本发明属于药物化学领域，特别涉及2’-C-甲基呋喃核糖基胞苷-3’-O-L-缬氨酸酯及其可 药用盐、衍生物和前药，以及它们的合成和它们在治疗由黄病毒科病毒(Flaviviridae)、特 别是丙型肝炎病毒(HCV)感染的寄主、特别是人中作为抗黄病毒科病毒制剂的应用。

黄病毒科病毒(Flaviviridae Viruses)
黄病毒科病毒包括至少三个截然不同的属：瘟病毒属(pestiviruses)，其引起牛和猪中 的疾病；黄病毒属(flaviviruses)，其是导致诸如登革热(dengue fever)和黄热病(yellow fever) 等疾病的首要原因；以及肝病毒属，其唯一的成员即为HCV。黄病毒属包括超过68种成员， 这些成员根据血清学的关联性(Calisher et al.，J Gen.Virol，1993，70，37-43)进行分组。不同的临 床症状包括：发烧、脑炎和出血热(Fields Virology，Editors：Fields，B.N.，Knipe，D.M.，and Howley，P.M.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，1996，Chapter 31，931-959)。引 起全球关注的与人类疾病相关的黄病毒属包括：登革出血热病毒(dengue hemorrhagic fever viruses(DHF))、黄热病毒(yellow fever virus)、休克综合症(shock syndrome)和日本 脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)(Halstead，S.B.，Rev.Infect.Dis.，1984，6，251-264； Halstead，S.B.，Science，239：476-481，1988；Monath，T.P.，New Eng.J.Med.，1988，319， 641-643)。
瘟病毒属包括：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV，也称猪瘟病毒(hog cholera virus))以及绵羊边界病病毒(BDV)(Moennig，V.et al.Adv.Vir.Res.1992，41，53-98)。驯养 家畜(牛、猪和绵羊)的瘟病毒感染在世界范围内均导致了严重的经济损失。BVDV导致牛 的粘膜病，其对于家畜产业影响深远(Meyers，G.and Thiel，H.-J.，Advances in Virus Research， 1996，47，53-118；Moennig V.，et al，Adv.Vir.Res.1992，41，53-98)。虽然人瘟病毒还没有像动 物瘟病毒这样进行广泛地鉴定，但是，血清学的调查研究表明人类受到相当多的瘟病毒的威 胁。
在黄病毒科中，瘟病毒属和肝病毒属(hepaciviruses)是非常接近的病毒组。该科中的 其它密切相关的病毒包括GB病毒A(GB virus A)、GB病毒A类似物(GB virus A-like agents)、GB病毒B(GB virus B)和GB病毒C(GB virus C，也称为肝炎G病毒(hepatitis G virus，HGV))。肝病毒属(丙型肝炎病毒；HCV)包括许多非常接近但在基因型上可辨别 的感染人类的病毒。大约有6种HCV基因型和超过50种亚型。由于瘟病毒属和肝病毒属之 间的相似性，并且由于肝病毒属很难在细胞培养基中有效地生长，牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)经常被用作替代物来研究HCV病毒。
瘟病毒属和肝病毒属的基因结构非常类似。这些正链的RNA病毒具有病毒复制所需要 的编码所有病毒蛋白的一个大的开放读码框架(ORF)。这些蛋白表达为多聚蛋白，其被细胞 的蛋白酶和病毒编码的蛋白酶进行共翻译和翻译后加工，从而产生成熟的病毒蛋白。负责病 毒基因组RNA的复制的病毒蛋白大致位于羧基末端。三分之二的ORF被称为非结构性(NS) 蛋白。对于瘟病毒属和肝病毒属，ORF的非结构性蛋白的基因结构和多聚蛋白的加工非常 相似。对于瘟病毒属和肝病毒属二者而言，成熟的非结构性(NS)蛋白按照序列顺序从非 结构性蛋白编码区的氨基末端到ORF的羧基末端包含：p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A 和NS5B。
瘟病毒属和肝病毒属的NS蛋白都有特定蛋白功能特性的序列结构域。例如，在这两组 病毒中的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶特性的氨基酸序列基序(Gorbalenya et al. (1988)Nature 333：22；Bazan and Fletterick(1989)Virology 171：637-639；Gorbalenya et AL. (1989)Nucleic Acid Res.17.3889-3897)。类似地，瘟病毒属和肝病毒属的NS5B蛋白具有RNA 指导的RNA聚合酶特性的基序。(Koonin，E.V.and Dolja，V.V.(1993)Crit.Rev.Biochem. Molec.Biol.28：375-430)。
瘟病毒属和肝病毒属的NS蛋白在病毒生命周期中的实际角色和功能是完全相似的。在 两者中，NS3丝氨酸蛋白酶负责在ORF中多聚蛋白前体下游位置的所有蛋白水解加工。 (Wiskerchen and Collett(1991)Virology 184：341-350；Bartenschlager et al.(1993)J Virol.67：3835-3844；Eckart et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Comm.192：399-406；Grakoui et al.(1993)J.Virol.67：2832-2843；Grakoui et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 10583-10587；Hijikata et al.(1993)J.Virol.67：4665-4675；Tome et al.(1993)J.Virol.67： 4017-4026)。NS4蛋白在两者中均作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅因子。(Bartenschlager et al. (1994)J.Virol.68：5045-5055；Failla et al.(1994)J.Virol.68：3753-3760；Lin et al.(1994)68： 8147-8157；Xu et al.(1997)J.Virol.71：5312-5322)。两种病毒属的NS3蛋白也都还具有解旋酶 的功能(Kim et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Comm.215：160-166；Jin and Peterson(1995) Arch.Biochem.Biophys.，323：47-53；Warrener and Collett(1995)J.Virol.69：1720-1726)。最 后，瘟病毒属和肝病毒属的NS5B蛋白具有可预测的RNA指导的RNA聚合酶活性(Behrens et al.(1996)EMBO J.15：12-22；Lchmann et al.(1997)J.Virol.71：8416-8428；Yuan et al.(1997) Biochem.Biophys.Res.Comm.232：231-235；Hagedom，PCT WO 97/12033；Zhong et al.(1998) J.Virol.72.9365-9369)。
丙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内慢性肝病的最主要病因(Boyer，N.et al.J.Hepatol. 32：98-112，2000)。HCV导致了缓慢增长的病毒感染并是肝硬化和肝细胞癌的主要病因(Di Besceglie，A.M.and Bacon，B.R.，Scientific American，Oct：80-85，(1999)；Boyer，N.et al.J. Hepatol.32：98-112，2000)。估计在世界范围内有1.7亿感染了HCV(Boyer，N.et al.J.Hepatol. 32：98-112，2000)。在美国估计每年因为慢性丙型肝炎病毒感染导致的肝硬化导致 8,000-12,000人死亡，并且对于肝移植而言HCV感染是最主要的指征。
已知HCV导致至少80％的输血后肝炎和大部分的偶发性急性肝炎。初步证据也表明 HCV在许多“原发性”慢性肝炎、“隐发性”肝硬化和可能在肝细胞癌的病例中与其它的 肝炎病毒，如乙型肝炎病毒(HBV)无关。一小部分的健康人群看来是慢性HCV的携带者， 具有地理分布上和其它流行病学因素的多样化。虽然仅仅是一个初步的消息，但其数目可能 实质上超过了HBV的携带者；尚不清楚究竟有多少人患有临床症状不明显的慢性肝病(The Merck Manual，ch.69，p.901，16th ed.，(1992))。
HCV是一种含有大约9.4kb的有义单链RNA基因组的有包膜病毒。病毒基因组由一个 5′非翻译区(UTR)、一个编码大约3011个氨基酸的多聚蛋白前体的长的开放阅读框、和一 个短的3′UTR组成。5′UTR是HCV基因组的最主要的高度保守部分且对于启动和控制多聚 蛋白的翻译起重要作用。HCV基因组的翻译通过已知为内部核糖体进入的加帽独立性机制 启动。该机制包括核糖体和RNA序列在已知为内部核糖体进入位点(IRES)上结合。一个RNA 假结结构近来已被测定是HCV IRES的一个基本结构元件。病毒结构蛋白包括一种核壳核心 蛋白(C)和两种有包膜糖蛋白，E1和E2。HCV也编码两种蛋白酶，一种NS2-NS3区编码 的依赖于锌的金属蛋白酶和一种NS3区编码的丝氨酸蛋白酶。对于剪切前体多聚蛋白的特 定区域形成成熟肽而言，这些蛋白酶是必需的。非结构蛋白5，NS5B，的羧基部分含有RNA 依赖的RNA聚合酶。剩余的非结构蛋白NS4A和NS4B以及NS5A(非结构蛋白5的氨基 部分)的功能仍然未知。
当前抗病毒研究的一个重要焦点是在于发展改良的治疗人体中慢性HCV感染的方法 (Di Besceglie，A.M.and Bacon，B.R.，Scientific American，Oct：80-85，(1999))。
用干扰素治疗HCV感染
近十年来，干扰素(IFNs)已可通过商业途径获得以用于治疗慢性肝炎。IFN是由免疫细 胞响应病毒感染过程中产生的糖蛋白。IFN抑制许多病毒包括HCV的复制，但单独用于治 疗丙型肝炎感染时，IFN在某些时候可以将血清HCV-RNA抑制到可探知的水平。此外，IFN 可以将血清氨基转移酶达到正常水平。然而IFN的效果仅仅是暂时性的，持续的响应仅在8 ％～9％的感染了慢性HCV的患者中产生(Gary L.Davis.Gastroenterology 118：S104-S114， 2000)。但是，大多数患者难于忍受因干扰素治疗而导致的严重的流行性感冒样症状、体重 降低、以及疲乏无力。
许多专利都公开了使用基于干扰素的疗法治疗包括HCV在内的黄病毒科。例如，Blatt 等人的美国专利第5,980,884号公开了用复合干扰素治疗饱受HCV折磨的病人的方法。 Bazer等人的美国专利第5,942,223号公开了使用羊或牛干扰素-τ(IFN-τ)的抗-HCV疗法。 Alber等人的美国专利第5,928,636公开了用于治疗由包括HCV在内的传染性疾病的白细胞 介素-12和干扰素α(IFN-α)联合疗法。Chretien等人的美国专利第5,849,696号公开了单 独使用胸腺素或与干扰素结合使用来治疗HCV。Valtuena等人的美国专利第5,830,455号公 开了使用干扰素和只有基清除剂的HCV联合疗法。Imakawa的美国专利第5,738,845号公 开了使用人干扰素-τ蛋白治疗HCV。另外，在Testa等人的美国专利第5,676,942号、Blatt 等人的美国专利第5,372,808号和美国专利第5,849,696号中公开了其它的基于干扰素的 HCV疗法。还有许多专利公开了聚乙二醇化形式的干扰素，这些专利如：Hoffmann-La Roche Inc的美国专利第5,747,646，5,792,834和5,834,594号；Enzon的公开号为WO 99/32139和 WO 99/32140的PCT专利；Schering的WO 95/13090美国专利第5,738,846和5,711,944 号，以及Glue等人的美国专利第5,908,621号。
干扰素α-2a和干扰素α-2b目前被许可作为治疗HCV的单独疗法。ROFERON_A(Roche) 是干扰素α-2a的重组形式。PEGASYS_(Roche)是干扰素α-2a的聚乙二醇化形式(即聚乙 二醇修饰的)。INTRON_A(Schering Corporation)是干扰素α-2b的重组形式。PEG-INTRON_ (Schering Corporation)是干扰素α-2b的聚乙二醇化形式。
干扰素α的其它形式以及干扰素β，γ，τ和ω目前还处于HCV治疗的临床开发阶段。例 如，InterMune的INFERGEN(干扰素alphacon-1)，Viragen的OMNIFERON(天然干扰素)， Human Genome Sciences的ALBUFERON，Ares-Serono的REBIF(干扰素β-1a)，BioMedicine 的ω干扰素，Amarillo Biosciences的口服干扰素α，以及InterMune的干扰素γ，干扰素τ和 干扰素γ-1b都在研究之中。
利巴韦林(Ribavirin)
利巴韦林(1-β-D-核糖呋喃基-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺)是一种合成的、非干扰素诱导的 广谱抗病毒核苷类似物，其商品命为Virazole(The Merck Index，11th edition，Editor：Budavari， S.，Merck & Co.，Inc.，Rahway，NJ，p1304，1989)。美国专利第3,798,209和RE29,835公开并 要求保护利巴韦林。利巴韦林在结构上与鸟苷相似，并且具有对抗包括黄病毒科在内的多种 DNA和RNA病毒的体外活性(Gary L.Davis.Gastroenterology 118：S104-S114，2000)。
利巴韦林可将40％的患者的血清氨基转移酶水平降低到正常水平，但不能降低 HCV-RNA的血清水平(Gary L.Davis.Gastroenterology 118：S104-S114，2000)。因此，利巴韦 林单独给药无法有效降低病毒RNA水平。此外，利巴韦林具有相当的毒性且已知能诱发贫 血症。
利巴韦林未获批准用于单独治疗HCV，但被批准用于和干扰素α-2a或干扰素α-2b联合 治疗HCV。
干扰素和利巴韦林的联合给药
当前治疗慢性丙型肝炎的标准是α干扰素和利巴韦林的联合疗法。对采用干扰素和利巴 韦林的联合疗法治疗HCV感染，已有报道称该疗法在治疗干扰素首次患者(interferon naive patients)时有效的(Battaglia，A.M.et al.，Ann.Pharmacother.34：487-494，2000)，此外，对于 治疗存在组织学疾病的患者的治疗，该疗法也是有效的(Berenguer，M.et al.Antivir.Ther.3 (Suppl.3)：125-136，1998)。研究表明，更多的丙型肝炎患者对聚乙二醇化的干扰素-α/利巴韦 林联合疗法的响应比对与非聚乙二醇化的干扰素-α联合疗法的响应强。但是，与单独疗法相 同的是，在联合疗法中，产生相当大的副作用，这包括溶血、流行性感冒样症状、贫血症和 疲乏(Gary L.Davis.Gastroenterology 118：S104-S114，2000)。
采用PEG-INTRON_(peg干扰素α-2b)和REBETOL_(利巴韦林，USP)联合疗法的胶囊 可由Schering Corporation获得。REBETOL_(Schering Corporation)还被批准与INTRON_A (干扰素α-2b，重组体，Schering Corporation)联合使用。另外，Roche′s PEGASYS_(聚乙二 醇化的干扰素α-2a)和COPEGUS_(利巴韦林)也被批准用于治疗HCV。
Schering Corporation的PCT公开号为WO 99/59621，WO 00/37110，WO 01/81359，WO 02/32414 and WO 03/024461的专利申请中公开了使用聚乙二醇化的干扰素α和利巴韦林联 合疗法治疗HCV。Hoffmann-La Roche Inc的PCT公开号为WO 99/15194，WO 99/64016，and WO 00/24355的专利申请中也公开了使用聚乙二醇化的干扰素α和利巴韦林联合疗法治疗 HCV。
治疗黄病毒科感染的其它方法
目前正在进行用于黄病毒科感染、特别是丙型肝炎病毒的新的抗病毒制剂的开发。源自 HCV的酶如蛋白酶、解旋酶的特异性抑制剂，和聚合酶抑制剂正在开发中。另外，用于抑 制HCV复制的其它步骤的抑制剂也在开发中，例如，阻断从RNA产生HCV抗原(IRES抑 制剂)、阻止HCV蛋白正常加工的药物(糖基化抑制剂)，阻断HCV进入细胞的药物(通 过阻断其受体)，以及阻止由于病毒感染引起的细胞损伤的非特异性细胞保护制剂。另外， 分子学方法也被发展用于治疗丙型肝炎，例如，正在进行研究的有：核酶(Ribozyme)，其能 特异性破坏病毒RNA分子的酶酸；反义寡聚核苷酸，其是DNA的小的互补片段，能结合 病毒RNA并抑制病毒复制。Bymock等人在Antiviral Chemistry & Chemotherapy，11：2；79-95 (2000)中，以及De Francesco等人在Antiviral Research，58：1-16(2003)中对大量的HCV的治 疗进行了综述。
已被开发的用于治疗黄病毒感染的药物的分类的实例包括：
(1)蛋白酶抑制剂
正在研究的有：基于底物的NS3蛋白酶抑制剂(Attwood et al.，Antiviral peptide derivatives， PCT WO 98/22496，1998；Attwood et al.，Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999，10， 259-273；Attwood et al.，Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents， German Patent Pub.DE 19914474；Tung et al.Inhibitors of serine proteases，particularly hepatitis C virus NS3 protease，PCT WO 98/17679)，包括α酮酰胺(alphaketoamides)和肼 基脲(hydrazinoureas)，和能终止亲电子试剂如硼酸或膦酸盐中的抑制剂(Llinas-Brunetet al.，Hepatitis C inhibitor peptide analogues，PCT WO 99/07734)。
另外，在研究的还有：基于非底物的NS3蛋白酶抑制剂，如2，4，6-三羟基-3-硝 基-苯甲酰胺衍生物(Sudo K.et al..，Biochemical and Biophysical Research Communications， 1997，238，643-647；Sudo K.et al..Antiviral Chemistry and Chemotherapy，1998，9，186)，包括 RD3-4082和RD3-4078，前者以碳14链取代酰胺，后者加工对苯氧基苯基。
Sch 68631，一种菲醌，是一种HCV蛋白酶抑制剂(Chu M.et al..，Tetrahedron Letters 37： 7229-7232，1996)。由该作者给出的另一个例子中，Sch 351633，分离自灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)，被确认为一种蛋白酶抑制剂(Chu M.et al..，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9：1949-1952)。通过基于水蛭蛋白酶抑制剂c(eglin c)设计的选择性抑制剂，可以得 到纳摩效能的抗HCV NS3蛋白酶的酶。Eglin c分离自水蛭，是几种丝氨酸蛋白酶如灰色链 霉菌(S.griseus)蛋白酶A和B，α-糜蛋白酶(α-chymotrypsin)，糜蛋白酶(chymase)和 枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)的潜在抑制剂。Qasim M.A.et al..，Biochemistry 36： 1598-1607，1997。
一些美国专利公开了治疗HCV的蛋白酶抑制剂。例如，Spruce等人的美国专利第6,004, 933号公开了用于抑制HCV肽链内切酶2的一类半胱氨酸蛋白酶。Zhang等人的美国专利第 5,990,276号公开了丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的合成抑制剂。该抑制剂是一种NS3蛋白酶底 物的亚序列或是一种NS4A辅因子的底物。在Reyes等人的美国专利第5,538,865号中公开 了使用限制酶治疗HCV。在Corvas International，Inc的WO 02/008251中和Schering Corporation的WO 02/008256中公开了以肽作为HCV的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂。
在Boehringer Ingelheim的美国专利第6,534,523、6,410,531和6,420,380号中以及 Bristol Myers Squibb的WO 02/060926中公开了HCV抑制剂三肽。在Schering Corporation 的WO 02/48172中公开了以二芳基肽作为HCV的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂。在Schering Corporation的WO 02/08198中和在Bristol Myers Squibb的WO 02/48157中公开了以咪唑啉 二酮(Imidazoleidinone)作为HCV的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂。Vertex Pharmaceuticals的 WO 98/17679和Bristol Myers Squibb的WO 02/48116也中开了HCV蛋白酶抑制剂；
(2)噻唑烷(Thiazolidines)衍生物，在采用NS3/4A融合蛋白和NS5A/5B底物进行 的反相HPLC测定中显示了相关的抑制作用(Sudo K.et al.，Antiviral Research，1996，32，9-18)， 特别是化合物RD-1-6250，其具有融合的被长链烷基取代的肉桂酰部分，RD4 6205和RD4 6193；
(3)噻唑烷和N-苯甲酰苯胺(benzanilides)，其确认见Kakiuchi N.et al..J.EBS Letters 421，217-220；Takeshita N.et al..Analytical Biochemistry，1997，247，242-246；
(4)菲醌(phenan-threnequinone)，其在SDS-PAGE和射线自显迹法测定中显示具有 抗蛋白酶活性，通过从链霉菌(Streptomyces sp.)的发酵培养肉汤分离(Chu M.et al..， Tetrahedron Letters，1996，37，7229-7232)，Sch 68631以及Sch 351633，分离自灰青霉菌 (Penicillium griseofulvum)，在闪烁近似测定(SPA)中显示出活性(Chu M.et al..，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9，1949-1952)；
(5)解旋酶抑制剂(Diana G.D.et al..，Compounds，compositions and methods for treatment of hepatitis C，美国专利第5,633,358号；Diana G.D.et al.，Piperidine derivatives， pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C，PCT WO 97/36554)；
(6)核苷聚合酶抑制剂和胶霉毒素(Ferrari R.et al..Journal of Virology，1999，73， 1649-1654)，以及天然产物浅蓝菌素(Lohmann V.et al..，Virology，1998，249，108-118)；
(7)反义硫代磷酸酯寡核苷酸(Antisense phosphorothioate oligonucleotide)(S-ODN)， 其与延伸入病毒的5’非编码区(NCR)(Alt M.et al..，Hepatology，1995，22，707-717)或包 含NCR的3’端的核苷326-348以及位于HCV RNA的核心编码区的核苷371-388(Alt M.et al..， Archives of Virology，1997，142，589-599；Galderisi U.et al..，Journal of Cellular Physiology， 1999，181，251-257)的序列互补；
