断奶仔猪多系统衰竭综合征(multisystemic wastingsyndrome) (PMWS)是新出现的猪疾病。PMWS看起来破坏宿主的免疫系统并在断 奶仔猪中引起高死亡率。这种疾病具有长潜伏期，一般为3-8周，并 影响受感染猪的多种器官。在加拿大、美国和法国检测到的PMWS综合 征的临床特征为体重逐步减轻以及表现为例如呼吸急促、呼吸困难和 黄疸。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结 病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎(Clark，Proc.Am. Assoc.Swine Prac.1997；499-501；La Semaine Veterinaire No. 26，supplement to La Semaine Veterinaire 1996(834)；La Semaine Veterinaire 1997(857)：54；Gupi P.S.Nayar等人，Can.Vet. J，第38卷，1997；385-387)。受PMWS侵袭的仔猪通常死于呼吸衰 竭和伴随组织细胞浸润的间质性肺炎。
猪圆环病毒(PCV)引起世界性的猪感染并且是高度传染性的。PCV 最初检测为猪肾(PK15)细胞系的非细胞病变性污染物。PCV已分类 为新病毒科圆环病毒科。这些病毒是具有单链环状DNA基因组的小型 无包膜因子。
各种圆环病毒已在一系列动物物种中鉴定，包括PCV，鸡贫血病 毒(CAV)，鹦鹉科鸟类的喙羽病病毒(beak and feather disease virus)(BFDV)，植物病毒包括地三叶草矮化病毒(SCSV)、椰子叶 腐烂病毒(CFDV)和香蕉束顶病毒(BBTV)。看起来在目前识别的圆 环病毒中没有DNA序列同源性或共同抗原决定簇。Todd等人，(1991) Arch.Virol.117：129-135。
圆环病毒科中的成员已显示引起贫血、免疫缺陷相关疾病并在体 外感染巨噬细胞。PCV仅在最近被认为涉及PMWS。参见，例如，Ellis 等人，(1998)Can.Vet.J.39：44-51和Gopi等人，(1997)Can. Vet.J.38：385-386。然而，由于PCV在猪群体中的普遍存在，PCV 与PMWS的病原学联系已受到怀疑。另外，用来源于受污染的PK15细 胞培养物的PCV接种物实验性感染猪未能产生临床疾病。参见，例如 Tischer等人，(1986)Arch.Virol.91：271-276。
猪的传染因子特别是病毒不仅深刻影响农业生产，由于对猪器官 用于人中的异种移植的兴趣增加，还对人造成潜在的公共卫生危险。 以前的PMWS疾病诊断基于组织病理学检查。因此，需要诊断PMWS相 关病原体存在，以及预防PMWS疾病的改进方法。
在美国，每年加工59,000,000只猪，并且由于胃食管溃疡的直接 死亡损失估计为至少2.0％且可能高达5％。经济损失为每年至少 $147,000,000。由于不健康以及其次由于咬尾而尸体报废的亚临床损 失未知但可能是巨大的，多达每年$750,000,000。猪中的胃食管溃疡 疾病一般发生在5-90％的3-6个月大的猪中，而每年的死亡损失为 1-5％。通常症状为猝死或贫血、厌食、呕吐和具有黑粪症的不健康、 咬尾症和尸体报废。已知影响GEU流行的因素包括高碳水化合物饮食、 饲料颗粒大小、社会应激和胃微生物。“Many of the techniques used to increase feed efficiency and reduce feeding costs are associated with an increased prevalence of stomach lesions. Economics dictate that a compromise between feed eficeincy and losses due to ulcers must be reached.”R.Friendship in “Diseases of Swine”，8th ed.，ISU Press，Ames，IA。
在人中，与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染相关的细菌 性胃炎现在识别为与胃癌和MALT淋巴瘤相关的B型胃炎的病因。这是 最常见的细菌性传染病，尽管在发达国家中频率减少。抗微生物药是 有效的治疗但“正常”胃细菌群体的失衡可能导致胃十二指肠溃疡和 与腺癌相关的胃反流病。人和猪之间的解剖学和生理学相似性提示可 能存在关于猪中的胃食管溃疡的细菌起源。然而，由于抗微生物药造 成的微生物菌群的紊乱也将是不希望有的。因此需要针对猪胃菌群， 且特别是与胃食管病症原因相关的那些细菌例如螺杆菌物种的疫苗。
本申请中任何文件的引用或认同并非承认此类文件可用作本发明 的现有技术。
发明概述
本发明基于从受PMWS侵袭仔猪的匀浆组织中分离、本文命名为 “PCV II型”或“PVCII”的新病毒的发现。该病毒的表征显示它与 从持续感染的PK15细胞中获得的、本文命名为“PCV I型”或“PCVI” 的非病原性猪圆环病毒具有共同特征。新型PCV变异体PCVII 412以 及几种另外的PCVII分离株的完整DNA基因组已克隆和测序。这些DNA 序列的部分用作探针以诊断临床样品中病毒的存在，并分离病毒的其 他天然存在的变异体。PCVII的基因组序列的了解还使得可获得在病 毒基因组的可读框内编码的各种蛋白质的多肽序列，并允许生产这些 肽或其部分，其用作诊断测试中的标准或反应物或用作疫苗组分。保 护性抗体还可由蛋白质引起并且可以以多克隆或单克隆形式产生。
完整PCVII序列的可用性因此允许设计和构建多肽，其可以充当 疫苗或诊断反应物，或充当在针对PMWS的被动免疫疗法中有用的单克 隆抗体(Mab)制剂生产中的中间产物，或充当用作诊断反应物的抗体 生产中的中间产物。
本发明进一步基于新型细菌物种，特别是与猪中的胃食管溃疡有 关的新型螺杆菌属物种的发现。特别地，新型物种H.cerdo已用作用 于开发治疗胃食管病症的疫苗的抗原来源。本发明提供了用于通过减 毒或化学灭活从H.cerdo及其相关物种获得免疫原性组合物的方法。
最有利地，新型螺杆菌和猪圆环病毒用于提供组合疫苗，由此来 源于2种病原体类型的免疫原可以共同递送至靶动物以刺激保护性抗 体和免疫性的产生。因此，本发明提供了用于治疗猪中的胃食管溃疡 和PMWS的疫苗。
因此，在一个方面，本发明涉及来源于PCVII基因组的用于生产 PCVII诊断剂和疫苗的多核苷酸。在一个具体实施方案中，多核苷酸 能够与PCVII核苷酸序列选择性杂交并包含至少约8个连续核苷酸， 所述连续核苷酸来源于PCVII毒株412、9741和B9、1010、1011-48121、 1011-48285、999、1103和1121的序列(SEQ ID NOS：1、11、12和 24-30)，或与之互补。在另一实施方案中，多核苷酸编码与多肽具有 至少约85％同一性的免疫原性PCVII多肽，所述前者多肽选自来源于 可读框ORFs 1-6的多肽，以及包含至少约5个氨基酸的ORFs 1-6的 免疫原性片段。在一个有利的实施方案中，多核苷酸编码ORF 6的多 肽或其免疫原性片段。本发明进一步涉及利用这些多核苷酸序列或其 部分作为寡聚探针，用于生产可以充当诊断反应物或疫苗抗原的肽， 涉及肽自身、以及在疾病诊断和治疗中有用的多克隆和单克隆抗体。
本发明的其他方面包括能够实现所需蛋白质生产的表达系统，所 述蛋白质由来源于完整PCVII基因组的序列编码，包含此类系统或其 部分的重组载体，用此类载体转化的重组宿主细胞，由转化细胞生产 的蛋白质，以及由此类蛋白质制备的疫苗。另外，本发明涉及由基因 组编码的具有表位的肽序列，并涉及与标记或载体蛋白共价连接的此 类序列。本发明还包含了PCVII基因组的各个ORFs，以及由这些ORFs 编码的蛋白质，及其部分。
本发明还涉及制备多肽组合物、例如疫苗和免疫诊断组合物、以 及免疫球蛋白的方法，还涉及免疫测定法和用于测定法的包含引物、 探针、多肽和/或免疫球蛋白的试剂盒。因此在一个实施方案中，本发 明涉及检测生物样品中的PCVII抗体的方法，其包括(a)提供生物样 品；(b)在允许生物样品中存在的PCVII抗体结合PCVII多肽以形成 抗体/抗原复合物的条件下，使生物样品与如上所述的免疫原性PCVII 多肽反应；和(c)检测复合物的存在或缺乏，由此检测样品中PCVII 抗体的存在或缺乏。
在本发明的组合免疫接种或疫苗接种程序中，还可以组合针对猪 圆环病毒的免疫接种或疫苗接种与针对猪螺杆菌的那种，并可以进一 步包括针对其他猪病原体，特别是可能与PMWS综合征相关的那些的免 疫接种或疫苗接种。根据本发明的免疫原性组合物或疫苗因此可以包 含对应另一种猪病原体的另一种效价(valency)，所述另一种病原体 例如但不限于，PRRS(猪繁殖与呼吸综合征)和/或猪肺炎枝原体 (Mycoplasma hypopneumoniae)，和/或大肠杆菌，和/或萎缩性鼻 炎，和/或伪狂犬病(假狂犬病)病毒和/或猪流行性感冒和/或胸膜肺 炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和/或猪霍乱，及 其组合。优选地，根据本发明的免疫接种或疫苗接种程序和疫苗将组 合针对圆环病毒和螺杆菌产生的胃食管溃疡，以及PRRS和/或猪流行 性感冒的免疫接种或疫苗接种。因此可以使用任何合适形式的免疫原 性组合物或疫苗，特别是任何可用的商品化疫苗，以便将其与如本文 所述的针对猪圆环病毒和猪螺杆菌的免疫原性组合物或疫苗组合。
本发明的主题因此还包含多价免疫原性组合物和疫苗、多疫苗试 剂盒、以及免疫接种或疫苗接种组合方法，其使得能够使用此类组合 免疫接种或疫苗接种程序。
因此，本发明的一个方面包含了用于诱发针对螺杆菌物种和猪圆 环病毒的免疫应答的免疫原性组合物，其包含至少一种螺杆菌抗原和 至少一种猪圆环病毒抗原，以及兽医学可接受的媒介物或赋形剂。
在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物，猪圆环病毒抗原 可以包含至少一种猪圆环病毒II型抗原。在本发明的另一实施方案 中，螺杆菌抗原可以是但不限于，Helicobacter cerdo、Helicobacter heilmanii或幽门螺杆菌抗原。
在本发明的各种实施方案中，猪圆环病毒II型抗原包含了保藏于 ECACC的选自下列的至少一种猪圆环病毒II型抗原：猪圆环病毒II 型登记号V97100219、猪圆环病毒II型登记号V97100218、猪圆环病 毒II型登记号V97100217、猪圆环病毒II型登记号V98011608和猪 圆环病毒II型登记号V98011609。在本发明的一个实施方案中，猪圆 环病毒II型抗原是减毒的猪圆环病毒II型病毒或灭活的猪圆环病毒 II型，或可以包含由猪圆环病毒I I型可读框(ORF)编码的抗原，所 述ORF选自ORFs 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。
本发明的另一实施方案进一步包含兽医学可接受的佐剂和非必需 的冻干稳定剂。
在本发明的各种实施方案中，螺杆菌抗原可以是Helicobacter cerdo抗原。
在本发明的其他实施方案中，猪圆环病毒II型抗原可以包含：含 有且在体内表达由猪圆环病毒II型可读框(ORF)编码的抗原的载体， 所述ORF选自ORFs 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。 在本发明的各种实施方案中，载体选自DNA质粒、线性DNA分子和重 组病毒。在本发明的其他实施方案中，重组病毒可以选自猪疱疹病毒、 猪腺病毒和痘病毒。
重组病毒可以选自但不限于，Aujesky病病毒、痘苗病毒、禽痘 病毒、金丝雀痘病毒和猪痘病毒。
本发明的螺杆菌抗原可以选自但不限于，减毒的螺杆菌菌株、灭 活的螺杆菌菌株、螺杆菌菌株亚单位，并且其中猪圆环病毒抗原选自 减毒的猪圆环病毒、灭活的猪圆环病毒、猪圆环病毒亚单位，和包含 且在体内表达编码猪圆环病毒抗原的核酸分子且选自DNA质粒、线性 DNA分子和重组病毒的载体；以及非必需的其它猪病原体的抗原。本 发明的一个实施方案进一步包含其它猪病原体的其它抗原。
在本发明的一个实施方案中，其它猪病原体的其它抗原选自：PRRS 病毒抗原、猪肺炎枝原体抗原、胸膜肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗 原、萎缩性鼻炎抗原、猪α疱疹病毒I型抗原、猪霍乱抗原、猪流行 性感冒抗原及其组合。在本发明的另一实施方案中，猪圆环病毒抗原 包含多种猪圆环病毒抗原。
本发明的另一方面是用于诱导针对螺杆菌菌株和猪圆环病毒的免 疫应答的方法，其包括给猪施用免疫原性组合物。
本发明的再一方面是用于制备包含至少一种螺杆菌抗原和至少一 种猪圆环病毒抗原的免疫原性组合物的试剂盒，其中(i)和(ii)分 开包装。在本发明的这个方面的一个实施方案中，猪圆环病毒抗原包 含至少一种猪圆环病毒II型抗原。
当结合附图阅读本发明的下列详细描述时可以更充分地理解本发 明的这些以及其他方面和特征。
应当注意在本公开内容中以及特别在权利要求和/或段落中，术语 例如“包含”可以具有在美国专利法中对其认定的含义；例如它们可 以意指“包括”；并且此类术语如“基本上由......组成”具有在美国 专利法中归于其的含义，例如它们涵盖未明确叙述的元件，但排除在 现有技术中发现或影响本发明的基本或新颖特征的元件。
附图简述
作为例子给出，但不希望将本发明限制于描述的具体实施方案的   下列详细描述，可以与引入本文作为参考的附图结合理解，其中：
图1显示了PCVII 412的图示，显示了可读框的位置。
图2A-2C显示了PCVII 412基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。 显示了有义和反义链。对应各个ORF的翻译产物的氨基酸序列同样显 示如下：ORF 1(SEQ ID NO：3)；ORF 2(SEQ ID NO：9)；ORF 3 (SEQ ID NO：7)；ORF 4(SEQ ID NO：20)；ORF 5(SEQ ID NO： 21)；和ORF 6(SEQ ID NO：5)。
图3A-3D显示了来自PCVII 412的可读框与从PK15细胞分离的 PCVI的可读框的氨基酸序列比较。图3A显示了与来自PCVI的相应ORF (底部行，SEQ ID NO：4)比较的PCVII 412的ORF 1(顶部行，SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。图3B显示了与来自PCVI的相应ORF(底 部行，SEQ ID NO：6)比较的PCVII 412的ORF 6(顶部行，SEQ ID NO： 5)的氨基酸序列。图3C显示了与来自PCVI的相应ORF(底部行，SEQ ID NO：8)比较的PCVII 412的ORF 3(顶部行，SEQ ID NO：7)的 氨基酸序列。图3D显示了与来自PCVI的相应ORF(底部行，SEQ ID NO： 10)比较的PCVII 412的ORF 2(顶部行，SEQ ID NO：9)的氨基酸 序列。
图4A-4B显示了各种PCV分离株的核苷酸序列比较：来自PK15 细胞的PCVI(SEQ ID NO：2)、PCVII 412(SEQ ID NO：1)、PCVII 9741(SEQ ID NO：11)和PCVII B9(SEQ ID NO：12)。
图5显示了用于检测PCV感染的多重PCR结果。该测定法鉴定PCV 感染并区分PCVI和PCVII的存在。泳道1是分子量标记。泳道2-4 是按照PCVII、PCVI和阴性顺序的对照。泳道5-13是从来自受PMWS 侵袭兽群的仔猪收集的血液样品。
图6显示了对来自受PMWS侵袭仔猪的各种组织样品进行的多重 PCR结果。两行中的泳道1是分子量标记。顶部行中的泳道2是阳性 PCVII对照，而泳道3是阴性对照。其余泳道是从受PMWS侵袭仔猪收 集的各种组织样品。
图7显示了从Helicobcater cerdo中提取并与幽门螺杆菌和另一 种未鉴定的螺杆菌物种比较的蛋白质的SDS-PAGE分析。
图8显示了猪圆环病毒毒株PCVII 1010的核苷酸序列(SEQ ID NO： 24)
图9显示了猪圆环病毒毒株PCVII 999的核苷酸序列(SEQ ID NO： 28)。
图10显示了猪圆环病毒毒株PCVII 999的优化核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。
图11显示了猪圆环病毒毒株PCVII 1011-48121的核苷酸序列 (SEQ ID NO：25)。
图12显示了猪圆环病毒毒株PCVII 1011-48285的核苷酸序列 (SEQ ID NO：26)。
图13显示了猪圆环病毒毒株PCVII 1103的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)。
图14显示了猪圆环病毒毒株PCVII 1121的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。
发明详述
除非另有说明，本发明的实践将采用在本领域范围内的分子生物 学、微生物学、重组DNA技术和免疫学的常规技术。此类技术在文献 中充分说明。参见，例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第I、II和III卷，第二版(1989)； DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid hYbridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture (R.K.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press，1986)；Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.， Academic Press，Inc.)系列；和Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell eds.，1986， Blackwell Scientific Publications)。
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于具体DNA、多肽 序列或方法参数，因为这样的事物当然可以改变。还应当理解本文使 用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案的目的，并不希望是限制 性的。
本文自始至终使用下列氨基酸缩写：丙氨酸：Ala(A)；精氨酸： Arg(R)；天冬酰胺：Asn(N)；天冬氨酸：Asp(D)；半胱氨酸： Cys(C)；谷氨酰胺：Gln(Q)；谷氨酸：Glu(E)；甘氨酸：Gly (G)；组氨酸：His(H)；异亮氨酸：Ile(I)；亮氨酸：Leu(L)； 赖氨酸：Lys(K)；甲硫氨酸：Met(M)；苯丙氨酸：Phe(F)；脯 氨酸：Pro(P)；丝氨酸：Ser(S)；苏氨酸：Thr(T)；色氨酸： Trp(W)；酪氨酸：Tyr(Y)；和缬氨酸：Val(V)。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所 属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些相 似或等价的许多方法和材料可以在本发明实践中使用，本文还是描述 了优选材料和方法。
在本发明的描述中，将采用下列术语并预期如下文指出的进行定 义。
术语“PCVII蛋白质”、“PMWS蛋白质”或编码其的核苷酸序列 分别意指衍生于如本文描述的新型PCVII分离株的蛋白质或核苷酸序 列。几种PCVII分离株的核苷酸序列显示于图4A-4B中并且与6种鉴 定的PCVIIORF对应的氨基酸序列显示于图2A-2C中。然而，如本文 定义的PCVII或PMWS蛋白质，或编码其的基因不限于描述的序列。
此外，如本文使用的，“衍生于”PCVII基因组的核苷酸序列或 其互补物指为了预期目的保留举例说明的多核苷酸的基本特性的序 列，表示它所来自的完整序列的一部分。此类衍生的具体而非限制性 例子为编码相同或基本上相同的氨基酸序列，但由于密码子简并采用 不同的特定密码子的序列；另一个例子是与病毒DNA互补的序列。在 诊断测试中有用的探针或寡核苷酸需要保留所示序列的互补性但可以 比完整序列更短或可以省略其部分。然而，对于在处理或表达中的使 用，核苷酸变化通常是希望的，以制备或删除限制性位点、提供加工 位点、或以不会不利地影响功能的方式改变编码的氨基酸序列。术语 “核苷酸序列”和“多核苷酸”指核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸序列， 且包括基因组链及其互补序列。
“衍生于”包含PCVII分离株基因组的核苷酸序列的序列因此指 包含对应基因组核苷酸序列(或其互补物)区域或以本领域已知方式 修饰与其预期用途一致的那种序列的区域组合的序列的序列。当然这 些序列无需在物理上来源于基因的核苷酸序列，还指基于多核苷酸所 来自的区域中的碱基序列提供的信息、以不管怎样的方式产生的多核 苷酸。例如，一般DNA序列所来自的区域包括编码特定表位的区域。
类似地，“衍生于”PCVII ORF的肽指基本上等同于这些多肽或 其部分、具有与那种部分相同的生物学特性的氨基酸序列。
此外，衍生的蛋白质或核苷酸序列无需在物理上衍生于上文描述 的基因，还可以以任何方式产生，包括例如，基于本文提供的信息的 化学合成、分离(例如，从PCVII分离株中)或通过重组生产。另外， 该术语意指具有与该基因编码的连续氨基酸序列基本上同源(如下文 定义的)的氨基酸序列的蛋白质，其显示免疫学活性。
因此，该术语意指全长以及免疫原性、截短的和部分序列，以及 蛋白质的活性类似物和前体形式。该术语还包括特定基因的核苷酸片 段，其包括基因的至少约8个连续碱基对、更优选至少约10-20个连 续碱基对，且甚至至少约25-50个或75个或更多个连续碱基对。如 下文更充分讨论的，此类片段在诊断方法中用作探针，和用于蛋白质 的重组生产。
该术语还包括中性形式或碱或酸加成盐形式的蛋白质，取决于制 备方式。此类酸加成盐可以涉及游离氨基并且碱性盐可以由游离羧基 形成。药学可接受的碱和酸加成盐在下文进一步讨论。另外，蛋白质 可以通过与其他生物材料例如脂质和糖类组合，或通过侧链修饰例如 氨基的乙酰化，羟基侧链的磷酸化，巯基的氧化，氨基酸残基的糖基 化，以及编码的一级序列的其他修饰进行修饰。
该术语进一步涉及序列的缺失、添加和置换，只要多肽起作用以 产生如本文定义的免疫应答。在这点上，特别优选的置换一般将是在 性质上保守的，即，在氨基酸家族内发生的那些置换。例如，氨基酸 一般分成4个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖 氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极 性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。可合理 地预言用异亮氨酸或缬氨酸单独替换亮氨酸，或反之亦然；用谷氨酸 单独替换天冬氨酸，或反之亦然；用丝氨酸单独替换苏氨酸，或反之 亦然；或使用结构上相关氨基酸的类似氨基酸保守替换，对生物活性 将没有较大的影响。具有与参考分子基本上相同的氨基酸序列但具有 基本上不影响蛋白质免疫原性的较小氨基酸置换的蛋白质因此在参考 多肽的定义内。
“可读框”或“ORF”是编码多肽的多核苷酸序列的区域。
“断奶仔猪多系统衰竭综合征”或“PMWS”指脊椎动物特别是猪 的疾病，其临床特征在于体重逐步减轻、呼吸急促、呼吸困难和黄疸。 一致的病理学变化包括淋巴细胞至肉芽肿间质性肺炎，淋巴结病以及 较罕见的淋巴细胞至肉芽肿性肝炎和肾炎。参见，例如，Clark，E.G. Proc.Am.Assoc.Swine Pract.1997：499-501；和Harding，J.Proc. Am.Assoc.Swine Pract.1997：503。
“分离的”核酸分子是从完整生物分开且离散的核酸分子，其中 该核酸分子在自然界中存在于该生物中；或完全或部分地缺乏在自然 界中通常与其结合的序列的核酸分子；或在自然界中存在但具有与其 结合的异源序列(如下文定义的)的序列。
术语“疫苗组合物”意指包含抗原的任何药物组合物，所述组合 物可以用于预防或治疗受试者中的疾病或病状。该术语因此涵盖了如 下文所述的亚单位疫苗，以及包含完整的被杀死、减毒、或灭活微生 物的组合物。
“亚单位疫苗组合物”指包含至少一种免疫原性多肽但不是全部 抗原的组合物，所述多肽和抗原来源于来自目的病原体的抗原或与其 同源。此类组合物基本上不含完整的病原体细胞或颗粒，或此类细胞 或颗粒的裂解物。因此，“亚单位疫苗组合物”由来自病原体的至少 部分纯化的(优选基本上纯化的)免疫原性多肽，或其重组类似物制 备。亚单位疫苗组合物可以包含基本上不含来自病原体的其他抗原或 多肽的亚单位抗原或目的抗原。
本发明的组合物可以包括本领域已知的任何药学可接受的载体。
术语“表位”指抗原或半抗原上特异性B细胞和/或T细胞对其应 答的位点。该术语还可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换 使用。识别相同表位的抗体可以在显示一种抗体阻断另一种抗体与靶 抗原结合的能力的简单免疫测定法中鉴定。
针对组合物或疫苗的“免疫应答”是在宿主中针对目的组合物或 疫苗产生的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常地，“免疫应答”包 括但不限于下列效应中的一种或多种：特异性针对目的组合物或疫苗 中包括的一种或多种抗原产生的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制 性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞。优选地，宿主将显 示治疗或保护性免疫应答，从而使得增强对于新感染的抵抗力和/或减 少疾病的临床严重度。此类保护将通过受感染宿主通常显示的症状的 减少或缺乏，更快的恢复时间和/或受感染宿主中病毒滴度的降低来证 明。
术语“免疫原性”蛋白质或多肽指诱发如上所述的免疫应答的氨 基酸序列。如本文使用的，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的 全长序列、其类似物、或其免疫原性片段。“免疫原性片段”指包括 一种或多种表位并因此诱发如上所述的免疫应答的蛋白质片段。此类 片段可以使用本领域众所周知的任何数目的表位作图技术进行鉴定。 参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press， Totowa，N.J。例如，线性表位可以通过例如在固体载体上同时合成对 应于蛋白质分子的部分的大量肽，并当肽仍附着至载体的时候使肽与 抗体反应来测定。此类技术是本领域已知的并且在例如全部整体引入 本文作为参考的美国专利号4,708,871；Geysen等人，(1984)Proc. Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4002；Geysen等人，(1986)Molec. Immunol.23：709-715中描述。类似地，构象表位通过测定氨基酸的 立体构象容易地鉴定，例如通过X射线晶体学和二维核磁共振。参见， 例如Epitope Mapping Protocols，同上。
