本发明涉及编码对乙型肝炎病毒抗原有特异性的多肽的重组DNA 分子。

更具体地说，本发明涉及用于在人体中刺激针对变异乙型肝炎病毒 的抗体产生的疫苗组合物。

乙型肝炎病毒粒子不同血清型基因组的克隆方法是本领域熟知的 (Miller et.al)。丹氏粒是乙型肝炎病毒粒子，可以从被感染的病人分 离，它具有约42nm的直径。各个粒子由包含乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的色膜、衣壳(HBcAg)、内源性聚合酶和DNA基因组组 成。第三种多肽“e”抗原(HBeAg)由乙型肝炎病毒产生，以溶解的 形式在血清中发现。

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的广泛存在的问题，但用 于公众免疫接种的疫苗目前是可广泛获得的。市售的抗HBV疫苗包括天 然或重组形式的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。真正的(或野生型)乙 型肝炎表面抗原可以从感染个体的血浆中以包含两种蛋白质的约22nm 粒子回收，所述的蛋白质称作P24和其糖基化衍生物GP28，它们两者 都被HBV基因组上的226个氨基酸编码序列编码，所述编码序列称作S 蛋白质编码序列或HBV S-基因(Tiollais et al.，(1985))。Valenzuela et al.，Nature 280 815(1979)中给出了HBsAg的完整氨基酸序列和编码核 苷酸序列。本文中采用Tiollais et al.使用的指定核苷酸和氨基酸位置的 编号系统。

Harford et al.Develop.Biol.Standard 54 125(1983)、Valenzuela et al.，Nature 298 347(1982)和Bitter et al.，J.Med.Virol，25 123(1988)已描述 了在表达载体上在酵母启动子控制下插入HBV S-基因编码序列以便能 够在啤洒糖酵母中表达用于制备疫苗的HBsAg的方法。Gregg et al.，Biotechnology 5 479(1987)已描述了在巴斯德毕赤氏酵母中的表达方 法(也参见欧洲专利出版物0226846)，其在多形汉逊氏酵母中也有表 达(欧洲专利出版物0299108)。

也已从包含HBsAg蛋白质的杂种免疫原性粒子(欧洲专利出版物 0278940描述)制备疫苗。这些免疫原性粒子可以含有，例如，HBsAg 前体蛋白的全体或部分，所述前体蛋白被HBV基因组上紧靠在HBV- S基因前边的编码序列(本文称作前-S编码序列)编码。该前-S编码 序列通常编码163个氨基酸(在ay HBV亚型的情况下)，并且包含前 -S1编码序列和前-S2编码序列。后者编码55个氨基酸，并且紧靠在 S蛋白质编码序列的前边(欧洲专利出版物0278940)。

HBV-DNA的表面抗原(S抗原)开放读框分成三个区：前-S1、 前-S2和S。它编码HBV的三种包膜蛋白质，称作大的、中等的和主 要的蛋白质。主要的蛋白质HBsAg由226个氨基酸组成，并由S基因编 码(Tiollais et al.，(1981)；Tiollais et al.，(1987)和Leu et al.)。所有三种包 膜蛋白质都含有HBsAg抗原位点，并且易于由常规的HBsAg免疫测定 方法检测。这些免疫测定方法广泛用于诊断HBV感染和筛选全球供血 者。HBsAg反应性取决于氨基酸124-147亲水区(定义为“a”决定 族(Ashton-Rickardt et al.和Brown et al.))的结构构象。这一点对所有 HBV亚型是共同的，其抗体赋予针对任何亚型再感染的保护作用。

在高度严格条件下与HBV探针杂交的HBV-DNA序列已表现在 血清HBsAg阴性受试者的肝脏、血清和血单核细胞中(Brechot et al. (1985)和Thier et al.)。来自不同实验室的最近的研究成果(使用斑点印 迹杂交或聚合酶链反应(PCR))证实了HBV DNA序列在HBsAg阴 性受试者血清中的存在。PCR技术的发展已使得可以检测许多病人中 HBV复制的非常低的水平，并可以对许多分离物(已在某些病毒分离物 中识别遗传变异)测序(Carman et al.，(1990)；Brechot et al.，(1991)Blum et al.)。在HBV高流行的台湾和撒丁岛，1.7％和0.3％的HBsAg阴性 键康供血者在他们的血清中具有斑点杂交印迹杂交可检测的HBVDNA (Lai et al.，(1989)和Sun et al.)。在中国大陆在抗-HB-阳性个体中 使用PCR的分子流行病学研究表明具有不可检测HBsAg的HBV载体的 存在，总共占中国总人口的3％(Luo et al.)。

