综合症、猪呼吸道疾病综合症、流产、死产及渗出性皮炎构成的组中的一种。
10.生药提取物在制备含有饮水用或饲料添加用组合物的饲料中的用途，所述生药提取物为用水或有机溶剂提取在1重量份的淫羊藿中分别以0.5～5重量份的混合比混合川芎、防风、当归、芍药、连翘、薄荷叶、麻黄、芒硝、大黄、石膏、桔梗、黄芩、白术、山栀子、荆芥、生姜、滑石、甘草、金银花、远志及木香的生药的生药提取物。
饮水用或饲料添加用组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及饮水用或饲料添加用组合物，尤其涉及可改善由猪繁殖与呼吸综合症病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，下称“PRRSV”）及/或猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type2，下称“PCV-2”）的感染导致的各种临床症状的饮水用或饲料添加用组合物。
背景技术
[0002] 饲料是维持牲畜的生命，提供生产奶、肉、蛋、毛皮所需的有机或无机营养素的物质，好饲料需营养素含量高，无对牲畜有害的组合物，产量高，而且，容易得到，始终新鲜，消化率高。现在，饲育牲畜的饲料大部分使用谷物，而近来随着人口的激增，作为粮食的谷物的需求大幅增加，将谷物作为饲料的原料变得越来越难，而谷物饲料的不足，制约牲畜饲育的发展。因此，饲料行业为开发能够替代谷物的饲料及提高所利用的饲料的效率而进行不懈的努力，而且，具有能够提高动物的消化功能及吸收率等附加功能的各种饲料添加剂的开发成为饲料行业的重点。
[0003] 饲料添加剂为一种补充饲料，添加于饲料中供应必要的营养素或起到特定效果而提高生产性，具体而言，是以补充缺乏的营养、增进饲料效率及促进生长为目的使用的食用添加剂。饲料添加剂有盐、骨粉、维生素剂、抗生物质、抗菌剂、抗氧化剂、防腐剂、酶制剂、益生菌、氨基酸剂及微量矿物质等。一般是将在以供应能量和蛋白质为主的普通饲料中添加或补充一点而提高饲料效果的物质称之为饲料添加剂，以与预防和治疗疾病为目的的动物药品加以区分。上述饲料添加剂用组合物的开发，通过促进牲畜的肥育和消化最大限度地提高饲料的效率，以减少饲料使用量，而且，通过快速增殖和肥育达到高质量的牲畜生产的目的，提高农民的收入水平，因此，意义非常重大。
[0004] 另外，断奶仔猪中产生的虚弱仔猪，其中的50%是由PRRSV与PCV-2的复合感染引起的圆环病毒相关疾病（Porcine Circovirus Associated Disease，下称“PCVAD”）所导致的。
[0005] 所述PRRSV是表现为繁殖障碍和呼吸系统感染的猪繁殖与呼吸综合症的致病病毒，如被上述病毒感染，致病的程度非常多样，轻则只通过血清检查即可知道感染情况，无临床症状及经济损失，重则将给农场的生产带来20%左右的损失。
[0006] PRRSV导致的繁殖障碍的特征为：集中在妊娠107天至113天之间的妊娠末期流产或早产胎儿分娩、死产及木乃伊仔猪的出现、仔猪的断奶前死亡率激增、断奶后死亡率增加、发情回归的延迟等，而这些症状集中出现在被感染的母猪和该母猪生产的仔猪中。PRRSV感染导致的繁殖障碍大部分经从感染初期到六个月左右的时间即恢复到感染以前的状态。
[0007] PRRSV感染导致的呼吸系统疾病可出现在全部日龄中，尤其集中出现在哺乳仔猪和断奶仔猪中。此时，出现急促的腹式呼吸、眼睑浮肿、结膜炎、打喷嚏、腹泻等症状，有时伴有短暂的体温上升，极少数还会出现神经症状。呼吸系统疾病的特征为：较之PRRSV的单独感染，多为细菌性、病毒性病原体的二次感染及复合感染，而此时，致病性将大幅提高。
[0008] 以上的临床症状在急性发作时表现的非常明显，而在准临床型感染或慢性的情况下，几乎不出现明显且特征性的临床症状。慢性感染主要出现在断奶仔猪和育成肥育阶段，受到PRRSV攻击的呼吸系统被细菌及病毒感染而引起鼻炎和肺炎。结果将导致日平均增重率的下降，饲料使用量增加，而断奶之后的死亡率较之PRRSV感染前的平均死亡率增加两倍左右。