合成抗原也包括在该定义内，例如，多表位、侧翼表位(flanking epitopes)，以及其他重组或合成来源的抗原。参见，例如，Bergmann 等人，(1993)Eur.J.Immunol.23：2777-2781；Bergmann等人， (1996)J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier，A.(1997)Immunol. and Cell Biol.75：402-408；Gardner等人，(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，Jun.28-Jul.3，1998。
用于本发明目的的免疫原性片段通常将包括分子的至少约3个氨 基酸，优选至少约5个氨基酸，更优选至少约10-15个氨基酸，且最 优选25或更多个氨基酸。对于片段的长度没有临界上限，它可以包含 几乎全长的蛋白质序列，或甚至包含蛋白质的2个或更多个表位的融 合蛋白。
上述免疫原性蛋白质、免疫原性多肽、合成抗原、或免疫原性片 段中的任何一种可以用于在宿主中产生抗体。
“天然”蛋白质或多肽指从蛋白质天然存在的来源分离的蛋白质 或多肽。“重组”多肽指通过重组DNA技术产生；即从由编码所需多 肽的外源DNA构建体转化的细胞产生的多肽。“合成”多肽是通过化 学合成制备的那些。
“载体”是另一种DNA区段可以与其附着的复制子，例如质粒、 噬菌体、或粘粒，以便产生附着区段的复制。
DNA“编码序列”或“编码特定蛋白质的核苷酸序列”是在合适的 调节元件控制下在体外或体内转录并翻译成多肽的DNA序列。编码序 列的边界由5′(氨基)末端上的起始密码子和3′(羧基)末端上的翻 译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于，原核序列、来自真 核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列， 和甚至是合成的DNA序列。转录终止序列通常将位于编码序列的3′。
DNA“控制元件”总的来说指启动子、核糖体结合位点、多腺苷酸 化信号、转录终止序列、上游调节结构域、增强子等，其共同使编码 序列在宿主细胞中转录和翻译。并非所有这些控制序列必须始终存在 于重组载体中，只要所需基因能够被转录和翻译。
“可操作地连接”指其中这样描述的组分被配置以便执行其通常 功能的元件排列。因此，与编码序列可操作地连接的控制元件能够实 现编码序列的表达。控制元件不必与编码序列邻接，只要它们起作用 以指导其表达。因此，例如，插入的不翻译但转录的序列可以存在于 启动子和编码序列之间并且启动子仍可视为与编码序列“可操作地连 接”。
控制元件例如启动子，“指导编码序列在细胞中的转录”，当RNA 聚合酶结合启动子并将编码序列转录成mRNA时，所述mRNA随后翻译 成由编码序列编码的多肽。
“宿主细胞”是已由外源核酸分子转化或能够由外源核酸分子转 化的细胞。
当外源DNA已引入细胞膜内时，细胞已由此类外源DNA“转化”。 外源DNA可以整合(共价连接)或不整合到构成细胞基因组的染色体 DNA内。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以维持在游离元件 例如质粒上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是其中外源DNA已整 合到染色体内从而使得它通过染色体复制由子细胞遗传的细胞。这种 稳定性通过真核细胞建立包含含有外源DNA的子细胞群体的细胞系或 克隆的能力证实。
“同源性”指2种多核苷酸或2种多肽之间的同一性百分比。当 序列在限定的分子长度上显示至少约80％-85％，优选至少约90％， 且最优选至少约95％-98％的序列同一性时，2种DNA或2种多肽序 列互相是“基本上同源的”。如本文使用的，基本上同源还指显示与 特定DNA或多肽序列具有完全同一性的序列。同一性百分比可以通过 直接比较2个分子之间的序列信息来测定，即通过序列比对，计数2 个比对序列之间的确切匹配数目，除以较短序列的长度，并将结果乘 以100。容易获得的计算机程序可以用于帮助分析，例如ALIGN， Dayhoff，M.O.in Atlas of Protein Sequence and Structure M. O.Dayhoff ed.，5 Suppl.3：353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，其修改了用于肽分析的Smith和 Waterman(1981)Advances in Appl.Math.2：482-489的局部同源 性算法。用于测定核苷酸序列同一性的程序在Wisconsin Sequence Analysis Package，版本8(从Genetics Computer Group，Madison， Wis.可获得)中可获得，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，其同样依 赖于Smith和Waterman的算法。这些程序可由制造商推荐以及上文提 及的Wisconsin Sequence Analysis Package中描述的缺省参数而容 易地使用。
可替代地，同源性可以通过多核苷酸在形成同源区之间的稳定双 链体的条件下杂交，随后用单链特异性核酸酶消化，以及消化片段的 大小测定来测定。基本上同源的DNA序列可以在DNA杂交实验中在例 如对于那种特定系统定义的严格条件下鉴定。合适杂交条件的确定在 本领域技术内。参见，例如，Sambrook等人，同上；DNA Cloning，同 上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
2种核酸片段视为可与多核苷酸“选择性杂交”，如果在下列条 件下它们能够与核酸或其变体(例如，与PCVII核酸杂交但不与来自 圆环病毒科的其他成员的多核苷酸杂交的探针)特异性杂交或特异性 启动聚合酶链式反应：(i)在如Sambrook等人，同上和Nucleic Acid Hybridization，同上，中所述的一般杂交和洗涤条件下，(ii)使用 允许最多约25-30％碱基对错配的降低的严格性洗涤条件，例如：2x SSC，0.1％SDS，室温2次，每次30分钟；随后2x SSC，0.1％SDS， 37℃1次，30分钟；随后2xSSC室温2次，每次10分钟，或(iii) 选择在标准条件下用于在一般聚合酶链式反应(PCR)中使用的引物(例 如在Saiki，等人，(1988)Science 239：487-491中描述)，这导 致PCVII或其变体序列的特异性扩增。
术语“功能性等价”意指蛋白质的氨基酸序列是与参考氨基酸序 列或其免疫原性部分诱发的应答比较，将诱发基本上等价或增强的如 上文定义的免疫应答的序列。
DNA构建体的“异源”区是在另一种DNA分子内或与另一种DNA 分子附着的DNA可鉴别区段，所述区段在自然条件下不与该另一种DNA 分子结合。因此，当异源区编码病毒基因时，基因通常将位于在来源 病毒基因组中不位于病毒基因侧面的DNA侧面。异源编码序列的另一 个例子是其中编码序列自身在自然界中未发现(例如，具有不同于天 然基因的密码子的合成序列)的构建体。等位基因变异或天然存在的 突变事件不产生如本文使用的DNA异源区。
术语“治疗”如本文使用的指(i)防止感染或再感染(预防)， 或(ii)减少或消除目的疾病的症状(治疗)。
如本文使用的，“生物样品”指从受试者中分离的组织或流体样 品，包括但不限于，例如，血液，血浆，血清，粪便物，尿，骨髓， 胆汁，脊髓液，淋巴组织和淋巴液，皮肤样品，皮肤、呼吸器官、肠 和生殖泌尿道的外分泌物，眼泪，唾液，乳汁，血细胞，器官，组织 活检样品，以及体外细胞培养成分的样品，包括但不限于，由培养基 中的细胞和组织生长产生的条件培养基，例如，重组细胞和细胞组分。
如本文使用的，术语“标记”和“可检测标记”指能够检测的分 子，包括但不限于，放射性同位素、荧光剂、化学发光物、酶、酶底 物、酶辅助因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、 配体(例如生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”指能够显示在可检 测范围内的荧光的物质或其部分。可以在本发明中使用的标记的具体 例子包括荧光素、罗丹明、丹酰基、伞形酮、得克萨斯红、鲁米诺、 NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
“脊椎动物受试者”指脊索动物(cordata)亚门的任何成员，包 括但不限于，哺乳动物例如牛、绵羊、猪、山羊、马和人；驯养动物 例如狗和猫；以及鸟类，包括驯养、野生和猎鸟，例如公鸡和母鸡包 括小鸡、火鸡及其他鹑鸡类鸟。该术语不指明特定年龄。因此，预期 包含成年和新生动物，以及胚胎。
本发明的一个方面是从受PMWS侵袭的猪中分离的、本文中称为 “PCVII”的新圆环病毒的发现。本发明的有用材料和方法经由核苷酸 序列家族的发现而变得可能，所述核苷酸序列各自包含新型PCVII病 毒的完整基因组。这种多核苷酸家族的可用性首先允许分离由于小异 质性而不同的基因组家族的其他成员。其次，它允许构建在诊断中有 用的DNA片段和蛋白质。例如，至少约8-10个核苷酸或更多的寡聚 物，优选包含至少约15-20个核苷酸的寡聚物在疾病诊断中用作杂交 探针。此类探针可以用于检测例如怀疑含有病毒的受试者血清中病毒 基因组的存在。类似地，编码蛋白质的基因可以进行克隆并用于设计 探针以检测和分离其他病毒分离株中的同源基因。
PCVII序列还允许设计和生产PCVII特异性多肽，该多肽用作关 于针对血清或血液中的PCVII产生的抗体存在的诊断反应物。针对这 些多肽的抗体还用作诊断剂。因为几种可读框可以在完整基因组的背 景下译解，所以可以推导出PCVII相关蛋白质的一级结构。最后，基 因序列的了解还使得能够设计和生产有效对抗PCVII的疫苗并因此用 于预防PMWS以及用于产生保护性抗体。
从基因组可获得的测序信息允许推导由病毒基因组编码的各种多 肽的氨基酸序列并鉴定合适的表位。由PCVII基因组中鉴定的几个ORF 编码的全长蛋白质或其合适部分可以使用独立获得并表达的相关DNA 的片段产生，从而使用重组技术提供所需多肽。原核和真核宿主都可 用于此类表达。短多肽片段还可以是化学合成的并连接至载体蛋白用 于作为疫苗使用。此外，可以生产与赋予免疫原性的蛋白质连接的表 位。因此产生的蛋白质其自身可以用作疫苗，或者可以用于在宿主中 诱导免疫活性B细胞，所述B细胞随后可以用于生产分泌在被动免疫 治疗中有用的抗体的杂交瘤。
更具体而言，图4A-4B中显示了关于PCVII的3种分离株-PCVII 412(SEQ ID NO：1)、PCVII 9741(SEQ ID NO：11)和PCVII B9 (SEQ ID NO：12)的完整遗传序列。各种PCVII分离株中的核苷酸序 列同源性百分比超过99％同一性。新近发现的病毒基因组与从受感染 PK15细胞中分离的PCV(本文中称为“PCVI”)在核苷酸水平上分享 大约76％的同一性。如实施例中进一步描述的，核苷酸插入和缺失 (indels)已在3个区域中发现。
如图1中所示，新病毒包含编码包含超过50个氨基酸残基的蛋白 质的至少6个可能的可读框(ORF)，而从PK15获得的PCVI具有7 个可能的ORF。代表性PCVII分离株的ORF存在于下列核苷酸位置上 (使用图4A-4B中所示的PCVII分离株的编号)：ORF 1，51-992； ORF 2，671-360；ORF 3，565-389；ORF 4，553-729；ORF 5，1016 -1174；和ORF 6，1735-1037。图2A-2C中显示了由6个ORF编码 的多肽。
ORF可以相对于Imp1010毒株进行限定。本发明还包含了在任何 其他PCVII毒株，以及如本文或本文引用的文件中定义的任何PCVII 毒株中的相应ORF的用途。因此，使用标准软件例如MacVector由基 因组核苷酸序列确定ORF是常规技术。同样地，与1010毒株的基因组 比对以及与1010毒株ORF的比较允许本领域技术人员容易地确定来自 另一种毒株(例如，WO-A-99 18214中公开的那些，例如Imp 1008、 Imp 1011-48121、Imp 1011-48285、Imp 999，以及新毒株1103和1121) 的基因组上的ORF。使用软件或进行比对不需要过度的实验法并且直 接提供等价ORF。
在本发明实践中同样等价和有用的是不会改变考虑的基因的功能 性和毒株特异性(例如2型毒株)或这种基因编码的多肽的那些核苷 酸序列。由于密码简并而不同的序列当然包括在本发明实践中。
PCVII的主要细胞靶是外周血中的单核细胞，例如巨噬细胞，尽 管该病毒同样在受感染动物的各种组织和器官中发现。受感染的巨噬 细胞失去其正常功能，引起宿主免疫系统的损害，导致死亡。
新型圆环病毒的克隆和测序已提供了关于PMWS的致病因子的信 息。如上文说明的，测序信息以及克隆及其基因产物对于诊断和疫苗 开发有用。特别地，PCR和基于抗体的诊断方法在疾病的诊断中有用 并且在本文中用于特异性鉴定和区分这种新型PCVI I病毒与来源于持 续感染的PK15细胞的PCVI。测序信息还在特异性引物设计中有用， 以表达病毒特异性基因产物、研究病毒结构、产生特异性抗体和鉴定 猪圆环病毒相关疾病中的毒性基因。
PCVII的新病毒基因组由从受PMWS侵袭猪的组织中分离的病毒获 得。病毒DNA从各种来源提取，包括受感染的Dulac和Vero细胞团块， 外周血棕黄层细胞，来自受感染动物的组织和血清。使用实施例中更 充分讨论的技术从样品中提取DNA。
通过比较圆环病毒科的已知病毒中的序列和结构相似性，利用保 守的茎环结构的互补序列设计独特引物。随后进行单引物PCR并克隆 产物。以不同方向插入质粒载体内的2种全长病毒基因组在2个方向 上完全测序。制备并测序另外的PCR产物以确保引物/茎环区的保真 度。
使用类似引物，获得其他PCVII分离株，包括PCVII 9741和PCVII B9。所得到的序列在本文中提供，并且完整序列或其任何部分同样可 以使用合成方法、或通过包含部分序列检索的合成方法组合使用类似 于本文描述的那些的方法来制备。
PCVII基因组序列的可用性允许构建编码来源于PCVII基因组的 病毒多肽及其抗原活性区域的表达载体。编码所需蛋白质的片段可以 使用常规限制性消化由cDNA克隆获得、或通过合成方法获得，并且连 接到例如包含融合序列例如β-半乳糖苷酶部分的载体内。包含可读框 的PCVII基因组的任何所需部分可以作为重组蛋白质例如成熟或融合 蛋白获得，或可以由化学合成或一般重组方法提供。
显而易见的是由上述DNA序列编码的PCVII蛋白质、来源于其的 活性片段、类似物和嵌合蛋白质可以通过各种方法产生。重组产物可 以采取部分蛋白质序列、全长序列的形式，包括信号序列的前体形式， 不含信号的成熟形式，或甚至是融合蛋白(例如，包含对于重组宿主 合适的前导序列，或包含关于其它病原体的其它亚单位抗原序列)。
可以构建基因文库并将所得到的克隆用于转化合适的宿主细胞。 集落可以合并且使用针对PCVII蛋白质的多克隆血清或单克隆抗体进 行筛选。
可替代地，一旦测定氨基酸序列，就可以制备包含编码所测定氨 基酸序列部分的密码子的寡核苷酸探针并用于在基因组或cDNA文库 中筛选编码目标蛋白质的基因。用于制备寡核苷酸探针和DNA文库， 及其通过核酸杂交的筛选的基本策略是本领域普通技术人员众所周知 的。参见，例如，DNA Cloning：第I卷，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上；Oligonucleotide Synthesis，同上；Sambrook 等人，同上。一旦来自筛选文库的克隆已通过阳性杂交鉴定，就可以 通过限制性酶分析和DNA测序证实特定文库插入物包含PCVII蛋白质 基因或其同系物。基因随后可以使用标准技术进一步分离，并且适当 时，使用PCR方法或限制性内切酶删除全长序列的部分。
类似地，基因可以使用已知技术例如苯酚提取直接从病毒中分离， 并且序列进一步处理以产生任何所需改变。关于用于获得和分离病毒 DNA的技术描述，参见例如，本文的实施例以及Hamel等人，(1998) J.Virol.72：5262-5267。
可替代地，DNA序列可以合成制备而不是克隆。如果序列将在蛋 白质生产中使用，那么可以设计具有对于特定氨基酸序列合适的密码 子的DNA序列。一般而言，如果序列将用于表达，那么将选择预期宿 主的偏爱密码子。全序列由通过标准方法制备并装配成完整编码序列 的重叠寡核苷酸装配。参见，例如，Edge(1981)Nature 292：756； Nambair等人，(1984)Science 223：1299；Jay等人，(1984)J. Biol.Chem.259：6311。
一旦所需蛋白质的编码序列已制备或分离，它们就可以克隆到任 何合适的载体或复制子内。众多克隆载体是本领域技术人员已知的， 并且合适的克隆载体的选择仅是挑选的问题。用于克隆的重组DNA载 体以及它们可以转化的宿主细胞的例子包括噬菌体(大肠杆菌)、 pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性 菌)、pGV1106(革兰氏阴性菌)、pLAFR1(革兰氏阴性菌)、pME290 (非大肠杆菌的革兰氏阴性菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis))、pBD9(芽孢杆菌(Bacillus))、pIJ61 (链霉菌(Streptomyces))、pUC6(链霉菌)、YIp5(糖酵母 (Saccharomyces))、YCp19(糖酵母)和牛乳头瘤病毒(哺乳动物 细胞)。参见，Sambrook等人，同上；DNA Cloning，同上；B.Perbal， 同上。
基因可以置于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和任选 地操纵子(本文统称为“控制”元件)的控制下，从而使得编码所需 蛋白质的DNA序列在通过包含这种表达构建体的载体转化的宿主细胞 中转录成RNA。编码序列可以含有或不含信号肽或前导序列。如果包 括信号序列，那么它可以是天然的同源序列、或异源序列。前导序列 可以通过宿主在翻译后加工中去除。参见，例如，美国专利号 4,431,739；4,425,437；4,338,397。
其他调节序列也可能是希望的，其允许相对于宿主细胞生长调节 蛋白质序列的表达。调节序列是本领域技术人员已知的，并且例子包 括响应化学或物理刺激(包括在调节化合物的存在下)，导致基因表 达开启或关闭的那些。其他类型的调节元件也可以存在于载体中，例 如增强子序列。
控制序列和其他调节序列可以在插入到载体例如上文所述的克隆 载体之前与编码序列连接。可替代地，编码序列可以直接克隆到已包 含控制序列和合适的限制性位点的表达载体内。
在某些情况下可能必须修饰编码序列，从而使得它可以以合适方 向连接至控制序列；即，以维持正确可读框。还可能希望生产所需 PCVII蛋白质的突变体或类似物。突变体或类似物可以通过下列制备： 删除编码蛋白质的序列的部分，插入序列，和/或置换序列内的一个或 多个核苷酸。用于修饰核苷酸序列的技术，例如定点诱变，在例如 Sambrook等人，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上，中描述。
表达载体随后用于转化合适的宿主细胞。许多哺乳动物细胞系是 本领域已知的且包括从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可获得的永 生细胞系，例如但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、 幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、Mandin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、以及其他。类似地，细 菌宿主例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌属将在本表达构建体中 发现用途。在本发明中有用的酵母宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母 (Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、 脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)、季氏毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。用于与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞包括埃 及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、 家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草 地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。
取决于选择的表达系统和宿主，本发明的蛋白质通过在能表达目 的蛋白质的条件下培养用上文所述表达载体转化的宿主细胞来产生。 蛋白质随后从宿主细胞中分离并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到 生长培养基内，那么蛋白质可以直接从培养基中纯化。如果蛋白质不 是分泌的，那么它从细胞裂解物中分离。合适的生长条件和回收方法 的选择在本领域技术内。
本发明的蛋白质还可以通过化学合成例如固相肽合成使用已知的 氨基酸序列或来源于目的基因的DNA序列的氨基酸序列来生产。此类 方法是本领域技术人员已知的。关于固相肽合成技术参见例如，J.M. Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.， Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.(1984)以及G.Barany和R. B.Merrifield，The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology， editors E.Gross和J.Meienhofer，第2卷，Academic Press，New York，(1980)，第3-254页；关于传统溶液合成参见M.Bodansky， Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Berlin(1984) 以及E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，The Peptides：Analysis， Synthesis，Biology，同上，第1卷。如果所述抗原的小片段能够在目 的受试者中产生免疫应答，那么肽的化学合成可能是优选的。
基因组分析显示存在至少6个可读框，其中至少一个编码假定的 DNA复制酶基因。
肽的抗原区一般相对较小，长度一般为10个氨基酸或更小。少至 5个氨基酸的片段一般可以表征抗原区。因此，使用PCVII的基因组 作为基础，来源于PCVII各个ORF中的任何一个，例如ORF1-6，且 特别是ORF 6，并且编码多肽的短区段的DNA可以重组表达为融合蛋 白或分离的肽。另外，短氨基酸序列可以化学合成。在其中合成的肽 适当构建以便提供正确表位但又太小而不能是免疫原的情况下，肽可 以连接至合适载体。
用于获得此类键的许多技术是本领域已知的，包括使用从Pierce Company，Rockford，IL获得的N-琥珀酸亚胺基-3-(2-吡啶基-硫代) 丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷 -1-羧酸酯(SMCC)形成二硫键。(如果肽缺少巯基，那么这可以通过 添加半胱氨酸残基来提供。)这些反应物在其自身和一种蛋白质上的 肽半胱氨酸残基之间产生二硫键，并通过另一种蛋白质中的赖氨酸上 的e-氨基，或其他游离氨基产生酰胺键。各种此类二硫化物/酰胺形 成剂是已知的。参见，例如，Immun.Rev(1982)62：185。其他双 功能偶联剂形成硫醚而不是二硫键。这些硫醚形成剂中的许多是商购 可得的并且包括6-马来酰亚胺基己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N- 马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸等的活性酯类。羧基可以通过将 其与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸，钠盐组合来活化。前述名 单并不意味着是穷举性的，并且无疑可以使用指定化合物的变体。
可以使用其自身不诱导产生对宿主有害的抗体的任何载体，例如 各种血清白蛋白、破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白(KLH)。
当缀合物注射到合适受试者内时将导致产生包含免疫球蛋白的抗 血清，所述免疫球蛋白不仅特定反应性针对缀合物，还针对携带序列 的类似部分的融合蛋白，并针对整个PCVII内的合适决定簇。
由本发明的新型病毒编码的蛋白质或其片段可以用于生产多克隆 和单克隆抗体。如果多克隆抗体是需要的，那么选择的哺乳动物(例 如，小鼠、兔、山羊、马等)用本发明的抗原、或其片段、或突变抗 原免疫。收集来自免疫动物的血清并根据已知操作处理。参见，例如， Jurgens等人，(1985)J.Chrom.348：363-370。如果使用包含多 克隆抗体的血清，那么多克隆抗体可以通过免疫亲和层析使用已知操 作进行纯化。
针对蛋白质及其片段的单克隆抗体同样可以由本领域技术人员容 易地生产。通过使用杂交瘤技术用于制备单克隆抗体的一般方法是众 所周知的。永生的抗体产生细胞系可以通过细胞融合，以及通过其他 技术例如用致癌性DNA直接转化、或用EB病毒转染B淋巴细胞进行制 备。参见，例如，M.Schreier等人，Hybridoma Techniques(1980)； Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981)；Kennett等人，Monoclonal Antibodies(1980)；还参见 美国专利号4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887； 4,452,570；4,466,917；4,472,500，4,491,632；和4,493,890。可 以筛选针对所需蛋白质或其片段产生的单克隆抗体组的各种特性；即， 同种型、表位、亲和力等。使用免疫亲和技术，单克隆抗体在它们针 对的相应抗原的纯化中有用。多克隆和单克隆抗体也可以用于被动免 疫接种或可以与亚单位疫苗制剂组合以增强免疫应答。多克隆和单克 隆抗体同样对于诊断目的是有用的。