HBV的抗原亚型由血清学定义，已显示出由基因组HBsAg编码区 中单个碱基的变化引起(Okamoto et al.)。然而，所有目前已知的抗原 亚型含有由HBsAg的氨基酸124到147组成的“a”决定簇。“a”决 定簇的抗体赋予针对所有亚型的保护作用。体外突变已表明在147位的 半胱氨酸和在142位的脯氨酸对显示“a”决定簇的全抗原性是重要的 (Ashton-Rickardt et al.)。

此外，Howard Thomas和William Carman在WO 91/14703中详 细描述了在HBV感染母亲生下的接种儿童中的HBsAg片段变体。测序 揭示了导致HBsAg“a”决定簇中145位上甘氨酸到精氨酸的氨基酸变 化的在核苷酸位置587上的鸟苷到腺苷的点突变(也参见Carman et al.，(1990))。已报道了类似的HBV突变体在体液免疫压下被主动(疫苗) 或被动(超免疫球蛋白)诱导的在宿主中的复制(Okamoto et al.，(1992) 和McMahon et al.)。然而，在某些这类病人的血清中用常规的免疫测 定方法检测的HBsAg和抗HBs(疫苗诱导的)两者的持续存在说明突 变不引起抗原性的完全丧失(Carman et al.，(1990)，Okamoto et al.，(1992)和McMahon et al.)。

从治疗学和流行病学的观点看，研究来源于在标准测定试验中无任 何HBsAg反应的受试者的HBV的分子特征更重要。从HBeAg、HBV -DNA以及抗HBs阳性的日本病人获得的测序结果表明，前-S2区氨 基酸9到22被缺失，而前S2的3和8位上的氨基酸以及HBs“a”决 定簇的第一环的126、131和133位上的氨基酸被取代(Moriyaa et al.)。从另一种分离物推定的氨基酸序列的分析揭示了主要HBs蛋白质 的3、53和210位上的取代，所有这些都在普通“a”决定簇之外，且 不能真正地解释在血清中缺少HBsAg(Liang et al.)。

在过去的十年中，已描述了几种推定的乙型肝炎病毒的变体或突变 体。例如，McMahon等已描述了在用抗HBsAg单克隆抗体治疗的肝移 植病人的推定的单克隆抗体结合域(由DNA序列分析推断)中精氨酸对 甘氨酸的取代(Cold Spring Harbor Symposium on the Molecular Biodogy of Hepatitis B Viruses，September，1989)。

在Carman et al.的研究和专利申请WO 94/26904的主题中，突变 体乙型肝炎病毒具有修饰的“a”决定簇，其中两种特异性氨基酸(天 冬酰胺和苏氨酸)被插入到HBsAg序列的122位上。此外，145位上的 突变(由甘氨酸取代野生型精氨酸)也详细列在氨基酸序列表中。

在另一份报告中，尽管在用两种许可使用的乙型肝炎疫苗之一免疫 接种后存在特异性抗体(抗-HBs)，儿童和成年人中还是发现带有循 环乙型肝炎表面抗原(表明病毒复制)(Zanetti et al.)。用单克隆抗体 对HBsAg的分析揭示所述循环抗原不携带“a”决定簇或者这一决定簇 被隐蔽起来。由此出结论，已检测到乙型肝炎病毒变体的出现，可能由 于与感染流行区免疫接种有关的流行病学压力。然而，没有进一步确定 所述变体的特征。