(8)依赖于IRES的翻译的抑制剂(Ikeda Net al..，Agent for the prevention and treatment of hepatitis C，日本专利公开号JP-08268890；Kai Y.et al..Prevention and treatment of viral diseases，日本专利公开号JP-10101591)；
(9)核酶，例如抗核酸酶核酶(Maccjak，D.J.et al..，Hepatology 1999，30，abstract 995)， 以及公开于Barber等人的美国专利第6,043,077号和Draper等人的美国专利第5,869,253和 5,610,054号中的内容；
(10)核苷类似物也不开发用于治疗黄病毒科感染。
Idenix Pharmaceuticals在国际申请公开号为WO 01/90121和WO 01/92282中公开了使用 支链的核苷治疗黄病毒属(包括HCV)和瘟病毒属。具体而言，在Idenix的公开文本中公 开的用于治疗在人类和其它宿主动物体内的丙型肝炎病毒感染(黄病毒属和瘟病毒属)的方 法，该方法包括实施有效量的具有生物活性的1′，2′，3′或4′-支链的β-D或β-L核苷或其可药 用盐或其衍生物，实施方式为单独实施或与其它抗病毒制剂联合给药，也可选择性地采用可 药用载体。
其它的揭示了使用某些核苷类似物治疗丙型肝炎病毒的专利申请包括：BioChem Pharma，Inc.(现在为Shire Biochem，Inc.)提交的PCT/CA00/01316(WO 01/32153；2000年11 月3日提交)和PCT/CA01/00197(WO 01/60315；2001年2月19日提交)；Merck & Co.，Inc. 提交的PCT/US02/01531(WO 02/057425；2002年1月18日提交)和PCT/US02/03086(WO 02/057287；2002年1月18日提交)，Roche提交的PCT/EP01/09633(WO 02/18404；2001年8 月21日公开)，和Pharmasset，Ltd的PCT公开号WO OIT9246(2001年4月13日提交)，WO 02/32920(2001年10月18日提交)和WO 02/48165。
Emory University的PCT公开号WO 99/43691，标题为″2′-氟代核苷″公开了使用某些2′- 氟代核苷治疗HCV。
Eldrup等人描述了用于抑制HCV的2′-修饰的核苷的结构活性关系(Oral Session V， Hepatitis C Virus，Flaviviridae；16th International Conference on Antiviral Research(April 27，2003，Savannah，Ga.))。
Bhat等人描述了作为可能的HCV RNA复制抑制剂的核苷类似物的合成和药物动力学 特性。作者报道了2′-修饰的核苷在基于细胞的复制子测定中显示出潜在的抑制活性(Oral Session V，Hepatitis C Virus，Flaviviridae；16th International Conference on Antiviral Research (April 27，2003，Savannah，Ga.)；p A75)。
Olsen等人也描述了2′-修饰核苷对HCV RNA复制的作用(Oral Session V，Hepatitis C Virus，Flaviviridae；16th International Conference on Antiviral Research(April 27，2003，Savannah， Ga.)pA76)。
(11)其它的各种化合物包括：1-氨基-烷基环己烷(Gold等人的美国专利第6,034,134 号)，烷基脂质(lipids)(Chojkier等人的美国专利第5,922,757号)，维生素E和其它抗 氧化剂(Chojkier等人的美国专利第5,922,757号)，鲨烯，金刚烷，胆汁酸(Ozeki等人的 美国专利第5,846,964号)，N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸，(Diana等美国专利第5,830,905 号)，苯二碳酰胺(Diana等人的美国专利第5,633,388号)，多聚腺苷酸衍生物(Wang等人的 美国专利第5,496,546号)，2′，3′-二脱氧肌苷(Yarchoan等人的美国专利第5,026,687号)，苯 并咪唑(Colacino等人的美国专利第5,891,874号)，植物提取物(Tsai等人的美国专利第 5,837,257号，Omer等人的美国专利第5,725,859号和美国专利第6,056,961号)和哌啶 (Diana等人的美国专利第5,830,905号)。
(12)当前处于临床前或临床开发中的用于治疗丙型肝炎病毒的其它化合物包括： Schering-Ploughd的白细胞介素-10，Interneuron的IP-501，Vertex的Merimebodib，Endo Labs Solvay的AMANTADINE_(金刚烷胺)，RPI的HEPTAZYME_，Idun Pharma.的IDN-6556， XTL的XTL-002，Chiron的HCV/MF59，NABI的CIVACIR_(丙型肝炎病毒免疫球蛋白)， ICN/Ribapharm的LEVOVIRIN_，ICN/Ribapharm的VIRAMIDINE_，Sci Clone的 ZADAXIN_(胸腺素α-1)，Sci Clone的胸腺素和聚乙二醇化干扰素，Maxim的CEPLENE_ (二盐酸组胺)，Vertex/Eli Lilly的VX 950/LY 570310，Pharmaceutical/Elan的Isis 14803，Idun Pharmaceuticals，Inc.的IDN-6556，AKROS Pharma的JTK 003，Boehringer Ingelheim的 BILN-2061，Roche的Cellcept(霉酚酸吗啉乙酯)，Tularik的T67，β-微管蛋白抑制剂， Innogenetics的针对E2的治疗疫苗，Fujisawa Healthcare，Inc.的FK788，IdB 1016(Siliphos，口 服水飞蓟素-磷酸噻吡二胺Phytosome(oral silybin-phosphatdylcholine phytosome))， ViroPharma/Wyeth的RNA复制抑制剂(VP50406)，Intercell的治疗疫苗，Epimmune/Genencor 的治疗疫苗，Anadys的IRES抑制剂，Anadys的ANA 245和ANA 246，Avant的免疫疗法 (Therapore)，Corvas/Schering的蛋白酶抑制剂，Vertex的解旋酶抑制剂，Trimeris的融合抑 制剂，CellExSys的T细胞疗法，Biocryst的聚合酶抑制剂，PTC Therapeutics的靶向RNA 化学，Immtech Int.的双阳离子(Dication)，Agouron的蛋白酶抑制剂，Chiron/Medivir的蛋 白酶抑制剂，AVI BioPharma的反义疗法，Hybridon的反义疗法，Aethlon Medical的血液清 洁剂(hemopurifier)，Meri的治疗疫苗，Bristol-Myers Squibb/Axys的蛋白酶抑制剂，Tripep 的Chron-VacC，一种治疗疫苗，United Therapeutics的UT 231B，Genelabs Technologies的蛋 白酶，解旋酶和聚合酶抑制剂，Immusol的IRES抑制剂，Rigel Pharmaceuticals的R803， InterMune的INFERGEN_(干扰素alphacon-1)，Viragen的OMNIFERON_(天然干扰素)， Human Genome Science的ALBUFERON_，Ares-Serono的REBIF_(干扰素beta-1a)， BioMedicine的ω-干扰素，Amarillo Biosciences的口服α-干扰素，InterMune的γ-干扰素， τ-干扰素和γ-1b干扰素。
先前已经描述了核苷前药用于治疗其它类型的肝炎。Idenix Pharmaceuticals的WO 01/96353(2001年6月15日提交)公开了2′-脱氧-β-L-核苷，以及它们用于治疗HBV的3′-前 药。Beauchamp的美国专利第4,957,924号公开了各种治疗用的无环鸟苷(acyclovir)的酯。
考虑到HCV感染已经达到了世界范围的流行程度，并对患者造成悲剧性的影响，因此 急需提供新而有效的并对寄主低毒性的治疗丙型肝炎的药物制剂。
另外，考虑到其他的黄病毒科感染的日渐上升的危害，急需提供新而有效的并对寄主低 毒性的药物制剂。
因此，本发明的一个目的是提供一种化合物，用于治疗感染了丙型肝炎病毒的寄主的方 法和组合物。
本发明的另一目的是提供用于治疗感染了瘟病毒属、黄病毒属或肝病毒属患者的通用方 法和组合物。

已发现β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-L-缬氨酸酯(以下可称为val-mCyd)对黄病 毒属和瘟病毒属，包括丙型肝炎病毒有非常好的治疗效果。基于此发现，提供了用于治疗黄 病毒科包括HCV的化合物、组合物、方法和用途，其包括将有效量的val-mCyd或其盐、酯、 前药，以及选择性的可药用载体进行给药。在选择性的实施方式中，val-mCyd被用于治疗 通过RNA依赖的RNA聚合酶来复制的病毒。
因此，第一种实施方式提供了具有式(I)的化合物，β-D-2′-C-甲基核糖呋喃基胞苷或 其可药用盐，以及该化合物在医学治疗中以及在制备治疗感染了包括HCV的黄病毒属或瘟 病毒属的宿主，特别是人类的药物中的用途。
化合物val-mCyd通过在胃肠黏膜、血液和肝脏内的脱酯化反应转变为母体mCyd，并 且在口服后从胃肠内腔通过在胃肠管道内黏膜中的氨基酸运输体作用(amino acid transporter function)而被有效地传送到血流中。因此，与主要通过核苷运输体作用运输的母体2′-支化 的核苷相比，在口服生物利用度上有所增加。并且与通过核苷运输体作用而不是氨基酸运输 体作用运输的其他的核苷或核苷类似物之间的竞争也减小了。由于在完全吸收之前的部分脱 酯化反应，缬氨酸的单或二酯继续通过氨基酸运输体作用而被吸收。因此，获得了更好的吸 收、生物利用度和与其他的核苷或核苷类似物之间的吸收入血流中的竞争的减小这样的极佳 的结果。
对感染了丙型肝炎的黑猩猩，val-mCyd在7天内使HCV RNA水平平均减少了0.83log10 copies/ml(8.3mg/kg/day)和1.05log10copies/ml(16.6mg/kg/day)。这些黑猩猩没有显示出与 药物相关的安全问题。
母体核苷(mCyd)结构可以β-D或β-L核苷形式存在。在一优选的实施方式中，可药 用化合物的给药形式是至少含90％的β-D对映体。在另一实施方式中，val-mCyd至少含95 ％的β-D对映体。缬氨酸酯也具有对映体形式。在一优选的实施方式中，缬氨酸部分至少为 90％的L-对映体。在另一实施方式中，缬氨酸部分至少为95％的L-对映体。在又一实施方 式中，化合物以作为外消旋混合物或以β-D或β-L母体核苷和L或D氨基酸加以利用。

                         式(I)
在一具体的实施方式中，式(I)化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨 酸酯·HCl盐。在另一具体的实施方式中，式(II)化合物，β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷 二盐酸盐，被用于对感染了黄病毒属或瘟病毒属感染的宿主，特别是人类的给药。在其他实 施方式中，提供了甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐，丙二酸盐，酒石酸盐，琥珀酸 盐，安息香酸盐，抗坏血酸盐，α-酮戊二酸盐，和α-甘油磷酸，甲酸盐，延胡索酸盐，丙酸盐， 乙醇酸盐，乳酸盐，丙酮酸盐，草酸盐，马来酸盐，水杨酸盐，硫酸盐，磺酸盐，硝酸盐，碳 酸氢盐，氢溴酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，碳酸盐和磷酸盐。

                         式(II)
在另一实施方式中，提供了一种药物组合物，其含有2′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-缬氨酸酯或 其可药用盐，包括单或二盐酸盐，酯，前药或其衍生物以及可药用载体，赋形剂或稀释剂。
在又一实施方式中，5′-羟基被5′-OR代替，其中，R是磷酸盐(包括单磷酸盐，二磷酸 盐，三磷酸盐或稳定化的磷酸盐前药)；酰基(包括低级酰基)；烷基(包括低级烷基)； 磺酸酯，其包括烷基或芳烷基磺酰基，所述烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺酰和卞基，其中， 苯基被一个或多个取代基选择性取代，所述取代基符合这里给出的芳基的定义；脂质，包括 磷脂；氨基酸；烃；肽；胆固醇；或其他可药用离去基团，这些离去基团当在体内给药后能 够提供R独立为H或磷酸盐的化合物。
本发明的活性化合物可以与其他能有效对抗包括HCV的黄病毒属或瘟病毒属(包括在 发明背景中描述或提到的)的其他制剂或其他有用的生物制剂联合给药或交替给药。因此， 另一主要的实施方式是药物组合物，其含有β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷-3′-O-L-缬氨酸酯 或可药用盐(包括单或二盐酸盐)，酯，前药或其可药用衍生物和一种或多种有效抗病毒制 剂，以及可选择的可药用载体或稀释剂。在另一实施方式中，提供了一种方法，即包括将 β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷-3′-O-L-缬氨酸酯或盐，酯，前药或其衍生物与一种或多种有 效抗病毒制剂，以及可选择的可药用载体或稀释剂联合或交替给药。
任何可以赋予期望的生物效应的第二种抗病毒制剂都可以选择。非限制性的例子包括： 干扰素，利巴韦林，白细胞介素，NS3蛋白酶抑制剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，菲醌，噻唑 烷衍生物，噻唑烷，N-苯甲酰苯胺，解旋酶抑制剂，聚合酶抑制剂，核苷类似物，胶霉毒素， 浅蓝菌素，反义硫代磷酸酯寡核苷酸，IRES-依赖翻译抑制剂或核酶。在一个具体实施方式 中，第二种抗病毒制剂选自：天然干扰素，干扰素α(包括干扰素-α-2a和干扰素-α-2b)，干 扰素β(包括干扰素β-1a)，ω干扰素，干扰素γ(包括干扰素γ-1b)，干扰素τ，和复合干扰素。 这些干扰素均可被稳定化或加以该性来提高耐受性和生物稳定性以及其他生物特性。常用的 一种改性是进行聚乙二醇化(用聚乙二醇该性)。在一个特定的实施方式中，第二种抗病毒 制剂是聚乙二醇化或未聚乙二醇化的干扰素2-α。
在又一实施方式中，活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-氨基酸酯，其中， 氨基酸可以是天然的或合成的，并可以为D或L立体构型。在另一实施例中，活性化合物 β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-乙酰基酯。
附图说明
图1a和1b表示了如实施例1中所描述的两种制备β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的 3′-O-L-缬氨酸酯二盐酸盐的方法。
图2为凝胶照片，其描述了如实施例9中所描述的通过位于RNA模板的特定鸟嘌呤残 基的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷三磷酸酯的体外RNA合成的位点特异性(cite-specific) 链终止。
图3是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的效价对BVDV感染的MDBK细胞传代数关系的 图片，其显示了如实施例10所述那样采用β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷(16μM)的持续 治疗，顽固的BVDV感染被彻底根除。箭头指示出退出药物治疗的部分的细胞的点。
图4a和4b是如实施例11中描述的被病毒持续感染的MDBK细胞中牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)的浓度的图。图中表明在降低病毒效价中，β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷与干扰 素α2b(IntronA)的协同作用。图4a是表示在持续感染的MDBK细胞中，β-D-2′-C-甲基- 核糖呋喃基胞苷与IntronA对BVDV(菌株NY-1)效价的影响的图。图4b是表示在持续感 染的MDBK细胞中，β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷与IntronA对BVDV(菌株I-N-dIns)效 价的影响的图。
图5a-d显示了研究对β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷治疗的实施例12中所述的感染了 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的MDBK细胞的抵抗性(resistance)的实验的结果。图5a是 显示了在持续感染的MDBK细胞中，用β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷或IntronA连续治疗 28天的效果的代表性实验的图表。图5b是一覆盖了感染的MDBK细胞的圆盘的图片，其 显示了由野生型BVDV(菌株I-N-dIns)的显型形成的聚点(foci)相对于抗β-D-2′-C-甲基- 核糖呋喃基胞苷的BVDV(I-N-dIns 107R)的大小，表明抵抗性的病毒形成了比野生型 I-N-dIns菌株小得多的聚点。图5c是描述在感染的MDBK细胞中，BVDV菌株I-N-dIns 或I-N-dIns 107R的效价随感染后的小时数变化的图表。图5d是描述在用Intron A治疗的de novo感染的MDBK细胞中，Intron A对BVDV病毒产生的影响的图表。
图6是表示在用如实施例13所描述的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸 酯治疗数天的单个黑猩猩中的丙型肝炎病毒的浓度(Log10)随时间变化的图表。
图7是表示在用如实施例13所描述的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸 酯治疗数天的单个黑猩猩中的丙型肝炎病毒的浓度(Log10)与基线的差别随时间变化的图 表。
图8是表示在实施例14中描述的当药物在人血浆中于4℃、21℃和37℃中温育 (incubation)后，随着时间的变化，残留在样品中的总的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的 3′-O-L-缬氨酸酯所占的比例的图表。
图9a是表示在实施例14中所描述的在用10μMβ-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷对HepG2 细胞进行温育后，β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷和β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基尿苷(mUrd) 的二和三磷酸酯衍生物的相对水平随时间变化的图表。图9b是表示在用10μMβ-D-2′-C-甲 基-核糖呋喃基胞苷对HepG2细胞进行温育后，β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的三磷酸酯衍 生物随时间衰减的图表。图9c是表示在增加药物的浓度(μM)的条件下，在用10μMβ-D-2′-C- 甲基-核糖呋喃基胞苷对HepG2细胞进行温育后，β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基尿苷(mUrd) 的二和三磷酸酯衍生物的浓度的图表。
图10是表示在实施例17中描述的对患者施用β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L- 缬氨酸酯后，人血清中β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的浓度(ng/ml)的图表。
图11是表示在实施例17中描述的对患者施于β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L- 缬氨酸酯后，人类患者中丙型肝炎病毒的效价的平均变化的图表。图中表明了由患者随访 (patient visit)得到的Log10HCV RNA与基线的变化。

已发现β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯(以下称为val-mCyd)对包括 丙型肝炎病毒在内的黄病毒属和瘟病毒属有极好的对抗性。基于此发现，提供了用于治疗包 括HCV的黄病毒科病毒的化合物、组合物、方法和用途，这包括了实施有效量的val-mCyd 或其盐、酯、前药或衍生物，也可以还有可药用载体。在另一实施方式中，val-mCyd被用 于治疗任何通过RNA依赖的RNA聚合酶的病毒的复制。
这些公开的化合物或它们的可药用衍生物或盐或可药用的含有这些化合物的配方 (formulation)在预防和治疗黄病毒科病毒(包括HCV)感染和其他相关疾病如抗-HCV抗 体阳性(anti-HCV antibody positive)和HCV-阳性疾病(HCV-positive conditions)以及与丙型 肝炎相关的肝癌(例如，肝细胞癌)和肝部肿瘤中是有用的。另外，这些化合物或剂型可被 预防性地用于预防和阻止抗-HCV(或更普遍的是抗-黄病毒科病毒)抗体或HCV-抗原或黄 病毒科病毒-抗原阳性的患者或暴露于HCV之下或其他黄病毒科病毒之下的患者的临床疾 病的发展。
综上所述，本发明具有以下特征：
(a)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯，其可药用前药，衍生物和盐， 具体包括单或二盐酸盐；
(b)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯，其可药用前药，衍生物和盐 在医学疗法中的应用，例如用于治疗黄病毒科病毒(包括HCV)感染的预防；
(c)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯，其可药用前药，衍生物和盐 在制备用于治疗黄病毒科病毒(包括HCV)感染的药物中的应用；
(d)药学制剂，含有β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯，其可药用 前药，衍生物和盐，以及可药用载体或稀释剂；
(e)制备β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯的方法；
(f)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯在治疗由通过RNA依赖的 RNA聚合酶复制的病毒引起的感染中的应用；
(g)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-缬氨酸酯在与其他抗病毒制剂联合或 交替实施用于治疗病毒感染中的应用。
在另一实施例中，活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-氨基酸酯，其中的 氨基酸可以是天然的或合成的，并且可以是D或L立体构型的。在又一实施方式中，活性 化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-酰基酯。本发明的化合物或者是具有抗病毒的 活性，或者是通过代谢转变为具有这种活性的化合物。
尽管不拘泥于理论，但体外药物作用机制(mechanism of action)研究表明mCyd是染色体 组的RNA复制的特异性抑制剂。并且，细胞内的5′-三磷酸酯部分，mCyd-TP，显示出对 NS5B RNA依赖的RNA聚合酶的直接抑制。对在mCyd-TP存在下的RNA合成的分析表明， mCyd-TP在RNA合成中起到链终止的作用，但其作用机理尚未得到确认。抗病毒核苷和核 苷类似物通常由细胞内的激酶转化为活性的代谢物5′-三磷酸酯(TP)衍生物。然后，核苷-TP 在病毒复制中通过抑制病毒聚合酶而表现出它们的抗病毒活性。在培养的细胞中，细胞内的 磷酸化作用将mCyd主要转化为活性型(species)mCyd-三磷酸酯(mCyd-TP)，并伴有较 少的mCyd-二磷酸酯。另外，还发现了第二种TP产物，2′-C-甲基-尿苷TP(mUrd-TP)，其 被认为通过细胞内的mCyd或mCyd-5′-磷酸酯型(species)的去氨基化而增加。