[0009] 另外，PCV-2还是在韩国国内带来最大经济损失的疾病之一的断奶后多系统衰竭综合症（Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的致病病毒。断奶后多系统衰竭综合症在最少六个月到最多三年的持续的时间内，持续降低农场20～40%的生产率，因此，发生断奶后多系统衰竭综合症的农场不能提高生产率，从而遭受严重的经济损失。PCV-2感染所导致的疾病，除了上述断奶后多系统衰竭综合症之外还有猪皮炎肾病综合症（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS），而最近还发现PCV-2与猪呼吸道疾病综合症（porcine respiratory disease complex，PRDC）、流产、死产等生殖系统疾病、渗出性皮炎等的发生也有关联。
[0010] 本发明人对可改善上述PCVAD所导致的各种临床症状的饮水或饲料添加剂进行了研究，结果发现在防风通圣散的原料中包含淫羊藿、金银花、远志及木香的生药之后提取制造的生药提取物，可提高受PCVAD感染的断奶仔猪（虚弱仔猪）群的增重率及生命体征，以此完成本发明。
发明内容
[0011] 本发明的目的在于提供一种提取在防风通圣散的原料中包含淫羊藿、金银花、远志及木香的生药混合物而制造的包含生药提取物的饮水用或饲料添加用组合物。
[0012] 本发明的目的是这样实现的：提供一种饮水用或饲料添加用组合物，其含有在作为防风通圣散的原料的川芎、防风、当归、芍药、连翘、薄荷叶、麻黄、芒硝、大黄、石膏、桔梗、黄芩、白术、山栀子、荆芥、生姜、滑石、甘草中混合包含淫羊藿、金银花、远志及木香等生药而提取的生药提取物。
[0013] 上述生药提取物的制造方法如下：首先向作为防风通圣散的原料的川芎、防风、当归、芍药、连翘、薄荷叶、麻黄、芒硝、大黄、石膏、桔梗、黄芩、白术、山栀子、荆芥、生姜、滑石、甘草的基础上包含淫羊藿、金银花、远志及木香的生药中，添加2～10倍量的水或有机溶剂，较佳为加水之后，在70～125℃的温度条件下提取1～10小时，较佳为3～4小时。但是，除上述热水提取法之外，还可以采用冷浸提取、回流冷凝提取或超声波提取等提取方法。在制造上述生药提取物的过程中，可在1重量份的淫羊藿中各混合0.5～5重量份的川芎、防风、当归、芍药、连翘、薄荷叶、麻黄、芒硝、大黄、石膏、桔梗、黄芩、白术、山栀子、荆芥、生姜、滑石、甘草、金银花、远志及木香的混合比进行制造，但只要能获得所需抗病毒效果，也可采用超出上述混合比的配方。另外，除上述生药原料之外，还可无限制地包含在中医学中用于预防或治疗感冒或重感冒的任何药材。在本发明中，上述有机溶剂可无限制地使用C1-C4的醇、C1-C4的酮、C1-C4的醛及上述醇、酮及醛的水溶液，但不限于此。
[0014] 在制造本发明的饮水用或饲料添加用组合物的过程中，将上述生药提取物稀释于水中用作饮用水，或直接制剂化，或与小麦粉、淀粉、糊精等稀释剂及谷类、粗糠及脱脂米糠等谷糠、油及富含脂肪的种子饼等饲料用原料一同制剂化。
[0015] 另外，本发明的饮水用或饲料添加用组合物可以是干燥或液体状态的制剂形式，而且，还可以包含一个以上的酶制剂。所添加的酶制剂可选用干燥或液体状态的制剂，可从由脂肪酶（lipase）等脂肪分解酶、分解植酸（phytic acid）生成磷酸盐和肌醇磷酸盐的植酸酶（phytase）、水解包含于淀粉和糖原（glycogen）等的α-1,4-糖苷键（α-1,4-glycoside bond）的淀粉酶（amylase）、水解有机磷酸酯的磷酸酶（phosphatase），分解纤维素（cellulose）的羧甲基纤维素酶（carboxymethylcellulase）、分解木糖（xylose）的木聚糖酶（xylanase）、将麦芽糖（maltose）水解为两个分子的葡萄糖（glucose）的麦芽糖酶（maltase）及水解蔗糖（saccharose）形成葡萄糖-果糖（glucose-fructose）混合物的转化酶（invertase）等糖生成酶构成的组中选择使用。