本发明的新型病毒蛋白质可以单独或与其他抗原组合配制到疫苗 组合物中用于在如下所述的受试者免疫中使用。制备此类制剂的方法 在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，18 Edition，1990中描述。一般 地，本发明的疫苗制备为可注射的，作为液体溶液或悬浮液。还可以 制备在注射之前适合于制成液体媒介物中的溶液或悬浮液的固体形 式。制剂还可以是乳化的或活性成分可以包装在脂质体媒介物中。活 性免疫原性成分一般与相容的药学媒介物例如水、盐水、葡萄糖、甘 油、乙醇等及其组合混合。另外，需要时，媒介物可以包含较小量的 辅助物质例如湿润或乳化剂和pH缓冲剂。
增强疫苗功效的佐剂也可以加入制剂中。此类佐剂包括但不限于， 由铝盐(铝)形成的佐剂，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；水包 油和油包水型乳剂制剂，例如完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂 (IFA)、阿夫立定和二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)；由细菌细胞 壁组分形成的佐剂，例如佐剂包括单磷酰脂质A(MPL)(Imoto等人， (1985)Tet.Lett.26：1545-1548)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM) 和细胞壁骨架(CWS)；来源于ADP-核糖基化的细菌毒素的佐剂，例 如来源于白喉毒素(例如，CRM197，无毒的白喉毒素突变体(参见，例 如Bixler等人，(1989)Adv. Exp.Med.Biol.251：175；和Constantino 等人，(1992)Vaccine)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大 肠杆菌热敏毒素(LT1和LT2)、假单胞菌(Pseudomonas)内毒素A、 肉毒梭菌(C.botulinum)C2和C3毒素，以及来自产气荚膜杆菌(C. perfringens)、C.spiriforma和难辨梭菌(C.difficile)的毒素； 皂甙佐剂，例如Quil A(美国专利号5,057,540)，或由皂甙产生的 颗粒例如ISCOMs(免疫刺激复合物)；细胞因子，例如白介素(例如， IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)，干扰素(例如， γ干扰素)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF) 等；胞壁酰肽例如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺 (thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨 酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨 酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE) 等；来源于CpG分子家族、CpG二核苷酸和包含CpG基序的合成寡核 苷酸(参见，例如，Krieg等人，Nature(1995)374：546和Davis 等人，J.Immunol.(1998)160：870-876)的佐剂；以及合成佐剂， 例如PCPP(聚二(羧基苯氧基)磷腈)(Payne等人，Vaccines(1998) 16：92-98)。此类佐剂是从许多经销商例如Accurate Chemicals； Ribi Immunechemicals，Hamilton，MT；GIBCO；Sigma，St.Louis， MO商购可得的。
如上文说明的，蛋白质可以连接至载体以便增加其免疫原性。合 适的载体包括大的代谢缓慢的大分子例如蛋白质，包括血清白蛋白、 钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白以及本领 域技术人员众所周知的其他蛋白质；多糖，例如琼脂糖凝胶、琼脂糖、 纤维素、纤维素珠等；聚氨基酸例如聚谷氨酸、聚赖氨酸等；氨基酸 共聚物；和灭活的病毒颗粒。
蛋白质可以以其天然形式使用，或者其官能团内含物可以通过例 如赖氨酸残基的琥珀酰化或与Cys-硫内酯反应进行修饰。巯基也可以 通过例如氨基官能团与2-亚氨基噻吩(iminothiolane)或3-(4-二 硫代吡啶基)丙酸盐的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应掺入载体(或抗原) 内。合适的载体也可以进行修饰以掺入间隔臂(例如环己二胺或类似 大小的其他双功能分子)用于附着肽。
关于本发明蛋白质的其他合适载体包括如引入本文作为参考的美 国专利号5,071,651中公开的轮状病毒的VP6多肽，或其功能片段。 还有用的是通过美国专利号4,722,840中公开的方法制备的目的免疫 原和病毒蛋白质的融合产物。再其他合适的载体包括细胞，例如淋巴 细胞，因为以这种形式呈递模拟受试者中引起免疫状态的天然呈递方 式。可替代地，本发明的蛋白质可以偶联至红细胞，优选受试者自己 的红细胞。将肽与蛋白质或细胞偶联的方法是本领域技术人员已知的。
此外，蛋白质可以以中性或盐形式配制到疫苗组合物内。药学可 接受的盐包括酸加成盐(由活性多肽的游离氨基形成)以及由无机酸 例如盐酸或磷酸，或此类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形 成的。由游离羧基形成的盐还可以来源于无机碱例如氢氧化钠、钾、 铵、钙或铁，以及此类有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组 氨酸、普鲁卡因等。
疫苗制剂将包含“治疗有效量”的活性成分，即，能够在组合物 将施用的受试者中诱发免疫应答的量。此类应答将通过受感染宿主通 常显示的症状的减少或缺乏和/或更快的恢复时间来证明。
确切量由本领域技术人员使用标准测试容易地确定。蛋白质浓度 一般将为组合物的1％-约95％(w/w)，或适当时再更高或更低。
为了免疫受试者，疫苗一般肠胃外通常通过肌内注射施用。然而， 其他施用方式例如皮下、腹膜内和静脉内注射也是可接受的。待施用 的量取决于待治疗的动物、动物免疫系统合成抗体的能力、以及所需 的保护程度。有效剂量可以由本领域普通技术人员通过确定剂量应答 曲线的常规试验容易地确定。受试者通过施用至少1次剂量，且优选 2次剂量的疫苗来免疫。此外，动物可以施用维持针对感染的免疫状 态所需的多次剂量。
适合于其他施用方式的另外的疫苗制剂包括栓剂，以及在某些情 况下的气溶胶、鼻内、口服制剂、和缓释制剂。对于栓剂，媒介物组 合物将包括传统的结合剂和载体，例如聚碱性乙二醇(polyalkaline glycol)或甘油三酸酯。此类栓剂可以由包含约0.5％-约10％(w/w)， 优选约1％-约2％的活性成分的混合物形成。口服媒介物包括此类通 常使用的赋形剂如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维 素糖精钠、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可以采取溶液、悬浮液、 片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、或粉剂的形式，并且包含约10％-约 95％的活性成分，优选约25％-约70％。
鼻内制剂将通常包括既不会对鼻粘膜造成刺激也不会明显干扰纤 毛功能的媒介物。稀释剂例如水、盐水或其他已知物质可以由本发明 使用。鼻制剂还可以包含防腐剂例如但不限于，氯丁醇和苯扎氯铵。 可以存在表面活性剂以增强目的蛋白质被鼻粘膜的吸收。
受控或缓释制剂通过将蛋白质掺入载体或媒介物内来制备，所述 载体或媒介物为例如脂质体、不可再吸收的不透性聚合物例如乙烯乙 酸乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物，可膨胀的聚合物例如水凝胶，或 可再吸收的聚合物例如胶原和某些多元酸或聚酯，例如用于制备可再 吸收的缝线的那些。蛋白质还可以使用本领域众所周知的植入的微型 泵递送。
本发明的蛋白质还可以经由表达其的载体病毒施用。与本发明一 起使用的载体病毒包括但不限于痘苗及其他痘病毒、腺病毒和疱疹病 毒。例如，表达新型蛋白质的重组痘苗病毒可以如下构建。编码特定 蛋白质的DNA首先插入合适的载体内，从而使得它邻近痘苗启动子并 位于痘苗DNA序列侧翼，例如编码胸苷激酶(TK)的序列侧翼。这种 载体随后用于转染同时感染痘苗的细胞。同源重组用于将痘苗启动子 和编码本发明蛋白质的基因插入病毒基因组内。在5-溴脱氧尿苷的存 在下培养细胞并挑选对其有抗性的病毒斑可以选择所得到的TK重组 体。
可替代的施用途径涉及基因治疗或核酸免疫接种。因此，编码目 的蛋白质的核苷酸序列(和伴随的调节元件)可以直接施用于受试者 用于其体内翻译。可替代地，离体转染受试者细胞或组织并将转化的 材料再引入宿主内可以完成基因转移。DNA可以直接引入宿主生物内， 即，通过注射(参见美国专利号5,580,859和5,589,466；国际公开 号WO 90/11092；以及Wolff等人，(1990)Science 247：1465-1468)。 脂质体介导的基因转移还可以使用已知方法完成。参见，例如，美国 专利号5,703,055；Hazinski等人，(1991)Am.J.Respir.Cell Mol. Biol.4：206-209；Brigham等人，(1989)Am.J.Med.Sci.298： 278-281；Canonico等人，(1991)Clin.Res.39：219A；和Nabel 等人，(1990)Science 249：1285-1288。靶向试剂例如针对特定细 胞类型上表达的表面抗原的抗体可以与脂质体表面共价缀合，从而使 得核酸可以递送至对感染敏感的特定组织和细胞。
如上文说明的，本发明的蛋白质还可以用作诊断剂以检测生物样 品中PCVII反应性抗体的存在，以便确定PCVII感染的存在。例如， 与蛋白质反应的抗体的存在可以使用标准电泳和免疫诊断技术进行检 测，包括免疫测定法例如竞争、直接反应、或夹层型测定法。此类测 定法包括但不限于，蛋白质印迹法；凝集测试；酶标记和介导的免疫 测定法，例如ELISAs；生物素/抗生物素蛋白型测定法；放射性免疫 测定法；免疫电泳法；免疫沉淀等。反应一般包括显示标记例如荧光、 化学发光、放射性、酶标记或染料分子，或用于检测抗原以及与其反 应的一种或多种抗体之间的复合物形成的其他方法。
上述测定法一般涉及液相中未结合的抗体与抗原-抗体复合物与 其结合的固相载体的分离。可以在本发明实践中使用的固体载体包括 基质例如硝酸纤维素(例如，以膜或微量滴定孔的形式)；聚氯乙稀 (例如，片或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微量滴定板)； 聚偏氟乙烯；重氮化纸；尼龙膜；活化珠、磁性反应珠等。
一般地，固体载体首先在合适的结合条件下与固相组分(例如， 一种或多种PCVII蛋白质)反应，从而使得组分充分固定于载体。首 先将抗原与具有较佳结合特性的蛋白质偶联有时可以增强抗原与载体 的固定。合适的偶联蛋白包括但不限于，大分子例如血清白蛋白包括 牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋 白、卵白蛋白以及本领域技术人员众所周知的其他蛋白质。可以用于 使抗原结合载体的其他分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、 氨基酸共聚物等。此类分子以及将此类分子与抗原偶联的方法是本领 域普通技术人员众所周知的。参见，例如，Brinkley，M.A. Bioconjugate Chem.(1992)3：2-13；Hashida等人，J.Appl.Biochem. (1984)6：56-63；以及Anjaneyulu和Staros，International J.of Peptide and Protein Res.(1987)30：117-124。
固体载体与固相组分反应后，通过洗涤从载体中去除任何未固定 的固相组分，并且随后在合适的结合条件下使载体结合组分与怀疑包 含配体部分(例如，针对固定抗原的抗体)的生物样品接触。洗涤以 去除任何未结合配体后，在合适的结合条件下加入次级结合剂部分， 其中所述次级结合剂能够与结合配体选择性结合。次级结合剂的存在 随后可以使用本领域众所周知的技术进行检测。
更具体而言，可以使用其中微量滴定板孔用所需蛋白质包被的 ELISA法。随后向包被孔中加入含有或怀疑含有抗蛋白质免疫球蛋白 分子的生物样品。足以允许抗体结合固定的抗原的孵育期后，可以洗 涤板以去除未结合部分并加入可检测地标记的次级结合分子。允许次 级结合分子与任何捕获的样品抗体反应，洗涤板并使用本领域众所周 知的方法检测次级结合分子的存在。
因此，在一个具体实施方案中，来自生物样品的结合的抗-抗原配 体的存在可以使用包含针对抗体配体的抗体的次级结合剂容易地检 测。许多抗猪免疫球蛋白(Ig)分子是本领域已知的，其可以使用本 领域技术人员已知的方法容易地缀合至可检测的酶标记，例如辣根过 氧化物酶、碱性磷酸酶或脲酶。合适的酶底物随后用于产生可检测的 信号。在其他相关实施方案中，竞争型ELISA技术可以使用本领域技 术人员已知的方法实行。
测定法还可以在溶液中进行，从而使得蛋白质和对那些蛋白质特 异的抗体在导致沉淀的条件下形成复合物。在一个具体实施方案中， 蛋白质可以使用本领域已知的偶联技术，例如通过直接化学或间接偶 联，附着至固相颗粒(例如，琼脂糖珠等)。抗原包被的颗粒随后在 合适的结合条件下与怀疑含有针对蛋白质的抗体的生物样品接触。结 合抗体之间的交联导致形成颗粒-抗原-抗体复合物聚集物，这可以沉 淀并使用洗涤和/或离心与样品分开。可以使用众多标准方法中的任何 一种例如上文描述的那些免疫诊断方法分析反应混合物，以确定抗体- 抗原复合物的存在或缺乏
在再进一步的实施方案中，可以提供免疫亲和性基质，其中来自 怀疑含有针对目的蛋白质的抗体的生物样品的多克隆抗体群体与基质 固定。在这点上，可以使用固定抗原进行样品的最初亲和纯化。所得 到的样品制剂因此将只包含抗PCVII部分，避免亲和力载体中可能的 非特异性结合特性。以高产量和良好保留抗原结合活性的固定免疫球 蛋白(完整的或特异性片段)的众多方法是本领域已知的。不受任何 具体方法的限制，固定的A蛋白或G蛋白可以用于固定免疫球蛋白。
因此，一旦免疫球蛋白分子已固定以提供免疫亲和性基质，标记 的蛋白质就可以在合适的结合条件下与结合抗体接触。任何非特异性 结合抗原已从免疫亲和性载体洗涤后，结合抗原的存在可以通过使用 本领域已知的方法测定标记来确定。
另外，针对蛋白质产生的抗体而不是蛋白质本身可以在上述测定 法中使用，以便检测给定样品中针对蛋白质的抗体的存在。这些测定 法基本上如上所述进行且是本领域技术人员众所周知的。
此外，还可以进行基于核酸的测定法。在这点上，使用公开的 PCVII核酸序列作为基础，可以制备寡聚物用作杂交探针或PCR引物 以检测例如来自怀疑含有病毒的受试者的生物样品中病毒基因组的存 在。用于在本发明的这个实施方案中使用的寡聚物长度为大约8个核 苷酸或更多，优选长度为至少约10-12个核苷酸，更优选长度为至少 约15-20个核苷酸，且长度至多50个或更多个核苷酸。优选地，寡 聚物来源于缺乏异质性的病毒基因组区域。
寡聚物通过从基因组中切除，或重组或合成制备。例如，寡聚物 可以使用常规方法例如寡核苷酸自动化合成法制备。
寡聚物可以在诊断测定法中用作探针。在代表性测定法中，处理 待分析的生物样品以提取其中包含的核酸。可以对从样品中获得的核 酸实施凝胶电泳或其他大小分离技术。可替代地，核酸样品可以无需 大小分离即可进行点印迹。探针随后用报道分子部分标记。合适的标 记以及用于标记探针的方法是本领域已知的，且包括例如通过切口翻 译或激酶作用(kinasing)掺入的放射性标记、生物素、荧光探针和 化学发光探针。从样品中提取的核酸随后在合适严格性的杂交条件下 用标记探针处理。
可以制备与靶向的PCVII基因序列完全互补的探针。然而，当在 诊断测定法中使用较长的探针时，互补性的程度可以较少。一般地， 在测定方法中使用高严格性条件，特别是当探针完全或高度互补时。 然而，当靶向异质性区域时应当使用严格性较低的条件。调整严格性 的方法是本领域众所周知的。此类调整在杂交和洗涤操作过程中进行 并且包括温度、离子强度、甲酰胺浓度和反应时间长度的调整。这些 因素在例如Sambrook等人，同上，中概述。
在一个更具体的实施方案中，上述方法包括使用PCVII核酸特异 性探针，其中2种探针(引物)限定PCVII基因组的内部区域。在这 个实施方案中，每种探针具有包含PCVII核酸内部区域内的3′末端的 一条链。核酸/探针杂交复合物随后通过引物延伸反应转换成包含双链 探针的片段。包含探针的片段通过接连重复下列步骤来扩增：(i)使 双链双链探针的片段变性以产生单链片段，(ii)使单链与探针杂交 以形成链/探针复合物，(iii)在DNA聚合酶以及所有4种脱氧核糖 核苷酸的存在下由链/探针复合物产生双链片段，和(iv)重复步骤(i) 到(iii)直至已达到所需扩增程度。扩增产物随后根据已建立的操作 鉴定。本发明的方法可以进一步包括能够与上述内部区域但不与用于 扩增的特异性探针/引物序列选择性杂交的第三种多核苷酸探针。
PCR技术例如上述的那些是本领域众所周知的。参见，例如，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press)； PCR A Practical Approach(IRL press)；Saiki等人，(1986)Nature 324：163。
其他扩增方法也可以在基于核酸的测定法中使用，例如连接酶链 反应(LCR)、PCR、Q-β复制酶等。
用于在本文中使用的其他测定法包括“Bio-Bridge”系统，其使 用末端脱氧核苷酸转移酶给核酸探针添加未修饰的3′-聚-dT-尾 (Enzo Biochem.Corp.)。带聚dt-尾的探针与靶核苷酸序列杂交， 并随后与生物素修饰的多聚A杂交。另外，EP 124221描述了DNA杂 交测定法，其中分析物退火至与酶标记的寡核苷酸互补的单链DNA探 针，并且所得到的加尾双链体与酶标记的寡核苷酸杂交。EP 204510 描述了DNA杂交测定法，其中分析物DNA与具有尾例如聚-dT-尾的探 针接触，具有与探针尾杂交的序列例如多聚A序列的扩增链，并且其 能够结合多条标记链。该技术首先可以涉及血清中的靶PCVII序列如 上所述扩增至大约106序列/ml。扩增的序列随后可以使用本领域已知 的杂交测定法进行检测。
此外，来源于PCVII病毒基因组的核酸序列还可以用于原位杂交 测定法。一般地，此类测定法使用福尔马林固定的细胞培养制剂或组 织，例如淋巴结、脾脏、扁桃体、肝、肺、心脏、肾、胰腺、鼻甲、 大肠和小肠等。关于合适的原位杂交测定法的描述参见，例如， Sirinarumitr等人，(1996)J.Virol.Meth 56：149-160。
上述测定法的反应物，包括蛋白质、针对其的抗体或寡聚物可以 与合适的说明书和其他必需的反应物一起在试剂盒中提供，以便进行 如上所述的免疫测定法。取决于使用的特定免疫测定法，试剂盒还可 以包含合适的标记以及其他包装的反应物和材料(即，洗涤缓冲液等)。 标准免疫测定法，例如上文描述的那些，可以使用这些试剂盒进行。
申请人已从位于加拿大、美国(California)和法国(Brittany) 的农场获得的肺或神经节样品中成功地分离了5种PCV新毒株。这些 病毒已在具有PMWS综合征的猪的病灶中检测到，但在健康猪中则没 有。另外，新型螺杆菌属细菌物种已鉴定并发现位于患有胃食管溃疡 的猪的胃和食管的粘膜表面之中和之上。一种新型螺杆菌物种是H. cerdo，其与幽门螺杆菌紧密相关但不相同。
另外，申请人已测序了PCV新毒株中4种的基因组，即从加拿大 和美国获得的毒株以及2种法国毒株。毒株在核苷酸水平上互相显示 出非常强的同源性，超过96％，并且与PK15毒株的同源性弱得多， 约76％。新毒株因此可以视为新类型猪圆环病毒(本文中称为II型) 的代表，I型由PK15代表。
5种毒株的纯化制剂根据布达佩斯条约于1997年10月2日星期 四以保藏号V97100219(本文中称为Imp.1008PCV)；V97100218(本 文中称为Imp.1010PCV)；V97100217(本文中称为Imp.999PCV)； 并且于1998年1月16日星期五以保藏号V98011608(本文中称为 Imp.1011-48285)；和V98011609(本文中称为Imp.1011-48121)保 藏于ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Culture)，应用微生物和研究中心(Centre for Applied microbiology &Research)，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，United Kingdom)。
PCVII毒株还从经历晚期流产和死产的农场的一窝流产小猪中分 离。重症弥漫性心肌炎存在于伴随广泛的PCVII抗原免疫组织化学染 色的1只小猪中。不同量的PCVII抗原还存在于多个胚胎的肝、肺和 肾中。与胎儿损伤和猪流产有关的其他因素包括猪细小病毒、猪繁殖 与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒和肠道病毒的存在无法确定。
从超过4周岁的30个高度健康的兽群获得并在常规流产或繁殖失 败的情况下测试的组织，在涉及几只死产小猪和不能存活的新生儿的 2次提交物中对于PCVII是阳性的，所述小猪呈现重症弥漫性心肌炎、 心脏肥大和慢性被动性充血的证据。2次阳性提交物来自同一农场， 但在2次不同的时间发生。受侵袭小猪的心脏及其他组织中的PCVII 通过免疫组织化学和病毒分离证实。在1999年前地方性传染区域中繁 殖失败的情况下无法检测到猪圆环病毒支持了生殖疾病是PCVII感染 的新临床表现的观点，并进一步暗示性传播方式以及垂直传播方式负 责猪群中的病毒散播。
因此，在如上所述的免疫接种程序表中用包括至少一种PCVII免 疫原(例如，来自在毒株Imp1008、Imp1010、Imp999、Imp1011-48285、 Imp1011-48121、1103和1121中选择的至少一种毒株)的组合物(所 述组合物还可以包括来自至少一种其他猪病原体例如至少一种猪细小 病毒的至少一种免疫原，其中当使用载体时，载体可以共表达PCVII 免疫原和至少一种其他猪病原体例如螺杆菌物种的至少一种免疫原或 PPV免疫原)接种猪例如母猪，例如大母猪或小母猪，可以预防与PCVII 相关的心肌炎和/或流产和/或子宫内感染，以及断奶仔猪多系统衰竭 综合征和其他与PCVII相关的病理后遗症。
因此，本发明包含了使用PCVII免疫原的方法和组合物，用于预 防与猪圆环病毒-2相关的心肌炎和/或流产和/或子宫内感染，以及与 PCVII相关的断奶仔猪多系统衰竭综合征和其他病理后遗症，以及对 抗其他感染例如螺杆菌物种。来自毒株1103和/或毒株1121的免疫原 可以对使用PCVII免疫原的方法和组合物有用，用于预防与猪圆环病 毒-2相关的心肌炎和/或流产和/或子宫内感染，并且可以根据本发明 与来源于螺杆菌物种优选H.cerdo的一种或多种免疫原组合。
PCVII免疫原可以是任何PCVII免疫原，包括任何表达PCVII的 载体，并且包含PCVII免疫原且在本发明实践中使用的组合物可以是 如任何本文引用的文件(或本文引用的文件中引用的任何文件)中的， 包括下列中的任何一个或全部：于1999年7月1日提交的美国申请序 列号09/347,594，于1998年7月6日提交的法国申请号98 08777； 于1998年9月25日提交的美国申请序列号09/161,092；于1998年5 月21日提交的美国申请序列号09/082,558；分别于1997年10月3 日、1998年1月22日和1998年3月20日提交的法国申请号9712382、 98 00873和98 03707；WO-A-99 18214；Audonnet等人，和Bublot 等人的美国申请，于1999年6月10日提交的序列号分别为60/138,352 和60/138,478，以及分别于2000年5月31日和6月1日提交的序列 号09/586,535和09/583,545(分别为“DNA VACCINE-PCV”，和“PORCINE CIRCOVIRUS RECOMBINANT POXVIRUS VACCINE”)；以及WO99/29717 (所有这些以及其中和其申请过程中引用的文件在此引入本文作为参 考)。因此，包含PCVII免疫原的组合物，包括表达PCVII免疫原的 载体可以如本文引用的文件所述制备。
来自至少一种其他猪病原体的至少一种免疫原可以如上述或本文 引用的专利或文献出版物(或其中引用的文件)中的任何一个中描述 的，或如已知猪疫苗或免疫原性组合物中使用的，或如1997年7月 15日提交的PCT/FR97/01313，于1998年1月29日公开的WO 98/03658； 或于1996年7月19日提交的法国申请96 09338；或于1999年1月 15日提交的美国申请序列号09/232,468(“POLYNUCLEOTIDE VACCINE FORMULA AGAINST PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY PATHOLOGIES”)中所述。
本发明中使用的组合物中PCVII免疫原的量可以如上述或本文引 用的专利或文献出版物(或其中引用的文件)中的任何一个中描述的。 并且，来自至少一种其他猪病原体的至少一种免疫原的量可以如上述 或本文引用的专利或文献出版物(或其中引用的文件)中的任何一个 中描述的，或如已知猪疫苗或免疫原性组合物中使用的。
用于在本发明中使用的组合物可以依照兽医学或药学领域的技术 人员众所周知的标准技术制备。此类组合物可以考虑到此类因素如猪 的年龄、性别、重量、状况和具体治疗以及施用途径以兽医学领域的 技术人员众所周知的剂量和技术施用。组合物可以单独施用，或可以 与本发明的其他组合物(例如包含PCVII免疫原的其他组合物)或与 其他预防或治疗组合物(例如，其他猪免疫原性或疫苗组合物)一起 共施用或顺次施用。因此，本发明还提供了多价或“混合(cocktail)” 或组合组合物，以及使用它们的方法。在这点上，可以参考美国专利 号5,843,456，所述专利引入本文作为参考且涉及狂犬病组合物和组 合组合物及其用途。
本发明的组合物可以用于肠胃外或粘膜施用，优选通过皮内或肌 内途径。特别对于皮内途径，注射可以使用无针注射器完成。当使用 粘膜施用时，可以使用口、鼻或眼途径。
在此类组合物中，免疫原可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例 如无菌水、生理盐水、葡萄糖等和/或优选与佐剂混合。组合物还可以 是冻干或冷冻的。取决于施用途径和所需制剂，组合物可以包含辅助 物质例如pH缓冲剂、佐剂、防腐剂、用于粘膜途径的聚合物赋形剂等。