对本发明范围内的黄病毒属的一般性讨论可以在Fields Virology，Editors：Fields，.N.， Knipe，D.M.and Howley，P.M.；Lippincott-Raven Pulishers，Philadelphia，PA；Chapter 31(1996) 一书中找到。具体的黄病毒属病毒包括但不限于：Absettarov，Alfuy，Apoi，Aroa，Bagaza， 斑齐(Banzi)，Bouboui，Bussuquara，Cacipacore，凯里岛(Carey Island)，达喀尔蝙蝠(Dakar bat)，1型登革热(Dengue 1)，2型登革热(Dengue 2)，3型登革热(Dengue 3)，4型登 革热(Dengue 4)，Edge Hill，Entebbe蝙蝠(Entebbe bat)，Gadgets Gully，Hanzalova， Hypr，Ilheus，以色列火鸡脑膜脑炎(Israel turkey meningoencephalitis)，日本脑炎(Japanese encephalitis)，Jugra，胡蒂亚帕病毒(Jutiapa)，Kadam，Karshi，Kedougou，科科贝拉(Kokobera)， 库坦戈(Koutango)，Kumlinge，昆津(Kunjin)，库阿撒鲁尔森林病(Kyasanur Forest disease)， Langat，跳跃病(Louping ill)，Meaban，莫多克(Modoc)，蒙大拿脑白质炎(Montana myotis leukoencephalitis)，墨累谷脑炎(Murray valley encephalitis)，Naranjal，勒格西(Negishi)， 恩他耶(Ntaya)，鄂木斯克出血热(Omsk hemorrhagic fever)，金边蝙蝠(Phnom-Penh bat)， 玻瓦桑(Powassan)，里奥布拉沃(Rio Bravo)，罗西奥(Rocio)，皇家农场(Royal Farm)， 俄罗斯春夏型脑炎(Russian spring-summer encephalitis)，萨波亚(Saboya)，圣路易士脑 炎(St.Louis encephalitis)，Sal Vieja，San Perlita，Saumarez Reef，塞匹克河(Sepik)，Sokuluk， Spondweni，斯特拉特福德(Stratford)，坦布苏(Tembusu)，秋列尼(Tyuleniy)，乌干 达S(Uganda S)，乌苏图河(Usutu)，威塞尔斯布隆(Wesselsbron)，西尼罗河(West Nile)， 雅温德(Yaounde)，黄热病(Yellow fever)和齐卡(Zika)。
对本发明范围内的瘟病毒属的一般性讨论也可以在Fields Virology(Id.)一书中找到。具 体的瘟病毒属病毒包括但不限于：牛病毒性腹泻病毒(“VDV”)、古典猪瘟病毒(“CSFV”， 也称之为猪瘟病毒)以及羊边界病病毒(“DV”)。
定义
这里使用的术语“烷基”，除非特别所指，是指饱和的直链、支链或环状的典型的C1 到C10的一级、二级或三级烃。具体包括CF3，CCl3，CFCl2，CF2CI，CH2CF3，CF2CF3，甲基，乙 基，丙基，异丙基，环丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，环戊基，异戊基，新 戊基，己基，异己基，环己基，环己基甲基，3-甲级戊基，2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁 基。该术语包括取代和未取代的烷基，特别包括卤化烷基，尤其特别是氟化烷基。可用于取 代烷基的部分的非限制性的例子选自由卤素(氟，氯，溴或碘)，羟基，氨基，烷氨基，芳 氨基，烷氧基，芳氧基，硝基，氰基，磺酸，硫酸盐，磷酸，磷酸盐或膦酸盐组成的组，可 以是未保护的，也可以是根据需要而保护的，这些对于本领域技术人员而言都是已知的，例 如在Greene，et al.， Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition， 1991一书中就有教导，该书在此引入作为参考。
这里使用的术语“低级烷基”，除非特别所指，是指C1到C4的饱和的直链、支链或环 状(例如，环丙基)的烷基，其包括取代和或未取代的形式。在本申请中除非特别所指，作 为烷基的合适的部分，以低级烷基为优选。同样的，作为烷基或低级烷基的合适部分，以未 取代的烷基或低级烷基为优选。
术语“烷氨基”或“芳氨基”分别指具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。
这里使用的术语“保护的”，除非特别所指，是指为了防止氧、氮或磷原子的进一步反 应或用于其他目的而加到它们上的的基团。多种氧和氮保护基对于有机合成领域的技术人员 而言是熟知的。
这里使用的术语“芳基”，除非特别所指，是指苯基，联苯基或萘基，优选苯基。该术 语包括取代的和未取代的两种情况。所述芳基可被任何被描述的基团取代，包括但不限于一 或多个选自卤素(氟，氯，溴或碘)，羟基，氨基，烷基氨基，芳基氨基，烷氧基，芳氧基， 硝基，氰基，磺酸，硫酸根，膦酸，磷酸根或膦酸根，其或者是未保护的，或者根据需要进 行保护的，这对于本领域技术人员而言是已知的，例如，Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991，中教导的那样。
术语“烷芳基”或“烷基芳基”指具有一个芳基取代基的烷基。术语芳烷基或芳基烷基 指具有一个烷基取代基的芳基。
在此使用的术语“卤代”分别具体包括氯，溴，碘和氟。
术语“嘌呤”或“嘧啶”碱基包括，但不限于腺嘌呤，N6-烷基嘌呤，N6-酰基嘌呤(其中 酰基是C(O)(烷基，芳基，烷基芳基，或芳基烷基)，N6-苄基嘌呤，N6-卤代嘌呤，N6-乙烯 基嘌呤，N6-乙炔型嘌呤，N6-酰基嘌呤，N6-羟基烷基嘌呤，N6-烷基氨基嘌呤，N6-硫代烷基 嘌呤，N2-烷基嘌呤，N2-烷基-6-硫代嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，5-氟代胞嘧啶，5-甲基胞嘧 啶，6-氮杂嘧啶，包括6-氮杂胞嘧啶，2-和/或4-巯基嘧啶，尿嘧啶，5-卤代尿嘧啶，包括 5-氟代尿嘧啶，C5-烷基嘧啶，5-碘代嘧啶，6-碘代嘧啶，2-Br-乙烯基-5-嘧啶，2-Br-乙 烯基-6-嘧啶，C5-苄基嘧啶，C5-卤代嘧啶，C5-乙烯基嘧啶，C5-乙炔型嘧啶，C5-酰基嘧啶， C5-羟基烷基嘌呤，C5-(酰)氨基嘧啶，C5-氰基嘧啶，C5-硝基嘧啶，C5-氨基-嘧啶，N2-烷基嘌 呤，N2-烷基-6-硫代嘌呤，5-氮杂胞苷基，5-氮杂尿嘧啶基，三唑并吡啶基，咪唑并吡啶基， 吡咯并嘧啶基，和吡唑并嘧啶基。嘌呤碱基包括，但不限于，鸟嘌呤，腺嘌呤，次黄嘌呤， 2，6-二氨基嘌呤，和6-氯代嘌呤。在必要或需要时，可以对碱基上的官能氧和氮进行保护。 本领域技术人员众所周知适当的保护基团，包括三甲硅烷基，二甲基己基甲硅烷基，叔丁基 二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基，三苯甲基，烷基和酰基，如乙酰基和丙酰基，甲 磺酰基，和对甲苯磺酰基。
术语“酰基”或“O-连接的酯”指具有式C(O)R’的基团，其中R’是直链，支链，或环 烷基(包括低级烷基)，氨基酸的羧酸盐残基，芳基包括苯基，杂芳基，烷基芳基，芳基烷基 包括卞基，烷氧基烷基，包括甲氧基甲基，芳氧基烷基如苯氧基甲基；或取代的烷基(包括 低级烷基)，芳基包括任选被氯，溴，氟，碘，C1至C4烷基或C1至C4烷氧基取代的苯基， 磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺酰基，单，二或三磷酸酯，三苯甲基或单甲氧基-三 苯甲基，取代的苄基，烷芳基，芳烷基包括苄基，烷氧基烷基包括甲氧基甲基，芳氧基烷基 如苯氧基甲基。所述酯中的芳基优选包含苯基。
在非限制性实施方式中，酰基包括乙酰基，三氟代乙酰基，甲基乙酰基，环丙基乙酰基， 环丙基羧基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，己酰基，庚酰基，辛酰基，新-庚酰基，苯乙酰 基，2-乙酸基-2-苯乙酰基，二苯乙酰基，α-甲氧基-α-三氟甲基-苯乙酰基，溴代乙酰基，2- 硝基-苯乙酰基，4-氯-苯乙酰基，2-氯-2，2-二苯乙酰基，2-氯-2-苯乙酰基，三甲基乙酰基， 氯二氟代乙酰基，全氟代乙酰基，氟代乙酰基，溴二氟代乙酰基，甲氧基乙酰基，2-噻吩乙 酰基，氯磺酰基乙酰基，3-甲氧基苯乙酰基，苯氧基乙酰基，叔-丁基乙酰基，三氯代乙酰 基，单氯-乙酰基，二氯代乙酰基，7H-十二氟-庚酰基，全氟-庚酰基，7H-十二-氟代庚酰基， 7-氯十二氟-庚酰基，7-氯-十二氟-庚酰基，7H-十二氟代庚酰基，7H-十二氟代庚酰基，九氟 -3，6-二氧杂-庚酰基，壬氟-3，6-二氧杂庚酰基，全氟代庚酰基，甲氧基苯甲酰基，甲基3-氨 基-5-苯基噻吩-2-羧基，3，6-二氯-2-甲氧基-苯甲酰基，4-(1，1，2，2-四氟-乙氧基)-苯甲酰基，2- 溴-丙酰基，ω-氨基辛酰基，癸酰基，正五癸酰基，硬脂酰基，3-环戊基-丙酰基，1-苯-羧基， O-乙酰基苦杏仁酰基，新戊酰基乙酰基，1-金刚烷-羧基，环己烷-羧基，2，6-吡啶二羧基， 环丙烷-羧基，环丁烷-羧基，全氟代环己基羧基，4-甲基苯甲酰基，氯甲基异噁唑基羰基，全 氟代环己基羧基，巴豆酰基，1-甲基-1H-吲唑-3-羰基，2-丙烯基，异戊酰基，1-吡咯烷羰基， 4-苯基苯甲酰基。
术语“氨基酸”包括天然存在和合成的α、β、γ或δ氨基酸，包括但不限于，在蛋白 中发现的氨基酸，即甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色 氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨 酸，赖氨酸，精氨酸和组氨酸。在一个优选的实施方案中，所述氨基酸是L-构型，但也可以 以D-构型使用。或者，所述氨基酸可以是丙氨酰，缬氨酰，亮氨酰，异亮氨酰，脯氨酰，苯丙 氨酰，色氨酰，甲硫氨酰，甘氨酰，丝氨酰，苏氨酰，半胱氨酰，酪氨酰，天冬酰胺酰，谷氨 酰胺酰，天冬氨酰，谷氨酰，赖氨酰，精氨酰，组氨酰，β-丙氨酰，β-缬氨酰，β-亮氨酰， β-异亮氨酰，β-脯氨酰，β-苯丙氨酰，β-色氨酰，β-甲硫氨酰，β-甘氨酰，β-丝氨酰，β- 苏氨酰，β-半胱氨酰，β-酪氨酰，β-天冬酰胺酰，β-谷氨酰胺酰，β-天冬氨酰，β-谷氨酰， β-赖氨酰，β-精氨酰或β-组氨酰的衍生物。
在此使用的术语“基本上不含有”或“基本上不存在”指在核苷组合物中包括重量比至 少为85％或90％，优选95％，98％，99％或100％的所述核苷的指定对映体。
同样地，术语“分离的”指在核苷组合物中包括重量比至少为85％，90％，95％，98％， 99％或100％的所述核苷。
在此使用的术语“宿主“指病毒在其中可复制的单细胞或多细胞生物体，包括细胞系和 动物，优选人。或者，所述宿主可携带一部分黄病毒基因组，其复制或功能可被本发明的化 合物改变。术语宿主具体指感染的细胞、用黄病毒基因组的全部或一部分转染的细胞和动物， 具体而言是灵长类(包括黑猩猩)和人。在大多数动物中应用本发明时，所述宿主是人患者。 然而，在某些适应症中，兽医也可以应用本发明(如用于黑猩猩)。
全文中使用的术语“可药用盐或前药″来描述核苷化合物的任何可药用形式(如酯，磷酸 酯，酯盐或相关基团)，在将上述所有这些形式施用于患者后，提供了所述的核苷化合物。 可药用盐包括那些衍生自可药用无机或有机碱和酸的盐。在众多制药领域众所周知的其它酸 中，适合的盐包括那些衍生自碱金属如钾和钠，碱土金属如钙和镁的盐。可药用前药指在宿 主体中被代谢如被水解或氧化以形成本发明化合物的化合物。前药的典型实例包括在所述活 性化合物的官能团部分具有生物学不稳定保护基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺 化、脱氨基、羟基化、脱羟基、水解、脱水、烷基化、脱烷基、酰化、脱酰基、磷酸化、脱 磷酸产生活性化合物的化合物。本发明的化合物具有抗黄病毒科病毒的抗病毒活性，或被代 谢以产生具有该活性的化合物。
I.活性化合物，其生理学上可接受的盐和前药
如上所述，用于治疗瘟病毒属病毒、黄病毒属病毒和丙型肝炎感染的方法和组合物包括 对受感染的宿主施于有效量的2′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-缬氨酸或其可药用盐、酯或前药。
在一个实施方式中，使用了式(I)化合物的盐酸盐。在另一实施方式中，优选使用式 (I)化合物的二盐酸盐。但是，活性化合物可以以任何盐或前药的方式给予接受者，只要 是能够提供直接的或间接的母体化合物或能自身显示出活性的物质。非限制性的例子是可药 用盐，其也可被成为“生理学上可接受的盐”，以及被烷化、酰化或以其他方式在5’-位或 在嘌呤或嘧啶碱基上进行了改性的的化合物，从而形成了“可药用盐”的形式。另外，改性 可以影响到化合物的生物活性，在某些情况下提高母体化合物的活性。关于对此的评价可以 通过制备盐或前药并根据在此描述的方法测试其抗病毒活性，或采取其他本领域技术人员习 知的方法进行。
在第一个主要的实施方式中，提供了式(I)化合物或其可药用盐或前药：

式(I)
应当理解的是，上式中包括了所有的立体异构形式、互变异构形式和多态形式的化合物。 2’-甲基取代也可以是其他烷基，如乙基、丙基或也可以是乙烯基。
在另一种实施方式中，活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-氨基酸酯，其 中的氨基酸可以是天然的或合成的，并且可以是D或L立体构型的。在又一实施方式中， 活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-酰基酯。
在另一选择性的实施方式中，5’-羟基被5’-OR代替，其中，R是磷酸酯(包括单磷酸酯、 二磷酸酯、三磷酸酯或稳定的磷酸酯前药)；稳定的磷酸酯前药；酰基(包括低级酰基)； 烷基(包括低级烷基)；磺酸酯，其包括烷基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基，以及卞基， 其中，苯基是可被一个或多个具有这里给出的芳基定义的取代基取代；脂质，包括磷脂；氨 基酸；碳水化合物；肽；胆固醇；或其他可药用离去基团，这些离去基团当在体内给药后能 够提供R独立为H或磷酸盐的化合物。
II.活性化合物的合成
本发明的化合物可以通过已知的方法进行合成。例如，在一个实施方式中，制备了核苷、 核苷类似物、或其盐、前药、立体异构体或互变异构体，其在2’C上发生了双取代。在另一 实施方式中，制备了具有作为活性核苷的意义或可用作过程中间体的β-D-2′-C-甲基-胞苷(4- 氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-C-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在又一实施方式 中，制备了β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基 -4-甲基-2-羟甲基-四氢-呋喃-3-基酯)的3’-O-缬氨酸酯或其盐酸盐形式。制备的核苷、核苷 类似物、盐、或酯类前药可用作在制备大量的其他核苷类似物中的中间体，也可以直接用作 抗病毒和/或抗肿瘤制剂。
实施例1：β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷-3′-缬氨酸酯的合成
在一种合成方法中，如在图1a中所示，合成包括：将胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈与1，2， 3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖( 1)反应，形成4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧-5-二苯甲酰 氧甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮( 2)；以及将( 2)与NaOMe/MeOH反应，提供 4-氨基-1-(3，4-二氢-5-羟甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮( 3)，也可叫作2-C-甲基-β -D-呋喃核糖。不使用苯甲酰胞嘧啶而使用胞嘧啶作为起始原料改善了方法的“原子经济 (atom economy)”并简化了后续步骤中的纯化操作。
本方法中的下一个步骤包括将( 3)与Me2NCH(OMe)2在DMF中反应，形成( 4)，N[1-(3， 4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒，其是 ( 3)的氨基-保护的形式；将( 4)与TBDPSCl和咪唑在DCM中反应，得到( 4)的5′-甲硅烷基保 护的形式，即N′-{1-[5-叔丁基-二苯基-硅烷氧甲基]-3，4-二羟基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基}-2-氧 -1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒( 5)，其中，使用DCM的优点是对二甲硅烷基副产物 的形成具有更好的控制；将( 5)与N-Boc-L-缬氨酸，EDC和DMAP在DCM中于室温下反应， 形成2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧甲基)-5-[4-(二甲氨基-亚甲 基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢-呋喃-3-基酯( 6)；将( 6)与NH4F在MeOH中 在约10摩尔当量的乙酸乙酯存在下反应，在防止3’-O-缬氨酸酯被产生的氨切断的条件下， 除去甲硅烷基和氨基保护基，回流混合物得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2- 氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢-呋喃-3-基酯( 7)；最后，将( 7)与HCl在EtOH中反应得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢- 呋喃-3-基酯，二盐酸盐( 8)，作为最终产物。
选择性合成
在合成本发明化合物的另一方法中，如图1b所示，将苯甲酰胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙 腈与1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖( 1)反应，形成4-苯甲酰-1-(3，4-二苯甲酰氧 -5-苯甲酰氧甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮( 2a)；将( 2a)与NH3在MeOH中反应， 并用色谱分离产物4-氨基-1-(3，4-二氢-5-羟甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮( 3)， 也可叫作2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。将( 3)与Me2NCH(OMe)2在DMF中于室温下反应1.5 小时，形成( 4)，N[1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4- 基]-N，N-二甲基-甲脒；将( 4)与TBDPSCl和嘧啶于室温下反应6小时，得到N′-{1-[5-叔丁基 -二苯基-硅烷氧甲基]-3，4-二羟基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基}-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二 甲基-甲脒( 5)；将( 5)与N-Boc-L-缬氨酸，EDC和DMAP在THF/DCM中于室温下反应两天， 并将在该反应中形成的产物通过HPLC，得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基- 二苯基-硅烷氧甲基)-5-[4-(二甲氨基-亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢-呋 喃-3-基酯( 6)；将( 6)与NH4F在MeOH中回流约3小时，除去甲硅烷基和氨基的保护基，并 将产物进行色谱纯化，得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1- 基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢-呋喃-3-基酯( 7)；最后，将( 7)与HCl在EtOH中于室温下反 应得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢-呋喃 -3-基酯，二盐酸盐( 8)，作为最终产物。
实施例2：2′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-缬氨酸酯(VAL-mCyd)的合成
                          流程1

步骤1：化合物9的合成：2-C-甲基-D-核糖-γ-内酯
在配备了悬挂式搅拌器、搅拌轴、数字温度读出装置和氩气线的250mL 3口圆底烧瓶中 搅拌去离子水(100mL)。向水中鼓入氩气30分钟，然后加入D-果糖(20.0g，0.111mol)， 溶液在几分钟内变清。在5分钟内分次加入氧化钙(12.5g，0.223mole)，并对混合物进行激烈 地搅拌。观察到放热，从开始加入氧化钙10分钟后，反应温度上升到39.6℃。经过约15 分钟，反应物变为黄色，并且颜色随着时间而加深。3小时后，取样用于TLC分析。用草酸 的饱和水溶液将取样酸化到pH2。所得的白色悬浮液在减压蒸馏下除去水。加入甲苯(2mL) 到残余物中并将混合物进行减压蒸馏(45-50℃)，以除去任何残留的水。再将残留固体溶 于2mL 1∶1的四氢呋喃：甲醇混合物中。充分混合后，使悬浮液静置，浮在表面的清澈的溶 液用于进行薄层色谱(TLC)(二氧化硅片在含2％甲醇的乙酸乙酯中展开，浸入1％的碱 性高锰酸钾中着色。然后用热气枪加热板，直到在粉色背景中出现黄色的斑点)。在上述条 件下，期望的内酯通常出现在Rf值为0.33之处。极性更强的副产物和未反应的物质在Rf 值为0.0到0.2的范围内被检测到。
尽管在3小时后观察到产物的生成，反应仍继续22小时，其间，对反应混合物在25℃ 加以搅拌。在该期间结束之际，混合物的pH为13.06。向反应混合物中鼓入二氧化碳气约 2.5小时(pH为7.25)。形成的碳酸钙固体通过真空过滤除去，滤饼用50mL的去离子水清 洗。合并水层并用草酸(5.0g，0.056mole)处理，对混合物在25℃剧烈搅拌30分钟(起始时 的深色基本消失，混合物变为奶白色的浆液)。在此阶段的混合物的pH通常为2-3。浆液 混合物在45-50℃搅拌过夜。然后将混合物在45-50℃下减压蒸馏，除去75mL的水。向 水性浆液中加入氯化钠(30g)和四氢呋喃(100mL)，对混合物在25℃剧烈搅拌30分钟。分 离各层，并向水层中加入75mL的新鲜的四氢呋喃，搅拌10分钟。重复该过程3次，合并 四氢呋喃溶液并加入10g无水硫酸镁搅拌30分钟。过滤混合物，硫酸镁滤饼用60mL的四 氢呋喃洗。将滤液在40℃减压蒸馏，得到10.86g呈深橙色半固体状的粗产物。(当提高 生产规模时，四氢呋喃将被丙酮替代，这样不用通过蒸馏来使粗产物干燥)。粗产物用丙酮 (20mL)在20℃搅拌3小时。通过真空过滤收集产物，并用12mL的丙酮洗滤饼，得到 目标产物9，其为白色结晶的固体。真空下干燥产物，得到2.45g(产率13.6％)。化合物9 的熔点为158-162℃(文献值：160-161℃)。′H NMR(DMSO-d6)δppm5.69(s，1H，用D2O 交换)，5.41(d，1H，用D2O交换)，5.00(t，1H，用D2O交换)，4.15(m，1H)，3.73(m，2H)，3.52 (m，1H)，1.22(s，3H).13C NMR(DMSO-d6)δppm176.44，82.95，72.17，72.02，59.63，20.95。 (C6H10O5；计算值：C，44.45；H，6.22。实测值：C，44.34；H，6.30)。
步骤2：化合物10的合成：2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖-γ-内酯
将内酯1(3.0g，18.50mmol.)、4-二甲基氨基吡啶(0.45g，3.72mmol.)和三乙氨(25.27g， 249.72mmol.)在1，2-二甲氧基乙烷(50mL)中的混合物在25℃下、氩气氛中搅拌30分钟。 将该白色悬浮液冷却到5℃，在15分钟内加入苯甲酰氯(11.7g，83.23mmol.)。再将混合物 在25℃搅拌两小时。TLC分析(二氧化硅片，含2％甲醇的乙酸乙酯)表明起始原料已全 部消耗。向反应混合物中加入冰水(100g)，继续搅拌30分钟。通过真空过滤收集形成的白 色固体，滤饼用冷水(50mL)洗。将该粗产物在叔丁基甲醚(60mL)中于20℃搅拌30分钟， 然后过滤，滤饼用叔丁基甲醚(25mL)洗冰真空干燥得到7.33g(产率83.4％)的化合物10，其 我白色固体，纯度97.74％(HPLC/AUC)。化合物10的熔点为137-140℃(文献值：141-142℃)。 1H NMR(CDCl3)δppm8.04(d，2H)，7.92(d，2H)，7.73(d，2H)，7.59(t，1H)，7.45(M，4H)，7.32 (t，2H)，7.17(t，2H)，5.51(d，1H)，5.17(m，1H)，4.82-4.66(d，(AB四重峰)，2H)，1.95，(s，3H).13C NMR(CDCl3)δppm172.87，166.17，166.08，165.58，134.06，133.91，133.72，130.09，129.85， 129.80，129.37，128.78，128.60，128.49，127.96，127.89，79.67，75.49，72.60，63.29，23.80。TOF MSES+(M+1：475)。