从Zanetti等的工作可以清楚地看出，目前所能获得的乙型肝炎疫 苗的最大的缺点是它们可以(至少在具有素因性免疫遗传特性的宿主 中)引起出现“逃逸突变体”，即复制已突变而不受中和性免疫反应影 响的感染性病毒。这样一种变体病毒明显具有引起发生疾病的能力，并 且可以认为是可以传递的。因为它不被基于普通HBsAg的疫苗产生的抗 体有效地中和，所以该变体病毒可以引起严重的免疫问题。已描述了HBV 的其它突变，但有关其改变的抗原性的意义并不清楚(Moriyama et al. 和Lai et al.，(1990))。

使用PCR在中国HBV感染高流行区最近的研究表明，30-40％ 的具有不明原因肝硬变、慢性活动性肝炎(CAH)或慢性迁延性肝炎 (CPH)的HBsAg阴性病人在其血清或肝组织中具有复制的HBV- DNA(Zhang et al.)。这些研究表明，在中国人群中存在一种HBV变 体，以血清中不可检测的HBsAg为特征。令人惊奇的是，这样一种推定 的突变体从来没有在分子水平上确定特征。

从我们的中国病人(即无任何可检测的HBsAg的病人)获得的分 离物是一些插入突变体，其中额外氨基酸插入到就在“a”决定簇之前 的密码子122和124之间。这一序列变异在任何已知的HBV亚型中以前 没有描述，并且在相同区的30个HBsAg阳性中国病人中没有发现。有 趣的是注意到发生插入的区是重要的HBsAg表位区。发现插入序列就在 决定亚型决定簇(d)的密码子122的下游，并且就在“a”决定簇的 上游。所有在密码子位置122之前和之后的核苷酸和氨基酸序列详细描 述在野生型HBV中(图6和7)。在不能与有关的理论联系上的情况下， 我们相信这一突变引起影响“a”决定簇和“d”亚型表位的构象变化。 一种很大的可能性是氨基酸的插入通过影响“a”决定簇的两环的空间 结构改变表位。另一种可能性是由单克隆抗体限定(Waters et al.)的 “a”决定簇的第一环可以包括(比原来认为的)更上游的氨基酸。我 们认为这些氨基酸被按以前提出的(Waters et al.和Ashton-Richardt et al.)122而不是124上游的二硫键形成。所述插入的氨基酸会增加环从 14到16或17氨基酸的长度，从而改变这一环的构象，阻止中和抗体结 合。

在本发明中，我们描述了从中国病人分离的HBV的新变体或“逃 逸突变体”，所述中国病人的血清在用斑点印迹杂交分析时为HBV- DNA阳性，而用市售多克隆抗体进行免疫试验时为HBsAg阴性。此外， 本发明克服了或至少减少了与已知HBV疫苗相关的缺点(这些疫苗对这 些新发现的突变体无效)。

本发明给出了新查明的HBV突变体的特征，所述突变体在HBV包 膜区紧靠位置122下游至少有两个氨基酸插入。本发明提供了在试验样 品中测定突变HBV存在的方法，以及在这些方法中有用的试剂。本发明 的各方面提供了“a”决定簇的修饰，其中在HBsAg序列122位下游有 至少2个氨基酸插入，相应于HBsAg基因组核苷酸519下游至少6个核 苷酸的插入。

得自突变HBV的核苷酸序列或其部分作为测定试验样品中突变 HBV存在的探针是有用的。所述序列也使得可获得在这种突变HBV基 因组内编码的突变HBV抗原的多肽序列，并允许产生作为诊断试验中的 标准或试剂和/或作为疫苗组分有用的多肽。针对包含在这些多肽序列内 的表位的单克隆和多克隆抗体对诊断试验以及治疗剂，筛选抗病毒剂和 分离突变HBV(所述核酸序列从其获得)也是有用的。