可以使用由M.Powell和M.Newman，Plenum Press，1995编辑 的“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”第147 页上描述的SPT乳剂，以及同一本书的第183页上描述的乳剂MF59。 例如包含佐剂的疫苗以下列方式制备：包含免疫原的67％v/v水相借 助于乳化叶轮式混合器在2.3％w/v甘露醇酐油酸酯、2.6％w/v用11 EO(环氧乙烷)乙氧基化的油酸和28.1％v/v轻液体石蜡油(欧洲药 典型)中乳化。
用于制备乳剂的可替代方法包括使混合物通过高压匀浆器进行乳 化，所述混合物包括5％w/v角鲨烷、2.5％w/v PluronicL121、0.2 ％w/v用20 EO乙氧基化的油酸和脱水山梨糖醇的酯、包含免疫原的 92.3％v/v水相。
进一步的佐剂例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物以及马来酸 酐和烯基衍生物共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是特别与糖或多 元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。这些化合物称为 卡波姆(Phameuropa第8卷，No.2,June1996)。本领域技术人员 还可以参考美国专利号2,909,462(引入本文作为参考)，其描述了 与含有至少3个羟基，优选不超过8个的多羟基化合物交联的此类丙 烯酸聚合物，其中至少3个羟基的氢原子由含有至少2个碳原子的不 饱和脂肪族基团取代。优选的基团是含有2-4个碳原子的那些，例如 乙烯基、烯丙基和其他烯键型不饱和基团。不饱和基团其自身可以含 有其他取代基，例如甲基。以名称Carbopol(BF_Goodrich，Ohio， USA)出售的产品是特别合适的。它们是与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊 四醇交联的。在它们中可以提及的是Carbopol974P、934P和971P。 在马来酸酐和烯基衍生物共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是优选 的，它是马来酸酐和乙烯共聚物，线性或交联的，例如与乙烯醚交联 的。可以参考引入本文作为参考的J.Fields等人，Nature，186： 778-780，4 June 1960。
从其结构观点来看，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物以及共聚物EMA 优选由下式的基本单位形成：

其中，R1和R2是相同或不同的，表示H或CH3；x＝0或1，优选x ＝1；和y＝1或2，而x+y＝2。对于共聚物EMA，x＝0和y＝ 2。对于卡波姆，x＝y＝1。
这些聚合物溶解于水中导致将优选中和至生理学pH的酸性溶液， 以便产生免疫原性、免疫或疫苗组合物自身将掺入其中的佐剂溶液。 聚合物的羧基随后部分为COO-形式。
优选地，根据本发明的佐剂特别是卡波姆的溶液在蒸馏水中优选 在氯化钠的存在下制备，获得的溶液为酸性pH。这种贮存液通过将其 加入所需量(用于获得所需最终浓度)或其基本部分的含有NaCl的水 中稀释，优选生理盐水(NaCL 9g/l)，一次或分为几个部分加入， 伴随同时或随后中和(pH 7.3-7.4)，优选用NaOH。当其用于与疫 苗混合时，将使用这种生理学pH的溶液，这可以特别以冻干、液体或 冷冻的形式贮存。
最终疫苗组合物中的聚合物浓度可以是0.01％-2％w/v，例如 0.06-1％w/v，例如0.1-0.6％w/v。
根据本公开内容和本领域的知识，无需过度实验，技术人员即可 选择合适的佐剂(需要时)以及其在根据本发明的免疫、免疫原性或 疫苗组合物中使用的量。
根据本发明的免疫原性或疫苗组合物可以与表达来自至少一种另 外猪病原体的至少一种免疫原或目的表位的至少一种活的减毒、灭活、 或亚单位疫苗，或重组疫苗(例如，作为载体或DNA质粒的痘病毒) 组合。
本发明设想了用于各种施用途径形式的组合物。并且再一次，有 效剂量和施用途径通过已知因素例如年龄、性别、重量以及已知且不 需要过度实验的其他筛选操作确定。每种活性剂的剂量可以如本文引 用的文件所述的和/或可以为1或数微克-数百或数千微克，例如对于 亚单位免疫原性或疫苗组合物为1μg-1mg；和对于灭活的(灭活前 滴度)免疫原性或疫苗组合物为104-1010 TCID50，有利地106-108 TCID50。对于活的减毒免疫原性或疫苗组合物，剂量可以为101-108， 有利地103-106 TCID50。
重组体或载体可以以合适的量施用，以获得对应本文和/或本文引 用的文件中所述剂量的体内表达。例如，关于病毒悬浮液的合适范围 可以以经验确定。本发明中的病毒载体或重组体可以以每次剂量(例 如约2ml)约至少103pfu的量施用于猪或感染或转染到细胞内；更优 选约104pfu-约1010pfu，例如约105pfu-约109pfu，例如约106pfu -约108pfu。并且，如果超过一种的基因产物由超过一种的重组体表 达，那么每种重组体可以以这些量施用；或者，每种重组体可以这样 施用，使得组合地存在包含这些量的重组体的总和。
在本发明中使用的质粒组合物中，剂量可以如本文引用文件中描 述或如本文描述的。例如，质粒组合物中每种质粒DNA的合适量可以 是1μg-2mg，优选50μg-1mg。技术人员可以参考关于DNA质粒 载体的本文引用的文件以无需过度实验而确定用于本发明的DNA质粒 载体组合物的其他合适剂量。
然而，诱发合适的免疫原应答的组合物剂量、其中的组分浓度和 施用组合物的时间选择可以通过方法来确定，所述方法例如为血清抗 体滴定，例如ELISA和/或血清中和测定法分析和/或猪中的疫苗接种 攻击评估。根据技术人员的知识、本公开内容和本文引用的文件，此 类确定并不需要过度实验。并且，用于顺次施用的时间可以类似地用 根据本公开内容以及本领域知识可确定的方法无需过度实验进行确 定。
PCVII免疫原可以由PCVII获得、或可以由PCVII基因或其部分 或表位的体外重组表达获得。螺杆菌免疫原可以由螺杆菌获得、或可 以由螺杆菌基因或其部分或表位的体外重组表达获得。用于制备和/ 或使用载体(或重组体)进行表达的方法可以通过下列中公开的方法 或类似方法完成：美国专利号4,603,112、4,769,330、5,174,993、 5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、 5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、5,756,103、 5,766,599、6,004,777、5,990,091、6,033,904、5,869,312、 5,382,425、PCT公开号WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018， Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：11341-11348， Smith等人，美国专利号4,745,051(重组杆状病毒)，Richardson， C.D.(Editor)，Methods in Molecular Biology39，“Baculovirus Expression Protocols”(1995 Humana Press Inc.)，Smith等人， (1983)Mol.Cell.Biol.，3：2156-2165；Pennock等人，(1984)， Mol.Cell.Biol.4：399-406；EPA0 370 573，于1986年10月16 日提交的美国申请序列号920,197，EP专利公开号265785，美国专利 号4,769,331(重组疱疹病毒)，Roizman，(1996)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 93：11307-11312；Andreansky等人，(1996)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 93：11313-11318；Robertson等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA USA 93：11334-11340，1996；Frolov等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 93：11371-11377，October 1996，Kitson等人，J.Virol. 65，3068-3075，1991；美国专利号5,591,439，5,552,143，WO 98/00166， 授权的于1996年7月3日提交的美国申请序列号08/675,556和 08/675,566(重组腺病毒)，Grunhaus等人，1992，“Adenovirus as cloning vectors，”Seminars in Virology(第3卷)第237-52页， 1993，Ballay等人，EMBO Journal，第4卷，第3861-65页，Graham， Tibtech 8，85-87，April，1990，Prevec等人，J.Gen Virol.70， 429-434，PCT WO91/11525，Feigner等人，(1994)，J.Biol.Chem. 269，2550-2561，Science，259：1745-49，1993和McClements等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11414-11420，1996，以及关于DNA 表达载体的美国专利号5,591,639，5,589,466和5,580,859。还参见 WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia，41：736-739，1998(慢病毒 表达系统)；Sanford等人，美国专利号4,945,050；Fischbach等人， (Intracel)，WO 90/01543；Robinson等人，seminars in IMMUNOLOGY， 第9卷，第271-283页(1997)(DNA载体系统)；Szoka等人，美国 专利号4,394,448(将DNA插入活细胞内的方法)；McCormick等人， 美国专利号5,677,178(细胞病变性病毒的用途)；和美国专利号 5,928,913(用于基因递送的载体)，以及本文引用的其他文件。例如 选自猪疱疹病毒例如Aujesky病病毒，猪腺病毒，痘病毒特别是痘苗 病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒和猪痘病毒的病毒载体，以及DNA载 体(DNA质粒)有利地在本发明实践中使用。
来自PCVII基因或其部分的表达产物可以用于产生对于诊断目的 有用的抗体，例如单克隆或多克隆抗体，类似地，来自PCVII基因或 其部分的表达产物可以用于诊断应用。
此外，根据本文的公开内容和本领域知识，本发明的技术人员无 需过度实验即可确定PCVI I或螺杆菌免疫原中、或另一种猪病原体的 免疫原中的目的表位；关于确定蛋白质的目的表位或表位区域的一般 信息参见，例如，引入本文作为参考的WO 98/40500。
特别参考于1998年9月25日提交的美国申请序列号09/161,092， 于1998年5月21日提交的美国申请序列号09/082,558，分别于1997 年10月3日、1998年1月22日和1998年3月20日提交的法国申请 号9712382、9800873和9803707，以及WO-A-9918214(全都引 入本文作为参考)，特别有利的免疫原性、免疫或疫苗组合物是：从 体外细胞培养物中收集的免疫原性或疫苗组合物，所述细胞培养物已 被纯化的PCVII制剂，例如纯化的猪圆环病毒制剂感染，所述纯化的 猪圆环病毒制剂选自以下列保藏号保藏于ECACC的制剂：于1997年 10月2日保藏的保藏号V97100219(毒株Imp.1008)、保藏号V97100218 (毒株Imp.1010)和保藏号V97100217(毒株Imp.999)、于1998年 1月16日保藏的保藏号V98011608(毒株Imp.1011-48285)和保藏号 V98011609(毒株Imp.1011-48121)，2000年2月2日保藏的保藏号 00012710(毒株1103)和保藏号00012709(毒株1121)，或包含在 体外细胞培养上生产并从中分离的猪圆环病毒的免疫原性或疫苗组合 物，这些细胞已被猪圆环病毒感染，所述猪圆环病毒能够从来自具有 PMWS综合征的猪的生理学样品中，或从组织样品特别是病灶中分离， 例如，此类组合物，其中猪圆环病毒在猪肾细胞系上生产并从中分离， 例如在不含PCV-1污染的PK/15细胞上生产并从中分离；或包含细胞 提取物或上清液、或由细胞培养物或上清液制备的此类组合物，所述 细胞培养物或上清液从已被此类圆环病毒感染的体外细胞培养物中收 集。因此，猪圆环病毒可以是免疫原。例如，疫苗或免疫原性组合物 可以包含减毒的活的完整免疫原(例如病毒)，有利地，在兽医学或 药学可接受的载体或稀释剂和任选地兽医学或药学可接受的佐剂，以 及任选地冻干稳定剂中。免疫原(例如病毒)可以是灭活的，并且疫 苗或免疫原性组合物可以另外和/或任选地包含兽医学或药学可接受 的媒介物或稀释剂和任选地兽医学或药学可接受的佐剂。疫苗或免疫 原性组合物可以包含PCVII免疫原和/或几种猪圆环病毒(包括PCVII 或PCVII的几种毒株，还包括PCV-1)的免疫原，以及来自其它猪病 原体的任选地另外免疫原，所述其它猪病原体例如PRRS、猪肺炎枝原 体、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、伪狂犬病、猪霍乱、支气管败血 性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、多杀巴斯德菌 (Pasteurella multocida)、猪流行性感冒、PPV(还参见于1999 年7月1日提交的美国申请序列号09/347,594和于1998年7月6日 提交的法国申请号98 08777)。
对于圆环病毒抗原制剂的生产，圆环病毒可以在细胞，特别是细 胞系，例如PK15细胞传代后获得。可以使用培养上清液或提取物，任 选通过标准技术纯化。
在减毒PCV的情况中，减毒可以根据常规方法进行，例如通过对 细胞传代，优选对猪细胞，特别是细胞系，例如PK15细胞传代(例如， 20-150，特别是大约40-100代)。
在灭活疫苗的情况中，PCV以及可能存在的成分根据本领域技术 人员已知的技术进行灭活。灭活将优选通过化学途径进行，例如通过 将抗原暴露于化学试剂例如甲醛(福尔马林)、多聚甲醛、β-丙内酯 或乙烯亚胺或其衍生物，和/或通过物理处理进行。优选的灭活方法在 本文中将是暴露于化学试剂且特别是暴露于乙烯亚胺或β-丙内酯。
疫苗或免疫原性组合物中的免疫原可以由包含序列或其片段的 DNA片段(有利地编码至少一种表位)表达，所述序列选自由SEQ ID NOS：1、11、12和24-30指定的序列组成(于1998年9月25日提交 的美国申请序列号09/161,092，于1998年5月21日提交的美国申请 序列号09/082,558，分别于1997年10月3日、1998年1月22日和 1998年3月20日提交的法国申请号9712382、9800873和9803707， 以及WO-A-99 18214)。疫苗或免疫原性组合物中的免疫原可以由包 含PCVII毒株的ORF的DNA片段表达，所述ORF选自ORF 1-13，例 如ORF 4、7、10和13；优选ORF4和/或13，所述PCVII毒株特别是 上文鉴定的毒株中的任何一种(如于1998年9月25日提交的美国申 请序列号09/161,092，于1998年5月21日提交的美国申请序列号 09/082,558，分别于1997年10月3日、1998年1月22日和1998年 3月20日提交的法国申请号97 12382、98 00873和98 03707，以及 WO-A-99 18214中指定的)。因此免疫原或其部分，例如目的表位可 以由其从重组体或载体体外表达获得。免疫原可以通过常规方法进一 步纯化和/或浓缩。
疫苗或免疫原性组合物中的免疫原可以由包含DNA片段的表达载 体体内表达，所述DNA片段包含选自SEQ ID NOS：1、11、12和24-30 的序列或其片段。类似地，疫苗、免疫原性或免疫组合物中的免疫原 可以由包含DNA片段的表达载体体内表达，所述DNA片段包含选自 PCVII毒株的ORF 1-13的ORF，例如ORF 4、7、10和13；优选ORF 4和/或13，所述PCVII毒株特别是上文鉴定的毒株中的任何一种(如 于1998年9月25日提交的美国申请序列号09/161,092，于1998年5 月21日提交的美国申请序列号09/082,558，分别于1997年10月3 日、1998年1月22日和1998年3月20日提交的法国申请号97 12382、 98 00873和98 03707，以及WO-A-99 18214中指定的)。即，疫苗 或免疫原性组合物可以包含体内表达免疫原或其部分例如目的表位的 表达载体。
表达载体可以是任何合适的载体，例如选自DNA质粒，细菌例如 大肠杆菌，病毒例如杆状病毒、疱疹病毒例如Aujesky病病毒、腺病 毒包括猪腺病毒、痘病毒特别是痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒 和猪痘病毒的载体(还参见Audonnet等人，和Bublot等人的美国申 请，于1999年6月10日提交的序列号分别为60/138,352和 60/138,478(分别为“DNA VACCINE-PCV”，和“PORCINE CIRCOVIRUS RECOMBINANT POXVIRUS VACCINE”)。
因此，本发明还包括核酸分子和包含其的载体，以及由此的表达 产物，包含此类核酸分子和/或载体和/或表达产物的组合物，以及用 于制备和使用任何或所有这些的方法。本发明特别包含本文公开的核 酸分子，本文引用或参考的文件包括PCT WO 99/29717的核酸分子， 其片段例如编码免疫原或表位的ORF和/或片段，以及毒株1103和/ 或1121的核酸分子或其片段，以及包含这些核酸分子的载体，包含这 些核酸分子、载体、或由此的表达产物的组合物，包含此类表达产物 的组合物，适合于此类核酸分子的引物或探针，以及涉及这些的用途 或方法，例如用于检测、诊断、测定PCVII，用于诱导免疫原性或保 护性应答等。事实上，本发明包含PCT WO 99/29717或其任何国家申 请中公开和/或请求保护的任何发明，所述任何国家申请要求PCT WO 99/29717或由那个PCT要求优先权的美国临时申请的优先权。  
如较早提及的，本发明的实施方案可以包括抗体。此类抗体可以 是多克隆或单克隆抗体；例如，由前述圆环病毒制备，或由具有选自 SEQ ID NOS：1、11、12和24-30的序列的DNA片段编码的多肽制备， 或由包含选自SEQ ID NOS：1、11、12和24-30的序列的载体表达的 多肽制备；或由包含DNA的载体表达的多肽制备，所述DNA包括选自 ORF 1-13的ORF(例如于1998年9月25日提交的美国申请序列号 09/161,092，于1998年5月21日提交的美国申请序列号09/082,558， 分别于1997年10月3日、1998年1月22日和1998年3月20日提 交的法国申请号9712382、9800873和9803707，以及WO-A-9918214 中指定的)。技术人员可以使用本领域已知的技术诱发抗体和产生单 克隆或多克隆抗体。抗体和抗原可以在诊断法中使用。
于1998年9月25日提交的美国申请序列号09/161,092，于1998 年5月21日提交的美国申请序列号09/082,558，分别于1997年10 月3日、1998年1月22日和1998年3月20日提交的法国申请号97 12382、98 00873和98 03707，以及WO-A-99 18214还提供了探针和 引物，其可以用于例如检测PCVII DNA，以及用于扩增PCVII DNA，例 如用于制备表达载体。探针或引物可以是PCVII基因组或PCVII基因 中的至少8个，优选至少10个，更优选至少12、13、14或15个，例 如至少20个，例如至少23或25个，例如至少27或30个核苷酸的任 何片段，所述片段是PCVII独特的或在PCVII中且至少在PCV或圆环 病毒家族中是保守的。关于PCR或杂交引物或探针和为此的最佳长度， 还可以参考Kajimura等人，(1990)GATA 7：71-79。杂交在高严格 性条件下是有利的，本领域技术人员应当理解术语“高严格性”(参 见，例如，Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.以及Hames和Higgins，eds.，1985，Nucleic Acid Hybridization， IRL Press，Oxford，U.K.)。杂交应当理解为使用良好建立的技术完 成，包括但不限于，DNA印迹杂交、RNA印迹杂交、原位杂交和有利地 对于PCR扩增的DNA片段的DNA杂交。
如同探针或引物，非全长PCVII蛋白质的肽是本发明的一部分且 可以是PCVII中的至少8个，优选至少10个，更优选至少12、13、 14或15个，例如至少20个，例如至少23或25个，例如至少27或 30个氨基酸的任何片段，所述片段是PCVII独特的或在PCVII中且至 少在PCV或圆环病毒家族中是保守的。可替代地或另外地，非全长 PCVII蛋白质的本发明的氨基酸可以是PCVII蛋白质的表位区域。
并且，关于本发明中使用的DNA和蛋白质序列，它们可以具有如 于1999年7月1日提交的美国申请序列号09/347,594中定义的同源 性、同一性或相似性及其程度，而同源性、同一性或相似性有利地如 USSN 09/347,594中讨论的测定。
本发明进一步涉及从受感染猪的胃中分离的新型细菌菌株。细菌 物种是螺杆菌属，包括基于例如分离株蛋白质的SDS-PAGE分析与已知 物种区分开的新型物种H.cerdo。
本发明的主题进一步涉及使用猪圆环病毒特别是I型或II型，有 利地II型疫苗，与使用猪螺杆菌疫苗的疫苗接种组合给猪接种疫苗。 应当理解这指使用二价疫苗的疫苗接种，或在猪中同时使用猪圆环病 毒疫苗和猪螺杆菌疫苗。有利的螺杆菌菌株是Helicobacter cerdo。
本发明的主题还是针对胃食管溃疡和PMWS综合征的抗原制剂，并 且它可以包含至少一种猪圆环病毒抗原(优选II型圆环病毒)和至少 一种螺杆菌抗原。依照本发明，猪圆环病毒抗原(优选II型圆环病毒) 和螺杆菌抗原互相独立地包含选自减毒的活的全抗原、灭活的全抗原、 亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原。应当理解根据本发明的 组合可以涉及任何合适的抗原或抗原制剂形式的应用，应当理解对于 给定组合无需使用相同形式。另外，如本身已知的，抗原制剂可以包 含从兽医学观点来看可接受的媒介物或赋形剂，和任选地从兽医学观 点来看可接受的佐剂。
本发明的主题还是针对胃食管溃疡和PMWS综合征的免疫原性组 合物或疫苗，在从兽医学观点来看可接受的媒介物或赋形剂，和任选 地从兽医学观点来看可接受的佐剂中包含有效量的如上所述猪圆环病 毒和螺杆菌抗原制剂。免疫原性组合物诱发可以是但不必是保护性的 免疫应答。疫苗组合物诱发保护性应答。因此，术语“免疫原性组合 物”包括疫苗组合物(因为前一术语可以是保护性组合物)。
本发明的主题还是包含分别包装的、针对猪圆环病毒的抗原制剂 或免疫原性组合物或疫苗和针对猪螺杆菌的抗原制剂或免疫原性组合 物或疫苗的免疫或疫苗接种试剂盒。这种试剂盒可以具有上文所述关 于抗原制剂、免疫原性组合物和疫苗的各种特征。
本发明的主题还是针对胃食管溃疡和PMWS综合征的免疫接种或 疫苗接种的方法，其包括施用针对猪圆环病毒的免疫原性组合物或疫 苗和针对螺杆菌的免疫原性组合物或疫苗，或施用在同一制剂中包含 对病毒和细菌特异的抗原制剂的二价免疫原性组合物或疫苗。这种免 疫接种或疫苗接种方法特别使用如上定义的疫苗。
本发明的主题还是针对螺杆菌的抗原制剂或免疫原性组合物或疫 苗，如特别是在上文定义的，与针对猪圆环病毒的抗原制剂或免疫原 性组合物或疫苗组合，用于制备在预防胃食管溃疡综合征中使用的药 物组合物的用途。
为了生产圆环病毒抗原制剂，圆环病毒可以在对细胞，特别是细 胞系，例如PK15细胞传代后获得。培养上清液或提取物，任选通过标 准技术纯化的，可以用作抗原制剂。
在减毒抗原制剂和减毒免疫原性组合物或疫苗的背景中，减毒可 以根据常规方法进行，例如通过对细胞传代，优选对猪细胞，特别是 细胞系，例如PK15细胞传代(例如，50-150，特别是大约100代)。 这些免疫原性组合物和疫苗一般包含从兽医学观点来看可接受的媒介 物或赋形剂、任选地从兽医学观点来看可接受的佐剂、以及任选地冻 干稳定剂。
这些抗原制剂、免疫原性组合物和疫苗将优选包含103-107 TCID50的所述减毒病毒或细菌。
它们可以是基于灭活的全抗原的抗原制剂、免疫原性组合物和疫 苗。灭活的免疫原性组合物和疫苗另外包含从兽医学观点来看可接受 的媒介物或赋形剂、与任选地另外从兽医学观点来看可接受的佐剂。
根据本发明的圆环病毒或螺杆菌分离株以及可能存在的成分根据 本领域技术人员已知的技术进行灭活。灭活将优选通过化学途径进行， 例如通过将抗原暴露于化学试剂例如甲醛(福尔马林)、多聚甲醛、 β-丙内酯或乙烯亚胺或其衍生物。有利的灭活方法在本文中将是暴露 于化学试剂。
有利地，根据本发明灭活的抗原制剂以及灭活的免疫原性组合物 和疫苗将根据本领域技术人员众所周知的技术补充佐剂，有利地以乳 剂的形式提供，例如油包水或水包油型。佐剂特征还可以来自将常规 佐剂化合物掺入活性成分内。
可以在本发明的组合疫苗中使用的佐剂中，作为例子可以提及的 是氢氧化铝、皂甙(例如Quillaja皂甙或QuilA；参见由Michael F. Powel和Mark J.Newman编辑的Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach，1995，Plennum Press，New-York和London， 第210页)、Avridine.RTM.(Vaccine Design，第148页)、DDA(二 甲基双十八烷基溴化铵，Vaccine Design，第157页)、聚磷腈(Vaccine Design，第204页)，或可替代地基于矿物油、角鲨烯(例如SPT乳 剂，Vaccine Design，第147页)、角鲨烯(例如MF59，Vaccine Design， 第183页)的水包油型乳剂，或基于可代谢油的油包水型乳剂(优选 根据WO-A-94 20071)以及美国专利号5,422,109中描述的乳剂。还 可以选择佐剂的组合，例如与乳剂组合的Avridine.RTM.或DDA。
关于上文所述活疫苗的佐剂可以选自关于灭活疫苗给出的那些。 乳剂是优选的。对于关于灭活疫苗指出的那些，可以添加 WO-A-9416681中描述的那些。作为冻干稳定剂，作为例子可以提及的 是SPGA(Bovarnik等人，J.Bact.59，509，950)，碳水化合物例 如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白质例如白 蛋白或酪蛋白，这些化合物的衍生物，或缓冲剂例如碱土金属磷酸盐。