步骤3：化合物11的合成：2，3，5-三-O-苯甲酰2-C-甲基-β-D-呋喃核糖
将Red-Al(65wt.％，甲苯中，2.0mL，6.56mmol.)在无水甲苯(2.0mL)中的溶液于0℃在 氩气气氛中搅拌。在5分钟内，将无水乙醇(0.38mL，6.56mmol.)在无水甲苯(1.6mL)中的溶 液加入到甲苯溶液。所得混合物在0℃搅拌15分钟，将2mL(2.18mmol.)的该Red-Al/乙醇 试剂在10分钟内加入到冷的(-5℃)2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖内酯 2(475mg，1.0 mmol.)在无水甲苯(10mL)的溶液中。在-5℃搅拌该反应混合物40分钟。TLC分析(二氧 化硅片，含2％甲醇的乙酸乙酯)表明起始原料已全部消耗。HPLC分析表明只有0.1％的起 始原料剩余。在0℃用丙酮(0.2mL)、水(15mL)和1N HCI(15mL)使反应结束，并升温到 室温。加入1N HCI(5mL)溶解无机盐(pH：2-3)。混合物用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，用盐水 (25mL)洗有机溶液，干燥(无水硫酸钠，10g)，40℃减压除去溶剂，得到目标产物11， 定量产率(480mg)。该物质用于后面的步骤。
步骤4：化合物12的合成：1，2，3，5-四-O-苯甲酰2-C-甲基-β-D-呋喃核糖
向化合物11(480mg，1.0mmol)，4-二甲基氨基吡啶(12.3mg，0.1mmol)和三乙胺(506mg， 5.0mmol)在无水四氢呋喃(5mL)中的冷溶液(5℃)中，加入苯甲酰氯(283mg，2.0mmol)。反 应混合物在室温氩气氛围下搅拌过夜。HPLC分析表明有0.25％的未反应的起始原料。加入 冰冷水(10g)和饱和碳酸氢钠水溶液结束反应。减压下除去四氢呋喃，用乙酸乙酯(50mL)萃 取混合物。用水(25mL)、盐水(25mL)洗有机溶液，干燥(无水硫酸钠，12g)，减压下 除去溶剂得到650g厚重的油状产物。该粗产物用5mL叔丁基甲醚搅拌5分钟，再加入庚烷 (5mL)和水(0.1mL)，继续在20℃下搅拌2小时。通过真空过滤收集固体，滤饼用1∶ 1的庚烷：叔丁基甲醚溶液(6mL)和叔丁基甲醚(2mL)洗。真空下干燥固体，得到300mg (52％)的目标产物12(HPLC/AUC测定的纯度未98.43％)，其为白色固体，在154-156.3 ℃熔化(文献值记载的熔点：155-156℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.13(m，4H)，8.07(d，2H)， 7.89(d，2H)，7.63(m，3H)，7.48(m，6H)，7.15(m，3H)，7.06(s，1H)，5.86(dd，1H)，4.79(m，1H)， 4.70-4.52(d，AB四重峰，2H)，1.95，(s，3H)。13C NMR(CDCl3)δppm166.31，165.83，165.01， 164.77，134.01，133.86，133.70，133.17，130.44，130.13，129.97，129.81，129.59，129.39，129.07， 128.84，128.76，128.37，98.01，86.87，78.77，76.35，64.05，17.07。(C34H28O9：计算值C，70.34； H，4.86。实测值：C，70.20；H，4.95)。
                          流程2

步骤5：化合物13的合成：4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基-5-苄氧基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H- 嘧啶-2-酮
在配备了回流冷凝器、悬挂式搅拌器和氩气入口转接器的12L的圆底烧瓶中，将胞嘧啶 (89g，0.80mol)悬浮于乙腈(900ml)中。在20℃氩气氛围中搅拌该悬浮液，并加入一部分N， O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(537ml，2.2mol)。所得溶液加热到80℃并在相同温度下继续 搅拌1小时。将1，2，3，5-四-O-苯甲酰2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(425.0g，0.73mol)悬浮于乙腈 (4000ml)中并加入到反应混合物中。几分钟后反应混合物变得清澈，温度降到约50℃。在 15分钟内加入氯化锡(IV)(154ml，1.31mol)并继续在80℃搅拌。一小时后，加入碳酸氢钠水 溶液使反应混合物的等分试样结束反应，并用乙酸乙酯萃取水层。用TLC(硅胶，20％乙酸 乙酯的庚烷溶液，糖衍生物的Rf为0.40)检查乙酸乙酯层。TLC分析表明糖衍生物被完全 消耗。目标产物用TLC使用10％的甲醇的二氯甲烷溶液(Rf为0.37)进行检测。反应还用 HPLC(方法#2)进行监控。反应混合物冷却到20℃并在30分钟内加入饱和碳酸氢钠水溶 液(3000ml)结束反应(当滴入头几滴碳酸氢钠溶液时即观察到勒放热)。分次加入固体碳酸 氢钠(1350g)以避免起泡。确认混合物的pH大于等于7。停止搅动，使之分层20分钟。放 出水层与乙酸乙酯(1500ml)搅拌，使混合物分层(30分钟)。分离有机层与乙腈溶液合并。 有机溶液用盐水(500ml)洗，然后除去溶剂至约750ml。产物可被直接用于后面的反应。 此外耶可以进一步除去溶剂得到白色泡沫状固体获得定量产率。化合物10的结构通过1H NMR分析得到了确认。
步骤6：化合物mCyd的合成：4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基-1H-嘧 啶-2-酮
向化合物10(416g，0.73mol)在甲醇(2000ml)溶液中，加入甲醇钠(13.8g，0.26mol)。反应 混合物在室温搅拌并用TLC监控(硅胶，10％的甲醇的二氯甲烷溶液，化合物9的Rf为0.53) 和(硅胶，30％的甲醇的二氯甲烷溶液，化合物11的Rf为0.21)。30分钟后产物开始沉淀， TLC表明反应在2小时后完成。反应还用HPLC(方法#2)进行监控。减压下除去甲醇至 体积为约500ml，接着加入750ml的乙醇，在20℃搅拌混合物1小时。过滤收集产物，滤饼 用乙醇(100ml)和叔丁基甲醚(100ml)洗，干燥，得到168g的产物11(两步的产率为90％)， 纯度大于97％(HPLC/AUC)。产物还用1H NMR和13C NMR进行了分析。
步骤7：化合物14的合成：2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4- 羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢-呋喃-3-基酯
对在2L圆底烧瓶中的N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酸(46.50g，214mmol.)，羰基二咪唑(34.70 g，214mmol)和无水四氢呋喃(1000mL)中的溶液在25℃氩气氛围中搅拌1.5小时，然后再在 40-50℃下搅拌20分钟。在一配备了悬挂式搅拌器、冷却塔、温度检测器、加料漏斗和氩 气线的分离式5L的5口圆底烧瓶中，加入4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢-呋喃 -2-基-1H-嘧啶-2-酮(50.0g，195mmol)和无水N，N-二甲基甲脒(1000mL)。将该混合物在100 ℃加热20分钟，直到所有的嘧啶-2-酮衍生化合物都进入到溶液中，然后，向溶液中加入三 乙胺(500mL)和4-二甲基氨基吡啶(2.38g，19mmol)。然后混合物在97℃加热20分钟，缓 慢通过加料漏斗在2小时内加入四氢呋喃溶液，保持温度不低于82℃。反应混合物在82℃ 加热1小时并用HPLC监控(产物＝68％，SM＝11％，在大约12分钟时的纯度＝17％，不含 二甲基氨基吡啶)。反应混合物冷却到室温，然后在30℃下真空除去三乙胺和四氢呋喃。 溶液再用乙酸中和，使pH为7.69。在35℃下真空除去N，N-二甲基甲脒，随后加入乙酸乙 酯(2×200mL)。粗产物与乙酸乙酯(500mL)和水(300mL)搅拌。分成两层，水层用乙酸乙酯 (500mL)萃取。合并的有机层用饱和盐水溶液(500mL)洗。然后，有机层用丙二酸(4×400mL， 10wt.％)水溶液萃取。用TLC(硅胶，20％的甲醇的二氯甲烷溶液)检测有机层，以确保所 有的目标产物都从有机层中除去。合并酸性萃取物并在冰水浴中冷却，用三乙胺中和到pH 为7.40，析出固体。然后，向水层中加入乙酸乙酯。真空过滤收集白色固体。真空干燥所得 固体，得到81.08g纯度99.01(HPLC)的首次产物。
步骤8：val-mCyd-2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2羟基-甲基-4- 甲基-四氢-呋喃-3-基酯(二盐酸盐)的合成
在配备了悬挂式搅拌器、温度检测器、氩气线和氯化氢气体鼓泡口的圆底烧瓶中，搅拌 化合物14(21.0g，0.046mol)在乙醇(168ml)中的溶液。氯化氢气体(22g)被鼓入清澈的溶液中 1小时。用冰水浴将反应温度保持在30℃。当引入氯化氢气体几分钟后开始形成固体。4 小时后，HPLC(方法#3)表明仅有0.8％的起始原料。过滤收集固体，滤饼用乙醇(20ml) 和二乙醚(100ml)洗。真空干燥产物16小时后，获得19.06g(96.5％)的val-mCyd，纯度为 97.26％HPLC(方法#3)；m.p.210℃(棕色)，248-250℃(熔化)；1H NMR(DMSO-D6)δppm 10.0(s，IH，1/2NH2，D2O可交换)，8.9-8.6(2 br s，4H，1/2NH2，NH3，D2O可交换)，8.42(d，1H， H-6，J5-6＝7.9Hz)，6.24(d，1H，H-5，J5-6＝7.9Hz)，5.84(s，1H，H-1′)，5.12(d，1H，H-3′，J3′-4′-＝8.8 Hz)，4.22(d，1H，H-4，J3′-4′＝8.7Hz)，4.0-3.9(m，1H，CH)，3.8-3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.3-2.1(m， 1H，CH)，1.16(s，3H，CH3)，1.0(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＞0(GT)713(2M+H)+，449(M+G+H)+， 357(M+H)+，246(S)+，112(B+2H)+；FAB＜0(GT)747(2M+Cl)-，483(M+G+CI)-，391(M+Cl)-， 355(M-H)-，116(VAL)-，110(B)-，35(Cl)-。
两种不同的HPLC方法被用来分析上述化合物。两种方法均使用了反相色谱柱：
方法1
按如下所述进行HPLC分析：254nm，乙腈/水线性梯度洗脱，流速1.00ml/min。运行时 间20分钟。各次操作间隔5分钟到达平衡。
表1：重要中间体的保留时间： 化合物  保留时间 化合物10  10.2分钟 化合物11  9.4分钟 化合物12  12.9分钟
方法2
检测波长272nm。色谱柱采用Waters Novapak C18，3.9×150mm ID，4μm的颗粒尺寸， 60_的孔尺寸或与其等同。色谱条件如下：注射体积＝10μl，柱温＝25℃，流速＝1.00ml/min， 紫外检测器检测波长为272nm，运行时间35分钟。对相对标准偏差与参考标准的百分比的 系统适应性要求小于1.0％。
表2a：纯净物和杂质在272nm进行检测：  时间(分钟) 乙酸缓冲液 HPLC级  0.00  100.0  0.0  10.00  85.0  15.0  25.00  5.0  95.0  35.0  5.0  95.0
表2b：重要中间体和最终药物物质的保留时间 化合物 保留时间(分钟) 化合物mCyd  2.7-2.8 化合物14  15.5 val-mCyd  9.1
立体化学
应意识到本发明的核苷具有多个手性中心并能够以旋光体和外消旋体形式存在和被分 离。一些化合物具有同质多晶现象。应理解的是本发明包含本发明化合物的任何的外消旋体、 旋光体、非对映体、多晶型物、或立体异构体，或它们的混合物，它们都具有在此所描述的 用途。在本领域众所周知如何制备旋光体(例如，通过重结晶技术拆分外消旋体，通过从旋 光性起始原料合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相的色谱分离)。
具体而言，因为核苷的1′和4′碳是手性的，至于糖环系统，它们的非氢取代基(分别是， 碱基和CHOR)可以是顺式(在同侧)或反式(在对侧)。因此，四个光学异构体表示为如 下构型(当糖部分定向于水平面时，使得氧原子位于后面)：顺式(两个基团位于“上方”， 相应于天然存在的β-D核苷的构型)，顺式(两个基团位于“下方”，相应于天然存在的 β-L核苷的构型)，反式(C2′取代基位于“上方”和C4′取代基位于“下方”)，和反式(C2′ 取代基位于“下方”和C4′取代基位于“上方”)。“D-核苷”在天然构型中是顺式核苷而 “L-核苷”在非天然存在的构型中是顺式核苷。
同样地，大多数氨基酸也是手性的(指定为L或D，其中L对映体是天然存在的构型) 和能以分离的对映体存在。
获得旋光性原料的方法的实例是本领域公知的，并包括至少如下方法：
i) 晶体的机械拆分法-在该技术中，通过人工分离单独的对映体的肉眼可见晶体。 如果分离的对映体的晶体存在，，即，原料是聚结体，和晶体在视觉上可区别，则可使用该 技术；
ii) 同时结晶法-在该技术中，各对映体分别从外消旋体溶液中结晶，只有在后者 在固体状态下是凝结体的情况下才由可能；
iii) 酶拆分法-在该合成技术中，通过对映体与酶的反应速度的不同，部分或全部 地分离外消旋体；
iv) 酶不对称合成法-在该合成技术中，合成过程中的至少一步使用酶反应来获得 异构纯的或富集的期望的对映体的合成前体；
v) 化学不对称合成法-在该合成技术中，通过使用手性催化剂或手性助剂来达到 在产物中产生不对称(即，手性)的条件下从手性前体合成期望的对映体；
vi) 非对映体拆分法-在该技术中，外消旋化合物与对映纯试剂(手性助剂)反应 将各对映体转变为非对映体。产生的非对映体接着根据具有的更截然不同的结构差异通过色 谱或结晶而被分离，随后将手性助剂除去以获得期望的对映体；
vii) 一级和二级非对称转化法-在该技术中，外消旋物中的非对映体达到平衡，从 而从期望的对映体产生溶液中占优势的非对映体，或者，在期望的对映体中的非对映体的占 优的结晶微扰了该平衡，使得最后所有的原料基本上都从期望的对映体转变为结晶的非对映 体，然后，期望的对映体从非对映体中释放出；
viii) 动力学拆分法-该技术是指，利用在动力学条件下，对映体和手性、非外消旋 试剂或催化剂反应具有不同反应速率，来获得对外消旋体的部分或完全的拆分(或对部分拆 分的化合物的进一步拆分)；
ix) 从非外消旋前体起始的对映特异性合成法-在该合成技术中，从非手性起原料 获得期望的对映体，并且，在合成过程中，其立体化学完整性未受到或仅仅受到最低程度的 危害。
x) 手性液相色谱法-在该技术中，外消旋体的对映体在液体流动相中根据它们与 固定相具有不同的相互作用而被分离。该固定相可以由手性原料制成或该流动相可含有额外 的手性原料以诱导不同的相互作用；
xi) 手性气相色谱法-在该技术中，通过外消旋体和对映体在气体流动相中与含有 固定的非外消旋手性吸收相具有不同的相互作用，外消旋体挥发且对映体被分离；
xii) 手性溶剂萃取法-在该技术中，通过在一种特定的手性溶剂中选择性溶解一种 对映体而分离对映体的技术；
xiii) 手性膜贯穿拆分法-在该技术中，将外消旋体与薄隔离膜接触。该隔离膜通常 将两种互溶液体分开，一种含有该外消旋体，这种分离利用浓度差或压力差等驱动力促使对 隔离膜选择性通过而进行。由于该膜利用了仅允许一种外消旋体的对映体通过的特性，从而 分离产生了非外消旋手性体。
III.药物组合物
通过可药用载体或稀释剂存在的条件下给患者施用有效量的活性化合物或可药用前药 或它们的盐，可治疗被瘟病毒、黄病毒、HCV或具有任何其它在此描述的病症或通过RNA 依赖的RNA病毒聚合酶复制的其它生物体感染的宿主包括人，，或达到治疗任何在此描述 的病症的目的。所述活性物质可以通过任何适当的途径，例如，经口、肠胃外、静脉、经皮、 皮下或局部，以液体或固体形式施用。
对于瘟病毒，黄病毒或HCV感染而言，所述化合物的优选剂量约为每公斤体重每天1- 50mg，优选1-20mg，更通常为患者每公斤体重每天0.1-约100mg。优选更低的剂量，例 如每公斤体重每天0.5-100mg，0.5-50mg，0.5-10mg或0.5-5mg剂量。甚至更低的剂量也 是有效地，因此该范围可包括每公斤体重每天0.1-0.5mg。可药用盐和前药的有效剂量范围 可基于待释放的母体核苷的重量来计算。如果所述盐或前药本身具有活性的话，那么可以如 上述用所述盐或前药的重量或通过本领域技术人员已知的其他方法估计有效剂量。
所述化合物可以任何适当剂量单位方便地予以施用，包括但不限于每剂量单位中含有 7-3000mg，优选70-1400mg活性化合物。50-1000mg的口服剂量通常很方便，包括以50， 100，200，250，300，400，500，600，700，800，900或1000mg的一种或多种剂量。优 选更低的剂量，例如10-100或1-50mg。预期的剂量也可为0.1-50mg或0.1-20mg或0.1-10.0 mg。此外，在通过非口服途径，如通过注射或吸入的情况下，可使用更低的剂量。
理想的是以下面方式施用的活性成分，即使该活性化合物的血浆峰值浓度约为0.2-70μ M，优选约1.0-10μM。该目标可通过如静脉注射0.1-5％活性成分的溶液，任选为盐溶液， 或以施用活性成分的药丸来达到。
药物组合物中活性化合物的浓度取决于该药物的吸收、失活和排泄率，也取决于其它本 领域技术人员公知的因素。应注意的是剂量也应随着要缓解的疾病的严重性而有所变化。同 时还应该理解，对于任何特定的患者而言，特定的给药方案应该根据个体的需要和施用或监 督该组合物给药的人员的专业判断而随时进行调整，而且前述的浓度范围仅仅是示例性的， 并不意欲限制所要求保护的组合物的范围或实施。可以是一次性施用所述活性成分，也可以 将其分为数个小剂量以不同的时间间隔施用，并且可以有也可以没有抗病毒制剂。
所述活性化合物的优选给药方式为经口给药。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用 的载体。可以将其装入明胶胶囊中，也可以将其压制成片剂。用于经口给药治疗时，可将活 性化合物与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。组合物中也可以加入药学上可配伍 的粘合剂、和/或佐剂。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何下列成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤 维素、黄芪胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂 如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷油， 水杨酸甲酯或橙类调味剂(orange flavoring)。当所述单位剂型为胶囊时，除上述类型物质 外，还可含有液体载体如脂肪油。此外，单位剂型还可含有各种可改变该剂型的物理形式的 其他物质，例如糖包衣物、虫胶或其他肠包衣剂。
也可以将所述化合物作为酏剂、悬浮剂、糖浆剂、干胶片剂、咀嚼胶等组分施用。除所 述活性成分外，糖浆剂可含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂及调味剂。
也可以将所述化合物或其可药用前药或盐与其他不影响它们的期望作用的活性物质、或 者与能补充该期望作用的物质混合，这些物质如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂或其他抗病毒剂， 包括其他的核苷化合物。用于肠胃外、皮内、皮下或局部使用的溶液或悬浮液可包括如下组 分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合 成溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂 如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节浸透压的试剂，如氯 化钠或葡萄糖。母体制剂可装入安瓿、一次性注射器或多剂量的玻璃或塑料小瓶中。
如果通过静脉注射给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)。
在一个优选实施方案中，将所述活性化合物与可保护该化合物不从体内快速消除的载体 一起制备为制剂，这些载体如控释制剂，包括植入物和微囊递药系统。可以采用可生物降解 的和生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。 对于本领域技术人员而言，制备此类制剂的方法是显而易见的。上述物质可购自Alza Corporation。
脂质体悬浮剂(包括靶向侵染细胞的具有病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也是优选的可 药用载体。可以根据本领域技术人员已知的方法，如描述于美国专利第4,522,811号(在此 全文一并引入作为参考)的方法，制备这样的制剂。例如，通过将适当的脂质(如硬脂酰磷 脂乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、arachadoyl磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于无机溶剂中，然后蒸发 并在容器表面形成干燥的脂质薄膜以制备脂质体制剂。随后向容器中加入所述活性或其单磷 酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液。接着用手旋转容器使脂质物质与容器表面 脱离并使脂质聚集体分散，由此形成脂质体悬浮剂。
IV.前药和衍生物
盐的形式
将核苷以可药用盐的形式施药在本发明的范围之内。可药用盐的例子有与酸形成的有机 酸加成的盐，其提供生理学上可接受的盐。包括如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸 盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷 酸、甲酸盐、延胡索酸盐、丙酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、马来酸盐、水 杨酸盐。另外，也可形成适当的无机盐，包括硫酸盐、磺酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐、氢溴酸 盐、碳酸盐和正磷酸盐。一个特别优选的实施方案是单或二盐酸盐。
采用本领域众所周知的标准方法，例如通过使具有足够碱性的化合物如胺与提供生理上 可接受的阴离子的适合的酸反应，可以获得可药用盐。也可以获得羧酸的碱金属(例如，钠、 钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。在一实施方案中，所述的盐是该化合物的盐酸盐。在另 一个实施方案中，所述的可药用盐是式(1)化合物的二盐酸盐。本发明的化合物具有抗黄 病毒、瘟病毒或HCV的抗病毒活性，或者经代谢而称为显示该活性的化合物。
核苷前药
在此描述的核苷可以核苷酸前药形式施用以增加核苷的活性、生物利用度、稳定性或通 过其他方式改变所述核苷的性质。已知有许多核苷酸前药配体。一般而言，对所述核苷的单、 二或三磷酸酯进行烷基化、酰化或其它亲脂性修饰能减少其极性并进入细胞。在磷酸酯部分 能取代一或多个氢的取代基的实例是烷基、芳基、甾族化合物、碳水化合物包括糖、1，2-二 酰基甘油和醇类。许多在R.Jones and N.Bischoferger，Antiviral Research，1995，27：1-17中被 描述。其中任何一种均可以与在此公开的核苷联合使用以获得期望的效果。