[0016] 另外，本发明的组合物还可以包含非致病性的其他微生物。可添加的微生物有可增加牲畜的体重、提高产奶量、提高饲料的消化吸收率的米曲霉（Aspergillus oryzae）等丝状菌（Slyter，L.L.J.Animal Sci.1976,43.910-926）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等 酵 母（Jhonson,D.E etal.J.Anim.Sci.,1983,56,735-739;Williams,P.E.V.et al,1990,211）及在牛的胃等厌氧条件下具有生理活性及有机物分解能力的乳杆菌（Lactobacillus sp.）等微生物，但不限于此。
[0017] 与此同时，还可适当使用包括经加工或未经加工的各种谷物及大豆蛋白在内的如花生、豌豆、甜菜、浆粕、谷物衍生物、动物内脏粉及鱼粉等的饲料原料。加工过程为在填充饲料原料的状态下挤压，以从一定的排出口挤出的工艺，而在蛋白质的情况下，采用经过变形增加实用性的挤出成型（extrusion）为宜。挤出成型通过热处理过程对蛋白质进行变性，破坏抗酶因子，通过分子结构变化向新部位酶性露出提高蛋白质分解酶的活性。另外，在大豆蛋白的情况下，通过挤出成型提高蛋白质的消化率，灭活存在于大豆的蛋白质分解酶抑制剂之一的胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor）等营养因子，利用蛋白质分解酶提高消化率，以此增加大豆蛋白的营养价值。
[0018] 可使用本发明的组合物的代表性动物有猪、仔猪、肉牛、奶牛、小牛、羊、山羊、马、兔子、狗、猫等家畜；小鸡、蛋鸡、家鸡、公鸡、鸭子、鹅、火鸡、鹌鹑、小鸟等家禽，但不限于此。另外，使用量取决于动物的种类、年龄及其他饲料组合物的种类，从而难以规定一个量，但一般而言，本发明的饲料添加用组合物可相对于100重量份的配合饲料混合0.01～10重量份，以作为辅助饲料为宜。
[0019] 本发明的组合物尤其可用于改善猪繁殖与呼吸综合症病毒及/或猪圆环病毒2型的感染导致的临床症状。上述临床症状包括体重下降、猪繁殖与呼吸综合症、断奶仔猪多系统衰竭综合症、猪皮炎肾病综合症、猪呼吸道疾病综合症、流产、死产及渗出性皮炎，但不限于此。
[0020] 本发明的生药提取物为天然物质，完全没有毒性，因此，可以持续大量使用，对小鼠的毒性实验结果表明，口服毒性实验的半数致死量（LD50）至少为2g/㎏以上，表明是安全的物质。另外，根据本发明的一实现例，在使用本发明的组合物的情况下，较之作为未使用药物的虚弱仔猪群的阴性对照组和作为未使用药物的健康仔猪群的良性对照组，增重率和体重增加量的绝对值显著提升（参考图1及图2）。
[0021] 另外，根据本发明的另一实现例，在平均体重方面，在使用本发明的组合物的情况下，较之作为未使用药物的虚弱仔猪群的阴性对照组，体重增加存在显著的差异（参考图3）。
[0022] 另外，根据本发明的又一实现例，在使用本发明的组合物的情况下，虽然直到实验第0周、第1周实验组的活力没有明显增加，但第2周之后，较之阴性对照组，生命体征分数明显增加（参考图6至图9）。
[0023] 本发明的饮水用或饲料添加用组合物显著提高牲畜的增重率和体重增加量的绝对值，明显提高生命体征分数，因此，可有效提高畜产动物，尤其是虚弱断奶仔猪的饲料效率及体重。
[0025] 图1为表示第RATIO周的相对体重增加率的曲线图，表示A（第0周—第1周）、B（第1周—第2周）、C（第2周—第3周）及D（第3周—第4周）期间的增重率；
[0026] 图2为表示第DIFF周的体重增加量的绝对值的曲线图，表示A（第0周—第1周）、B（第1周—第2周）、C（第2周—第3周）及D（第3周—第4周）期间的体重增加量；
[0027] 图3为表示4周期间的平均体重增加情况的曲线图，黑色表示阳性对照组，蓝色表示阴性对照组，而红色表示实验组；