根据本发明的抗原制剂、免疫原性组合物和疫苗可以包含根据本 发明的一种或多种圆环病毒和/或螺杆菌属物种的一种或多种活性成 分(抗原)。
在本发明的组合免疫接种或疫苗接种程序的背景中，还可以将针 对猪圆环病毒和猪螺杆菌的免疫接种或疫苗接种与针对其它猪病原体 (特别是可能与PMWS综合征有关的那些)的免疫接种或疫苗接种组 合。根据本发明的免疫原性组合物或疫苗因此可以包含对应其它猪病 原体的其它效价，所述其它猪病原体例如但不限于，PRRS(猪繁殖与 呼吸综合征)和/或猪肺炎枝原体，和/或大肠杆菌，和/或萎缩性鼻炎， 和/或伪狂犬病(假狂犬病)病毒和/或猪流行性感冒和/或胸膜肺炎放 线杆菌和/或猪霍乱，及其组合。优选地，根据本发明的免疫接种或疫 苗接种程序和疫苗将组合针对圆环病毒和细小病毒，以及PRRS (WO-A-93/07898，WO-A-94/18311，FR-A-2 709 966；C.Charreyre 等人，Proceedings of the 15th IPVS Congress，Birmingham，England， Jul.5-9，1998，第139页)；和/或猪肺炎枝原体(EP-A-597 852， EP-A-550 477，EP-A571 648；O.Martinon等人，第157、284、285 页和G.Reynaud等人，第150页，都在上文提及的Proceedings of the 15th IPVS Congress中)和/或猪流行性感冒的免疫接种或疫苗接种。 因此可以使用任何合适形式的免疫原性组合物或疫苗，特别是任何可 用的商品化疫苗，以便将其与如本文所述的针对猪圆环病毒和猪螺杆 菌的免疫原组合物或疫苗组合。
本发明的主题因此还是多价免疫原性组合物和疫苗、多疫苗试剂 盒、以及组合免疫接种或疫苗接种方法，其使得能够使用此类组合免 疫接种或疫苗接种程序。
因此，本发明的一个方面是用于诱发针对螺杆菌物种和猪圆环病 毒的免疫应答的免疫原性组合物，其包含至少一种螺杆菌抗原和至少 一种猪圆环病毒抗原，以及兽医学可接受的媒介物或赋形剂。
在根据本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，猪圆环病毒 抗原可以包含至少一种猪圆环病毒II型抗原。
在本发明的其他实施方案中，螺杆菌抗原可以是Helicobacter cerdo、Helicobacter heilmanii或幽门螺杆菌抗原。
在本发明的各种实施方案中，猪圆环病毒II型抗原是保藏于 ECACC的选自下列的至少一种猪圆环病毒II型抗原：猪圆环病毒II 型保藏号V97100219、猪圆环病毒II型保藏号V97100218、猪圆环病 毒II型保藏号V97100217、猪圆环病毒II型保藏号V98011608和猪 圆环病毒II型保藏号V98011609。
在本发明的一个实施方案中，猪圆环病毒II型抗原是减毒的猪圆 环病毒II型或灭活的猪圆环病毒II型。
本发明的另一实施方案进一步包含兽医学可接受的佐剂和任选地 冻干稳定剂。
在本发明的各种实施方案中，螺杆菌抗原可以是Helicobacter cerdo抗原。
在本发明的实施方案中，猪圆环病毒II型抗原可以包含由猪圆环 病毒II型可读框(ORF)编码的抗原，所述ORF选自PCVII毒株1010 中鉴定的ORF 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，或其 他PCVII毒株的等价ORF。
在本发明的其他实施方案中，猪圆环病毒II型抗原包含含有且在 体内表达由猪圆环病毒II型可读框(ORF)编码的抗原的载体，所述 ORF选自PCVII毒株1010中鉴定的ORF 1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12和13，或其他PCVII毒株的等价ORF。
在本发明的再其他的实施方案中，载体选自DNA质粒、线性DNA 分子和重组病毒。
在本发明的实施方案中，重组病毒可以选自猪疱疹病毒、猪腺病 毒和疸病毒。
在本发明的再其他的实施方案中，重组病毒选自Aujesky病病毒、 痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒和猪痘病毒。
在本发明的实施方案中，螺杆菌抗原可以选自减毒的螺杆菌菌株、 灭活的螺杆菌菌株、或螺杆菌菌株亚单位，并且猪圆环病毒抗原可以 选自减毒的猪圆环病毒、灭活的猪圆环病毒、或猪圆环病毒亚单位， 和包含且在体内表达编码至少一种上述抗原的核酸分子的载体。载体 可以选自但不限于DNA质粒、线性DNA分子和重组病毒；以及任选地 其它猪病原体的另外抗原。
本发明的一个实施方案进一步包含其它猪病原体的另外抗原，其 选自但不限于：PRRS病毒抗原、猪肺炎枝原体抗原、胸膜肺炎放线杆 菌抗原、大肠杆菌抗原、萎缩性鼻炎抗原、猪α疱疹病毒I型抗原、 猪霍乱抗原、猪流行性感冒抗原及其组合。
在本发明的另一实施方案中，猪圆环病毒抗原包含多种猪圆环病 毒抗原。
本发明的另一方面是用于诱导针对螺杆菌菌株和猪圆环病毒的免 疫应答的方法，其包括给猪施用具有来源于每种微生物类型的免疫原 的免疫原性组合物。
本发明的再一方面是用于制备包含至少一种螺杆菌抗原和至少一 种猪圆环病毒抗原的免疫原性组合物的试剂盒，其中(i)和(ii)分 开包装或一起包装。在本发明的这个方面的一个实施方案中，猪圆环 病毒抗原包含至少一种猪圆环病毒II型抗原。
应当理解本发明不限于本文描述的具体组合物或方法，并且具有 等价于所述那些的配方的任何组合物或方法步骤包括在本发明的范围 内。组合物的制备途径和方法步骤仅是示例性的，以便使得本领域普 通技术人员能够根据所述过程及其等价过程制备并使用组合物。还应 当理解尽管本文显示和描述的本发明形式构成本发明的有利的实施方 案，但它并不意味着举例说明了本发明的所有可能形式。措辞是说明 性而不是限制性的措辞。可以对本发明进行各种变化和改变而不背离 本发明的精神和范围。
本发明通过下列非限制性实施例举例说明。
实施例
实施例1：用于分离和表征PCV分离株的方法
1)细胞培养：无PCV的PK15衍生物即Dulac细胞系从Dr.John Ellis(University of Saskatchewan，Saskatoon，Saskatchewan) 获得。Vero细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas， VA获得。这些细胞在如ATCC建议的培养基中培养并在37℃和5％CO2 下孵育。
猪圆环病毒：常规的PCVI从持续感染的PK15细胞(ATCC CCL33) 中分离。分离株PCVII 412从用来自受PMWS侵袭小猪的淋巴结匀浆攻 击的小猪淋巴结中获得。这只被攻击的小猪已诊断具有PMWS。分离株 PCVII 9741在PCVII 412分离后从同一兽群的受PMWS侵袭小猪的外 周血棕黄层中分离。分离株PCVII B9从1997年秋天具有PMWS 临床爆 发的美国猪群中的受侵袭小猪中分离。
PCVI的繁殖：来自持续感染的PK15细胞的PCVI使用Tischer等 人，(1987)Arch.Virol.96：39-57的修改方法培养和纯化。简言 之，从PK15细胞收获的PCV以约1的moi用于超感染单层PK15细胞 2小时，之后细胞用300mM D-葡糖胺处理。将细胞洗涤1次后，向细 胞中加入含5％FBS的DMEM(Gibco，目录号21013)，并将细胞另外 孵育4天。刮下受感染的细胞并在1500xg下离心15分钟后收集。细 胞团块随后用0.5％的Triton X-114于37℃处理30分钟。再一次低 速离心以去除细胞碎片后，向上清液中加入等量Freon(Sigma目录号 T-5271)，并使用Polytron以最大速率将混合物均质化1分钟。混合 物随后离心并收集顶部层并与等体积的0.1M PBS混合。在210,000x g下超速离心30分钟后将病毒团块收集到20％蔗糖层内。
野生分离株(PCVII)的培养：分离株PCVII 412使用与PCVI类 似的方式培养和纯化，但使用Dulac细胞。分离株PCVII B9在用来自 美国PMWS爆发的自连接的全长PCR产物转染的异基因Vero细胞中培 养。因此，消除了来自其他猪病原体污染的可能性。B9转染的Vero 细胞连续传代并如上文所述用300mM D-葡糖胺处理。
病毒DNA分离：病毒DNA从各种来源提取，包括受感染的Dulac 和Vero细胞团块，外周血棕黄层细胞，来自受感染动物和血清的组织。 组织样品用蛋白酶K处理并且病毒DNA使用苯酚/氯仿或Qiagen组织 试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)提取。来自肝素化血液和血清 的外周血棕黄层细胞的DNA使用Qiagen血液试剂盒类似地收集。
小猪的感染：小猪来源于无特异病原体的母猪。在1天龄时，每 只小猪接受从受PMWS侵袭小猪收集的大约1克淋巴结。组织匀浆在口 服和腹膜内途径之间平均分配。在每个实验组中使用10只小猪并每天 观察，共7周。2组被攻击并且2组是未感染的对照。1组攻击和1 组对照在第0和14天时用环孢菌素A(2mg/kg)处理。小猪喂养罐 装牛奶(Carnation)和水(50∶50)直至它们自己断奶至高营养密度 的商业制备饲料。
野生PCV分离株的PCR、克隆和测序：2步方法用于分离株PCVII 412病毒基因组DNA的最初克隆。设计与保守环茎序列环-(表1)杂 交的引物以进行利用互补序列和PCV基因组DNA的环状性质的单引物 PCR。关于单引物PCR的PCR反应是2步过程。第一个阶段由94℃变 性1分钟、37℃退火30秒和72℃延伸2分钟的5个循环组成。第二 个阶段由类似程序的25个循环组成，除了退火温度增至52℃以外。 PCR产物克隆到TA克隆载体内(Invitrogen，Carlsbad，CA.)。测 序3种不同克隆的2条链以确保序列保真度。基于获得的序列，在病 毒DNA序列的非编码区中设计引物1000-和R1F并用于克隆全长病毒 基因组。本研究中使用的所有引物序列显示于下表1中。环区的序列 随后从全长克隆获得。分离株PCVII 9741和PCVII B9的序列从纯化 的PCR产物获得。由Plant Biotechnology Institute of NRC，Canada 进行的DNA自动测序使用几种内部引物。分离株PCVII 412(AF085695； SEQ ID NO：1)、PCVII 9741(AF086835；SEQ ID NO：11)和PCVII B9(AF086834 SEQ ID NO：12)的序列存于美国国家生物技术信息中 心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)。
表1.本研究中使用的引物序列
    引物名称     引物序列 SEQ ID NO：     环- ACTACAGCAGCGCACTTC     13     1000- AAAAAAGACTCAGTAATTTATTTCATATGG     14     R1F ATCACTTCGTAATGGTTTTTATT     15     1710+ TGCGGTAACGCCTCCTTG     16     850- CTACAGCTGGGACAGCAGTTG     17     1100+ CATACATGGTTACACGGATATTG     18
    1570- CCGCACCTTCGGATATACTG     19     1230- TCCCGTTACTTCACACCCAA     22     400+ CCTGTCTACTGCTGTGAGTA     23
序列分析：其他圆环病毒的序列从NCBI获得。各种公众域用于序 列分析，例如Biology工作台、Blast搜索、DNA/蛋白质分析工具等。 序列比对使用Clustal W程序产生并且系统树通过PAUP 3.1程序产生 (David L.Swofford，Laboratory of Molecular Systematics， MRC5 34，MRC at Smithsonian Institution，Washington，D.C.)。
多重PCR：设计2组引物以鉴别PCV群特异性序列和毒株特异性 序列。引物对1710+/850-是PCV群特异性对，而1100+/1570-是新型 PCV毒株特异性对，这区分了新型PCV与来源于PK15细胞的PCV。2 组引物对于PCR反应具有类似的退火温度并且以0.5μM的浓度在标 准热启动PCR中一起使用。使用Ampli Taq Gold(Perkin Elmer)或 Plentinum Taq(Gibco)。
抗血清：兔抗PCVII 412混合血清从用在水包油型乳剂中的纯化 的分离株PCVII 412以50μg/剂量注射的2只兔子获得。注射以21 天的间隔重复3次。猪抗PMWS血清从来自受PMWS侵袭兽群的恢复期 猪中收集。
ELISA：纯化的PCV在碳酸钠缓冲液(0.05M)pH9.6中稀释至 0.5μg/100μL的浓度，并用于包被Immulon II板(Dynatech Laboratories，Inc.)。板用TTBS(20mM Tris-HCl，500mM NaCl， 0.05％吐温20，pH7.5)洗涤6次，之后加入系列稀释的兔或猪一抗。 用TTBS洗涤6次后，加入碱性磷酸酶缀合的二抗(1/5000稀释)， 抗兔或抗猪(Kirkegaard & Perry)。板用100μL/孔溶于1M二乙 醇胺，0.5MgCl2，pH9.8的磷酸对硝基苯酯(PNPP，3g/L)显色， 并且板在ELISA阅读仪(BioRad)上于405/490nm处阅读。
淋巴细胞表面标记的FACS分析：血液样品从野生的受PMWS侵袭 小猪和阴性对照中收集。裂解RBC并用抗猪CD3、CD4和CD8单克隆抗 体染色WBC，并随后用荧光标记的抗小鼠二抗染色WBC。特异标记的细 胞用2％甲醛固定并使用FACS系统(Becton Dickinson)计数5000 个细胞。
实施例2：PMWS再现
PMWS在受控条件下仍未再现，也仍未进行病因学研究。为了确定 这种疾病的致病因子，如上文实施例1中所述从受PMWS侵袭的猪中收 集许多组织并进行研究。淋巴结显示最明显的总损害、组织病理学变 化，并且通过免疫染色证实圆环病毒感染。因此，在上文所述的攻击 实验中使用淋巴结。
如材料和方法中所述进行的攻击实验在猪中成功地产生了PMWS。 特别的，某些小猪死于感染并且无症状的感染小猪在试验结束时发展 PMWS样微观损害。
在另一种攻击实验中，使用的原材料是具有慢性消瘦和淋巴结肿 大的猪的肺组织。这些临床体征是PMWS的特征。该组织与无菌0.1M 磷酸盐缓冲盐水(PBS)组合并经由通过polytron混合器均质化。粗 制组织匀浆用于攻击猪。特别地，总共40只小猪(大约1天大)随机 (通过出生窝、性别和体重平衡)分配到“组织攻击”、“伴随环孢 菌素A的组织攻击”、“对照”、或“环孢菌素A”处理组。环孢菌 素处理对处理的猪没有临床或血液影响，除了在药物施用3小时后在 那些猪的血液中检测到环孢菌素。因此，组在经过用于分析的环孢霉 素处理后虚脱。
一般而言，被攻击猪中的PMWS疾病的死后体征包括淋巴结肿大和 肺组织不完全萎陷。PMWS疾病的死后体征在用组织提取物处理组中(9 只中的7只猪)比用安慰剂处理组中(18只中的2只猪)明显(p＜0.01； 两尾费歇尔精确检验(two-tailed Fishers exact-test))更多的 猪中检测到。通过组织提取物注射处理组中(212g/天)的平均日增 重与给予安慰剂的组(202g/天)没有显著不同。
血液样品在整个实验过程中获得并且组织样品在死后获取。通过 PCR测试样品的PCVII病毒DNA，该PCR产生830个碱基对的产物。给 予肺组织提取物的4只猪具有阳性血液样品；而给予安慰剂的猪中没 有一只在其血液中检测到PCVII DNA。PCVII在来自“病毒攻击”处理 组的8只存活猪中的7只的一种或多种组织中检测到，而来自对照组 中的猪的所有组织对于PCVII是阴性的。相依表(contingency table) 分析显示出显著差异(p＜0.001；两尾费歇尔精确检验)。
在另一种攻击实验中，收集具有慢性消瘦和淋巴结肿大的猪的肺 组织并通过离心去除细胞碎片(8000rpm 30分钟)。将上清液应用 于氯化铯梯度并在100,000xg下离心。条带在41％CsCl2(1.28gm/ml) 和63％(1.40gm/ml)之间出现。对这些条带应用30％CsCl2并在 100,000xg下离心2小时。将团块重悬浮于15mL无菌0.1M PBS 中。
总共20只断奶仔猪(大约3周大)随机(通过出生窝、性别和体 重平衡)分配到“对照”、或“病毒攻击”处理组。猪在大约3周大 断奶(第0天)。一般而言，PMWS疾病的临床体征包括淋巴结肿大和 消瘦或生长缓慢。淋巴结肿大在用病毒处理组中(7只猪)比用安慰 剂处理组中(1只猪)明显(p＜0.02；两尾费歇尔精确检验)更多的 猪中检测到。病毒注射处理组中(580gm/天)的平均日增重少于给予 安慰剂的组(616gm/天)，但差异不显著(p＝0.17；两尾费歇尔精 确检验)。在内脏器官(肝、肺、心脏、脾、肾)的相对质量中组间 没有差异。
使用上文描述的PCR技术测试在整个实验过程中获得的血液样品 和死后获取的组织样品的PCVII病毒DNA。
所有血液样品包括就在安乐死前获取的那些对于PCVII是阴性 的。PCVII在“病毒攻击”处理组的10只猪中的8只的一种或多种组 织中检测到，而来自对照组中的猪的所有测试组织对于PCVII是阴性 的。相依表分析显示出这是显著差异(p＜0.001；两尾费歇尔精确检验)
总之，这些实验证实用包含PCVII的组织提取物和梯度纯化的病 毒材料注射断奶仔猪导致多组织感染。感染持续至少8周的时间。
实施例3：PCVII的分离和繁殖
为了确定关于PMWS的传染性致病因子的存在，来自猪#412(在感 染后21天处死的实验性攻击的小猪)的各种组织用于病毒分离。来自 猪#412的淋巴结样品在Dulac细胞中连续传代后，观察到病毒积聚或 适应。最初发展了细胞病变效应的独特模式，随后为如上文所述通过 ELISA使用标准Berlin抗PCV抗体测定的病毒滴度增加。
用分离株PCVII 412感染的Dulac细胞中圆环病毒的存在随后通 过电子显微镜检查进行检测。传代6次后，病毒结构蛋白质使用蛋白 质印迹测定法可以一致地检测到。
实施例4：在受PMWS侵袭兽群的无症状感染和恢复期小猪中的特 异性抗PCVII抗体
因为看起来猪圆环病毒具有某些异质性，所以使用从具有PMWS 爆发的兽群中收集、针对PCV和分离株PCVII 412病毒的小猪血清进 行ELISA。大多数无症状的PCVII感染和恢复期小猪发展针对PCVII 而不是PCVI的特异性抗体。
实施例5：PCVII病毒和病毒基因组DNA的分离、克隆和测序
为了研究2种猪圆环病毒毒株之间的遗传差别，从受感染的Dulac 细胞中提取病毒DNA。考虑到PCVI和PCVII之间可能的遗传无关性， 方法是设计来自最保守区域的引物。PK15 PCV DNA序列的先前分析 (Mankertz等人，(1997)J.Gen.Virol.71：2562-2566；Meehan 等人，(1997)J.Gen.Virol.78：221-227)显示复制起点中的茎 环结构。因为这个重要结构域的高度保守性质设计靶向茎环结构(环-) 的反向重复序列的单个引物(参见实施例1，表1)。通过单引物PCR 扩增PCVII 412病毒DNA是成功的。克隆到TA克隆载体内后，病毒基 因组序列通过来自几种克隆以及有义和反义的自动测序获得以确保保 真度。茎环或引物区的实际序列随后由第二种全长克隆获得，所述第 二种全长克隆通过引物1000-和R1F从病毒仅有的非编码区产生。关 于PCV 412的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)显示于图2A-2C的顶部 行中。
使用类似引物，获得其他PCVII分离株，包括来自与PCVII 412 相同兽群的PCVII 9741，以及来自美国PMWS爆发的PCVII B9。这些 毒株进行测序并与PCVII 412和PCVI比较。关于PCVII 412与PCVI 的比较参见图2A-2C，并且关于PCVII 412序列(SEQ ID NO：1)与 各种PCV分离株的比较参见图4A-4B。
使用PAUP 3.1程序的系统进化分析法结果暗示新PMWS分离株紧 密相关且与PCVI在不同簇中。这些分离株因此称为“PCVII”分离株。 新型猪圆环病毒分离株中的核苷酸序列同源性百分比超过99％同一。 相反，这些核苷酸序列与PK15 PCVI的比较仅显示出75.8％的总核苷 酸序列同源性。不同区域中核苷酸序列的比较分析进一步显示这2种 病毒的假定复制相关蛋白质基因分享81.4％的同源性，而其他大ORF 的核苷酸序列只有67.6％同源性。
此外，核苷酸插入和缺失在3个区域中发现。在PCVI序列38- 61处，新分离株中有13个碱基插入，其位于由ORF1编码的假定35.8 kd蛋白质的起始密码子侧面。包含15个碱基插入和缺失(indels) 的PCVI 915-1033区域在末端和猪圆环病毒2个最大ORF(另一个ORF 是反义的)的接头区。第3个区域涵盖含15个碱基插入和缺失的PCVI 序列1529-1735，位于由ORF 6编码的假定27.8kd蛋白质的氨基末 端。PCVI序列还与可获得的圆环病毒科其余成员的序列比较。PCVI 与植物病毒-香蕉束顶病毒(BBTV)比与鸡贫血病毒(CAV)和喙羽病 病毒(BFDV)(这2种是禽类圆环病毒)更紧密相关。
分离株PCVII 412的基因图谱显示于图1中。总共有6个潜在ORF 编码大于50个氨基酸残基的蛋白质。PCVII 412和PK15 PCVI之间比 较显示4个ORF中的同源性(表2)。35.8kd即假定的DNA复制酶蛋 白的功能先前已预测(Meehan等人，(1997)J.Gen.Virol.78： 221-227)。这些蛋白质的分析预测35.8kd和反义的27.8kd蛋白质 是核蛋白质。核苷酸序列分析还指出2种蛋白质的起始密码子在复制 起点的33个碱基内，其也可能是启动子。另外，2个ORF以正常的终 止密码子和多聚A尾信号结束。因为预测的蛋白质(基于大小)中的 某些可以在蛋白质印迹中发现，所以这些发现暗示猪圆环病毒mRNA 可以由有义和反义的复制形式转录。然而，没有足够长的编码序列编 码对于由蛋白质印迹分析检测到的PCVII 412分离株的常见的31kd 蛋白质和另外的20kd蛋白质。这暗示某些猪圆环病毒蛋白质的表达 中可能涉及翻译后切割和/或RNA剪接。
表2. PK15PCVI和PCVII 412之间的推定氨基酸序列比较
               可读框     PCVI                 PCVII/412     序列同源性     ％PCVI/412     预测的定位和功能     47-983     (ORF 1)    51-992    (ORF 1)     83.5     核，假定的Rep蛋白质     1723-1024     (ORF 6)    1735-1037    (ORF 6)     66.4     核     552-207     (ORF 4)    565-389    (ORF 3)     40.9     内质网     658-40     (ORF 3)    671-359    (ORF 2)     29.1     微体
实施例6：使用分子克隆法纯化PCVII
Dulac细胞用还在许多猪起源的细胞系中发现的猪逆转录病毒感 染。另外，其他猪病原体还发现与受PMWS侵袭的小猪中的PCVII不一 致地相关。因此，为了获得纯PCVII培养物，使用脂质体将基因克隆 的PCvII DNA转移至易感的非猪起源的Vero细胞。传代2次后，在细 胞中检测到扩增的PCV抗原。可见PCVII在核中复制和积聚并在细胞 有丝分裂期释放到细胞质和其他细胞内。
实施例7：在PCVII鉴定和PMWS诊断中的多重PCR
为了区分猪圆环病毒的2种毒株PCVI和PCVII，基于病毒DNA序 列的比较分析设计2组引物。在多重PCR中使用PCV群特异性对 1710+/850和分离物PCVII 412毒株特异性1100+/1570-测试野生样 品。对于冷冻组织和外周血棕黄层细胞使用这些引物组。如通过多重 PCR判断的，使用那些引物对，不仅测定这些样品中的PCVII感染还 测定野生样品的遗传相关性。圆环病毒的存在随后通过电子显微术证 实。
这种诊断方法的效力用从受PMWS侵袭兽群收集的另一组样品进 一步测试(参见图5)。PCVII DNA序列还可以在受PMWS侵袭小猪的 几乎所有组织中鉴定(图6)。
实施例8：在PMWS爆发之前和之时的PCVII病毒血症
使用血清的PCR的开发使得我们能够测试显示特异性抗PCVII抗 体的猪群中的PCVII病毒血症。1组23只小猪从1天龄监控直至7周 龄，并以大约2周的间隔收集样品。如通过23只小猪的9只中检测到 的PCVII病毒血症的出现至消失所示的，观察到了PCVII病毒血症和 PMWS爆发的全过程。显示PCVII病毒血症的大多数小猪发展PMWS，而 某些显示严重PMWS。表3显示典型小猪中的PMWS表现。总损害在大 多数组织和器官中发现(表3)。
表3.受PMWS侵袭的典型小猪的临床、组织学、病毒学和免疫学报告
  PMWS猪     总外观     组织学   PCR   H254     脊柱(Spine)、多毛、不感兴     趣和摇晃     ND     ND   唾液     ND     ND     +   尿     苍白色/澄清     ND     +   胆汁     稀薄，不粘稠     ND     +   粪便     不足但正常     ND     +   血清     正常     ND     +   血浆     黄色     +   皮肤     微黄色     +   脂肪     少/无脂肪     +   肌肉     正常     +   舌     正常     舌炎     +   扁桃体     小隐窝     淋巴细胞消耗     +   子宫颈淋巴结     肿大     淋巴细胞消耗     +   内侧(Med.)淋巴结     非常大，表面发暗，中心黄色     淋巴细胞消耗     +   肠系膜淋巴结     非常肿大，暗且湿润     淋巴细胞消耗     +   腹股沟淋巴结     大，暗且湿润     淋巴细胞消耗     +   脾     小且薄     淋巴细胞消耗     +   胸腺     小且难以发现     ND     +   气管     正常     化生性腺炎     +   肺     A、M叶80％肺膨胀不全；质地     坚硬，色斑和斑点遍及所有叶     间质性肺炎     +   心脏     有裂片     +   肝     薄且松软     +   胆囊     “伪装”式色斑     +   胰腺     正常，适度丰满     +   肾上腺     正常     局部肾上腺炎     +   脑     正常     脑膜炎     +   眼     正常     +   胃     正常，巩膜白色     +   小肠     正常，充满饲料     派伊尔氏斑     +   大肠     正常     粘膜下层发炎     +   肾     正常，沙/砂砾内含物     间质性肾炎     +   膀胱     扩大，暗，无脓     +   CBC     正常     WBC：20.1     Segs：62％或12.462     淋巴：29.0％或5.829     Ref.mg×109/L     11.0-22.0     3.08-10.4     4.29-13.6   FACS     CD3：52.1％     CD4：9.0％     CD8：66.5％     55％     30％     15％