所述活性核苷也可以以5′-磷酸醚醚脂或5′-醚脂的形式提供。非限制性实例在包括下述 的参考文献(其在此一并引入作为参考)中被描述：Kucera，L.S.，N.Iyer，E.Leake，A.Raben， Modest E.K.，D.L.W.，和C.Piantadosi.1990.“抑制HIV-1感染产生并诱导缺陷型病毒形 成的新的与膜相互作用的醚脂类似物(Novel membrane-interactive ether lipod analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation)”AIDS Res.Hum.Retro Viruses.6：491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F. Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi，和E.J. Modest.1991.“具有抗HIV活性的新的醚脂核苷轭合物的合成和评估(Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity)”【109】J.Med.Chem. 34：1408.1414；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk，和H.van den Bosch.1992.“二肉豆蔻酰基甘油3′-脱氧胸腺嘧啶二磷酸酯，3′-脱氧胸腺 嘧啶的脂质前药大大增加人免疫缺陷病毒1型在CEM和HT4-6C细胞中复制的抑制作用 (Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3′-deoxythymine diphosphate dimyristoylglycerol，a lipid produg of 3，-deoxythymine)”，Antimicrob.Agents Chemother..36：2025.2029；Hosetler，K.Y.，L.M. Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van den Bosch，and D.D.Richman，1990.“叠氮基胸腺嘧啶及其 他抗病毒核苷的磷脂类似物的合成可抗反转录病毒活性(Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymine and other antiviral nucleosides)”J.Biol.Chem.265： 61127。
美国专利中公开的可共价结合到核苷，优选在核苷的5′-OH位的合适的亲脂性取代基或 亲脂性制剂的非限制性实例包括：美国专利第5,149,794号(1992年9月22日，Yatvin等)； 第5,194,654号(1993年3月16日，Hostetler等)；第5,223,263号(1993年6月29日，Hostetler 等)；第5,256,641号(1993年10月26日，Yatvin等)；第5,411,947号(1995年5月2日， Hostetler等)；第5,463,092号(1995年10月31日，Hostetler等)；第5,543,389号(1996年 8月6日，Yatvin等)；第5,543,390号(1996年8月6日，Yatvin等)；第5,543,391号(1996 年8月6日，Yatvin等)；和第5,554,728号(1996年9月10日，Basava等)，所有的内容 在此一并引入作为参考。外国专利中公开了可与本发明的核苷连接的亲脂性取代基或亲脂性 制剂的申请包括：WO 89/02733，WO 90/00555，WO 91/16920，WO 91/18914，WO 93/00910， WO 94/26273，WO 96/15 132，EP 0 350 287，EP 93917054.4和WO 91/19721。
V.联合治疗或交替治疗
本发明的活性化合物可与其它的抗黄病毒或瘟病毒剂或具体而言是抗HCV剂联合给药 或交替给药以治疗在此描述的任何一种病症。在联合治疗中，有效剂量的两种或更多种药剂 被一起施用，而在交替或连续治疗中，有效剂量的每种药剂被连续或顺序地施用。剂量取决 于该药物的吸收、失活和排泄率，也取决于其它本领域技术人员公知的因素。应注意的是剂 量也应随着要缓解的疾病的严重性而有所变化。同时还应该理解，对于任何特定的患者而言， 特定的给药方案和给药时间表应该根据个体的需要和施用或监督该组合物给药的人员的专 业判断而随时进行调整。在一个优选的实施方案中，具有10-15μM或优选小于1-5μM的 EC50的抗-HCV(或抗瘟病毒或抗黄病毒)化合物是所期望的。
已经认识到，在用抗病毒剂延长治疗一段时间后，会出现黄病毒、瘟病毒或HCV的抗 药性变体。最普遍的抗药性是由于编码病毒复制的酶的基因发生突变所致。通过将所述化合 物和第二种或第三种抗病毒化合物联合或交替给药，可以延长、增加或恢复药物抗病毒感染 的效能，所述第二种和第三种抗病毒化合物能诱导与主要药物引起的突变不同的突变。或者， 通过此类联合治疗或交替治疗，可改变所述药物的药代动力学、生物分布或其它参数。一般 而言，相对于交替治疗，通常优选联合治疗，因为联合治疗对所述病毒同时产生多重胁迫作 用。
任何在本发明背景中描述的抗病毒剂可与在说明书中描述的化合物用于联合治疗或交 替治疗。非限制性实例包括：
(1)蛋白酶抑制剂
实例包括基于底物的NS3蛋白酶抑制剂(Attwoodet al，Antiviral peptide derivatives(抗病 毒肽衍生物)，PCT WO 98/22496，1998；Attwoodet al.，Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999，10，259-273；Attwood et al.，Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents(制备和使用作为一种抗病毒剂的氨基酸衍生物)，德国专利公开号DE 19914474；Tung et al.，Inhibitiors of serine proteases，particularly hepatitis C virus NS3 protease(丝氨酸蛋白酶， 特别是丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的抑制剂)，PCT WO 98/17679)，包括α-酮酰胺和肼基脲 (hydrazinoureas)，和能终止亲电子试剂如硼酸或膦酸盐的抑制剂(Llinas-Brunet et al，Hepatitis C inhibitorpeptide analogues(丙型肝炎病毒抑制剂肽类似物)，PCT WO 99/07734)；基于非底 物的NS3蛋白酶抑制剂如2，4，6-三羟基-3-硝基-苯甲酰胺衍生物(Sudo K.et al，Biochemical and Biophysical Research Communications，1997，238，643-647；Sudo K.et al.，Antiviral Chemistry and Chemotherapy，1998，9，186)，包括RD3-4082和RD3-4078，前者在酰胺上被 14碳链取代，后者加工对苯氧基苯基，和Sch 68631，一种菲醌，是一种HCV蛋白酶的抑制 剂(Chu M.et al.，Tetrahedron Letters 37：7229-7232，1996)。
Sch 351633，分离自灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)，被确认为一种蛋白酶抑制剂 (Chu M.et al.，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9：1949-1952)。Eglin c分离自水蛭， 是几种丝氨酸蛋白酶如灰色链霉菌(S.Griseus)蛋白酶A和B、α-糜蛋白酶、糜蛋白酶和 枯草杆菌蛋白酶潜在的抑制剂。Qasim M.A.et al.，Biochemistry 36：1598-1607，1997。
公开了用于治疗HCV的蛋白酶抑制剂的美国专利包括，例如，Spruce等的美国专利第 6,004,933号公开了一类用于抑制HCV肽链内切酶2的半胱氨酸蛋白酶抑制剂；Zhang等的 美国专利第5,990,276号公开了丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的合成抑制剂；Reyes等的美国专 利第5,538,865号；Corvas International，Inc的WO 02/008251及Schering Corporation的WO 02/08187和WO 02/008256。HCV抑制剂肽公开于Boehringer Ingelheim的美国专利第6,534, 523号，6,410,531号和6,420,380号和Bristol Myers Squibb的WO 02/060926中。作为HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的二芳基肽公开于Schering Corporation的WO 02/48172中。作为 HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的咪唑啉二酮(Imidazoleidinones)公开于Schering Corporation 的WO 02/08198和Bristol Myers Squibb的WO 02/48157中。Vertex Pharmaceuticals的WO 98/17679和Bristol Myers Squibb的WO 02/48116也公开了HCV蛋白酶抑制剂。
(2)噻唑烷(Thiazolidines)衍生物，在采用NS3/4A融合蛋白和NS5A/5B底物进行 的反相HPLC测定中显示了相关的抑制作用(Sudo K.et al.，Antiviral Research，1996，32，9-18)， 特别是具有融合的被长链烷基取代的肉桂酰部分的化合物RD-1-6250，，以及RD4 6205和 RD4 6193；
(3)噻唑烷和N-苯甲酰苯胺(benzanilides)，其确认见Kakiuchi N.et al.，J.EBS Letters 421，217-220；Takeshita N.et al.，Analytical Biochemistry，1997，247，242-246；
(4)菲醌(phenan-threnequinone)，其在SDS-PAGE和射线自显迹法测定中显示具 有抗蛋白酶活性，通过从链霉菌(Streptomyces sp.)的发酵培养肉汤分离(Chu M.et al.， Tetrahedron Letters，1996，37，7229-7232)，Sch 68631以及Sch 351633，分离自灰青霉菌 (Penicillium griseofulvum)，在闪烁近似测定(SPA)中显示出活性(Chu M.et al.，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9，1949-1952)；
(5)解旋酶抑制剂(例如，Diana G.D.et al.，Compounds，compositions and methods for treatment of hepatitis C，美国专利第5,633,358号；Diana G.D.et al.，Piperidine derivatives， pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C，PCT WO 97/36554)；
(6)核苷聚合酶抑制剂和胶霉毒素(Ferrari R.et al.，Journal of Virology，1999，73， 1649-1654)，和天然产物浅蓝菌素(Lohmann V.et al.，Virology，1998，249，108-118)；
(7)反义硫代磷酸酯寡核苷酸(S-ODN)其与延伸入病毒的5’非编码区(NCR)(Alt M. et al.，Hepatology，1995，22，707-717)，或包含NCR的3’端的核苷326-348以及位于HCV RNA 的核心编码区的核苷371-388(Alt M.et al.，Archives of Virology，1997，142，589-599；Galderisi U. et al.，Journal of Cellular Physiology，1999，181，251-257))的序列互补；
(8)依赖于IRES的翻译的抑制剂(Ikeda N et al.，Agent for the prevention and treatment of hepatitis C((用于预防和治疗丙型肝炎的药剂))，日本专利公开号JP-08268890；Kai Y.et al.， Prevention and treatment of viral diseases，(病毒性疾病的预防和治疗)，日本专利公开号 JP-10101591)；
(9)核酶，如抗核酸酶核酶(Maccjak D.J.et al.，Hepatology 1999，30，摘要995)和那些公 开于Barber等的美国专利第6,043,077号和Draper等的美国专利第5,869,253号和5,610,054 号中的内容；和
(10)核苷类似物也被开发用于治疗黄病毒科病毒感染。
(11)在Idenix Pharmaceuticals的国际申请号WO 01/90121和WO 01/92282中描述的 任何化合物；
(12)其它的揭示了使用某些核苷类似物治疗丙型肝炎病毒的专利申请包括：BioChem Pharma，Inc.(现在为Shire Biochem，Inc.)提交的PCT/CA00/01316(WO 01/32153；2000年11 月3日提交)和PCT/CA01/00197(WO 01/60315；2001年2月19日提交)；Merck & Co.，Inc. 提交的PCT/US02/01531(WO 02/057425；2002年1月18日提交)和PCT/US02/03086(WO 02/057287；2002年1月18日提交)，Roche提交的PCT/EP01/09633(WO 02/18404；2001年8 月21日公开)，和Pharmasset，Ltd的PCT公开号WO OIT9246(2001年4月13日提交)，WO 02/32920(2001年10月18日提交)和WO 02/48165。
(13)Emory University的PCT公开号WO 99/43691，标题为″2′-氟代核苷″公开了使用 某些2′-氟代核苷治疗HCV。
(14)其它的各种化合物包括：1-氨基-烷基环己烷(Gold等美国专利第6,034,134号)， 烷基脂质(Chojkier等美国专利第5,922,757号)，维生素E和其它抗氧化剂(Chojkier等美国 专利第5,922,757号)，鲨烯，金刚烷胺、胆汁酸(Ozeki等美国专利第5,846,964号)，N-(膦 酰基乙酰基)-L-天冬氨酸，(Diana等美国专利第5,830,905号)，苯二碳酰胺(Diana等美国专 利第5,633,388号)，多聚腺苷酸衍生物(Wang等美国专利第5,496,546号)，2′，3′-二脱氧肌苷 (Yarchoan等美国专利第5,026,687号)，苯并咪唑(Colacino等美国专利第5,891,874号)，植 物抽提物(Tsai等美国专利第5,837,257号，Omer等美国专利第5,725,859号，和美国专利 第6,056,961号)，和哌啶(piperidenes)(Diana等美国专利第5,830,905号)。
(15)当前处于临床前或临床开发中的用于治疗丙型肝炎病毒的其它化合物，包括： Schering-Plough的白细胞介素-10，Interneuron的IP-501，Vertex的Merimebodib(VX-497)， Endo Labs Solvay的AMANTADINE_(金刚烷胺)，RPI的HEPTAZYME_，Idun Pharma的 IDN-6556，XTL的XTL-002，Chiron的HCV/MF59，NABI的CIVACIR_(丙型肝炎病毒 免疫球蛋白)，ICN/RIBAPHARM的LEVOVIRIN_，ICN/RIBAPHARM的VIRAMIDINE_， Sci Clone的ZADAXIN_(胸腺素α-1)，Sci Clone的胸腺素和聚乙二醇化干扰素，Maxim 的CEPLENE_(二盐酸组胺)，Vertex/Eli Lilly的VX 950/LY 570310，Isis PHARMACEUTICAL/ELAN的ISIS 14803，Idun Pharmaceuticals Inc.的IDN-6556，AKROS Pharma的JTK 003，Boehringer Ingelheim的BILN-2061，Roche的CellCept(霉酚酸吗啉乙 酯)，Tularik的T67，一种β-微管蛋白抑制剂，Innogenetics的针对E2的治疗疫苗，Fujisawa Healthcare，Inc的FK788，IdB 1016(Siliphos，口服水飞蓟素-磷酸噻吡二胺Phytosome(oral silybin-phosphatdylcholine phytosome))，ViroPharma/Wyeth的RNA复制抑制剂(VP50406)， Intercell的治疗疫苗，Epimmune/Genencor的治疗疫苗，Anadys的IRES抑制剂，Anadys的 ANA 245和ANA 246，Avant的免疫疗法(Therapore)，Corvas/Schering的蛋白酶抑制剂， Vertex的解旋酶抑制剂，Trimeris的融合抑制剂，CellExSys的T细胞疗法，Biocryst的聚合 酶抑制剂，PTC Therapeutics的靶向RNA化学，Immtech，Int的双阳离子(Dication)，Agouron 的蛋白酶抑制剂，Chiron/Medivir的蛋白酶抑制剂，AVIBioPharma的反义疗法，Hybridon的 反义疗法，Aethlon Medical的血液清洁剂(hemopurifier)，Merix的治疗疫苗，Bristol-Myers Squibb/Axys的蛋白酶抑制剂，Tripep的Chron-VacC，一种治疗疫苗，United Therapeutics的 UT 231B，Genelabs Technologies的蛋白酶、解旋酶和聚合酶抑制剂，Immusol的IRES抑制 剂，Rigel Pharmaceuticals的R803，InterMune的INFERGEN_(干扰素alphacon-1)，Viragen 的OMNIFERON_(天然干扰素)，Human Genome Sciences的ALBUFERON_，Ares-Serono 的REBIF(β-1a干扰素)，BioMedicine的ω-干扰素，Amarillo Biosciences的口服α-干扰素， InterMune的γ-干扰素、τ-干扰素和γ-1b干扰素。
V.生物数据
用于确定抗病毒活性的细胞培养基系统
利用一种有用的检测HCV及其抑制性的基于细胞的测定来评价源自为HCV复制子提 供栖所的Huh7细胞的复制子RNA的水平。这些细胞可以在标准的介质中培养，例如，在 DMEM介质中(高浓度的葡萄糖，无丙酮酸盐)辅以10％的胚胎牛血清，1×非必需氨基酸， Pen-Strip-Glu(分别为100单位/升，100毫克/升和2.92毫克/升)，以及G418(C20H40N4O10， 500～1000毫克/升)。抗病毒筛选测定可以在相同的介质中在没有G418的条件下进行。为 了保持细胞处于对数生长期，将细胞在96-孔板上以低密度种植(例如，每孔1000个细胞)。 在将细胞种植后立即加入测试化合物，并在培养箱中于37℃下培养3～7天。然后除去介质， 将细胞用于制备总RNA提取液(复制子RNA+宿主RNA)。复制子RNA可再用实时聚合 酶链式反应法RT-PCR(Q-RT-PCR)进行扩增和定量。
在复制子RNA的定量中观察到的差异是测试化合物的表达抗病毒能力的一种途径。在 典型的实验中，在负调控和非活性化合物下产生了可比较量的复制子。如果在两种条件下测 量得到的HCV RT-PCR的阀值周期大致相同，则可以得到上述结论。在这样的实验中，用 于表达化合物的抗病毒效果的方法是从测试化合物的阀值RT-PCR周期(Ct测试化合物)减去负 调控的平均阀值RT-PCR周期(Ct负)。该值被称为ΔCt(ΔCt＝Ct测试化合物-Ct负)。ΔCt 的值为3.3表示在复制子产生中的1-log减少。作为正调控，重组干扰素α-2a(例如，Roferon-A， Hoffmann-Roche，NJ，USA)可与测试化合物一同使用。另外，也可以稀释后的化合物进行测 试(通常稀释到100，33，10，3和1μM)。
通过每种浓度下的ΔCt的值可以计算得到50％有效浓度(EC50)。
如上所述的测定在改变了细胞体系和病毒病原体后能够适用于黄病毒科的其它病毒。用 于确定这些抗病毒化合物的效力的方法学包括对描述于以下著作中的标准技术的改进： Holbrook MR et al. Virus Res.2000，69，31；Markland W et al. Antimicrob.Agents.Chemother. 2000，44，859；Diamond MS et al.，J.Virol.2000，74，7814；Jordan I et al. J.Infect.Dis.2000， 182，1214；Sreenivasan V et al. J.Virol.Methods 1993，45(1)，1；或Baginski SG et al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，97(14)，7981或者实时RT-PCR技术。作为实例如可采用 HuH7细胞中的HCV复制子体系(Lohmann V et al. Science 1999，285(5424)，110)或者对其 的改进(Blight et al.2000)。
适用于检测HCV的非基于细胞的测定
核酸扩增技术目前是用于确认生物试样中大量且还在增长的微生物例如结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)，人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)的选 择方法。核酸扩增技术包括聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，依赖核酸 序列的扩增(NASBA)，链替代扩增(SDA)和转录介导的扩增(TMA)。许多FDA批准 的诊断产品中均包含了这些分子诊断方法(见下表)。核酸扩增技术测试不仅包括扩增，还 包括检测方法。分子诊断的前景在于其在样品处理、扩增和靶检测步骤上的改进，以及在于 将这些步骤结合成为自动化的形式。 FDA-批准的测定 扩增产物：检测方 法 核酸扩增方法 商业途径 沙眼衣原体， (C.trachomatis) 淋病奈瑟菌， (N.gonorrhoeae.) 结核分枝杆菌， (M.tuberculosis) HIV-1 异质性：比色法 PCR Roche Diagnostics 沙眼衣原体， (C.trachomatis) 异质性：化学发光 法 LCR Abbott Laboratories 淋病奈瑟菌， (N.gonorrhoeae.) 沙眼衣原体， (C.trachomatis) 淋病奈瑟菌， (N.gonorrhoeae.) 均质性：荧光法 SDA  Becton Dickinson 沙眼衣原体， (C.trachomatis) 结核分枝杆菌， (M.tuberculosis) 均质性：化学发光 法 TMA  Gen-Probe
扩增产物的检测流程
扩增产物的检测流程有两种基本类型：异质和均质型。异质性检测的特征是含有如清洗 这样的特殊步骤，其目的是从杂交的探针中除去未杂交的探针，而在均质性检测中，没有从 束缚探针上除去自由探针的物理分离步骤。存在着多元异质性检测和均质性检测的方法。这 些异质性或均质性测定可被用于评价本发明的化合物相对于RNA依赖的RNA聚合酶病毒， 如HCV的有效性。
异质性检测：例如，DNA印迹法(Southern blotting)是一种异质性检测技术。在DNA 印迹法中，运用电泳对扩增产物依据其大小和电荷加以分离。将按照大小分级的产物通过扩 散，抽真空或电印记而转移到膜或过滤器上。然后，标记的检测探针被杂交到溶液中膜束缚 的靶上，清洗过滤器，除去未杂交的探针，用各种方法检测膜上的杂交的探针。
其它类型的异质性检测是基于对扩增产物的特异性捕获，其方式是联免疫吸附分析 (ELISAs)。与PCR一同使用的一种方法包括：用半抗原或配体如生物素标记一个引物， 扩增后，用抗体包被的或链霉抗生物素蛋白包被的微盘将其捕获。其它的引物用报道基因 (reporter)如荧光素标记，并通过加入抗荧光素抗体，辣根过氧化物酶(HRP)而使检测得以 进行。这种类型的方法的特异性比使用探针杂交来限定靶扩增产物进行检测的方法的特异性 低。
LCx探针系统(Abbott Laboratories；Abbott Part，IL)和Amplicor HIV-1测试(Roche Molecular Systems Inc.；Pleasanton，CA)是使用异质性检测方法的系统。在LCx系统中，半 抗原-标记的寡核苷酸探针在连接酶链反应中热循环。捕获半抗原或检测半抗原均共价连接 到四个引物寡核苷酸中的每一个上。当扩增完成时，LCx系统仪器将反应转移到新的井(well) 中，在这里抗体-包被的微粒连接到捕获半抗原上。然后，每个微粒不可逆地连接到玻璃纤 维的基质上。通过洗涤步骤从微粒中除去仅含检测半抗原的探针。LCx仪器添加连接到检测 半抗原的碱性磷酸酶(AP)-抗体结合体(conjugate)。用于AP的荧光生成基质是4- 甲基伞形酮酰(4-methylumbelliferyl)。由AP对4-甲基伞形酮酰的脱磷酸作用将其转变为 具有荧光性的4-甲基伞形酮(umbelliferone)。
Amplicor HIV-1测试采用ELISA形式。在用PCR扩增后，对扩增子进行化学改性。扩 增子特异性寡核苷酸探针将改性的链捕获到被包被的微盘上。在洗涤步骤，操纵基因 (operator)洗去任何未插如的引物和未杂交的材料，然后将抗生物素蛋白(avidin)-HRP 结合体(conjugate)加入到各孔(well)中。该结合体连接到捕获到盘上的生物素-标记的扩 增子上。然后该扩增子加入3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯(TMB)，一种发色的HRP基质。 当存在过氧化氢时，HRP氧化TMB。可由比色法确定信号。