[0028] 图4为表示在死亡仔猪中各检测出PRRSV（A）及CPV-2（B）的情况的电泳照片；
[0029] 图5为表示死亡仔猪分别具有间质性肺炎（interstitial pneumomia）（A）及胸膜炎（pleuritis）（B）的显微镜照片（×100）；
[0030] 图6为表示阴性对照组、阳性对照组及实验组的不同周的生命体征分数的曲线图；
[0031] 图7至图9分别为表示实验组、阴性对照组及阳性对照组的组分离之后（A）及4周后（B）的饲育状态及生命体征状态的照片；
[0032] 图10至图12分别为表示在没有S9混合物的情况下处理24小时之后、在没有S9混合物的情况下处理6小时之后及在有S9混合物的情况下处理6小时之后发生染色体异常的细胞数的曲线图；
[0033] 图13至图16分别为直接法中的碱基置换型菌株的使用应答曲线、代谢活性法中的碱基置换型菌株的使用应答曲线、直接法中的移码型菌株的使用应答曲线及代谢活性法中的移码型菌株的使用应答曲线。
具体实施方式
[0034] 下面，通过实施例对本发明进行详细说明。
[0035] 但是，下列实施例旨在示例性地说明本发明，而本发明的范围不受下列实施例的限制。
[0036] 实施例1饮水用或饲料添加用组合物的制造
[0037] 所有的生药购买韩国产的作为试验材料。向具有如下表1的构成的精选生药约2,456.5g中添加水15l之后，在常温下放置1小时。接着，在115℃温度条件下进行3小时的热水提取获取约11l体积的生药提取物之后，冷冻干燥上述生药提取物获取约9.6g的冷冻干燥物。将上述生药提取物用于本发明，将试验物质以1%的浓度添加于水用在实验中。
[0038] 表1
[0039]原料名称 重量（g）
川芎 84.5
防风 84.5
当归 84.5
芍药 84.5
连翘 84.5
薄荷叶 84.5
麻黄 84.5
芒硝 84.5
大黄 84.5
石膏 131
桔梗 131
黄芩 131
白术 65.5
山栀子 65.5
荆芥 65.5
生姜 225
滑石 318.5
甘草 225
金银花 84.5
淫羊藿 84.5
远志 84.5
木香 84.5
川芎 84.5
防风 84.5
当归 84.5
芍药 84.5
连翘 84.5
薄荷叶 84.5
麻黄 84.5
芒硝 84.5
大黄 84.5
石膏 131
桔梗 131
黄芩 131
白术 65.5
山栀子 65.5
荆芥 65.5
生姜 225
滑石 318.5
甘草 225
金银花 84.5
淫羊藿 84.5
远志 84.5
木香 84.5
[0040] 实施例2增重率评价
[0041] <2-1>第RATIO周及第DIFF周
[0042] 将有呼吸系统症状，在血清检查中确认存在PRRSV和PCV-2病毒的复合感染，完全无临床症状，生命体征正常的仔猪比率约为60～70%左右的20日龄的断奶仔猪作为虚弱仔猪，并使其适应一天的新环境之后实施实验。实验动物在确保充足空间的3个猪舍内，以23±3℃的温度和50±5%的湿度环境下进行饲育。将在上述实施例1中制造的试验物质用于实验，并严格按食品药品安全评价院的标准作业顺序中的“试验物质的混合及调制（NITR/SOP/TSB/002_02）”实施。通过每周的体重测量计算周间增重率，测量直到断奶仔猪达到49日龄为止的4周之内的增重率。为评价实验结果的统计学上的意义，各实验组的个体数量为10头，相同的实验重复3次之后，对数据进行分析。通过t-检验验证试验药物和对照组的变化数值及误差的意义，而统计程序使用SAS。对于增重率使用下述两种方法：
[0043] （1）第RATIO周=（相应周的体重前周的体重）/前周的体重
[0044] （2）第DIFF周=相应周的体重前周的体重
[0045] 上述RATIO周为对前周的相对体重增加率，表示准确意义上的体重增加率，而第DIFF周为前周和相应周的体重差异，表示所增加的体重的绝对量。
[0046] 结果表明，在第RATIO周的情况下，在第0周—第1周期间的增重率方面，在作为未使用本发明的组合物的虚弱仔猪群的阴性对照组、作为未使用本发明的组合物的健康仔猪群的阳性对照组及药物使用组中没有明显的差异（p<0.01），但经过第3周—第4周之后，药物使用组的增重率较之阴性对照组和阳性对照组得到显著提高（p<0.01）（图1）。