实施例9：受PMWS侵袭小猪中的宿主免疫系统功能障碍
虽然在大多数组织中观察到淋巴细胞浸润，但淋巴细胞消耗在所 有淋巴样组织中一致发现(表4)。还可见CD4细胞减少和CD8细胞 增加，而CD3细胞保持相对稳定(表4，平均数目来自2只受PMWS侵 袭和40只阴性对照小猪)。这些变化导致CD4/CD8比率从1.58急剧 下降到0.13。这些发现暗示CD4/CD8可以诱导宿主免疫系统功能障碍 并因此抑制针对PCVII和可能的其他病原体的宿主免疫应答。因此， PMWS看起来是小猪中的免疫缺陷性疾病。
表4.受PMWS侵袭和对照6周大的小猪的淋巴细胞表面标记
CD3  CD4  CD8  CD4/CD8比率 PMWS 59.88  8.85  67.6  0.13 对照 53.46  24.02  15.18  1.58
在本发明实践中有用的毒株保藏物
克隆B9WTA(包括如图4A-4B中所示PCVII B9全长核酸序列的 克隆)的生物学纯培养物的保藏在美国典型培养物保藏中心10801 Univrsity Boulevard，Manassas，Va.进行，在______上并指定保 藏号______。
表明的保藏号在成功的存活力测试后指定，并支付必需费用。保 藏根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约以及其下规 则(布达佩斯条约)条款进行。这保证从保藏日起三十(30)年的时 期可存活培养物的维持。该生物根据布达佩斯条约条款通过ATCC将是 可获得的，这保证美国专利与商标局根据35 U.S.C.§122和美国专 利与商标局对其依据的规则(包括特别参考886 OG 638的37 C.F.R. §1.12)确定的生物后代的持续和无限制的可用性。专利授权后，对 公众获得该保藏培养物所作的所有限制将不可避免地取消。
这些保藏物仅为了本领域技术人员方便而提供，并不是承认保藏 物根据35 U.S.C.§112是必需的。这些基因的核酸序列以及由其编 码的分子的氨基酸序列引入本文作为参考，并且在本说明书有任何冲 突的事件中为准。
实施例10：猪圆环病毒毒株的培养和分离
组织样品在法国、加拿大和美国从小猪的肺和淋巴结中收集。这 些小猪显示断奶仔猪多系统衰竭综合征的一般临床体征。为了促进病 毒的分离，组织样品在尸检后立即冷冻于-70℃。
病毒1103和1021根据Ellis等人，(1998)Can.J.Vet.39： 44-51中描述的方法分别在Alberta，分别地Saskatoon，加拿大从流 产病例中分离。
对于病毒分离，在包含Earle′s盐(EMEM，BioWhittaker UK Ltd.， Wokingham，UK)、盘尼西林(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml) (MEM-SA培养基)的基本培养基中，通过使用无菌研钵和研棒用无菌 沙研磨组织制备包含约15％组织样品的悬浮液。这种研磨制剂随后吸 收到MEM-SA中，并随后在3000g下于4℃离心30分钟以便收获上清 液。
在接种细胞培养物之前，向2ml的每种上清液中加入100μl 体积的氯仿且于室温连续混合10分钟。随后将这种混合物转移到微量 离心管，在3000g下离心10分钟并随后收获上清液。这种上清液随 后用作病毒分离实验的接种物。
所有病毒分离研究对已知未被下列病毒污染的PK15细胞培养物 进行：猪圆环病毒(PCV)、瘟病毒、猪腺病毒和猪细小病毒(Allan 等人，(1995)Vet.Microbiol.44：49-64)。
猪圆环病毒的分离根据下列操作进行：PK15单层细胞通过用胰蛋 白酶-维尔烯混合物进行胰蛋白酶消化脱离汇合培养，并以约4×105 细胞/ml的终浓度吸收到未被瘟病毒污染、包含15％胎牛血清的 MEM-SA培养基(＝MEM-G培养基)中。每种这种细胞悬浮液的10ml 等分试样部分随后与上文所述接种物的2ml等分试样部分混合，并且 最终混合物在2个25cm2Falcon烧瓶中等分为6ml体积。这些培养 物随后在含有10％CO2的大气下于37℃孵育18小时。
孵育后，半汇合单层的培养基用300mM D-葡糖胺(Cat#G48175， Sigma-Aldrich Company Limited，Poole，UK)处理(Tischr I.等 人，(1987)Arch.Virol.96：39-57)，随后孵育于37℃继续另 外48-72小时的时间段。随后对每种接种物的2个Falcons中的1 个实施3次连续的冷冻/融化循环。剩余Falcon的PK15细胞用胰蛋白 酶-维尔烯溶液处理，重悬浮于20ml MEM-G培养基中，并随后以4× 105细胞/ml的浓度接种到75cm2Falcons内。新近接种的烧瓶随后通 过加入冷冻/融化循环后获得的5ml相应裂解物“超感染”。
实施例11：用于通过免疫荧光或通过原位杂交检测猪圆环病毒的 细胞培养样品的制备
5ml体积的“超感染”悬浮液被收集并接种到直径55mm、包含 无菌和无脂肪的玻璃盖片的培养皿中。烧瓶中和玻璃盖片上的培养物 于37℃孵育并如实施例1中所述用葡糖胺处理。玻璃盖片上的培养物 在葡糖胺处理后24小时-28小时收获，并用丙酮于室温固定10分钟， 或用10％缓冲的甲醛固定4小时。固定后，在其用于原位杂交研究和 免疫细胞化学标记研究之前，所有玻璃盖片在硅胶上贮存于-70℃。
实施例12：通过原位杂交用于检测PCV序列的操作
对从患病猪收集且用甲醛固定的组织进行原位杂交，并同样对用 病毒分离株(参见实施例3)接种且在玻璃盖片上固定的细胞培养物 制剂进行原位杂交。
使用对应PK15猪圆环病毒(PCV)和传染性鸡贫血病毒(CAV)的 完整基因组探针。包含复制型PCV基因组(以单个1.7千碱基对(kbp) 插入片段的形式克隆)的质粒pPCV1(Meehan B.等人，(1997)J.Gen. Virol.78：221-227)用作PCV的特定病毒DNA来源。包含2.3kbp 复制型禽类圆环病毒CAV的类似质粒pCAA1用作阴性对照。2种质粒 的分别的甘油贮存液根据碱性裂解技术用于生产和纯化质粒 (Sambrook J.等人，Molecular cloning：A Laboratory Manual.2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor， N.Y.，1989)，从而使得它们随后用作制备探针的模板。代表PCV和 CAV完整基因组的圆环病毒探针使用商品化非放射性标记试剂盒 (“DIG DNA labelling kit”，Boehringer Mannheim，Lewes，UK) 根据厂商建议由上述纯化质粒(对于每种探针为1μg)以及随机的6 核苷酸引物产生。地高辛配基标记的探针在用于原位杂交之前吸收到 50-100μl体积的无菌水中。
包裹在石蜡中并用甲醛固定的患病猪的组织样品，以及用甲醛固 定的受感染细胞培养物制剂，被制备用于根据下列操作检测PCV核酸：
从包裹在石蜡中的组织块切下5μm厚的切片，去除石蜡，并随 后在浓度渐减的乙醇连续溶液中再水合。组织切片和用甲醛固定的细 胞培养物于37℃在溶于包含5mM EDTA(pH7.6)的0.05M Tris-HCl 缓冲液的0.5％蛋白酶K溶液中分别孵育15分钟和5分钟。载玻片随 后置于溶于高压灭菌蒸馏水的1％甘氨酸溶液中30秒，用0.01M PBS 缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)(pH7.2)洗涤2次，并最后在无菌蒸馏 水中洗涤5分钟。它们最后在空气中干燥并与探针接触。
每种组织/探针制剂用干净且无脂肪的玻璃盖片覆盖，并随后置于 烤箱中于+90℃ 10分钟，并随后置于与冰块接触1分钟，并最后于37 ℃孵育18小时。制剂随后短暂浸入2x柠檬酸钠盐(SSC)缓冲液(pH 7.0)中以便去除保护性玻璃盖片，并随后在2x SSC缓冲液中洗涤2 次、5分钟，并最后在PBS缓冲液中洗涤2次、5分钟。
洗涤后，制剂浸入0.1M马来酸、0.15M NaCl(pH7.5)(马来 酸缓冲液)溶液中10分钟，并随后在溶于马来酸缓冲液的1％封闭反 应物溶液(Cat#1096176，Boehringer Mannheim UK，Lewis，East Sussex，UK)中于37℃孵育20分钟。
制剂随后与在封闭缓冲液中稀释的抗地高辛配基单克隆抗体 (Boehringer Mannheim)的1/250溶液一起于37℃孵育1小时，在 PBS中洗涤并最后与生物素化的抗小鼠免疫球蛋白抗体一起于37℃孵 育30分钟。制剂在PBS中洗涤并通过用溶于PBS的0.5％过氧化氢溶 液于室温处理20分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。制剂再次在PBS 中洗涤并用刚在使用前制备的3-氨基-9-二乙基咔唑(AEC)底物 (Cambridge Bioscience，Cambridge，UK)处理。
用自来水最后洗涤后，制剂用苏木精复染，在自来水下“变蓝”， 并用固定液(GVA Mount，Cambridge Bioscience，Cambridge，UK) 固定在显微镜玻璃盖片上。实验对照包括对从患病猪和非患病猪获得 的样品使用无关的阴性探针(CAV)和阳性探针(PCV)。
实施例13：通过免疫荧光检测PCV的操作
用丙酮固定的所有细胞培养物制剂的起始筛选通过间接免疫荧光 技术(IIF)使用1/100稀释的成年猪混合血清进行。这种混合血清包 含来自北爱尔兰的25只成年母猪的血清并且已知包含针对广泛多样 的猪病毒的抗体，包括：PCV、猪细小病毒、猪腺病毒和PRRS病毒。 IIF技术通过使血清(在PBS中稀释)与细胞培养物于37℃接触1小 时，随后在PBS中洗涤2次进行。细胞培养物随后用在PBS中1/80 稀释、与异硫氰酸荧光素缀合的兔抗猪免疫球蛋白抗体染色1小时， 并随后用PBS洗涤并在甘油缓冲液中固定，之后在紫外光下显微镜观 察。
实施例14：关于患病猪组织的原位杂交结果
原位杂交使用由从法国、加拿大和加州小猪(具有多系统消瘦损 伤)收集的组织制备的PCV基因组探针(用甲醛固定)，显示在研究 的几种损伤中与损伤相关的PCV核酸的存在。当PCV基因组探针对从 非患病猪收集的组织使用时，或当CAV探针对患病猪组织使用时，没 有观察到信号。在浸润加州小猪的肺中损伤的众多单核细胞的细胞质 和核中鉴定了PCV核酸的存在。PCV核酸的存在还在肺细胞、支气管 和细支气管上皮细胞中，以及在小动脉、小静脉和淋巴管的内皮细胞 中证实。
在患病法国猪中，在众多滤泡淋巴细胞的细胞质和淋巴结的窦内 单核细胞中检测到PCV核酸的存在。PCV核酸还在偶见的合胞体中检 测到。取决于这些检测结果，为了分离猪圆环病毒新毒株的目的选择 加州猪的肺、法国猪的肠系膜淋巴结和加州猪的器官样品。
实施例15：猪圆环病毒新毒株的细胞培养和通过免疫荧光检测的 结果
在用从法国小猪(Imp.1008毒株)、加州小猪(Imp.999毒株) 和加拿大小猪(Imp.1010毒株)收集的样品接种的细胞培养物中没有 观察到细胞病变效应(CPE)，所述小猪显示多系统衰竭综合征的临床 体征。然而，在使用猪混合多克隆血清在丙酮固定后从接种的细胞培 养物获得的制剂进行的免疫标记，显示在使用加州小猪的肺(Imp.999 毒株)、使用法国小猪的肠系膜淋巴结(Imp.1008毒株)和使用加拿 大小猪的器官(Imp.1010毒株)接种培养物的众多细胞中的核荧光。
实施例16：猪圆环病毒基因组DNA的提取
如关于复制型CAV克隆描述的(Todd等人，(1991)J.Clin. Microbiol.29：933-939)，使用孵育72-76小时后收获并用葡糖胺 处理的受感染的PK15细胞培养物(参见实施例3)(10个75cm2 Falcons)制备复制型猪圆环病毒(PCV)新毒株。根据如Molitor (Molitor等人，(1984)Virology，137：241-254)描述的Hirt技 术(Hirt B.(1967)J.Mol.Biol.36：365-369)的修改提取这 些复制型的双链DNA。
实施例17：猪圆环病毒Imp.999毒株的复制型基因组的限制性图 谱
根据Hirt技术提取的DNA(1-5μg)根据厂商建议用核酸酶S1 (Amersham)处理，并且随后这种DNA用各种限制性内切酶消化，并 如Todd等人，(1990)J.Gen.Virol.71：819-823)所述在溴化 乙锭的存在下通过电泳在1.5％琼脂糖凝胶上分离消化产物。从 Imp.999毒株培养物提取的DNA具有独特的EcoRI位点、2个SacI位 点并且没有任何PstI位点。这种限制性特征因此不同于由PCV PK15 毒株(Meehan B.等人，(1997)78，221-227)显示的限制性特征， 所述PCV PK15毒株与之相反具有PstI位点且没有EcoRI位点。
实施例18：猪圆环病毒Imp.999毒株的基因组克隆
用限制性内切酶EcoRI消化双链复制型PCV Imp.999毒株产生的 约1.8kbp的限制性片段使用Qiagen商品化试剂盒(QIAEXII Gel Extraction Kit，Cat#20021，QIAGENLtd.，Crawley，West Sussex， UK)在1.5％琼脂糖凝胶上电泳后分离(参见实施例3)。这种 EcoRI-EcoRI限制性片段随后与载体pGEM-7(Promega，Medical Supply Company，Dublin，Ireland)连接，所述载体pGEM-7根据标 准克隆技术预先用相同的限制性内切酶消化并去磷酸化(Sambrook J. 等人，Molecular cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。 获得的质粒随后根据标准技术转化到大肠杆菌(Escherichia coli) JM109宿主菌株(Stratagene，La Jolla，USA)内。PCV Imp.999毒 株的EcoRI-EcoRI限制性片段同样克隆到载体pBlueScript SK+ (Stratagene Inc.La Jolla，USA)的EcoRI位点内。在对于每种 宿主菌株获得的克隆中，选择包含预期大小片段的至少2个克隆。获 得的克隆随后进行培养，并且包含Imp.999毒株完整基因组的质粒根 据标准质粒制备和纯化技术以小体积(2ml)或大体积(250ml)进 行纯化。
实施例19：PCV Imp.999毒株的基因组DNA(双链复制型)的测 序
2种EcoRI Imp.999克隆(克隆pGEM-7/2和pGEM-7/8)的核苷 酸序列根据Sanger氏双脱氧核苷酸技术使用测序试剂盒“AmpliTaq DNA polymerase FS”(Cat # 402079 PE Applied Biosystems， Warrington，UK)和Applied BioSystems AB1373A自动测序装置根 据厂商建议进行测定。最初的测序反应使用M13“正向”和“反向” 通用引物进行。随后的测序反应根据“DNA步移”技术产生。对于这 些后续测序所需的寡核苷酸由Life Technologies(Inchinnan Business Park，Paisley，UK)合成。
产生的序列借助于MacDNASIS版本3.2软件(Cat # 22020101， Appligene，Durham，UK)装配和分析。各种可读框借助于在“美国国 家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，Md.，USA)服务器上可获 得的BLAST算法进行分析。
最初从克隆pGEM-7/8获得的EcoRI-EcoRI片段的全序列(SEQ ID NO：28)呈现于图9中。它任意在EcoRI位点的G后开始并且从核苷 酸的观点来看显示少许不确定性。
测序随后进行优化并且SEQ ID NO：27(图10)给出这种毒株的 全长序列，它任意在EcoRI位点开始处开始，也就是说G作为第一个 核苷酸。操作以根据本发明用于获得其他3种分离株序列的类似方式 进行(参见SEQ ID NOS：24-30)。
4种毒株的基因组大小是：Imp.10111-48121(SEQ ID NO：25)， 1767个核苷酸；Imp.1011-48285(SEQ ID NO：26)，1767个核苷酸； Imp.999(SEQ ID NO：27)，1768个核苷酸；和Imp.1010(SEQ ID NO： 24)，1768个核苷酸。
实施例20：PCV Imp.999毒株的序列分析
当由Imp.999毒株产生的序列用于测试相对于GenBank数据库中 包含的序列的同源性时，检测到的唯一显著的同源性是与PK15毒株序 列(登记号Y09921和U49186)约76％的同源性(在核酸水平上)(参 见图5)。
在氨基酸水平上，使用数据库(在NCBI服务器上的BLAST X算法) 在6个阶段中的序列翻译同源性测试使得能够证实与对应BBTV病毒理 论复制酶的可读框的94％同源性，类似于由GenBank U49186序列编 码的植物圆环病毒(GenBank识别号1841515)。
数据库中包含的其他序列没有显示出与由PCV Imp.999毒株产生 的序列的显著同源性。
使用从加州小猪收集的病灶培养的Imp.999毒株获得的序列分析 清楚地显示这种病毒分离物是猪圆环病毒新毒株，所述加州小猪具有 多系统衰竭综合征的临床体征。
实施例21：序列比较分析
4种PCV新毒株的核苷酸序列与PCV PK15(PCVI)毒株进行比对 (图5)。建立考虑4种新毒株和先前PK15毒株的同源性矩阵(表5)。
表5：4种新毒株和PK15(PCVI)毒株的同源性矩阵
  1*   2   3   4   5     1   1.0000  0.9977  0.9615  0.9621  0.7600     2  1.0000  0.9621  0.9632  0.7594     3  1.0000  0.9949  0.7560     4  1.0000  0.7566     5  1.0000
*1：Imp.1011-48121；2：Imp.1011-48285；3：Imp.999；4： Imp.1010；5：PK15
2种法国毒株Imp.1011-48121和Imp.1011-48285之间的同源性 大于99％(0.9977)。2种北美毒株Imp.999和Imp.1010之间的同源 性也大于99％(0.9949)。法国毒株和北美毒株之间的同源性略微大 于96％。所有这些毒株和PK15之间的同源性的值为75-76％。
推论根据本发明的毒株是不同于由PK15毒株代表的类型的猪圆 环病毒新类型代表。从显示PMWS综合征的猪中分离的这种新类型称为 II型猪圆环病毒，PK15代表I型。属于这种II型的毒株显示出显著 的核苷酸序列同质性，尽管它们事实上从非常远的地理区域中分离。
实施例22：由PCV毒株基因组编码的蛋白质的分析
Imp.1010分离株的核苷酸序列视为与多系统衰竭综合征有关的 其他圆环病毒毒株的代表。这个序列借助于BLASTX算法(Altschul 等人，J.Mol.Biol.1990.215.403-410)和来自MacVector 6.0软件包(Oxford Molecular Group，Oxford OX44GA，UK)的程序 组合更详细地进行分析。在这个序列(环状基因组)上可以检测到大 小超过20个氨基酸的13个可读框(或ORF)。这13个ORF显示于表 6中。
表6：在PCVII毒株1010的基因组序列中鉴定的ORF
             ORF的大小     蛋白质的大小     名称     起始     终止   链   (核苷酸)     (氨基酸)     ORF1     103     210   有义   108nt     35aa     ORF2     1180     1317   有义   138nt     45aa     ORF3     1363     1524   有义   162nt     53aa     0RF4     398     1342   有义   945nt     314aa     ORF5     900     1079   有义   180nt     59aa     ORF6     1254     1334   有义   81nt     26aa     ORF7     1018     704   反义   315nt     104aa     ORF8     439     311   反义   129nt     42aa     ORF9     190     101   反义   90nt     29aa     ORF10     912     733   反义   180nt     59aa     ORF11     645     565   反义   81nt     26aa     ORF12     1100     1035   反义   66nt     21aa     ORF13     314     1381   反义   702nt     213aa
每个ORF的起始和终止位置参考图8中所示毒株1010的基因组序 列(SEQ ID No.24)。ORF 1-13的界限与毒株999相同。它们还与 毒株1011-48121和1011-48285相同，除了ORF 3和13之外(ORF3： 1432-1539，有义，108nt，35aa；ORF13：314-1377，反义，705nt， 234aa)。
毒株1010中鉴定的这13个ORF中，4个与位于克隆的病毒PCV PK15(PCVI)基因组上的类似ORF具有显著同源性。分析位于与多系 统衰竭综合征相关的所有圆环病毒分离株基因组上的每个可读框。这 4个ORF在表7中。
表7：在PCVI中鉴定的PCVII毒株1010的ORF
               ORF的大小          蛋白质的大小   名称     起始-终止*   链     核苷酸     氨基酸     分子量   ORF4     398-1342   有义     945nt     314aa     37.7kDa   ORF7     1018-704   反义     315nt     104aa     11.8kDa   ORF10     912-733   反义     180nt     59aa     6.5kDa   ORF13     314-1381   反义     702nt     233aa     27.8kDa
*每个ORF的起始和终止位置参考图4中所示序列(SEQ ID No.4)。
ORF(以核苷酸＝nt)的大小包括终止密码子。
ORF相对于毒株Imp1010进行界定。本发明还包含了任何其他 PCVII毒株，以及如本文或本文引用的文件中定义的任何PCVII毒株 中相应ORF的用途。因此，使用标准软件例如MacVector由基因组核 苷酸序列确定ORF是常规技术。同样地，与毒株1010的基因组比对以 及与毒株1010ORF的比较允许本领域技术人员容易地确定另一种毒株 (例如WO-A-99 18214中公开的那些，如Imp1008、Imp1011-48121、 Imp 1011-48285、Imp 999，以及新毒株1103和1121)基因组上的 ORF。使用软件或进行比对不是过度实验并且直接提供等价ORF。
例如，毒株1103和1121的相应ORF如表8中给出的。
表8：PCVII毒株1103和1121的ORF
  名称     起始     终止     链 ORF的大小(核 苷酸(nt))   蛋白质大小 (氨基酸(aa))   ORF1     1524     1631     有义     108nt     35aa   ORF2     833     970     有义     138nt     45aa   ORF3     1016     1177     有义     162nt     53aa   ORF4     51     995     有义     945nt     314aa   ORF5     553     732     有义     180nt     59aa   ORF6     907     987     有义     81nt     26aa   ORF7     671     357     反义     315nt     104aa   ORF8     92     1732     反义     129nt     42aa   ORF9     1611     1522     反义     90nt     29aa   ORF10     565     386     反义     180nt     59aa   ORF11     298     218     反义     81nt     26aa   ORF12     753     688     反义     66nt     21aa   ORF13     1735     1037     反义     702nt     213aa
显示于图1中、在PCVII毒株412(SEQ ID NO：1)基因组中鉴 定并根据图4A-4C中所示序列比较编号的ORF 1-6位置在表9中给出，
所述表9还包括对于毒株1010指定的等价ORF(上文)。
表9：PCVII毒株412的ORF
    ORF     PCV序列内的位置     (根据图4A-4C编号)     PCVII毒株1010     的等价ORF     1     51-992     4     2     6710360     7     3     565-389     10     4     553-729     5     5     1016-1174     3     6     1735-1037     4
PCV Imp.1010和PCV PK15分离株的基因组结构之间的比较允许 鉴别在2种病毒基因组中保留的4个ORF。下表10呈现了观察到的同 源性程度。
表10：PCVII 1010和PCVI的等价ORF之间的同源性程度
  ORF Imp.1010/ORF PVC PK15     同源性百分比     ORF4/ORF1     86.0％     ORF13/ORF2     66.4％     ORF7/ORF3     61.5％(在重叠的水平上(104 aa))     ORF10/ORF4     83.0％(在重叠的水平上(59aa))
最大的序列同一性在ORF4 Imp.1010和ORF1 PK15之间观察到(86 ％同源性)。这跟预期一致，因为这种蛋白质可能涉及病毒DNA复制 且是病毒复制所需的(Meehan等人，(1997)J.Gen.Virol.78： 221-227；Mankertz等人，(1998)J.Gen.Virol.79：381-384)。
PCVII毒株1103和1121的相应ORF在表11中给出。
表11：PCVII毒株1103和1121的ORF