均质性检测：由于杂交的和非杂交的检测探针在均质性检测系统中不被物理分离，这些 方法要求比异质性检测方法更少的步骤，因此较不易受到污染。在可商业获得的试剂盒中， 使用荧光和化学发光标记的均质检测的试剂盒有：TaqMan系统(Applied Biosystems；Foster City，CA)，BDProbeTecET系统(Becton Dickinson；Franklin Lakes，NJ)，QPCR系统5000 (Perkin-Elmer Corp.；Norwalk，CT)，和Hybridization Protection Assay(Gen-Probe Inc.；San Diego)。
TaqMan系统对扩增子进行实时检测。杂交到扩增子内部区域的检测探针含有供体荧光 基团，如在其5’末端的荧光素(fluoroscein)和淬火剂部分，例如，在其3’末端的若丹明。 当淬火剂和荧光基团均在同一寡核苷酸上时，供体荧光被抑制。在扩增过程中，探针连接到 靶上。当Taq检测探针合成勒替代链后，聚合酶将其替代并切断。将检测探针切断导致将荧 光基团从淬火剂分离，从而供体荧光信号的增强。在扩增的每个循环中，都重复该过程。随 着扩增子的量的增加，荧光信号也增强。
分子信标(molecular beacon)也采用淬火剂和荧光基团。信标(beacon)是与靶扩增子 互补的、但在各端含短序列(约5个核苷酸)互补寡核苷酸的探针。各信标的5′和3′末端 分别用荧光基团和淬火剂标记。当信标未杂交到靶上时，形成发夹结构，与荧光基团和淬火 剂接触并且导致荧光淬火。环状区域含有与扩增子互补的区域。当杂交到靶上后，发夹结构 打开，淬火剂和荧光基团分离，从而能够形成荧光信号14。用荧光仪实时测量荧光信号。
BDProbeTecET系统使用结合勒TaqMan和分子信标两者的实时检测方法。探针具有发 夹圈的结构并含有荧光素和若丹明标记。但是，在该系统中，与靶分子互补的区域不是在环 中，而是在若丹明标记的区域3’内。该单链的环不是含有与靶互补的序列，而是含有限制酶 BsoBI用的限制酶切位点。单链序列不是酶的基质。在扩增前荧光素和若丹明标记相互靠近， 以淬火荧光素的荧光。链替换的扩增将探针转化为双链的分子。然后，限制酶BsoBI可切断 该分子，使得标记分离并增强荧光信号。
QPCR系统5000采用钌标记的电化学发光。使用了生物素化的引物。在扩增后，生物 素产物被捕获到包被了链霉抗生素蛋白(streptavindin)的顺磁性珠子上。通过以气吸和磁 吸当方式将珠子固定到电极上，从而将其转化为流动池。经电刺激后，该钌标记的探针就发 出光。
杂交保护测定(Hybridization Protection Assay)被用于Gen-Probe′s非扩增的PACE测定 以及扩增的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)测定中。在HPA中的检测寡核苷酸探针被化学发光的吖啶(acridinium)酯(AE) 通过连接臂(linker arm)的方式加以标记。在进行扩增的试管中，在60℃下进行15分钟 杂交。杂交后，加入为一种温和的碱性缓冲液的选择性试剂，以水解任何未杂变的探针上的 AE，从而消除这些AE的化学发光性。位于杂交的探针上的AE折叠在双螺旋的小沟内，从 而保护自己不被选择性试剂水解。当先后用过氧化氢和氢氧化钠水解后，AE发出化学发光 的信号。用发光仪记录该化学发光的信号2秒钟(该期间被称为信时(light-off))并以相 对光单元(RLU)报告发射的光子。
在使用探针检测扩增产物的所有方法体系中，检测探针的设计是很关键的。好的检测探 针仅杂化特异的扩增产物而不杂化非特异的产物。其他的优化检测方法体系的关键包括标记 探针以及实现样品量的最大化。
标记方法和报道基因分子。检测探针可通过各种不同的方法加以标记。通过酶将32P或 35S插入到探针中的方法最普遍的同位素标记方法。在杂交和洗涤后，信号在放射自显影胶 片上被检测到。
为了进行非放射性的检测，探针可以通过酶而标记上各种分子。生物素可通过酶被插入， 然后用链霉抗生素蛋白(streptavidin)-结合的碱性磷酸酶检测，其间使用AP基质，如5- 溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)和硝基蓝四氮唑(NBT)。化学发光的基质包括如Lumi-Phos 530或Lumi-Phos Plus(Lumigen，Southfield，MI)也可与AP一同使用。此外，洋地黄毒苷 -11-dUTP可通过酶插入到DNA或RNA中，而抗洋地黄毒苷AP结合体可与比色检测或化 学发光检测一同使用。
另外，还有许多其他类型的报道基因(reporter)分子，包括化学发光的部分，如吖啶酯。 也有许多荧光部分可获得。电化学发光的化合物如三(2，2′-二吡啶)钌(II)也可被使用。关于 这些技术和类似技术的进一步的讨论可参见：SchiffER，de Medina M，Kahn RS.Semin Liver Dis.1999；19(Suppl 1：3-15)。
实施例3：2′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-缬氨酸酯(VAL-mCyd)的细胞药理学 核苷转化为活性三磷酸酯的磷酸化测定
为了确定化合物的细胞代谢，从美洲型培养收集物(American Type Culture Collection (Rockville，MD))中获得HepG2细胞，使其在225cm2的补充了非必需氨基酸，1％青霉素- 链霉素的含最少基本介质的组织培养烧瓶中生长。每隔3天更换一次介质，细胞每隔一周进 行一次次培养。当在暴露于30mL的胰岛素-EDTA 10分钟和用介质进行3次连续的洗涤而 分离粘着的单层后，将融合性的HepG2细胞种植到密度为2.5×106细胞/孔的6-孔板上，并 暴露在10μM的[3H]标记的活性化合物(500dpm/pmol)特定的时间。将细胞在37℃的5％CO2气氛中保持。在选定的时刻，用冰冷却的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗细胞3次。细胞内的活 性化合物及其相应的代谢物通过对细胞球在-20℃下用甲醇培养过夜后另用20μL冷的甲醇 在冰水浴中提取1小时而被提取。接着合并提取物，在温和的过滤过的空气流中干燥，并储 存在-20℃，以用于HPLC分析。
抗病毒核苷及核苷类似物通常使转化为活性代谢物，即通过细胞内的激酶转化为5′-三 磷酸酯(TP)。然后，该核苷-三磷酸酯通过抑制在病毒复制中的病毒的聚合物来表现其抗病毒 作用。在原发性人肝细胞(primary human hepatocyte)培养物中，在人肝癌细胞系(human hepatoma cell line)(HepG2)中，和在牛肾细胞系(MDBK)中，mCyd被转化为主要的代 谢物，2′-C-甲基-胞苷-5′-三磷酸酯(mCyd-TP)，以及少量的尿苷5′-三磷酸酯衍生物，2′-C- 甲基-尿苷-5′-三磷酸酯(mUrd-TP)。mCyd-TP当在体外测试对抗BVDV复制酶，NS5B RNA 依赖的RNA聚合酶时显示出抑制性，并被认为对mCyd的抗病毒活性其决定作用。
mCyd的细胞内的代谢通过将MDBK细胞、HepG2细胞和人原发性肝细胞暴露于10μM 的[3H]-mCyd中进行检测。高效液相色谱(HPLC)分析显示mCyd在三种细胞类型中均被 磷酸酯化，且mCyd-TP在24小时后为主要的代谢物。测试了在将人肝细胞瘤HepG2细胞 暴露于10μM的[3H]-mCyd中48小时后而获得的代谢廓图。在HepG2细胞中，mCyd-TP的 水平在41.5±13.4μM、24小时后达到峰值(见表3)，然后下降。在原发性人肝细胞中， mCyd-TP浓度的峰值在24小时时为10.7±6.7μM，低4倍。MDBK牛肾细胞产生了中间水平 的mCyd-TP(24小时时为30.1±6.9μM)。
将肝细胞暴露于mCyd导致了第二种5′-三磷酸酯衍生物，mUrd-TP的产生。在暴露于 10μM的[3H]-mCyd的HepG2细胞种，该mUrd-TP的水平在24小时后达到1.9±1.6μM，可 于在MDBK细胞种的8.1±3.4μM和在原发性人肝细胞中的3.2±2.0μM相比。虽然MDBK 和HepG2细胞在24小时产生的磷酸化的种类的总量接近(分别为约43对47μM)，但mUrd-TP 却包含了MDBK细胞中的总产物的19％和HepG2细胞中的总产物的4％。mUrd-TP浓度随 时间稳定地增长，但在24小时后达到平台或下降。
表3：mCyd(10μM)在干细胞和MDBK细胞中的活化
代谢物(μM) 细胞a N   mCyd-MP  mUrd-MP  mCyd-DP  mUrd-DP  mCyd-TP  mUrd-TP HepG2 人原发 性肝细 胞 MDBK 牛肾细 胞 6 5   7     ND     ND       ND  ND  ND    ND  3.7±2.1  1.15±1.1    4.2±2.7  ND  0.26±0.4C    0.76±0.95  41.5±13.4  10.7±6.7    30.1±6.9  1.9±1.6  3.2±2.0    8.1±3.4
a：细胞用[3H]-mCyd培养24小时，特异性活性：HepG2测定＝0.5Ci/mmol；人和猴肝 细胞测定＝1.0Ci/mmol。
b：代谢物浓度以皮摩尔/百万细胞来进行确定。一皮摩尔/百万细胞大致相当于1μM。
ND表示未检测到。
mCyd-TP的明显的细胞内的半衰期是在HepG2细胞中为13.9±2.2小时，在MDBK细 胞中为7.6±0.6小时：该数据不适合于计算mUrd-TP的半衰期。除了上述的特异性上的差 别外，在原发性人肝细胞中检测到的磷酸化模式与使用了HepG2或MDBK细胞的性质类似。
实施例4：细胞毒性
线粒体毒性测定
如上所述，HepG2细胞在12-孔板内培养，并如在Pan-Zhou X-R，Cui L，Zhou X-J， Sommadossi J-P，Darley-Usmer VM.″Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells″Antimicrob.Agents Chemother.2000；44：496-503中教导 暴露于各种浓度的药物之下。在暴露于药物4天后的培养介质中的乳酸水平用Boehringer 乳酸测定盒进行测量。乳酸水平用由血球计数仪测定的细胞数进行标准化。
毒性测定
将细胞以5×103到5×104/孔的比率种植到96-孔板中，在37℃和潮湿的CO2(5％)氛围 中在生长介质中过夜。然后加入含有药物连续稀释的新的生长介质。培养4天后，培养物用 50％TCA固定，并用磺酰罗丹明B染色。在550nm读取光学密度。细胞毒素的浓度表达为 将细胞数目降低50％所要求的浓度(CC50)。
传统的细胞增殖测定被用于评价mCyd的细胞毒性以及其在快速分裂的细胞中的细胞 内的代谢物。mCyd的抑制效果被确定为天然地抑制细胞生长的，这是由于mCyd在融合性 的细胞中即使浓度远远超过用于特定细胞系的相应的CC50时，也没有显示毒性的缘故。mCyd 对快速生长的Huh7人肝细胞瘤细胞或H9c2鼠心肌细胞在最高测试浓度(CC50＞250μM)显 示出无毒性。mCyd的CC50值在BHK-21仓鼠肾和HepG2人肝癌细胞系中分别为132和 161μM。当细胞在包被了胶原质的盘上生长4或10天，mCyd在HepG2细胞中的CC50值将 增到200μM。为便于比较，用利巴韦林在HepG2和Huh7细胞中测试时，其CC50值为 35-36μM。在用于BVDV抗病毒研究的MDBK牛肾细胞中，mCyd的CC50值为36μM。在 用mCyd对抗MT-4人T淋巴细胞时确定了类似的CC50值(34μM)。此外，由National Institutes of Health(NIH)Antiviral Research and Antimicrobial Chemistry Program进行的测试表明，对于 其他的许多人类以及其他源于喃乳动物的细胞系，包括多个人癌细胞系，mCyd或者是无毒 性的，或者是弱毒性的(CC50＞50～＞250μM)。例外的情况是快速增殖的HFF人包皮纤维 原细胞(HFF human foreskin fibroblast)和MEF鼠胚胎纤维原细胞(MEF mouse embryo fibroblasts)，其中，mCyd显示出较强的毒性(CC50分别为16.9和2.4μM)。并且，mCyd 对于纤维原细胞的稳定期的毒性要小得多。
mCyd用量的增加对细胞DNA或RNA合成的毒性影响通过将HepG2细胞暴露于[3H]- 胸苷或[3H]-尿苷而进行测试。在HepG2细胞中，使放射标记的胸苷和尿苷结合到细胞DNA 和RNA中的量减少50％所需要的mCyd的CC50分别是112和186μM。而测得的用于DNA 或RNA合成的利巴韦林(RBV)的CC50值分别为3.16和6.85μM。这些值反应出在常规的 细胞增殖毒性测定中，mCyd和RBV的CC50通常分别是161和36μM。为了评价mCyd插 入细胞的RNA和DNA，将HepG2细胞暴露在10μM[3H]-mCyd或对照核苷(特异活性 5.6-8.0Ci/mmole，在碱基上标记)30小时。标记的细胞的RNA或DNA被分别分离，并用 闪烁计数法加以确定。将HepG2细胞暴露于mCyd会导致非常低水平的核苷类似物进入细 胞内的DNA或RNA(0.0013-0.0014pmol/μg核酸)。这些水平与ZDV和ddC进入RNA的 各自为0.0009和0.0013pmol/μg的值接近。这是由于这些脱氧核苷不被认为会进入RNA， 这些水平有可能反应出测定背景。ZDV和ddC进入DNA的量相当的高(分别为0.103和 0.0055pmol/μg)。利巴韦林(RBV)进入DNA和RNA的水平比mCyd高10倍。
表4a：细胞的核酸合成和HepG2细胞中的进入研究 (10μM药物和核苷对照)  CC50(μM)  进入的药物的量 化合物  DNA  ([3H]-胸苷)  RNA  ([3H]-尿苷)  pmol/μg DNA  pmol/μg RNA mCyd  112.3±34.5  186.1±28.2  0.0013±0.0008a 0.0014±0.0008a ZDV  Nd  Nd  0.103±0.0123a 0.0009±0.0003a ddC  Nd  Nd  0.0055b 0.0013b 利巴韦林  3.16±0.13  6.85±1.83  0.0120b 0.0132c
a.表示3次试验的平均值的数据
b.表示1次试验的数据
c.表示2次试验的平均值的数据
nd，未检测到
表4b：mCyd在喃乳动物细胞系中的毒性 细胞系a  n CC50(μM) Huh 7  7 ＞250 Hep G2  6 161±19 Hep G2b  2 ＞200 MDBK  7 36±7 BHK-21  2 132±6 H9c2  2 ＞250
a.所有细胞毒性测试均在快速细胞分裂的条件下进行
b.细胞在包被了胶原质的盘上生长4或10天
对人骨髓祖细胞(Human Bone Marrow Progenitor cell)的影响
骨髓毒性测定
从正常的健康志愿者中收集人骨髓细胞，通过Ficoll-Hypaque分级离心分离单核种群。 该分级分离在Sommadossi J-P，Carlisle R.″Toxicity of 3′-azido-3′-deoxythymidine and 9-(1， 3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hematopoietic progenitor cells in vitro″Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1987；31：452-454；和Sommadossi J-P，Schinazi RF，Chu CK，Xie M-Y.″Comparison of cytotoxicity of the(-)-and(+)-enantiomer of 2′， 3′-dideoxy-3′-thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells″Biochemical Pharmacology 1992；44：1921-1925中已有描述。对CFU-GM和BFU-E的培养基测定是通过 使用双层软琼脂或甲基纤维素法来进行的。药物在组织培养介质中稀释并过滤。在37℃和 潮湿的含5％CO2的空气氛围中14-18天后，用反相显微镜对大于50个细胞的菌落计数。结 果表示为与溶液对照培养相比在药物存在下的菌落形成的抑制性的百分比。
细胞保护测定(CPA)
该测定主要是按照下述文献的描述进行：Baginski，S.G.；Pevear，D.C.；Seipel，M.；Sun，S. C.C.；Benetatos，C.A.；Chunduru，S.K.；Rice，C.M.and M.S.Collett″Mechanism of action of a pestivirus antiviral COMPOUND″PNAS USA 2000，97(14)，7981-7986。在使用前将MDBK细 胞(ATCC)种植到96-孔培养盘(每孔4000细胞)。当在0.02噬斑(plaque)形成单位(PFU)/ 细胞的感染复数(MOI)下感染了BVDV(菌株NADL，ATCC)之后，测试化合物的连续 稀释被加入感染的和未感染的细胞，使在生长介质种的DMSO的最终浓度为0.5％。每种稀 释物均被测试四次。调整细胞密度和病毒接种体，以保证试验过程中细胞的连续生长并在未 处理过的对照物中获得后感染(post-infection)4天后的超过90％的病毒诱导的细胞破坏。4 天后，盘用50％TCA固定，并用磺酰罗丹明B染色。在550nm用显微盘读取器读取孔的 光学密度。50％的有效浓度(EC50)值被定义为使病毒的细胞病理效应得以降低50％的化 合物的浓度。
某些核苷类似物的脊髓抑制(myelosuppressive)效果使人们认识到需要在克隆源性测定 中对被研究的药物对人骨髓祖细胞的生长的潜在的影响进行测试。特别的，贫血症和嗜中性 白血球减少症是与HCV治疗中使用的标准联合治疗中的组分抗-HIV药物齐多夫定 (zidovudine，ZDV)或利巴韦林(RBV)相联系的最普遍的与药物相关的临床毒性。这些 毒性已在体外测定中采用来自健康自愿者的骨髓细胞进行了模型构建(Sommadossi J-P， Carlisle R.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31(3)：452-454)。已有结果显示，在该模型 中，ZDV在临床相关浓度1-2μM下，直接抑制人粒细胞-巨噬细胞菌落形成(CFU-GM)和 (BFU-E)活性(Berman E，et al.Blood 1989；74(4)：1281-128红细胞爆裂形成6；Yoshida Y， Yoshida C.AIDS Res.Hum.Retroviruses 1990；6(7)：929-932.；Lerza R，et al.Exp.Hematol. 1997；25(3)：252-255；Domsife RE，Averett DR.Antimicrob.Agents Chemother.1996；40(2)： 514-519；Kurtzberg J，Carter SG.Exp.Hematol.1990；18(10)：1094-1096；Weinberg RS，et al. Mt.Sinai.J.Med.1998；65(1)：5-13)。使用人骨髓克隆源性测定，mCyd的CC50值在CFU-GM 和BFU-E中为14.1±4.5和13.9±3.2μM(见表5)。mCyd对骨髓细胞的毒性明显比ZDV和 RBV低(见表5)。
表5：mCyd在粒细胞巨噬细胞祖细胞和红血球前体细胞中的骨髓毒性 化合物     CFU-GMa     CC50(μM)     BFU-Ea     CC50(μM) mCyd ZDV RBV     14.1±4.5μM     0.89±0.47     7.49±2.20     13.9±3.2     0.35±0.28     0.99±0.24
a.由RBV的3个独立试验和mCyd和ZDV的5-8个独立试验获得的数据。所有的试 验都进行三次。
对线粒体功能的影响
经核准用于HIV治疗的抗病毒核苷类似物，如ZDV，司他夫定(stavudine)(d4T)， 去羟肌苷(didanosine)(ddl)和扎西他滨(zalcitabine)(ddC)有时与临床限制性延时的 毒性有关，这些毒性如周围神经病，肌病和胰腺炎(Browne MJ，et al.J.Infect.Dis.1993；167 (1)：21-29；Fischl MA，et al.Ann.Intern.Med.1993；18(10)：762-769.；Richman DD，et al. N.Engl.J.Med.1987；317(4)：192-197；Yarchoan R，et al.Lancet 1990；336(8714)：526-529)。 一些专家认为这些临床的不利现象归因于因线粒体DNA(mtDNA)含量的减少和核苷类似 物进入mtDNA而产生的对线粒体功能的抑制。此外，一个特别的核苷类似物，非阿尿苷 (fialuridine)(1，-2′-脱氧-2′-氟-1-β-D-阿糖基(arabinofuranosyl)-5-碘-尿嘧啶；FIAU)-引起 的肝衰竭，胰腺炎，神经病，肌病和乳酸酸中毒直接由线粒体毒性引起((McKenzie R，et al. N Engl J Med 1995；333(17)：1099-1105))。与药物相关的乳酸产量的增加可认为是导致受损 的线粒体功能或氧化性磷酸化的原因(Colacino，J.M.Antiviral Res 1996 29(2-3)：125-39)。
为了评价mCyd产生线粒体毒性的潜在可能性，进行了多项使用人肝癌细胞系HepG2 或Huh7的体外研究。这些研究包括对乳酸产量，mtDNA含量的分析，以及确定线粒体超 微结构的形态学上的变化(例如，嵴(cristae)的失去，基质溶解和膨胀，以及脂滴形成)。
mCyd对线粒体的影响示于表6中。在经mCyd治疗的细胞中和未经治疗的细胞中，未 观察到乳酸产量的区别，其中，在Huh7细胞中mCyd用量最高为50μM，或者在HepG2细 胞中mCyd用量最高为10μM。在用50μM的mCyd治疗的HepG2细胞中观察到了中等的乳 酸产量的增加(38％)。这项发现的意义还不明确，主要是因为mCyd不太可能在临床中保 持50μM的血浆浓度。为便于比较，在用10μM的FIAU治疗的细胞中，其乳酸产量与对照 细胞相比，增长为100％(Cui L，Yoon，et al.J.Clin.Invest.1995；95：555-563)。将HepG2细胞 暴露于浓度最高为50μM的mCyd下6或14天，对线粒体DNA含量没有不良影响，而在 ddC治疗的细胞中，分别出现56％或80％的减少。
在暴露于10μM的mCyd之下14天后，用透射电子显微镜检查HepG2细胞的超微结构， 具体的是线粒体。在绝大多数细胞中，没有观察到在细胞结构或在线粒体数量或形态学(包 括嵴)中的变化。在17％的细胞中，平均每个细胞的25个线粒体中的1到2个线粒体显示 出增大。这样小的变化不太可能对线粒体功能产生显著的影响。ddC-治疗的细胞显示出异常 的线粒体的形态学，如失去脊膜(cristae)以及脂肪滴积聚。(Medina，D.J.，C.H.Tsai，et al. Antimicrob.Agents Chemother.1994 38(8)：1824-8；Lewis W，et al.J.Clin.Invest.1992；89(4)： 1354-1360.，Lewis，L.D.，F.M.Hamzeh，et al.Antimicrob.Agents Chemother.1992 36(9)： 2061-5)。
表6：mCyd对肝细胞增殖，线粒体功能和HepG2细胞中的形态学的影响  L-乳酸盐  (占对照a的％)  mtDNA/和DNA  (占对照b的％) 电子显微镜c 试剂  浓度  (μM)  HepG2细  胞  Huh7细  胞  处理6天  处理14  天 脂滴形 成 线粒体 形态 含量  0  100  100  100  100 负 正常 mCyd  10  50  98.6±7.3  138.0±8.9  98.0±12.3  97.1±10.1  117.3±17.5  158.2±17.5  99.7±23.9  83.0±15.5 负 nd 正常d nd ddC  1  10  nd  nd  nd  nd  44.3±9.3  nd  19.6±8.2  nd nd 正 nd 失去嵴
对人DNA聚合酶α，β和γ的影响
细胞DNA聚合酶负责正常的核和线粒体DNA的合成和修复。核苷类似物三磷酸酯是 DNA聚合酶的潜在抑制剂，因此能够破坏关键的细胞功能。特别的，人聚合酶γ的抑制， 负责线粒体DNA合成的酶被认为与线粒体功能缺陷有关。(Lewis，W.，E.S.Levine，et al. Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 1996 93(8)：3592-7)。已进行了确定 mCyd-TP是否抑制人DNA聚合酶的试验。如表7所示，mCyd-TP不是人DNA聚合酶α，β 或γ的基质。即使是1mM的mCyd-TP也不能在绝大多数的复制测定中抑制50％的这些酶， 且IC50值仅被确认为超过880-1000μM。与此相对，ddC是三种人DNA聚合酶，特别是聚合 酶β和γ的现在抑制剂(IC50分别为4.8和2.7μM)。对作为对照药物的DNA依赖的DNA 聚合酶的已知抑制剂放线菌素D，也观察到潜在的抑制。
表7：mCyd-三磷酸酯对人聚合酶的抑制                            IC50(μM)      mCyd-TPa                     ddC-TPb                      Act.Da      聚合酶α      ＞1000      78±23.4      5.8±3.1      聚合酶β      ≥883.3±165      4.8±1      7.9±3      聚合酶γ      ≥929.3±100      2.7±1      15.5±4
a. 由4组数据得到的平均数±S.D.