[0047] 另外，在第DIFF周的情况下，也确认了到第3周—第4周实验组的体重增加量的绝对值较之作为未使用本发明的组合物的虚弱仔猪群的阴性对照组存在明显的差异（p<0.01）（图2）。
[0048] <2-2>平均体重的增加情况
[0049] 较之未使用本发明的组合物的虚弱仔猪群的阴性对照组，作为使用本发明的组合物的虚弱仔猪群的实验组的体重增加明显（图3）。
[0050] <2-3>从死亡虚弱仔猪中分离致病病毒
[0051] 在实验过程中，在阴性对照组中出现2头死亡的猪（第2周1头，第3周1头），因此，对上述2头死猪进行了血清分析。具体而言，从死亡的2头猪的血清中提取病毒RNA和病毒DNA之后（PRRSV为RNA病毒，PCV-2为DNA病毒），利用对PRRSV和PCV-2表现出特异性的引物（PRRSV的ORF7、PCV-2的ORF2）通过PCR技术扩增相应基因部位。此时，对PRRSV的引物使用具有记载为序列号1及序列号2的碱基序列的引物（Res Vet Sci.2008Aug;85(1):184-93.Epub2007Dec3.Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)by real-time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green.MartE，Riera P，SitjM，Fang Y，Oliveira S，Maldonado J.），而对PCV-2的引物使用具有记载为序列号3及序列号4的碱基序列的引物（J Vet Diagn Invest.2003Jul;15(4):369-73.Detection of porcine circovirus type2in feces of pigs with or without enteric disease by polymerase chain reaction.Yang JS，Song DS，Kim SY，Lyoo KS，Park BK.)。之后，通过执行电泳确认PRRSV及CPV-2呈阳性（PRRSV:300bp，PCV-2:300bp）（图4）。
[0052] 另外，死亡后立即通过解剖观察肉眼能观察到的病变，用10%的缓冲福尔马林固定组织之后，制作成石蜡块并利用H&F染色进行分析的结果表明，组织上出现间质性肺炎及胸膜内炎症（图5）。这是PRRSV和PCV-2感染导致的呼吸系统症状的典型反应。
[0053] 实施例3生命体征评价
[0054] 生命体征的计分方法为对参考论文（Halina M.Zaleski，Roger R.Hacker，Variables related to the progress of parturition and probability of stillbirth in swine，The Canadian Veterinary Journal，1993February;34(2):109-113）的方法进行变更，综合肌肉紧张度（muscle tone）、皮肤状态、30分钟内活动时间和躺卧时间比率、临床症状的存在与否、饲料摄取量、饮水摄取量而打0—12分的分数。上述生命体征的计分在第3、7、10、14、17、21、24、28日龄实施。
[0055] 结果表明，到实验第0周、第1周为止，实验组的生命体征没有明显的增加，但第2周之后，生命体征分数较之阴性对照组明显增加（图6至图9）。
[0056] 实施例4急性毒性实验
[0057] 使用东元生物科技（DooYeolBiotech）提供的7周龄的无特定病原（specific pathogen-free，SPF）SD（Sprague-Dawley）系统的大鼠实施如下急性毒性实验。获取实验动物并经7天的驯化之后，每组取雄性/雌性各5只组成对照组及使用在上述实施例1中制造的生药提取物各500、1,000及2,000㎎/㎏容量的实验组进行实验。第一次口服之后，观察动物的死亡与否、临床症状及体重变化（使用前、使用后第1天、第3天、第7天及第14天），并通过解剖肉眼观察胸腔及腹部脏器的异常与否。