  名称   起始     终止     链   ORF的大小(核苷   酸(nt))     蛋白质大小     (氨基酸(aa))   ORF1     1524     1631     有义     108nt     35aa   ORF2     833     970     有义     138nt     45aa   ORF3     1016     1177     有义     162nt     53aa   ORF4     51     995     有义     945nt     314aa   ORF5     553     732     有义     180nt     59aa   ORF6     907     987     有义     81nt     26aa   ORF7     671     357     反义     315nt     104aa   ORF8     92     1732     反义     129nt     42aa   ORF9     1611     1522     反义     90nt     29aa   ORF10     565     386     反义     180nt     59aa   ORF11     298     218     反义     81nt     26aa   ORF12     753     688     反义     66nt     21aa   ORF13     1735     1037     反义     702nt     213aa
ORF13 Imp.1010和ORF2 PK15之间的序列同一性较不强烈(66.4 ％同源性)，但这2个ORF中的每一个的确显示了高度保守的N末端 碱性区域，它等同于CAV禽类圆环病毒的主要结构蛋白质的N末端区 域(Meehan等人，Arch.Virol.1992.124.301-319)。此外 在ORF7 Imp.1010和ORF3 PK15之间以及ORF10 Imp.1010和ORF4 PK15 之间观察到很大的差异。在每种情况下，当它们与PCV PK15的ORF3 和ORF4比较时，Imp.1010分离株的ORF7和ORF10的C末端区域有缺 失。最大的序列同源性在ORF7：ORF3(在重叠水平上61.5％的同源性) 和ORF10：ORF4(在重叠水平上83％的同源性)的N末端区域水平上 观察到。
看起来由于其基因组非常紧密，所以猪圆环病毒的基因组组织相 当复杂。主要结构蛋白质可能来源于位于猪圆环病毒基因组相同链上 的几个可读框之间的剪接。因此可以认为如上表中描述的任何可读框 (ORF1-ORF13)可以代表由II型猪圆环病毒编码的抗原蛋白质的全 部或部分，并且因此很可能是可以用于特异性诊断和/或疫苗接种的抗 原。本发明因此涉及包含这些ORF中至少一个的任何蛋白质。有利地， 本发明涉及基本上由ORF4、ORF7、ORF10或ORF13组成的蛋白质。
实施例23：由新毒株克隆的PCV基因组的传染性特征
包含Imp.999分离株的完整基因组(复制型)的质粒pGEM-7/8 根据Meehan等人，(1992)Arch.Virol.124：301-319)描述的技 术转染到PK15细胞内。对未污染的PK15细胞转染后的第一代进行的 免疫荧光分析(参见实施例11)已显示克隆pGEM7/8的质粒能够诱导 传染性PCV病毒的生产。包含传染性PCV遗传材料的克隆的可用性允 许对病毒基因组的任何有用操作，以便产生可以用于生产减毒或重组 疫苗、或用于生产用于诊断试剂盒的抗原的修饰的PCV病毒(在猪中 是减毒的，或有缺陷的)。
实施例24：通过体外培养生产PCV抗原
未污染的PK15细胞的培养和病毒繁殖根据与实施例1中一样的方 法进行。受感染细胞于37℃孵育4天后胰蛋白酶消化后收获并计数。 下一代用4×105受感染细胞/ml接种。
在病毒培养结束时，收获受感染细胞并使用超声(Branson Sonifier)或借助于转子-定子型胶体磨(UltraTurrax，IKA)裂解。 悬浮液随后在3700g下离心30分钟。病毒悬浮液用0.1％乙烯亚胺 于37℃灭活18小时，或用0.5％β-丙内酯于+28℃灭活24小时。如 果病毒滴度在灭活前不够，那么使用截止值为300kDa的膜(Millipore PTMK300)通过超滤浓缩病毒悬浮液。灭活的病毒悬浮液贮存于+5℃。
实施例25：基于矿物油的乳剂形式的疫苗的制备
疫苗根据下式进行制备：
灭活的猪圆环病毒悬浮液：250ml
Montanide.RTM.ISA 70(SEPPIC)：750ml
水相和油相经由过滤分开灭菌。乳剂通过混合成分并借助于 Silverson涡轮乳化器均质化来制备。一个疫苗剂量包含约107.5 TCID50。一个疫苗剂量的体积对于经由皮内途径的施用是0.5ml，且 对于经由肌内途径的施用是2ml。
这种疫苗在针对多系统衰竭综合征的疫苗接种程序中与 Parvovax疫苗组合使用。
实施例26：基于可代谢油的乳剂形式的疫苗的制备
疫苗根据下式进行制备：
灭活的猪圆环病毒悬浮液：200ml
Dehymuls HRE 7(Henkel)：60ml
Radia 7204(Oleofina)：740ml
水相和油相经由过滤分开灭菌。乳剂通过混合成分并借助于 Silverson涡轮乳化器均质化来制备。一个疫苗剂量包含约107.5 TCID50。一个疫苗剂量的体积对于经由肌内途径的施用是2ml。
这种疫苗在针对多系统衰竭综合征的疫苗接种程序中与 Parvovax疫苗组合使用。
实施例27：间接免疫荧光法结果
表12显示使用高免疫血清(PCV-T)、由PK15制备的单克隆抗体 组F99、和由加拿大毒株(PCV-C)制备的高免疫血清，关于美国和法 国PCV-2毒株以及PK15 PCV-1污染物的间接免疫荧光法结果。
表12：免疫荧光
                       病毒     PK15(PCVI)     美国     法国     PCV-T抗血清     *6400     200     800     PCV-C抗血清     200     *6.400     *6.400     F99 1H4     *10 000     ＜100     100     F99 4B10     *10 000     ＜100     ＜100     F99 2B7     *10 000     100     ＜100     F99 2E12     *10 000     ＜100     ＜100     F99 1C9     *10 000     ＜100     100     F99 2E1     *10 000     ＜100     ＜100     F99 1H4     *10 000     100     ＜100
*在间接免疫荧光法中产生阳性反应的血清或单克隆抗体的最后 一个稀释度的倒数。
实施例28：猪多系统衰竭综合征的实验性产生-方案1
通过剖腹产获得并维持在隔离单位中的3天大的悉生小猪用PCV 病毒溶液接种。使用的II型PCV病毒是Imp 1010分离株并且病毒得 自从患病猪获得的淋巴结匀浆。设立5个组。小猪全部在3天大时通 过口鼻途径用1.5ml病毒溶液根据表13中所示方案接种。
表13：接种方案
    组   数目   病毒   剂量     A     6   淋巴结匀浆   ND     B     5   Imp.1010(低传代)   102TCID50     C     4   Imp.1010(高传代)   102TCID50     D     2   不含PCV病毒的PK15细胞   裂解物     E     3   --   --
实验性攻击的结果：在5周观察期间，小猪没有发展临床体征， 除了组B中的1只动物显示实质性衰竭外。在尸检时，组A、B和C 中的猪显示淋巴结增生(大小是组D和E中的动物的2-10倍)，特 别是下颌、支气管、肠系膜、髂骨和股骨神经节。这种增生与经由单 核细胞和巨噬细胞浸润的皮质区的显著扩张有关。组A、B和C中的小 猪还显示支气管淋巴样组织增生。组A、B和C中各有1只小猪具有肺 炎。组B中显示实质性衰竭的小猪，以及组A中的1只小猪具有胃溃 疡。此外，组A、B和C中的所有动物在胃和肠的肌膜中具有肌炎。组 A、B和C中的大多数动物具有心肌炎，伴随淋巴细胞、巨噬细胞和嗜 酸性粒细胞浸润的多病灶性肝炎，以及皮质和髓质间质性肾炎。组C 中的1只小猪具有尺寸大于正常、在其表面具有散布的清晰病灶的肝。 在组D和E的小猪中没有观察到损伤。圆环病毒从组A、B和C的猪的 器官中分离。
实施例29：猪多系统衰竭综合征的实验性再现-方案2和3
与其母亲分离的常规小猪从出生起用II型PCV、猪细小病毒、或 2种病毒混合物的病毒溶液接种。使用的II型PCV病毒是Imp.1010 和Imp.1011分离株(毒株48121)。使用的PPV病毒是加拿大起源的 Imp.1005分离株。这种病毒具有等同于其他已知猪细小病毒毒株(PPV 毒株NADL-2和Kresse毒株)的序列(测序基因组的1/3)。进行2 种实验方案。
方案2：由3天大的小猪构成3个组。小猪全部通过口鼻途径用1 ml病毒溶液根据表14中所示方案接种。
表14：接种方案
    组   数目     病毒     剂量    A     5     Imp.1010     107TCID50    B     5     Imp.1010+Imp.1005     5×106TCID50    C(对照)     2     --     --
实验性攻击的结果：组A：2只小猪在接种后21天死亡，和1只 小猪在接种后24天被人道杀死。组B：1只小猪在接种后23天死亡， 和1只小猪在接种后24天被人道杀死。对感染后死亡的小猪进行的尸 检显示存在实质性肉眼损伤：在胸膜腔中存在液体、肺水肿、肾内出 血、在肾上针头形式的带白色损伤、肝坏死。这些损伤等同于在野生 情况下观察到的那些。对被处死小猪进行的尸检没有显示肉眼损伤。 对组A和B中感染后死亡的小猪以及这2组中被处死小猪中摘除的器 官进行的组织学检查显示在野外动物中观察到的猪多系统衰竭综合征 的典型和全部损伤模式：肝坏死、淋巴结坏死、胰腺坏死、肾内局灶 性坏死和严重出血、肺内存在合胞体、伴随核包含体存在的肝细胞严 重坏死。应当指出在所有这些损伤(死亡或被处死的猪)中发现大量 PCV抗原，但在这些相同损伤中未检测到PPV抗原的存在。在组C的 对照小猪中未检测到损伤。
方案3：由4周大的小猪构成4个组。猪全部通过口鼻途径用1ml 病毒溶液根据表15中的方案接种。
表15：接种方案
    组   数目     病毒     剂量    A(对照)     2     --     --    B     4     Imp.1005(PPV)     105.3TCID50    C     4     Imp.1011(PCV)     105TCID50    D     4     Imp.1005+Imp.1011     105+5×104TCID50
实验性攻击的结果：1只“对照”小猪和每个实验组(B、C和D) 中的2只小猪在接种后2周被人道杀死并实施尸检。在D组(PCV+PPV 共感染)的2只小猪中观察到显著的免疫组织学损伤。应当指出在这 些损伤中无法检测到猪细小病毒的存在，尽管在组D的所有猪中观察 到与猪细小病毒有关的血清转化。在对照小猪和其他组的小猪中没有 观察到肉眼或组织学损伤。因此看起来PCV+PPV组合使得能够再现猪 多系统衰竭综合征的典型组织学损伤。根据这2种实验方案，可以观 察到PCV单独接种如PCV+PPV混合物一样导致较严重或较不严重的猪 多系统衰竭综合征再现，但在损伤中只能检测到猪圆环病毒。相反， 使用单独的PPV的实验性感染(方案3的组B)无法诱导肉眼或组织 学损伤；然而，在PCV的存在下，在4周大的猪中观察到损伤的出现 (方案3的组D)。
实施例30：与PCVII有关的心肌炎、流产和子宫内感染
当猪场开始生产时在450只新母猪中发生晚期流产以及死产和木 乃伊化小猪分娩。在几只小母猪中还观察到假妊娠。小母猪在生育前 接受包含细小病毒和钩端螺旋体免疫原的2次剂量的灭活疫苗。
接受尸体检查的一窝小猪由看起来已在妊娠的各个阶段上死亡的 9个胚胎组成。有2个木乃伊化、2个被浸软、3个自溶和2个新鲜的 死产小猪。只在1个部分自溶的胚胎中的总体病理学检查上观察到损 伤。在这个胚胎中2个心室都扩张，肝肿大且坚硬，并且还有胸膜积 水和腹水。在组织病理学上，存在广泛的心肌变性或坏死区域伴随水 肿和轻度纤维化，以及中度扩散性淋巴细胞和巨噬细胞浸润。存在显 著的泛发性肝充血和肝细胞丧失。脾和肾也是充血的。在其他胚胎中 未检测到显著的组织学损伤。
关于PCVII的免疫组织化学染色如先前所述使用针对PCVII产生 的兔多克隆抗血清和单克隆抗体在福尔马林固定、常规处理和包埋的 组织切片上进行(Ellis等人，1998；Ellis等人，1999)。在具有扩 张性心肌病的胚胎中，遍及受侵袭的心肌存在广泛的PCVII抗原染色。 染色在坏死区域内最广泛并且看起来主要涉及肌细胞。存在细胞质和 核染色。在多个胚胎中，在肝中存在广泛染色。在某些切片中，看起 来主要涉及窦内皮和库普弗(Kupfer)细胞，而在其他胚胎包括具有 心肌炎的胚胎中，还存在肝细胞的核和细胞质染色。阳性染色细胞散 布于整个肺，并在肾内多病灶散布。PCVII的的聚合酶链式反应如先 前所述使用冷冻组织(Ellis等人，1999)进行。PCVII的预期大小的 PCR产物由胚胎组织扩增。PCVII从具有心肌炎的胚胎以及来自该窝的 其他胚胎的混合组织分离，通过在无PCV的PK15细胞上接种组织匀浆 来完成。
同时检查胎组织中已与胎损伤和猪流产关联的其他病毒病原体， 包括猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、脑心 肌炎病毒(EMCV)和肠道病毒。通过对来自木乃伊化或死产胎的肺、 肝和脾冷冻切片的荧光抗体测试(FAT)未检测到PPV抗原。来自流产 胎的肝、肺和脾的匀浆同样接种到无PCV的PK15细胞、原代猪输卵管 细胞和Vero细胞培养物内。传代3次后未检测到细胞病变性病毒。使 用PCR，组织对于PPV是阴性的。通过免疫组织化学染色未检测到PRRSV 抗原。
因此，存在直接与PCVII相关的胎损伤和流产。这些结果还显示 了病毒的垂直传播。
在先前研究中，PCVI从检查的160个猪胎的2个中分离，暗示这 群病毒可以垂直传播；然而，PCVI抗原不能与组织中的任何损伤关联 (Allan等人，1995)。也排除了与胎损伤和猪流产关联的其他因子： 包括：PPV(Bolt等人，1997；Molitor等人，1991)、PRRSV(Lager 等人，1996)、EMCV(Kim等人，1989)和肠道病毒(Molitor等人， 1991)，这表明PCVII可以引起显著的胎病理状态和后续流产。
然而，PCVI免疫原(仍根据开始时给出的一般定义)可以诱发针 对心肌炎和/或流产和/或子宫内感染以及断奶仔猪多系统衰竭综合征 的免疫原性或保护性应答，并且因此PCVI免疫原也可以在本发明实践 中(例如，在方法、组合物、用途等中)使用-单独或与PCVII免疫 原组合(载体可以包含并表达编码PCVI免疫原和/或表位以及PCVII 免疫原和/或表位的DNA)，和/或单独或与其他猪病原体的免疫原和/ 或表位组合(如果使用载体，那么载体可以包含并表达编码PCVI免疫 原和/或表位以及另一种猪病原体的免疫原和/或表位的DNA，或编码 PCVI免疫原和/或表位以及PCVII免疫原和/或表位以及另一种猪病原 体的免疫原和/或表位的DNA)。因此，本领域技术人员无需过度实验 即可在本发明实践中可替代地或另外地使用PCVI免疫原和/或表位和 /或编码此类免疫原和/或表位的载体；例如，为了做到这点，技术人 员只需要阅读在这个实施例之前以及这个实施例(之后)的结论处的 本文文本，并使用基于本文教导的任何较小修改用PCVI代替“PCVII”。
与PCVII感染有关的衰竭综合征最常在5-12周大的猪中发生 (Allan等人，1998；Ellis等人，1998)。新生猪的实验性感染指出 在感染和与PCVI I相关的临床体征发展之间相对长的前驱期(Allan 等人，1999；Ellis等人，1999)。本文的发现显示该病毒垂直传播 或在围产期传播。PCVII的子宫间垂直传播可能导致流产，而且很可 能亚致死的子宫内感染小猪可能是后来发展PMWS的动物。
此外，这些结果显示在生育或交配之前、或在围产期之前和/或在 妊娠期间用包含PCVII免疫原的组合物(所述组合物还可以包括来自 另一种猪病原体例如猪细小病毒的免疫原)接种母猪，可以通过诱发 针对PCVII的免疫应答或抗体来预防与猪圆环病毒-2有关的心肌炎和 /或流产和/或子宫内感染，以及与PCVII相关的断奶仔猪多系统衰竭 综合征和其他病理后遗症。
当然，本发明的组合物、方法及其他方面可以在除了猪以外的动 物，例如绵羊、野牛、牛、野猪中使用或实践；例如，当PCVII感染 此类其他动物时。
新生小猪中存在的PCVII提示垂直传播可能是病毒传播的重要方 式。这种传播方式可能不仅涉及繁殖失败，还可能涉及生命后期中多 系统疾病的发展。感兴趣的是确定先前未检出的PCVII(和PCVI)是 否已在其中PMWS已地方性流行至少数年的猪肉生产区垂直传播以及 通过扩展PCVII感染传播。
评估了Western College of Veterinary Medicine(WCVM)， University of Saskatchewan，Saskatoon，加拿大的诊断实验室经 过4年期间从加拿大总共30个高度健康的兽群中收到的涉及繁殖失败 的38次提交物。样品由其获得的5个农场已诊断PMWS病例。38次提 交物中的27次(71％)分类为流产；这些中的5次还涉及至少一个木 乃伊化胎。其余10个病例中，5个涉及连同无法存活小猪的死产小猪 (13％)；2个具有死产以及一个或多个木乃伊化胎(5％)；2个只有 死产小猪(5％)；和1个只有木乃伊化胎(2.5％)。关于除圆环病毒 以外的病原体的常规诊断显示其中病原学确定为猪细小病毒的4个病 例(11％)，以及其中病因学确定为细菌起源的2个病例(5％)。进 行总体尸检并收集组织且在缓冲的福尔马林中固定(固定时间为 24-72小时)，并且在大多数情况下还提交新鲜组织用于常规微生物 学评估。这些病例中没有一个先前已测试PCVII。
用于检测PCVI和PCVII的PCR技术如先前所述(Tischer等人， 1974)进行。在包含来自4年期间的繁殖失败的任何提交物中通过PCR 没有检测到PCVI。在来源于同一多位点猪肉生产部门的2次不同提交 物中通过PCR检测到PCVII，所述2次不同提交物来自在4年时期中 最后1年春天的2次分别的机会。这些提交物中的第一个包含具有心 肌炎、心脏肥厚和慢性被动性充血的肉眼证据的一窝小猪。
组织中的PCVII的免疫组织化学鉴定如先前所述(Tischer等人， 1974)进行。关于PCVII的免疫组织化学染色(IHC)在来自提交的所 有6只小猪的心脏中是阳性的，而6只中有4只通过PCVII PCR是阳 性的(参见下表16)。
表16：通过PCR、IHC和细胞培养中的病毒分离在具有心肌炎的猪的 福尔马林固定的心脏中检测PCVII
 PCVII阳性组织 PCR  IHC 病毒分离 固定 5/6  6/6  N/A 冷冻 4/4  N/A  2/4
来自同一农场的第二次提交物由一窝4只小猪组成，其中2只是 死产并且另外2只出生后不久死亡。所有4只小猪还具有重症弥漫性 心肌炎、心脏肥厚和慢性被动性充血的肉眼证据。只提交了新鲜冷冻 的心脏和混合的肺/脾组织用于分析。PCVII PCR在4只小猪中2只的 心脏以及4只小猪中4只的肺和脾混合组织中是阳性的。来自受感染 心脏和/或肺和脾混合组织的PCVII分离在通过PCR是PCVII阳性的4 个病例的2个中是阳性的。基于血清学和/或PCR，与猪繁殖失败相关 的其他因子包括猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒显然在育种兽 群中循环。然而，这些因子未能显示与受侵袭小猪中的严重心脏(或 其他)损伤相关，但它们可能促成PMWS。
在4年时期的前3年期间提交的任何代表性繁殖失败病例中通过 PCR或IHC没有检测到PCVII(它在4年时期的最后1年期间提交的繁 殖失败病例中检测到)。为了排除由于福尔马林固定对DNA的损害作 为限制通过PCR检测PCVII能力的可能不利因素，对从具有PMWS的4 只断奶仔猪收集的组织进行PCR，在来自所有4个个体的测试的所有固 定组织中扩增PCVII DNA，包括：肺、肝、肾和支气管淋巴结。此外， PCR PCVII的敏感性不依赖于每种组织在福尔马林中固定的时间长短。
这些结果证实并扩展了PCVII可以垂直传播且可以大量存在于来 自子宫内感染的小猪的病灶内的先前观察(West等人，1999)。PCVII 病毒的垂直传播和所造成的胚胎损害例如心肌炎是PCVII的另外疾病 表现。此外，在4年时期的最后1年之前的繁殖失败病例中没有检测 到PCVII可能表明垂直传播不是负责病毒感染的最初散播的主要机 制。性传播方式以及垂直传播方式可以归因于猪中的PCVII感染蔓延。
实施例31：PCVII滴定
滴定在96孔微孔板中进行。首先引入PK15细胞悬浮液(1.5×105 细胞/ml)(100μl/孔)。随后进行病毒培养物稀释并在孔中引入100 μl稀释液。孵育于37℃与CO2一起进行。24小时后，于37℃用葡糖 胺处理30分钟。随后去除培养基并引入新鲜培养基。孵育于37℃进 行72小时。病灶显示使用抗PCVII单克隆抗体和FITC标记的小鼠缀 合物进行。这种方法可以用于滴定以制备灭活的以及活的减毒PCVII。
实施例32：使用DNA(质粒)载体的小猪疫苗接种
每组3或4只caesarian来源的小猪第0天置于隔离畜舍内。小 猪在第2天用(A)包含ORF 13的质粒或(B)这种质粒和包含ORF 4 的另一种质粒的混合物进行疫苗接种，并且对于对照组使用生理溶液。 每种质粒在无菌生理溶液(NaCl 0.9％)中稀释至250μg/μl的终浓 度。2ml体积通过肌内途径以各1ml的2个点(颈每侧1个点)进 行注射。第14天施用疫苗或安慰剂的第2次注射。使用DNA的疫苗接 种被小猪良好耐受且没有注意到关于疫苗接种的不良反应的证据。小 猪在第21天通过口鼻施用PCVII病毒悬浮液进行攻击，每个鼻孔1ml。 攻击后小猪每周称重一次。在第17、21、22、24、27、29、31、34、 37、41、44天记录直肠温度。第44天收集来自每只小猪的粪便拭子 用于测定PCVII释放(shedding)。病毒通过定量PCR检测和定量。 第45天进行尸检并收集组织样品用于病毒分离。
临床症状：对于平均体重增加或平均体温，组间没有显著差异。
尸检损伤：在结束时在猪中注意到的唯一肉眼发现是支气管淋巴 结病。损伤根据下列标准记分：0＝淋巴结没有可视肿大；1＝淋巴结 轻度肿大，限于支气管淋巴结；2＝淋巴结中度肿大，限于支气管淋巴 结；3＝淋巴结重度肿大，扩展至支气管下颌下肩胛骨上(原文为 prescapsular)和腹股沟淋巴结，如表17中所示。
表17
    淋巴结病得分     平均值     stda     Nb     (A)     (B)     对照     1.2     2.0     3.0     1.3     1.7     0.0     4     3     3
astd是标准差的缩写；bN＝每组中的小猪数目
在用(A)免疫的4只小猪中的3只以及用(B)混合物免疫的3 只小猪中的1只中观察到淋巴结损伤的减少。由于标准差(std)的值 很高，所以这种差异并不显著(p＞0.05)。
淋巴结组织中的病毒载量：对由支气管和肠系膜淋巴结制备的组 织匀浆进行定量病毒再分离。表18中所示数据对应以log10转化后的 组织匀浆中的病毒滴度。
表18：组织匀浆中的病毒滴度
    PCVII滴度   支气管淋巴结     肠系膜淋巴结     平均值     标准差     平均值     标准差     N     (A)     0.9     0.8     0.9     0.8     4     (B)     0.7     0.6     0.2     0.2     3     对照     2.0     1.1     1.8     1.1     4
支气管淋巴结似乎包含最有传染性的病毒。在来自用(A)或(B) 混合物免疫的小猪的支气管和肠系膜淋巴结中观察到病毒载量减少。 这种减少是显著的(对于质粒混合物，p#0.05)。
病毒排出：通过基于PCVII ORF13扩增的PCR评估攻击后的粪便 拭子用于测量释放的PCVII。每种测定法(参见表19)对2ml样品一 式三份进行。未接种疫苗的对照在攻击前对于PCVII是阴性的且在攻 击后是阳性的，证实了PCR测定法的有效性。
表19
    PCVII DNA分子的Log10数目     组     平均值     标准差     N     (A)     3.3     0.3     4     (B)     2.9     0.7     3     对照     3.6     0.6     4
值表示为log10(2μl样品中的PCVII DNA分子数目)。组间差 异不显著(p＞0.05)。
实施例33：使用PCVII疫苗的疫苗接种结果
疫苗接种使用在水包油型乳剂中配制、灭活前滴度为106.6TCID50 的灭活PCVII进行。对于一个疫苗剂量的体积为2ml。
16只小猪(14天大)分配到每组8只动物的2个组中，一组作为 对照组另一组作为疫苗接种组。疫苗接种组的8只动物在第0和21 天时通过肌内途径注射。4只对照组小猪用生理溶液注射。疫苗接种 和对照动物随后在第35天通过口鼻施用PCVII病毒悬浮液进行攻击， 每个鼻孔5ml(每个鼻孔5.5.DICC50)。
抗体产生：如表20中所示血清中的抗体通过免疫荧光测量。
表20：通过免疫荧光测量的血清中抗体
第8天* 第2天* 第19天 第28天 第33天 第43天 平均滴度  2.5  2.2  1.9  2.7  2.8  2.9 std  0.17  0.25  0.0  0.37  0.36  0.28 平均滴度  2.4  2.3  1.9  1.9  1.9  1.9 std  0.11  0.20  0.0  0.0  0.0  0.0
std＝标准差；*，在第-8和-2天时母体抗体的残留滴度
接种疫苗的小猪在第2次疫苗注射后血清转化。疫苗接种和对照 组之间的差异显著(ANOVA分析)。
粪便中的病毒排出：直肠拭子在攻击后的不同时间收集以观察病 毒排出。粪便拭子通过PCR评估PCVII的存在。
未接种疫苗的对照在攻击前对于PCVII是阴性的且在攻击后是阳 性的，证实了PCR测定法的有效性。
值(表21)表示为在粪便中排出PCVII的小猪百分比和以天数表 示的排出平均持续时间。
表21：粪便中的病毒排出
    对照 疫苗接种 ％病毒排出     100％     38％ 排出平均持续时间     9.1天     1.3天
在疫苗接种组中观察到病毒排出减少。疫苗接种和对照组之间的 差异显著(ANOVA分析)。
淋巴结组织中的病毒载量：收集纵隔和肠系膜淋巴结。通过免疫 化学测定病毒载量(表22)。
表22：淋巴结组织中的病毒载量
疫苗接种   对照     纵隔     75％     100％     肠系膜     25％     100％     纵隔     0.4     1.9     肠系膜     0.1     1.9
(1)具有由其可以检测PCVII存在的纵隔或肠系膜淋巴结的小猪 百分比。 (2)使用下列标准的得分平均值：0，缺乏荧光；1，在某些 器官载玻片上有一些荧光病灶；2，每张片(shot)大约1个病灶；3， 整个器官荧光。