b. 由2组数据得到的平均数±S.D.
a.HepG2或Huh7细胞用化合物处理4天，数据由至少3组独立实验表示
b.HepG2细胞用化合物处理6天或14天，数据由至少3组独立实验表示
c.HepG2细胞用化合物处理14天
d.在2组独立实验中，17％的细胞(64中的11个)含有1或2个增大的线粒体(25 个线粒体中)
nd，未检测到
实施例5：对BVDV的体外抗病毒活性
通过抑制在复制周期中的其他酶或其他途径，化合物可通过抑制黄病毒或瘟病毒聚合酶 而显示出抗黄病毒或瘟病毒的活性。
噬斑减少测定(Plaque Reduction Assay)
通过噬斑减少测定在两个相同的24-孔板中确定每种化合物的有效浓度。使细胞单层感 染100PFU/孔的病毒。然后，向该单层中加入测试化合物的MEM的连续稀释(补充了2％ 的灭活的血清和0.75％甲基纤维素)。培养物进一步在37℃培养3天，然后用50％乙醇和 0.8％结晶紫固定，洗涤和空气干燥。然后对噬斑计数以确定获得90％的病毒抑制的浓度。
产率减少测定
通过产率减少测定，在两个相同的24-孔板中确定获得病毒载量减少6-log的每种化合 物的浓度。该测定主要按照文献中描述的方式进行，但作了微小的改变：Baginski，S.G.； Pevear，D.C.；Seipel，M.；Sun，S.C.C.；Benetatos，C.A.；Chunduru，S.K.；Rice，C.M.and M.S. Collett″Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound″PNAS USA 2000，97(14)， 7981-7986。简言之，在用BVDV(NADL菌株)的0.1PFU/细胞的感染复数(MOI)进行感 染之前，将MDBK细胞种植到24孔板(2×105细胞/孔)中24小时。将测试化合物的连续 稀释物加入到细胞中使得生长介质中的DMSO的最终浓度为0.5％。每个稀释物都进行3次 测试。3天后，细胞培养物(细胞单层和上清)通过3次冷冻-解冻循环而裂解，用噬斑测定 对病毒产量进行定量。简言之，将MDBK细胞种植到6孔板(5×105细胞/孔)，洗涤，并 在生长介质中用0.5％的琼脂糖覆盖。3天后，细胞单层用3.5％的甲醛固定并用1％的结晶紫 (w/v在50％的乙醇中)染色显示出噬斑。对噬斑进行计数以确定获得病毒载量减少6-log 的浓度。
在培养的细胞中进行mCyd的抗病毒活性的研究。用于确定mCyd的抗病毒能力的主要 测定是基于BVDV的细胞饱和测定(CPA)。该测定衡量mCyd在保护生长的MDBK牛肾 病毒不受BVDV的细胞病变的NADL菌株的破坏方面的能力。测试药物对未感染细胞的毒 性进行平行测定。mCyd和利巴韦林在CPA中的抗病毒活性的比较列于表8a。mCyd以浓度 依赖的方式(EC50＝0.67±0.22μM)有效地保护de novo-感染的MDBK细胞(表8a)。在远 低于该测定的mCyd的CC50(38±9μM)的浓度下，mCyd提供了完全的细胞保护。在CPA 以及其他如下所述的测定中，利巴韦林未显示出明显的抗病毒效果：由于利巴韦林的毒性与 保护效果重叠并发生掩盖，因此明显的细胞保护(50％或更大)在大多数测定中未获得。因 此，在CPA中，利巴韦林的CC50为4.3±0.6μM，EC50＞4.3μM。
表8a：在细胞饱和测定中，mCyd对BVDV的体外活性  化合物  n  EC50，μM  CC50，μM  MCyd  11  0.67±0.22  38±9  RBV  3  ＞4.3  4.3±0.6
表8b：β-D-2′-C-甲基-胞苷(化合物G)，β-D-2′-C-甲基-胞苷二盐酸盐的′-O-缬氨酸酯(化 合物M)和β-D-2′-C-甲基-尿嘧啶(化合物N)的CC50测试结果 CC50  化合物  BVDV  YFV DENY 2  WNV  CVB-2  Sb-1  REO  G  34  2.3  54 95  80  12  11.5  13  M  24  5.8  82 ＞100  82  12  14  22  N  ＞100  18  100 ＞或＝100  80  ＞100  55  ＞100
注：使用的细胞系包括：用于HIV的MT-4；Vero 76，用于SARS的非洲绿猴肾细胞； 用于牛病毒性腹泻病毒的BHK；用于脊髓灰质炎病毒萨宾1型的Sb-1；用于柯萨奇病毒 B-2，B-3，B-4和A-9的CVB-2，CVB-3，CVB-4和CVA-9；以及用于双链RNA病毒的REO-1。
表8c：β-D-2′-C-甲基-胞苷(化合物G)的CC50和EC50测试结果 CC50  CC50  CC50  EC50  EC50  EC50  EC50  EC50  EC50 化合物 MT-4  Vero  76  BHK  Sb-1  CVB-  2  CVB-  3  CVB-  4  CVA-  9  REO-  1 G 34  ＞100  ＞100  6  11  9  13  26  13
注：使用的细胞系包括：用于HIV的MT-4；Vero 76，用于SARS的非洲绿猴肾细胞； 用于牛病毒性腹泻病毒的BHK；用于脊髓灰质炎病毒萨宾1型的Sb-1；用于柯萨奇病毒 B-2，B-3，B-4和A-9的CVB-2，CVB-3，CVB-4和CVA-9；以及用于双链RNA病毒的REO-1。
mCyd对不同的BVDV菌株和细胞病变的(cp)和非细胞病变的(ncp)生物型的总的 抗病毒能力在细胞保护测定和噬斑减少及产量减少测定中得以确定。后面的测定测量的是细 胞中的感染性病毒的产量，因此提供了抗病毒效力的严格的测试。表9中显示了在三中测定 中的不同的数据的抑制性。mCyd的在50％到90％范围内的有效抑制浓度(EC50和EC90) 值分别为0.3-2.8μM和0.87-4.8μM。
在BVDV产量减少测定中，mCyd的亚细胞毒素的(subcytotoxic)浓度(约20μM)抑 制了de novo BVDV产量达6log10，达到了无感染性病毒被检测到的程度。在6.0-13.9μM的 mCyd中获得了4log10的有效BVDV产量的减少(EC4log10或EC99.99)。相反，干扰素α2b (IFNα2b)尽管在给测定(EC50 2.6IU/ml)中对BVDV有活性，但即使在1000IU/ml也未 得到2logs的病毒减少。因此，mCyd对BVDV的抗病毒效果比IFNα2b或RBV要高得多。
实施例6：对其他正链RNA病毒的体外抗病毒活性
mCyd对除BVDV外的其他正链RNA病毒的效力进行了测试。获得的数据总结于表9 和10中。对于黄病毒属病毒，mCyd显示出中等的活性。由两点确定的复合EC50的范围(μM) 为：西尼罗河病毒(46-97)；黄热病毒(9-80)；登革病毒(59-95)。对于mCyd对α病 毒，委内瑞拉马脑炎病毒而言，EC50值为1.3-45μM。mCyd对小核糖核酸病毒，如脊髓灰质 炎病毒(EC50＝6μM)，柯萨奇病毒(EC50＝15μM)，5型和14型鼻病毒(EC50s＝＜0.1和0.6μg/ml)， 以及2型鼻病毒(EC502-10μM)具有广泛的活性。除了正链RNA病毒外，mCyd对所有测 试的RNA和DNA病毒通常都不具有活性。还发现mCyd对MT-4人淋巴细胞中的HIV或 HepG2.2.15细胞中的HBV没有活性。
表9：mCyd对正链RNA病毒的体外抗病毒活性 测定方法  病毒类型 细胞类型  N  抗病毒效力(μM)  EC50  EC90  EC4log 细胞保护 测定  BVDV  NADL cp  MDBK  11  0.67±0.22 产量减少 测定  BVDV  NADL cp  MDBK  3  2.77±1.16  4.8±1.55  13.9±3.07  BVDV  MDBK  6  0.30±0.07  0.87±0.18  6.03±1.41  纽约-1  ncp  BVDV  I-NADL  cp  MDBK  1  0.68  1.73  8.22  BVDV  I-N-dIns  ncp  MDBK  1  0.59  1.49  7.14 噬斑减少 测定 BVDV NADL cp  MDBK  3  2.57±0.35  4.63±0.72 细胞保护 测定 西尼罗河 病毒  BHK  3  63-97 细胞保护 测定 黄热病毒 17D  BHK  1  60-80 DENV-2  BHK  2  95 细胞保护 测定 DENV-4  BHK  1  59 脊髓灰质 炎病毒 噬斑减少 测定 Sb-1  VERO  1  6 噬斑减少 测定 柯萨奇病 毒B2  VERO  1  15
cp，细胞病变的病毒；ncp，非细胞病变的病毒
I-NADL cp和I-N-dIns ncp表示重组BVDV病毒
表10：mCyd的体外抗病毒活性，选择性和细胞毒性 病毒(细胞系)a EC50b(μM) CC50c(μM) WNV(Vero) 46 114-124 YFV(Vero) 9-30 150-＞200 VEE(Vero) 1.3-45 ＞200 HSV-1(HFF)d ＞100 ＞100 HSV-2(HFF)d ＞100 ＞100 VZV(HFF)d ＞20 67.8 EBV(Daudi)d 25.5 ＞50 HCMV(HFF)d 9.9-15.6 67-73 MCMV(MEF) ＞0.8 2.4 流感A/H1N1(MDCK) ＞200 ＞200 流感A/H3N2(MDCK) ＞20 45-65 流感B(MDCK) ＞200 55-140 1型腺病毒(A549) ＞200 ＞200 3型副流感病毒 (MA-104) ＞200 ＞200 2型鼻病毒(KB) 2-10 ＞200 5型鼻病毒(KB)d 0.6 20-30 14型鼻病毒(HeLa-Ohio) d ＜0.1 20-＞100 RSV型A(MA-104) ＞200 200 Punta Toro A(LLC-MK2) ＞200 ＞200
a.HFF，人包皮纤维原细胞(HFF human foreskin fibroblast)；Daudi，Burkitt′s B-细胞 淋巴瘤；MDCK，犬肾细胞；CV-1，非洲绿猴肾细胞；KB，人鼻咽癌；MA-104，恒河猴肾 细胞；LLC-MK2，恒河猴肾细胞；A549，人肺癌细胞；MEF，鼠胚胎纤维原细胞；Vero， 非洲绿猴肾细胞；Hela，人子宫颈腺癌细胞。
b.EC50＝50％有效浓度。
c.CC50＝50％细胞毒性浓度。
d.用μg/mL而非μM表示的结果。
实施例7：感染复数(MOI)和抗病毒效力
使用细胞保护测定形式来检测BVDV病毒量的增长对mCyd的EC50的影响。该测定中， BVDV的感染复数(MOI)从0.04增加到0.16，导致mCyd的EC50线性地从0.5μM增加到 约2.2μM。
实施例8：mCyd治疗的细胞中的病毒回弹
断续地用mCyd治疗的效果在受BVDV的持续感染的非引起细胞病变的菌株(菌株 I-N-dIns)的MDBK细胞中被测试。一旦进入细胞培养物，这些细胞就连续不断地随处产生 106到大于107(每ml介质)的感染性的病毒颗粒。该病毒可通过向未感染的MDBK细胞中 加入来自治疗的MDBK(BVDV)细胞的培养物的上清，并在用BVDV-特异性抗体进行免 疫染色后，对所得的暴露的病毒聚点进行计数。用4μM的mCyd对持续感染的细胞系进行 为期一个细胞传代(3天)的处理，将BVDV效价从仅低于107的感染单元/ml的处理前或 对照细胞水平降低了约3log10。在此点上，mCyd处理是非连续的。在单个传代过程中，BVDV 效价回弹到刚超过107的感染单元/ml的未治疗的对照水平。
实施例9：药物作用机制
在标准BVDV CPA测定中，mCyd处理导致了总细胞RNA含量随细胞生长的显著增加， 其不受BVDV的细胞毒素作用的影响。这与由mCyd引起的BVDV RNA产量的显著减少有 关。相反，在没有mCyd时，由于受到引起细胞病变的病毒的破坏，总细胞RNA实际上随 着BVDV RNA的增加而减少。为进一步测试mCyd对病毒的和细胞的RNA的影响，在MDBK 细胞内使用了实时RT-PCR对18小时的后感染(在大约一个病毒复制周期后)细胞内BVDV RNA的积聚进行监控。与之平行的，通过使用特定引物的RT-PCR也对细胞内看家 (housekeeping)核糖体蛋白质mRNA(rig S15 mRNA)进行定量。该结果表明，mCyd在de novo-感染的MDBK细胞中显著地降低了BVDV RNA的水平，其EC50为1.7μM，EC90为 2.3μM。最高的由病毒引起的RNA减少在受测最高抑制剂浓度下是4log10(125μM)。没有 观察到对rig S15细胞mRNA对照物水平的影响。并且，以前的发现表明mCyd通过特异性 地干扰病毒的基因组RNA合成而不影响细胞RNA含量来抑制BVDV。该观点得到如下事 实的进一步支持(表4a)：即通过HepG2细胞中[3H]-尿苷的吸收测定的抑制RNA合成需 要高浓度的mCyd(EC50＝186μM)。
在使用纯化的BVDV NS5B RNA依赖的RNA聚合酶(Kao，C.C.，A.M.Del Vecchio，et al. (1999).″De novo initiation of RNA synthesis by a recombinant flaviviridae RNA-dependent RNA polymerase.″Virology 253(1)：1-7)和合成RNA模板的体外研究中，mCyd-TP以0.74μM的 IC50抑制了RNA的合成，并且是BVDV NS5B RNA依赖的RNA聚合酶对天然CTP基质的 竞争抑制剂。mCyd-TP的抑制常数(Ki)为0.16μM，而CTP的Michaelis-Menten常数(Km) 为0.03μM。mCyd-TP对RNA合成的抑制要求在RNA模板中有同源物G残基的存在。在对 无CTP时的mCyd-TP对RNA合成的影响的更详细的研究中，使用了连续的短的(21mer) 合成的RNA模板，该模板含有单股的G残基，其逐步地沿着模板被移动。对由这些模板在 mCyd-TP存在下产生的新合成的转录的进行的分析表明，增长仅持续到G残基，然后停止 (图2)。在含有超过1个G残基的模板中，RNA合成停止在遭遇到聚合酶的第一个G残 基处。这些数据强有力地表明mCyd-TP是作为非专性的链终止者。对于该明显的链终止基 质的研究还正在进行。
实施例10：持续性BVDV感染的根除
对mCyd根除病毒性感染的能力的测试在持续感染了BVDV的非引起细胞病变的菌株 (菌株I-N-dIns)的MDBK细胞中进行(Vassilev，V.B.and R.O.Donis Virus Res 2000 69(2)： 95-107.)。与未治疗的细胞相比，当用16μM的mCyd对持续感染的细胞进行为期两个细胞 传代(3-4天/传代)的处理，病毒产量由超过6logs病毒/ml降低到不可检测的水平。用mCyd 进行为期12个细胞传代的连续处理后再无可测的病毒产量。在传代8，9和10代(箭头， 图3)时，一部分细胞被培养以用于后续的无药物存在的传代，这样使得mCyd-TP有足够 的时间进行衰变并且使得病毒的复制得以恢复。对细胞的培养介质中重新出现的病毒进行如 下重复测试：向未感染的MDBK细胞中加入来自治疗的MDBK(BVDV)细胞的培养物的 上清，并用BVDV-特异性抗体进行免疫染色使所得病毒聚点显示后进行计数。尽管该测定 能够检测处单个的病毒颗粒，但在药物处理后，细胞中无病毒出现。因此，用mCyd处理8 或更多传代能够成功地从持续感染的细胞中消除病毒。
实施例11：与干扰素α2B的联合研究
第一项研究是在持续感染了BVDV的纽约-1(NY-1)菌株的MDBK细胞中进行，比较单 独使用mCyd(8μM)或干扰素α2b(200/ml)或者联合使用两种药物的效果(图4A)。在 该实验中，但使用8μM的mCyd在一个传代后将病毒效价降低约3.5log10，并继续维持在该 水平2个传代。除了对de novo BVDV感染有活性外，单独使用干扰素α2b基本上对持续 BVDV感染(病毒效价降低约0.1log10)无效。但是，在mCyd上联合使用干扰素α2b后， 在2个传代后将病毒减少至检测不到的水平，并清楚地显示出较单独疗法更好的效果。
在持续感染了BVDV的I-N-dIns非引起细胞病变的菌株的MDBK细胞中进行的研究中 (图4B)，mCyd以固定的剂量0，2，4和8μM供给，而干扰素α2b从0到2000IU/ml被 滴定。同样的，干扰素α2b基本上无活性(病毒效价降低约0.1log)，而mCyd单独地以 剂量依赖的方式抑制着BVDV(菌株I-N-dIns)的繁殖。8μM的mCyd降低了病毒产量6.2 log10，几乎达到了背景水平。
实施例12：抵抗性发展
在早期细胞培养研究中，在mCyd存在下的MDBK细胞中重复进行的引起细胞病变的 BVDV菌株的传代没有产生抵抗性突变异种，这就说明了分离mCyd-抵抗性BVDV突变异 种使困难的。但是，对持续感染了非引起细胞病变的BVDV形式的细胞系的研究使得能够 通过在未达最佳的治疗浓度的药物(2-8μM，取决于实验)下相对地延长mCyd的治疗来选 择抵抗性的病毒。在图5A显示的代表性试验中，在8μM的mCyd存在下经过传代2代后， 再也没有检测到病毒，但在传代6代后又重新出现。从以下数据可以明显得出重新出现的病 毒具有较低的效价：抵抗性病毒通常具有比野生型病毒低10倍或更低的效价，并能够容易 地被使用了IntronA的联合疗法抑制(图5A)。重新出现的显型病毒与野生型病毒存在显著 的区别：如图5B所示，其产生了小得多的聚点(通常比野生型病毒的直径小3-10倍)。这 种显型在存在抑制剂的培养基中经过延长的传代后(至少72天)没有变化，但是，其在断 续的处理后很快转变为野生型的显型(大的聚点)。
抵抗性突变异种的RT-PCR测序被用于确定产生抵抗性的突变异种。测序工作集中在 BVDV的NS5B RNA依赖的RNA聚合酶区域，其被认为是核苷抑制剂可能发生作用的靶。
在聚合酶的高度保守的B区域基序的开始处，特异性S405T氨基酸取代被确认。B区 域是聚合酶活性位点的一部分，被认为参与核苷结合(Lesburg，C.A.，M.B.Cable，et al. Nature Structural Biology 1999 6(10)：937-43)。其他病毒如HBV对核苷的抵抗性已绘于该 区域(Ono et al，J Clin Invest.2001 Feb；107(4)：449-55)。为了确认这种突变决定观察到的 抵抗性，将突变再引入到BVDV的重组分子克隆的骨架上。所得的克隆在显型特性上不能 区别于分离的突变异种病毒，这就证实了S405T突变决定了抵抗性，且NS5B RNA依赖的 RNA聚合酶是mCyd的分子靶向。通过在核苷序列中的该基序的高度保守的特性(Lai，V.C.， C.C.Kao，et al.J Virol 1999 73(12)：10129-36)和在正链RNA病毒中的结构级(包括HCV) 可以预测，在NS5B RNA依赖的RNA聚合酶中的相同的突变可能会是S282T。
S405T突变异种BVDV对最高可测试浓度的mCyd(EC50＞32μM)具有抵抗性，但是与 野生型病毒相比，成活力也受到显著的损害。如上所述，S405T突变异种显示出比野生型 BVDV低1-2log10的效价，并产生小得多的病毒噬斑。此外，突变异种病毒显示出在复制单 循环速率上的显著的降低(12h时，低于1000倍的病毒效价)，甚至在复制36小时后积累 到约比野生型病毒低100倍的水平(图5C)。同样的，该病毒在除去药物后很快地转变为 野生型病毒。最后，突变异种对用IFNα2b治疗的敏感性比野生型病毒的高约40倍(图5D)。
第二种附加突变，C446S，在S405T突变异种病毒在药物存在下继续经过传代后被观察 到。该突变产生在BVDV的NS5B RNA依赖的RNA聚合酶的C区域的主要GDD基序的紧 前方。初步的研究表明，具有两种突变的病毒与S405T突变异种相比，在复制上并未显示出 很大的优势，因此，这种突变对病毒适应性的贡献仍不清楚。
实施例13：动物效验模型中的val-mCyd的体内抗病毒活性
慢性感染了HCV的黑猩猩时最为广泛接受的人类患者感染HCV的动物模型(Lanford， R.E.，C.Bigger，et al.Ilar J 2001 42(2)：117-26；Grakoui，A.，H.L.Hanson，et al. Hepatology 2001 33(3)：489-95)。对感染了慢性肝病毒属病毒的黑猩猩模型进行了口服val-mCyd的单 一体内研究。