[0058] 实验结果表明，在所有实验组的实验动物中未出现死亡动物及特殊的一般症状，而且，体重测量结果表明所有实验动物的体重增加正常。与此同时，实验结束时，对所有生存动物的解剖结果未发现特殊的肉眼可观察到的现象。以上结果表明，上述生药提取物在雄性/雌性大鼠中直至2g/㎏为止未表现出毒性变化，口服半数致死量（LD50）为2g/㎏以上，表明是安全的物质。
[0059] 实施例5染色体异常实验
[0060] 为评价在实施例1中制造的生药提取物的遗传毒性，利用中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1cell），通过使用代谢活性酶（S9）的代谢活性法（+S9mix）及未使用的直接法（-S9mix）进行染色体异常实验。此时，上述S9混合物的构成如下：S9混合物1ml包含0.3ml的S9，5μmol的MgCl2，33μmol的KCl，5μmol的G-6-P，4μmol的NADP，4μmol的HEPES缓冲液。实验物质用无菌蒸馏水溶解之后进行稀释。为决定实验物质的处理浓度，进行了细胞增殖抑制实验，实验物质以8个浓度阶段（39.06、78.13、156.25、312.5、625、1,250、2,500、5,000μg/ml)进行实验之后，决定用于本实验的浓度。以细胞增殖抑制实验结果为基础决定本实验的实验物质最高处理浓度，最终以共沸2的3阶段浓度组定为如下：
[0061] 直接法（-S9mix，24小时连续处理组）：312.5、625、1,250μg/ml
[0062] 直接法（-S9mix，6小时处理/18小时恢复组）：312.5、625、1,250μg/ml[0063] 代谢活性法（+S9mix，6小时处理/18小时恢复组）：625、1,250、2,500μg/ml[0064] 本实验结果表明，在未使用代谢活性化的直接法的24小时连续处理组的情况下，较之阴性对照组，异常中期相（aberrant metaphases）的频率在所有处理浓度中没有明显的增加（图10），而在直接法的6小时处理/18小时恢复组中，较之阴性对照组，异常中期相的频率在所有处理浓度中没有明显增加（图11）。在24小时连续处理组及6小时处理18小时恢复组中，较之阴性对照组，多倍性（polyploidy，PP）及核内复制（endoreduplication，ER）的频率没有表现出统计学上有意义的增加（表2）。
[0065] 表2
[0066]
[0067] *与阴性对照组的有意义的差异（p<0.05）
[0068] a）处理时间-恢复时间
[0069] MMC：丝裂霉素C（0.04μg/ml，PP：多倍性，ER：核内复制
[0070] Gap：表示未被染色的部分位于染色单体的纵轴上，从而其宽度大致有染色单体的厚度，区分明显的现象。
[0071] 另外，在利用代谢活性法处理6小时的实验物质的情况下，较之阴性对照组，在所有处理组，异常中期相的频率没有表现出统计学上有意义的增加（图12），而多倍性（PP）及核内复制（ER）的频率也较之阴性对照组，没有出现统计学上有意义的增加（表3）。
[0072] 表3
[0073]
[0074] *与阴性对照组的有意义的差异（p<0.05）
[0075] a）处理时间-恢复时间
[0076] CPA：环磷酰胺·H2O（10μg/ml）
[0077] 从上述结果可知，上述生药提取物在本实验条件下不会对CHO-K1细胞诱发染色体异常。
[0078] 实施例6微生物回复突变实验