(1)和(2)的值在接种疫苗的小猪中比对照中更低。差异是显 著的(对于(1)为卡方检验并且对于(2)为克-瓦二氏检验 (Kruskall-Wallis test))。
尸检损伤：尸检在第63和64天时进行并且对损伤进行评分(表 23)。
表23：尸检损伤
对照   16.8 疫苗接种   8.9
在疫苗接种组中观察到显著减少(克-瓦二氏检验)。关于1只小 猪的得分(如表24中所示)等于对应观察到的每个器官的得分总和。
表24：损伤得分
正常 白色 黄色  0  1  2 正常 薄 非常薄 恶病质  0  1  2  3 正常 白色 黄色  0  1  2 正常 明亮 黄色  0  1  2 正常 明亮 可视  0  1  2 正常 损伤  0  1 正常 损伤＜A 损伤＞4＜6 损伤＞6  0  1  2  3
因此，如通过粪便中的病毒排出、器官中的病毒载量以及PMWS 损伤的明显减少证实的，用灭活PCVII疫苗接种保护了猪不受攻击。
实施例34：使用金丝雀痘活载体的小猪疫苗接种和结果
每组3或4只caesarian来源的小猪第0天置于隔离畜舍内。小 猪在第2天用在1ml PBS中的108pfu(C)包含ORF 13的金丝雀痘 或(D)包含ORF 13和ORF 4的金丝雀痘，或亲本金丝雀痘，通过肌 内途径在颈侧进行疫苗接种。在第14天时施用疫苗或安慰剂的第2 次注射。使用金丝雀痘的疫苗接种被小猪良好耐受且没有注意到关于 疫苗接种的不良反应的证据。小猪在第21天通过口鼻施用PCVII病毒 悬浮液进行攻击，每个鼻孔1ml。第45天进行尸检并收集组织样品 用于病毒分离。
尸检结果：PMWS的一般特征在于淋巴结病和较罕见的肝炎或肾 炎。淋巴结中的肉眼发现以下列方式对每只小猪评分：0＝淋巴结没有 可视肿大；1＝淋巴结轻度肿大，限于支气管淋巴结；2＝淋巴结中度 肿大，限于支气管淋巴结；3＝淋巴结重度肿大，扩展至支气管、下颌 下肩胛骨上(prescapsular)和腹股沟淋巴结，如表25中所示。
表25：淋巴结得分
    组     得分     (C)     平均值     标准差     0.5     0.0     0.0     1.0     0.38     0.48     (D)     平均值     标准差     0.0     0.5     0.5     1.0     0.5     0.41     对照     平均值     标准差     2.0     2.5     2.5     2.5     2.38     0.25
关于PCVII的支气管淋巴结病是显著的肉眼发现。在用(C)和(D) 免疫接种后观察到相对于对照组的淋巴结损伤的显著减少(p≤0.05)。
实施例35：对于使用基于H.cerdo的疫苗的疫苗接种的动物和 方法
在这个研究中使用的动物选择无PRRSV且无猪肺炎枝原体的普通 猪。
普通小猪将在仍与其母亲在一起时进行选择。所有猪进行称重并 记录其重量。猪将分配到每组至少5只猪的4个组，通过Cerberus 人员根据重量、性别和来源窝来分层。将检查所有猪以确保健康状况。 只有临床上健康的动物将包括在试验中。所有猪将通过在左耳中顺次 编号的耳标签鉴别。如果动物丢失其耳标签，那么将安装具有相同识 别号的新耳标签。
猪将在仍与其母亲在一起时1周和2周大时进行疫苗接种。3组 猪将接种疫苗并且剩下1组作为未接种疫苗的对照。接种疫苗的动物 将经由肌内途径接受1个剂量(2ml/剂量)，在每个肩膀和臀部上各 为0.5ml。未接种疫苗的对照将不接受任何注射。
在3周大时，所有猪将断奶并进行攻击。每组将在隔离设施中分 开的围栏中饲养。猪将在攻击后大约28天时进行尸检。阴性对照猪将 在最终尸检日时进行尸检。实验设计概括于表26中。
表26：实验设计
    处理描述   螺杆菌攻击   无攻击     疫苗A     5只猪     疫苗B     5只猪     疫苗C     5只猪     阴性对照   5只猪
攻击程序和评估：在严重临床疾病的情况下，可以施用认为对动 物福利所需的治疗。将记录每只动物的耳标签编号、生病日期、假定 诊断、治疗方案和动物处置。在攻击后将不提供治疗。垂死或受伤的 动物将实施安乐死。不健康的动物(临床疾病或受伤)可能退出该研 究。
血清学和皮肤测试：血液将在疫苗接种前、攻击前和尸检时从前 腔静脉收集。螺杆菌抗体水平将使用ELISA确定。针对其他病原体的 抗体可以在需要时测定。将进行皮肤测试。
生产参数：猪将在到达后、疫苗接种前、攻击前和各自尸检时进 行称重以评估可能的重量增加或减轻。
尸检：猪将在适应螺杆菌攻击的28 DPI时进行尸检。
实施例36：螺杆菌制备方法
培养：细菌培养物来自甘油(植物起源)贮存液，将5-10％接 种物接种入补充10％胎牛血清(FBS)的Brucella培养基。培养物在 通气有盖烧瓶中在三重气体孵育器(triple gas incubator)(85％ N2，10％CO2，5％O2)中伴随约70rpm的振荡于37℃生长。在接种时， TSA+5％绵羊血(SB)板还进行划线培养(struck)作为诊断测试以 测定样品纯度。菌落形态为点状和清晰。当板在孵育器中放置3-4 天时可见某些溶血。培养进行24-36小时以生长至OD600＞1。生长培养 物还在TSA+5％SB平板上划线培养，并测试过氧化氢酶和脲酶生产 (Helicobacter cerdo对于两者都是阳性的)。
离心：生长至OD600＞1的培养物等分到无菌离心瓶内并在大约8600 g时使用J10 Beckman转子在7500rpm下离心20分钟。弃去上清液 并用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞团块。团块重悬浮于PBS中 并等分到10-ml疫苗小瓶内，并分成3个不同组(A、B和C)用于不 同的抗原制剂。
冻干：抗原制剂A和B冻干36小时，不使用稳定剂或防腐剂。观 察到良好成形的块状物。
胃蛋白酶消化：胃蛋白酶溶液(0.1％)在10mM HCl中制备并用 0.2微米过滤器过滤灭菌2次。冻干的抗原制剂A和B在37℃和轻微 摇动下用胃蛋白酶消化(对于每mg干细胞团加入1μg胃蛋白酶)25 小时。100μl样品在18和25小时时涂布在TSA+5％SB板上(在 三重气体微需氧孵育器中于37℃孵育)；在96小时后没有看到生长， 表明胃蛋白酶消化具有灭活效应。胃蛋白酶溶液同样以这种方式测试。 没有看到生长。
PBS中和：抗原制剂A和B在胃蛋白酶消化后具有约2.0的pH， 因此它们用2∶1体积的PBS中和。pH中和后，pH为约7.0。
超声处理：抗原制剂C使用探针型超声波仪在冰上通过30秒高速 脉冲进行超声处理，伴随30秒冷却期，共20次。裂解通过显微镜检 查证实，尽管灭活测试(通过将100μl样品在TSA+5％SB板上铺 板、在三重气体微需氧孵育器中于37℃孵育72小时来确定)显示某 些细菌仍是存活的且能够形成菌落。
福尔马林灭活：抗原制剂B和C使用0.3％福尔马林于37℃伴随 24小时摇动进行福尔马林灭活。100μL样品在18和24小时时涂布 在TSA+5％SB板上(在三重气体微需氧孵育器中于37℃孵育)，在 96小时后没有看到生长。抗原制剂B的福尔马林终浓度为0.11％。抗 原制剂C的福尔马林终浓度为0.04％。
实施例37：用胃蛋白酶或福尔马林处理的Helicobacter cerdo 制备的抗原制剂的配制
疫苗将如表27中所示通过将冻干细菌溶解于10ml佐剂/小瓶内 当时进行配制。值反映配制后每种成分的浓度。
表27：疫苗配制
                                      抗原A 成分 组分 成分量mg/ml 成分量mg/剂量(2ml) PBS NaCl 2 4 KCl 0.05 0.1 Na2HPO4 0.2875 0.575 KH2PO4 0.05 0.1 去离子H2O 胃蛋白酶(溶液) 3.5μg 7.0μg HCl 0.042 0.084 螺杆菌细胞 3.5 7.0 抗原B 成分 组分 成分量mg/ml 成分量mg/剂量(2ml) PBS NaCl 2 4 KCl 0.05 0.1 Na2HPO4 0.2875 0.575 KH2PO4 0.05 0.1 去离子H2O 福尔马林 1.11(0.11％福尔马林) 2.22 胃蛋白酶(溶液) 3.7μg 7.4μg HCl 0.045 0.089 螺杆菌细胞 3.7 7.3 抗原C： 成分 组分 成分量mg/ml 成分量mg/剂量(2ml) PBS NaCl 1.2 2.4 KCl 0.03 0.06 Na2HPO4 0.1725 0.345 KH2PO4 0.03 0.06 去离子H2O 福尔马林 0.412(0.04％) 0.824 螺杆菌细胞 3.6 7.3
LR2佐剂
    成分     起源     乙氧基化油酸醇2OE(Oleth-2)     植物来源     Macrogol油酸醚5OE(Oleth-5)     植物来源     Pluronic F127(泊洛沙姆407)     合成     石蜡油     矿物来源     生理学磷酸盐缓冲液     矿物来源
实施例38：螺杆菌分离株
2种细菌分离株(2662和1268)通过在Skirrow氏培养板上微需 氧培养和传代从猪胃粘膜回收。
基于胃定位(贲门和窦)、形态学(革兰氏阴性、短、弯曲的“鸥 翅样”杆菌)、脲酶活性、与兔抗Hp抗体的反应性，2种分离株基于 SDS-PAGE和蛋白质印迹特征归于螺杆菌属，如图7中所示，发现分离 株2662类似于幽门螺杆菌且命名为“Helicobacter cerdo”。分离株 1268具有与2662的区别性特征。
实施例39：通过脲酶活性测量的细菌载量
表28：通过脲酶活性测量的细菌载量
    组     胃粘膜中的脲酶活性     无       弱       中    强 材料A(蛋白酶消 化)     4*     0     2     - 材料B(福尔马林 全部)     1     4     1     - 材料C(超声处理， 福尔马林)     2     1     3     - 感染对照     -     1     3     3
*肉眼损害部分食管
实施例40：胃炎症应答
胃炎症应答(表29)以下列量表对胃固有层内的滤泡和淋巴细胞 性浸润“评分”：0，无；1，轻度；2，中度；和3，重度。关于每只 猪的总炎症得分计算为胃贲门和窦中组织学得分总和。组平均得分由 这些计算。
表29：胃炎症应答
    组编号     平均总得分     A     3.6     B     4.4     C     4.3     D(对照)     4.4
实施例41：血清学应答
表30：血清学应答
组     第6     天     第14天     第24天     第40天 材料A(蛋白酶 消化)     1.0     1.3     81.0     86.5 材料B(福尔马 林全部)     1.8     0.0     3.2     13.7 材料C(超声处 理，福尔马林)     1.0     0.5     22.5     25.7 感染对照     1.0     0.8     1.3     4.5 Suivaxyn Myco hyo+H.cerdo     6.9     11.8     99.9     97.3 对照     9.4     6.6     9.1     9.0
基于脲酶活性强度、组织切片的不知情的组织学评估和最强的血 清学应答，疫苗A提供了保护性免疫的最佳指数。Suivaxyn Myco hyo 和H.cerdo的组合疫苗以及疫苗A给出了相似的抗体应答。
实施例42：对于使用基于PCVII/H.cerdo的组合疫苗的疫苗接 种的动物和方法-方案1
动物如下分成3个疫苗组(每组10只动物)：
只有PCV2+LR4佐剂
PCV2+H.cerdo+LR4佐剂
PK15对照+LR4佐剂
抗原制剂
H.cerdo裂解物制剂：H.cerdo裂解物根据类似于Waters等人， (2000)Vaccine 18：711-719中所述消化方案的方法使用蛋白水解 消化制备。在微需氧条件(和持续搅拌)下在补充10％胎牛血清(FCS) 的Brucella(Difco)液体培养基中繁殖的H.cerdo细菌悬浮液允许 达到大约109细菌/ml。细菌通过离心(2000-3000xg)10分钟进行 回收。弃去上清液并将细菌团块重悬浮于2ml 0.01M磷酸盐缓冲盐水 (PBS)中，转移到2ml(平底)Eppendorf管并在离心蒸发器装置(加 速，真空)中用低热干燥过夜。合并冻干的细菌团块并称重。对于细 菌消化，通过在10mM HCl，pH1.9-2.2内稀释制备浓度为1.0μg/ml 的胃蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)。1μg胃蛋白酶与1mg冻干 细菌一起于37℃在磁力搅拌器上孵育24-25小时。消化完成后，消 化液贮存于-70℃直至使用。发现H.cerdo裂解物在消化后具有4.76 mg/mL的蛋白质浓度。
PCV2制剂：病毒通过β-丙内酯灭活并通过Leanne Stevenson/Irene McNair由Belfast的Gordon Allen组提供。发现 蛋白质浓度是2.615mg/mL和9.5×105/mL TCID50(如通过PCV2抗 原捕获ELISA测定的)。
PK15对照制剂：贮存于液氮中的PK15细胞在包含10％FCS的极 限必需培养基中繁殖。对2个T175烧瓶(70mL)中完全长满(100 ％汇合)的细胞应用3次冷冻和融化循环。培养物随后以35mL的量 分配并用最大功率超声处理60秒。将样品合并在一起，进行超声处理， 加温至37℃且加入终浓度为0.5％v/v Triton的Triton-X-114(预 热至37℃)并于37℃孵育30分钟。培养物在10,000rpm下离心1 小时，收集上清液并在30,000rpm下离心4小时。倾出上清液并将团 块重悬浮于7mL TE缓冲液(99ml DW，1ml 1M Tris pH 7.8，200ml 0.5M EDTA pH 8.0)中。样品以最大功率超声处理60秒。发现蛋白质 浓度为1.547mg/mL且通过PCV2抗原捕获ELISA没有检测到PCV2特 异性抗原的量。
疫苗制剂
佐剂+抗原乳化：LR4在水浴中加热至37℃ 10分钟并使用磁力 搅动板搅拌1分钟。LR4随后在4℃冷室中快速冷却，不使用搅拌。一 旦冷却，LR4就使用磁力搅动板进行搅动并加入PCV2+H.cerdo或 PK15对照抗原制剂。疫苗伴随搅动贮存于4℃直至施用。
PCV2+H.cerdo：给每只猪经皮施用的制剂是25uL H.cerdo 裂解物+25uL 0.02M PBS(pH调整至7.0)+50uL灭活PCV2+100 uL LR4。疫苗在佐剂中乳化并将混合物注射到每只小猪的颈部区域内。 每只小猪在7天大时(在颈右侧上注射)和35天大时(在颈左侧上注 射)经皮接受1-200uL注射液。
PK15对照：给每只猪经皮施用的制剂是50uL PK15裂解物+50 uL 0.02M PBS(pH调整至7.0)+100 uL LR4。疫苗在佐剂中乳化并 将混合物注射到每只小猪的颈部区域内。每只小猪在7天大时(在颈 右侧上注射)和35天大时(在颈左侧上注射)经皮接受1-200uL 注射液。
表31显示了H.cerdo结果。每组接受初始疫苗，随后为4周后 的第二次疫苗接种。猪在用H.cerdo和PCV2第二次疫苗接种后3周进 行攻击。猪在攻击后4周进行尸检。在攻击和尸检时通过ELISA测量 H.cerdo的抑制百分比。
表31：H.cerdo结果-抑制百分比
标签 编号     对照 标签 编号     PCV-2   标签   编号 PCV-2+H.cerdo     攻击     尸检     攻击     尸检     攻击     尸检   W03     50     69   W02     45     71   W01     100     83   W05     39     47   W04     16     57   W08     75     64   W07     3 3     52   W06     45     73   W11     100     83   W09     27     52   W10     44     42   W15     100     81   W12     N/A     N/A   W13     76     75   W16     100     100   W14     43     71   W18     52     88   W17     62     78   W21     38     66   W19     62     86   W20     100     100   W24     61     84   W22     77     79   W23     98     94   W26     65     75   W28     62     71   W25     99     90   W30     54     67   W27     83     59   W29*     84     100
*这个受试者最初是对照，随后在第二次疫苗接种时接受PCV-2+ H.cerdo疫苗。
表32显示了PCV-2结果。猪如上所述进行疫苗接种、攻击和尸检。 在攻击和尸检时通过ELISA测量PCV-2的抑制百分比。
表32：PCV-2结果
标签 编号     对照 标签 编号     PCV-2 标签 编号     PCV-2+H.cerdo     攻击     尸检     攻击     尸检     攻击     尸检   W03     3     92   W02     5     96   W01     1     97   W05     8     89   W04     5     94   W08     4     97   W07     6     84   W06     4     97   W11     12     4   W09     16     95   W10     7     96   W15     23     93   W12     N/A     N/A   W13     76     85   W16     5     95   W14     2 2     9   W18     25     13   W17     49     12   W21     6     85   W19     47     93   W20     41     80   W24     21     66   W22     12     94   W23     9     97   W26     7     87   W28     76     41   W25     6     2   W30     79     84   W27     13     96   W29*     82     47
*这个受试者最初是对照，随后在第二次疫苗接种时接受PCV-2+ H.cerdo疫苗。
表33显示了对于PCV-2抗体的免疫过氧化物酶单层测定法(IPMA) 结果。测量的终末点滴度以1∶50开始，随后为连续7次的3倍稀释。
表33：PCV-2结果
标签 编号     对照 标签 编号                 PCV-2 标签 编号     PCV-2+H.cerdo     攻击     尸检   攻击     尸检   攻击   尸检   W03     ＜1∶50     1∶4050   W02   1∶50     1∶4050   W01   ＜1∶50   1∶12150   W05     1∶50     1∶4050   W04   1∶50     1∶4050   W08   1∶50   1∶36450   W07     1∶50     1∶1350   W06   1∶50     1∶109350   W11   1∶50   ＜1∶50   W09     1∶50     1∶12150   W10   ＜1∶50     1∶12150   W15   1∶50   1∶4050   W12     N/A     N/A   W13   1∶1350     1∶450   W16   ＜1∶50   1∶4050   W14     1∶50     1∶50   W18   1∶50     ＜1∶50   W17   1∶50   ＜1∶50   W21     ＜1∶50     1∶4050   W19   1∶50     1∶1350   W20   1∶50   1∶1350   W24     1∶150     1∶450   W22   ＜1∶50     1∶1350   W23   ＜1∶50   1∶4050   W26     ＜1∶50     1∶12150   W28   1∶150     1∶150   W25   ＜1∶50   ＜1∶50   W30   1∶150     1∶1350   W27   ＜1∶50   1∶12150   W29*   1∶150   1∶450
*这个受试者最初是对照，随后在第二次疫苗接种时接受PCV-2+ H.cerdo疫苗。
实施例43：对于使用基于PCVII/H.cerdo的组合疫苗的疫苗接 种的动物和方法-方案2
在这个研究中使用的动物选择无PRRSV且无猪肺炎枝原体的普通 猪。
普通小猪将在仍与其母亲在一起时进行选择。所有猪进行称重并 记录其重量。猪将分配到每组至少5只猪的4个组，通过Cerberus 人员根据重量、性别和来源窝来分层。将检查所有猪以确保健康状况。 只有临床上健康的动物将包括在试验中。所有猪将通过在左耳中顺次 编号的耳标签鉴别。如果动物丢失其耳标签，那么将安装具有相同识 别号的新耳标签。
猪将在仍与其母亲在一起时1周和2周大时进行疫苗接种。3组 猪将接种疫苗并且剩下1组作为未接种疫苗的对照。接种疫苗的动物 将经由肌内途径接受1次剂量(2ml/剂量)，在每个肩膀和臀部上各 为0.5ml。
施用的疫苗将是单独的Hcerdo疫苗A、B或C(如上文实施例25、 26和37中所述制备)，或与PCVII疫苗组合的Hcerdo疫苗A、B或 C。未接种疫苗的对照将不接受任何注射。疫苗接种将通过使用在水包 油型乳剂中配制、灭活前滴度为106.6TCID50的灭活PCVII进行。一 次疫苗剂量的体积将为2ml。
16只小猪(14天大)将分配到2组动物中，一组作为对照组另一 组作为疫苗接种组。疫苗接种组的动物将在第0和21天时通过肌内途 径注射。4只对照组小猪将用生理溶液注射。疫苗接种和对照动物随 后将在第35天通过口鼻施用PCVII病毒悬浮液进行攻击，每个鼻孔5 ml(每个鼻孔5.5.DICC50)。
抗体产生：如下表所示血清中的抗体可以通过免疫荧光测量。
在3周大时，所有猪将断奶并进行攻击。每组将在隔离设施中分 开的围栏中饲养。猪将在攻击后大约28天时进行尸检。阴性对照猪将 在最终尸检日时进行尸检。实验设计概括于表34中。
表34：实验设计
    处理描述   螺杆菌攻击   无攻击     疫苗A     5只猪     疫苗B     5只猪     疫苗C     5只猪     阴性对照   5只猪     疫苗A+PCVII     5只猪     疫苗B+PCVII     5只猪     疫苗C+PCVII     5只猪     +PCVII     5只猪
攻击程序和评估：在严重临床疾病的情况下，可以施用认为对动 物福利所需的治疗。将记录每只动物的耳标签编号、生病日期、假定 诊断、治疗方案和动物处置。在攻击后将不提供治疗。垂死或受伤的 动物将实施安乐死。不健康的动物(临床疾病或受伤)可能退出该研 究。
血清学和皮肤测试：血液将在疫苗接种前、攻击前和尸检时从前 腔静脉收集。螺杆菌抗体水平将使用基于荧光的技术确定。针对其他 病原体的抗体可以在需要时测定。进行皮肤测试。
生产参数：猪将在到达后、疫苗接种前、攻击前和各自尸检时进 行称重以评估可能的重量增加或减轻。
尸检：猪将在适应螺杆菌攻击的28 DPI时进行尸检。
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鉴于因此详细描述的本发明的有利实施方案，应当理解由附加权 利要求限定的本发明不限于上文说明书中阐述的具体细节，因为无需 背离本发明的精神或范围即可进行其许多显而易见的变化。本文描述 的方法和装置的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，并 由下列权利要求包含。
与相关申请的交叉参照
本申请要求于2005年4月15日提交的美国申请序列号 11/107,219的优先权，其内容在此特别引入本文作为参考。
本申请是于2003年9月2日提交的悬而未决的美国申请序列号 10/653,849的部分继续申请，该美国申请是于2002年12月31日提 交的悬而未决的美国申请序列号10/334,245的部分继续申请，该后者 申请是于2001年8月20日提交的放弃的美国申请序列号09/935,428 的继续申请，该后者申请是于1998年12月10日提交的放弃的美国申 请序列号09/209,961的继续申请，该后者申请要求于1997年12月 16日提交的美国申请序列号60/069,750以及于1997年12月11日提 交的美国申请序列号60/069,233的优先权。
本申请还是于2001年6月19日提交的悬而未决的美国申请序列 号09/884,514的部分继续申请，该美国申请是美国申请序列号 09/161,092的分案申请，后者于1998年9月25日提交、现在是美国 专利号6,391,314，该后者申请是美国申请序列号09/082,558的部分 继续申请，后者于1998年5月21日提交、现在是美国专利号 6,368,601，该后者申请要求于1997年10月3日提交的法国申请 97/12382；于1998年1月22日提交的98/00873和于1998年5月20 日提交的98/03707的优先权。
本申请还是于2000年10月6日提交的悬而未决的美国申请序列 号09/680,228的部分继续申请，该美国申请是美国申请序列号 09/583,350的部分继续申请，后者于2000年5月31日提交、现在是 美国专利号6,517,843，该后者申请要求于1999年8月31日提交的 美国申请序列号60/151,564的优先权。本申请还是于2001年2月16 日提交的悬而未决的美国申请序列号09/784,962的部分继续申请，该 后者申请是美国申请序列号09/347,594的分案申请，后者于1999年 7月1日提交、现在是美国专利号6,217,883，该后者申请要求于1998 年7月6日提交的法国申请98/08777的优先权。本申请涉及于1998 年12月11日提交的国际申请序列号PCT/CA98/01130。
引入的参考文献
其中或其申请过程中引用的所有文件(“申请引用的文件”)和 申请引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或参考的所 有文件(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用或参考 的所有文件，连同本文提及和引入本文作为参考的任何文件中的任何 产品的任何制造商说明书、描述、产品说明书和产品宣传单，在此引 入本文作为参考，并且可以在本发明实践中采用。