西南基础灵长类的动物中心(Southwest Foundation Primate Center)对5只黑猩猩进行 了HCV基因型化，作为他们的委托的内部健康和维护项目(Health and Maintenance Program) 的一部分，目的在于探知所有动物的疾病状态，从而有利于确定对雇员的潜在安全威胁。用 于该项研究的5只黑猩猩在对将基因型1HCV从所有其他基因型的RT PCT基因型化测定 中显示出高的HCV效价，但是不能区别基因型1a和1b。这表明用于该项研究的黑猩猩受 基因型1HCV(HCV-1)感染。
表11：慢性HCV感染的黑猩猩模型中的val-mCyd体内活性研究总结 研究描述 种 (N) val-mCyd剂量 (mg/kg)(n) 施药频率/途 径   终点 感染了慢性丙 型肝炎病毒 (基因型1) 的黑猩猩种 mCyd的一周 的抗病毒活性 黑猩猩 (5) 10和20(每个 为2) [相当于88.3 和16.6mpk的 自由基，载体 对照(1) QD×7天 (PO)   血清HCV   RNA，血清化   学，CBCs，大   众福利，临床   观察
在慢性丙型肝炎病毒感染的黑猩猩模型种的7日的抗病毒研究
4只黑猩猩(每两只一组，各组服用剂量为10mg/kg/日或20mg/kg/日)接受了新鲜地溶 解在风味水果饮料载体(vehicle)中val-mCyd二盐酸盐。这些剂量分别相当于88.3和16.6 mg/kg/日的自由基。第5只仅服用载体的动物作为安慰剂对照(placebo control)。
研究设计包括3次治疗前放血以建立病毒载量的基线波动，以及在一周的处理中的3次 放血(在治疗的第2，5和7天)以评价抗病毒效力。分析在一周的给药期内完全完成。
HCV RNA的确定
在整个研究中，HCV RNA的血清水平在两个临床医院的实验室被独立地确定。使用定 量RT-PCR核酸扩增测定(Roche扩增子HCV监控器(Roche Amplicor HCV Monitor)，2.0 版)分析HCV RNA。该测定具有检测下限(LLOD)为600IU/mL，线性范围为 600-850,000IU/mL。
为帮助解释在治疗中观察到的病毒载量的下降，将重点放于确定(i)在动物个体中的 基线HCV病毒载量的波动程度，和(ii)HCV病毒载量测定的内在可变性和再现性。为此， 比较了由两个实验室获得的全部病毒载量数据组。由两处获得的结果非常接近可比，并确定 了治疗前HCV病毒载量的稳定性和HCV Roche扩增子测定的可靠性。为了对研究有一个 综合的评价，将两组数据结合得到的平均值列于图6和7中。图6表示了剂量组的平均数据， 而图7表示了单个动物的数据。对各个动物在每处的治疗中观察到的病毒载量对基线的改变 也都总结于表12中。
由两处得到的HCV病毒载量分析揭示了，治疗前HCV病毒载量(i)在所有的五只动 物和所有的3个剂量组中都非常相似，(ii)在3周的治疗前期都非常稳定。平均治疗前log10 病毒载量和五只动物的标准偏差为5.8±0.1(场所1)和5.6±0.1(场所2)。这些数据表明测 定的变异系数在两处仅为约2％。在治疗前观察到的任何动物的HCV病毒载量的最大波动 为约0.3log10。
如图6和7所示，每天一次的口服val-mCyd产生了快速的抗病毒作用，而这在服用安 慰剂的动物中没有出现，且在治疗前期也未出现。对于所有的接受了val-mCyd治疗两天后 的动物而言，病毒效价均显著地较基线有下降，并且在两个治疗臂(treatment arms)中的持 续治疗下趋于进一步的下降。在处理结束时(第7天)，由基线HCV病毒载量的平均下降 对于8.3和16.6mg/kg/日的剂量组分别未0.83log10和1.05log10。服用安慰剂的动物的效价在 治疗期内几乎保持与基线相同。
对来自两个定量处所的数据所作的对治疗的响应的基线HCV病毒载量变化的分析见表 12。总的来说，两组数据相互很符合，这就确认了测定的可信度。除了动物501外，在两处 的病毒载量的区别一般为0.3log10或更低，与治疗前期观察到的波动类似。对于动物501， 差异接近0.5log10。观察到对治疗响应的病毒载量从0.436(动物501，场所1)降低到1.514 log10(动物497，场所2)。后者对应于HCV病毒载量从535,000(治疗前)变为16,500(第 7日)基因组/ml的改变。
表12：治疗期间基线log10HCV RNA病毒载量改变的总结 剂量(mpk) 动物ID 场所 第2天 第5天 第7天 0  499  1  2 -0.00041 -0.06604 -0.11518 0.10612 0.14085 -0.16273 8.3  500  1  2 -1.15634 -1.07902 -0.40385 -0.55027 -0.80507 -1.06259 8.3  501  1  2 -0.25180 -0.45201 -0.36179 -0.71254 -0.43610 -0.90034 16.6  497  1  2 -0.72148 -0.85561 -0.90704 -1.01993 -1.27723 -1.51351 16.6  498  1  2 -0.29472 -0.65846 -0.28139 -0.55966 -0.60304 -0.69138
将黑猩猩暴露于mCyd
用有限的HPCL分析确定服用了val-mCyd的黑猩猩的血清中获得的mCyd的浓度。在 2和5天给药的给药后的1-2小时后取得的血清中，在治疗的动物中的mCyd的水平一般为 2.9-12.1μM(分别为750和3100ng/mL)。在治疗前的血清或服用安慰剂的对照血清中，未 检测到mCyd。在最后服用的24小时内，mCyd的血清水平降到0.2-0.4μM(分别未50和100 ng/mL)。尽管使用mUrd的方法中采用0.4μM(100ng/mL)的下限，但在任何的血清样品 中均未检测到mUrd。
mCyd在感染了慢性HCV的黑猩猩模型中的安全性
由受过训练的兽医对黑猩猩在整个研究中的体重的减少，体温，胃口和一般性健康以及 血液化学概况和CBCs进行监控。未发现由于药物引起的不良影响。在接受治疗的所有4只 动物中，均显示出对药物的良好的耐受性。在研究中所有的5只动物均发生一些失重，并表 现出一些天冬氨酸盐氨基转移酶(AST)的增高，但这些通常由采样的镇静过程有关，而与 研究的药物无关。单个动物在服用药物的治疗前期经历了丙胺酸氨基转移酶(ALT)的突发， 但在治疗中ALT水平小时。因此，该孤立的ALT与药物无关。
实施例14：体外代谢
对val-mCyd和mCyd在人血浆中的稳定性进行了研究。val-mCyd在人血浆中于0，21 或37℃温育，并在达到10小时的不同时刻对样品进行分析(图8)。在37℃，val-mCyd被 有效地转变为mCyd，在10小时后仅有2％的输入的val-mCyd剩余。在人血浆中的人 val-mCyd的体外半衰期为1.81小时。在人血浆中的mCyd的体外稳定性研究中，或在人胞 苷/脱氧胞苷脱氨基酶中富集的粗制备物处理后，mCyd几乎保持不变，并在37℃温育后， 没有mCyd(mUrd)的尿苷衍生物的脱氨基发生。仅在恒河猴和食蟹猴(cynomologus monkey) 的血浆中观察到有限的脱氨基作用。mCyd在37℃在食蟹猴的血浆中温育24和48小时后， 分别产生了6.7和13.0％的mUrd脱氨基产物，其条件时对照的胞苷类似物发生了高度的脱 氨化。
除了mCyd和mUrd的TP衍生物外，在所有的三种细胞类型种还观察到少量mCyd-5’- 二磷酸酯，mCyd-DP，约为相应的TP的量的10％。仅在两种细胞类型中，原发性人肝细胞 和MDBK细胞中检测到更少量的mUrd-DP。在任何一种细胞类型中均物单磷酸酯代谢物被 检测出。没有任何的细胞内的mUrd的痕迹，并且没有证据支持形成了脂质核苷代谢物如在 其他胞苷类似物的细胞代谢中出现的5’-二胆碱磷酸类。
图9显示了在将HepG2细胞暴露于10μM[3H]-mCyd24小时后确定的mCyd-TP的衰减 廓图。mCyd-TP的明显的细胞内半衰期是在HepG2细胞中为13.9±2.2小时，和在MDBK细 胞中为7.6±0.6小时：该数据不适于计算mUrd-TP的半衰期。mCyd-TP在人肝细胞瘤细胞中 的长的寿命支持了在治疗HCV疗法的临床试验中每天服用一次val-mCyd的观点。如图9C 的HepG2细胞所示，mCyd的磷酸化在所有的3种细胞类型中以剂量依赖的模式发生达50μM 的药物。除了上述的特定的区别外，在原发性人肝细胞中检测到的磷酸化模式在性质上与使 用HepG2细胞或MDBK细胞获得的相似。
mUrd的作用
除了细胞内的活性部分mCyd-TP，不同种类的细胞还显示出通过细胞内mCyd的脱氨基 而产生了不同的和更少量的二磷酸酯mUrd-TP。mUrd-TP对BVDV NS5B RNA依赖的RNA 聚合酶的活性虽还未测试但其进行已在计划之中。到目前为止，由对mUrd的抗病毒效力和 细胞毒性的探测性的细胞培养物研究所获得的数据表明，mUrd(a)约比mCyd在对BVDV 的效力上低10倍；(b)基本上对其他广谱病毒无活性；(c)在不同的细胞毒性测试中(包 括骨髓测定，线粒体功能测定和进入细胞核酸)，当高浓度测试时无作用。基于这些结果， 可以看出mUrd对mCyd的总的抗病毒活性或毒性的廓图的贡献可能很小。在猴子身上进行 的使用val-mCyd的亚慢性研究中，存在着mCyd的代谢物mUrd的更广泛的毒理学范围。
实施例15：代谢活化的细胞途径
在基质竞争试验中，研究了对mCyd磷酸化其作用的酶的性质。胞苷(Cyd)是胞质尿 苷-胞苷激酶(UCK)的天然基质。UCK是将Cyd转化未Cyd-5’-单磷酸酯(CMP)的嘧啶 补救酶(pyrimidine salvage enzyme)。在胞苷或尿苷存在下，mCyd到mCyd-TP的细胞内磷 酸化以剂量依赖的模式减少(对胞苷，EC50值为19.17±4.67μM，对尿苷，EC50值为 20.92±7.10)。相反，脱氧胞苷，酶脱氧胞苷激酶(dCK)的基质对EC50＞100μM的mCyd-TP 的形成作用很小。除脱氧胞苷外，胞苷和尿苷对mCyd磷酸化的抑制表明mCyd是通过嘧啶 补救酶，尿肝-胞苷激酶而磷酸化的(Van Rompay，A.R.，A.Norda，et al.Mol Pharmacol 2001 59(5)：1181-6)。对这些激酶在mCyd活化中所起作用还需进一步的试验加以确定。
实施例16：mUrd-TP的细胞生物合成的途径
如上所概述，mUrd-TP是在不同种类的细胞中产生的含量不同的少量的代谢物。由于在 细胞介质中无mUrd，而该介质也缺少脱氨基活性，因此mUrd不是由mCyd的细胞内脱氨 基而产生。细胞代谢数据支持了mUrd-TP是通过细胞内大mCyd种类的生物转化而产生的 观点。对已知的核苷代谢途径的考虑表明，最有可能的途径包括由两种独特的脱氨基酶将两 种mCyd种类中的一种加以脱氨基：或者是通过胞嘧啶核苷酸脱氨基酶(例如脱氧胞嘧啶核 苷酸脱氨基酶，dCMPD)对mCyd-MP脱氨基，或者是通过胞苷脱氨基酶(CD)对mCyd 的脱氨基。进一步的磷酸化步骤产生了mUrd-TP。这些可能性还有待于进一步研究。
实施例17：val-mCyd的临床评价
符合要求的患者被随机引入处于基线(第1天，即研究施药的第一天)的研究中。每组 剂量的病人为12人，以10∶2的比例随机分配进行施药或分配安慰剂的治疗。在第1，2， 4，8，11和15天，患者随访研究中心进行治疗方案的评价。15天后，停止药物研究。此后， 患者在第16，17，22和29天参加追踪随访(follow-up visit)。在治疗的第1天和最后1天 (第1天和第15天)，在禁食的条件下对所有患者进行药代动力学的采样。
对Val-mCyd的抗病毒效果进行以下评价：(i)在第15天时，HCV RNA水平由基线 降低a≥1.0log10的患者的比例，(ii)血清HCV RNA水平降低到a≥1.01og10的时间，(iii) HCV RNA水平从第1天到第15天的变化，(iv)HCV RNA水平从第1天到第29天的变 化，(v)在第29天经历了血清HCV RNA水平返回基线的患者的比例，(vi)从第1天到 第15天的val-mCyd剂量与HCV RNA改变的关系。
以逐渐增加的剂量口服val-mCyd后的临床的药代动力学
在第一天的第一剂后8小时和第15天后的最后一剂后的期间对药代动力学进行评价， 使用到在的2，4，8，11和16天监测到的24小时槽式水平(trough level)，以及在第17 天监测到的48小时槽式水平。mCyd，mUrd和val-mCyd的血浆浓度用HPLC/MS/MS的方 法进行测定，定量下限(LOQ)为20ng/ml。
用非区划(non-compartmental)的方法对mCyd的药代动力学进行了分析。如在下表中 所示的，主要的药代动力学参数在第1天和第15天是可比的，这就表明在重复施药后没有 血浆药物的积累。血浆暴露(plasma exposure)是剂量的线性函数。如下表所示，当剂量由 50升至100mg时，药物暴露的主要的药代动力学参数(Cmax和AUC)加倍。
表13：50mg的mCyd的药代动力学参数 参数 Cmax  Tmax  AUC0-inf  t1/2 (ng/ml)  (h)  (ng/ml×h)  (h) 第1天 平均 428.1  2.5  3118.7  4.1 SD 175.5  1.1  1246.4  0.6 CV％ 41.0  43.2  40.0  13.8 第15天 平均 362.7  2.2  3168.4  4.6 SD 165.7  1.0  1714.8  1.3 CV％ 45.7  46.9  54.1  28.6
表14： 100mg的mCyd的药代动力学参数 参数 Cmax  Tmax  AUC0-inf  t1/2 (ng/ml)  (h)  (ng/ml×h)  (h) 第1天 平均  928.1  2.6  6901.7  4.4 SD  453.5  1.0  2445.7  1.1 CV％  46.1  36.2  35.4  25.2 第15天 平均  1054.7  2.0  7667.5  4.2 SD  181.0  0.0  1319.5  0.5 CV％  17.2  0.0  18.1  11.7
50mg和100mg的mCyd在第1天和第15天的血浆动力学廓图描绘于图10中。
总之，在口服val-mCyd后，母体化合物mCyd在HCV感染的受治疗者的血浆中被检测 到。mCyd在这些受治疗者中表现出线性的血浆药代动力学，这些受治疗者经受了已检测的 两种剂量水平。在每天服用已检测的剂量15天后，没有发现在受治疗者的血浆中有明显的 mCyd的积累。
HCV感染的患者以50mg/天的剂量开始口服val-mCyd，并以增加的剂量服用15天后的mCyd 的抗病毒活性
通过使用扩增子HCV监控TM测定2.0版(Amplicor HCV MonitorTM assay v2.0)(Roche Systems，Branchburg，NJ，USA)利用聚合酶链式反应(PCR)的方法来确定血清HCV RNA的 水平。该测定中的定量下限(LLOQ)估计为约600IU/ml，定量上限(ULOQ)估计为约 500,000IU/ml。
HCV RNA的血清样品在第42天前到第7天前经对是否符合研究标准进行筛选 (screening)而获得。筛选的血清HCV RNA值必须≥5log10IU/mL(根据在中心研究实验室 的扩增子HCV监控TM测定得到)。
在研究期间，HCV RNA的血清样品在基线处(第1天)、每个治疗方案规定的后基线 研究随访处(at every protocol-stipulated post-Baseline study visit)(第2，4，8，11，15，16， 17，22和29天)获得。HCV RNA的血清样品也从过早地终止研究的患者的治疗方案规定 的后续随访期间收集。
在正在进行的研究中，与前两组(50和100mg/天)相关的抗病毒活性总结于以下的表 和图中。尽管剂量的持续时间短(15天)且起始剂量水平低，但对感染的患者的血浆中的 HCV RNA的水平已表现出明显的影响。
表15：HCV RNA在Log10标准中的统计学总结                                                 天数   治疗   -1   1   2   4   8   11   15   16   17   22   29   安慰   剂 N   6   5   5   4   4   4   4   4   3   4   3 中值   6.45   6.25   6.25   6.52   6.42   6.28   6.58   6.51   6.64   6.35   6.61 平均 值   6.45   6.28   6.40   6.48   6.36   6.34   6.54   6.52   6.50   6.40   6.40 标准 误差   0.25   0.12   0.15   0.18   0.24   0.16   0.11   0.19   0.31   0.23   0.30   50mg N   10   10   10   10   10   10   10   10   10   10   10 中值   6.81   6.69   6.58   6.55   6.56   6.46   6.57   6.45   6.54   6.73   6.67 平均 值   6.72   6.72   6.60   6.56   6.62   6.47   6.57   6.57   6.54   6.64   6.71 标准 误差   0.11   0.11   0.12   0.06   0.10   0.09   0.08   0.11   0.08   0.10   0.09   100mg N   11   10   10   10   9   10   10   9   9   10   4 中值   6.57   6.93   6.80   6.46   6.59   6.57   6.41   6.40   6.72   6.66   6.71 平均 值   6.60   6.68   6.52   6.43   6.42   6.36   6.30   6.23   6.65   6.53   6.67 标准 误差   0.16   0.24   0.23   0.21   0.24   0.22   0.22   0.23   0.16   0.18   0.17
表16：在Log10HCV RNA中由基线(第1天)的变化的统计学总结                                          天数   治   疗   2  4   8  11  15  16  17  22  29   安   慰   剂   N   5  4   4  4  4  4  3  4  3   中值   0.17  0.21   0.15  0.08  0.31  0.21  0.27  0.17  0.09   平均   值   0.12  0.22   0.10  0.08  0.28  0.25  0.15  0.14  0.09   标准   误差   0.09  0.12   0.16  0.06  0.15  0.10  0.18  0.09  0.16 50m g     N 10 10 10 10 10 10 10 10 10   中值 -0.07 -0.13 -0.06 -0.26 -0.10 -0.13 -0.21 -0.09 -0.04   平均   值 -0.13 -0.16 -0.11 -0.26 -0.15 -0.15 -0.18 -0.09 -0.01   标准   误差 0.05 0.07 0.05 0.06 0.08 0.05 0.07 0.06 0.10 100 mg   N 10 10 9 10 10 9 9 10 4   中值 -0.12 -0.24 -0.20 -0.38 -0.43 -0.49 -0.24 -0.19 -0.12   平均   值 -0.16 -0.25 -0.21 -0.32 -0.38 -0.39 -0.18 -0.15 0.13   标准   误差 0.07 0.10 0.16 0.13 0.12 0.14 0.15 0.13 0.28
图11描述了在Log10HCV RNA中由随访得到的与基线的平均变化
本发明通过以上实施例的描述而得以说明。应当理解，对于本领域技术人员而言，这些 实施例不应限制本发明，并且在不背离本发明精神的范围内可以作适当的改变。