[0079] 为了获取在实施例1中制造的生药提取物是否诱发癌症的基础资料，实施了遗传毒性实验中的微生物回复突变实验。实验利用了作为鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型菌株的TA98、TA100、TA1535、TA1537及作为大肠菌的色氨酸缺陷型菌株的WP2uvrA。实验物质悬浮于无菌蒸馏水使用，采用利用代谢活性的情况和未使用代谢活性的情况。此时，用作代谢活性物质的S9混合物的构成如下：在S9混合物10ml包含1ml的S9，0.2ml的0.4M MgCl2/1.65M KCl，0.05ml的1.0M葡萄糖-6-磷酸，0.4ml的0.1M NADPH，0.4ml的0.1M NADH，5ml的0.2M Na-PBS及2.95ml的蒸馏水。
[0080] 为了决定本实验中的使用浓度，以5,000μg/板作为最高浓度，以共沸2的5阶段浓度组进行浓度结晶实验的结果表明，不受使用代谢活性物质
[0081] 的影响，在所有菌株中未观察到生育障碍（表4）。
[0082] 表4
[0083]
[0084] 在上表中，NaN3表示叠氮钠，9-AA表示9-氨基吖啶水氢氯化物，AF-2表示2-（2-呋喃基）-3-(5-硝基-2-呋喃基）丙烯酰胺)，2-AA表示2-氨基蒽。
[0085] 以浓度结晶实验结果为基础，在本实验中，在使用代谢活性化的情况和不使用代谢活性化的情况下，较之阴性对照组，在5,000μg/板浓度处理组中观察到回复菌落数的增加，但未观察到可判定为阳性的回复菌落数的增加（表5及图13至图16）。
[0086] 表5
[0087]
[0088] 从以上结果可知，上述生药提取物在本实验条件下不会诱发回复突变。
[0089] 实施例7利用小鼠骨髓细胞的微核实验
[0090] 为了评价在实施例1中制造的生药提取物的遗传毒性，进行利用雄性小鼠的骨髓细胞的微核实验。本微核实验在预备实验和正式实验中，各取7周龄的雄性小鼠经7天驯化之后，按不同浓度口服实验物质。实验物质悬浮于无菌生理盐水调制而成，而且，在预备实验和正式实验中都以1,250、2,500、5,000㎎/㎏的阶段浓度进行处理。
[0091] 预备实验结果表明，较之溶剂对照组，在所有实验物质使用组中未观察到特殊的一般症状。以使用浓度（1,250、2,500、5,000㎎/㎏）及使用后宰杀时间（24小时、48小时）进行观察的结果表明，较之溶剂对照组，全部红血球中的多色（polychromatic）红血球的数量未表现出明显的骨髓细胞增殖抑制现象。
[0092] 以预备实验结果为基础，以5,000㎎/㎏作为最高使用浓度，24小时作为解剖及标本制作时间进行本实验。结果表明，在5,000㎎/㎏使用组中，较之溶剂对照组，全部红血球中的多色红血球的数量表现出统计学上有意义的差异（p<0.05）。较之溶剂对照组，在所有实验物质使用组（1,250、2,500、5,000㎎/㎏）中，对每个个体的约2,000个多色红血球中观察的微核诱发频率未表现出统计学上有意义的结果。另外，较之溶剂对照组，用作阳性对照组的丝裂霉素C，在微核诱发频率方面表现出统计学上有意义的明显的增加（p<0.01）。在使用实验物质之后，较之溶剂对照组，在所有使用组中未观察到统计学上有意义的体重变化（表6）。
[0093] 表6
[0094]
[0095] *与阴性对照组的有意义的差异（p<0.05）（单因素ANOVA）
[0096] **与阴性对照组的有意义的差异（p<0.01）（单因素ANOVA）
[0097] MNPCE：具有一个以上微核的PCE；PCE：多色红血球；NCE：正常红血球；MMC：丝裂霉素C
[0098] 从以上结果可知，上述生药提取物在本实验条件下不会对小鼠骨髓细胞的微核形成产生影响。
[0099] 制造例：制造包含生药提取物的饲料添加用组合物
[0100] 本发明人以下表7所示的构成制造包含实施例1中制造的生药提取物的饲料添加用组合物。
[0101] 表7饲料添加用组合物的构成比率（单位：重量%）
[0102]
[0103] 在上述表7中，酶制剂使用植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、麦芽糖酶及转化酶的混合制剂，非致病性微生物使用米曲霉。
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