将要理解的是，如果需要，这一突变HBsAg也可以包括前-S序 列。

按照本发明的变体HBsAg蛋白质或其片段此后缩写为 “mHBsAg”。

将意识到，这些mHBsAg突变体不是“天然产生”的形式，而是合 成的和高度纯化的物质，不含血产物。

本发明中描述的较好的这些突变体相当于全长HBsAg，并且除了 在122位下游插入至少两个氨基酸残基外，与野生型HBsAg相同。

优选的HBsAg突变体为高度纯化的形式，比如为纯度大于75％， 更优选的大于90％，最优选的为95-100％的状态。

本发明另一方面提供了包含免疫保护量的这些HBsAg“逃逸突变 体”以及合适载体的疫苗组合物。

此后描述本发明的其它方面。

本发明的mHBsAg和疫苗可以用于克服由出现以上定义的“逃逸突 变体(其中，紧靠病毒HBsAg＂a＂决定簇上游的区(包膜区)已进行修 饰)产生的问题。特别是，本发明的疫苗具有可以用于抵抗和阻止变体 HBV的出现或传播，所述变体HBV被定义为在HBsAg氨基酸序列中具 有修饰的HBV包膜区，其中至少有两个插入到122位下游的氨基酸。

因此，本发明也提供了一种保护人体使其免受与所说变体HBV感 染相关的病症折磨的方法，该方法包括给人体施用安全有效量的按照本 发明的疫苗。

本发明另一方面提供了用于治疗，尤其是预防的mHBsAg。

本发明也提供了mHBsAg在制造疫苗组合物上的用途，所说疫苗组 合物用于保护人体抵抗与所说变体HBV感染相关的病症。

当用于抗存在的变体HBV病毒的人体免疫时，疫苗中的mHBsAg 序列通常比得上或抗原性等同于变体HBV病毒中mHBsAg序列是合意 的。

在本发明的mHBsAg中122位后插入的优选的氨基酸残基是可以由 插入六个或更多个核苷酸衍生的那些。编码额外氨基酸的插入核苷酸可 以影响普通HBsAg中密码子123的3个核苷酸的任何一个。

从理论上说，改变包膜蛋白亲水性的任何突变都能引起改变的抗原 性和出现变体HBV。野生型的亲水性和突变体的亲水性在这一区是很不 相同。这里所述的亲水性降低常常与抗原性丧失相关联。所述突变体在 第一环中的增加的疏水性也可以产生在包膜脂质中主要蛋白质的改变的 蛋白质，从而对构象具有很大的影响。

在本发明的一个优选的实施方案中，普通HBsAg 122位之后的残基 可以降低“a”决定簇的亲水性。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述mHBsAg除了在122 位下游插入至少两个氨基酸残基外，与普通(野生型)HBsAg S-蛋白 质相同。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，122位下游的修饰是分别 插入精氨酸，然后是丙氨酸。另一种优选的是，可以以那种顺序在122 位下游插入精氨酸、甘氨酸和丙氨酸。

本发明各方面优选的特征在细节上作必要的修改后是本发明的其它 各方面。

现在，本发明将由下列实施例说明。所述实施例涉及附图，其中：

图1说明1号病人的系列血清转氨酶(ALT)水平。正常水平在 40iμ/L以下。在各时间点测定血清HBV标记。1992年8月由PCR发 现HBV DNA，而未测得HBsAg和其它HBV标记。

图2说明2号病人的系列血清ALT水平以及血清乙型肝炎病毒标 记。缩写W表示野生型，M表示突变体。

图3是表面基因开放读框(PCR和测序引物的位置)和重叠聚合酶 开放读框(PORF)的图示说明。黑圈代表起始和终止密码子，而有阴 影的方块表示与“a”决定簇相关的插入热点(522-593位)。核苷 酸编号从如出版的HBV DNA序列中的假拟的EcoRI位点开始，因为本 发明的分离物不具有EcoRI位点。

图4表示在PCR产物的直接测序后与野生型(中间)比较在分离物 1和2(左边和右边)中核苷酸插入的放射自显影。箭头表示插入点。

图5表示与野生型(adw)比较的分离物1和2的核苷酸和氨基酸 序列。插入序列的下面划线。

图6说明mHBsAg分离物1的完整的核苷酸序列。上面的序列代表 突变HBsAg分离物表面基因和“a”决定簇的序列，下面的序列代表野 生型序列。(…)代表氨基酸插入位点。

图7说明mHBsAg分离物2的完整的核苷酸序列。上面的序列代表 突变HBsAg分离物表面基因和“a”决定簇的序列，下面的序列代表野 生型序列。(…)代表氨基酸插入位点。

表1描绘了用于聚合酶链反应和测序反应的合成寡核苷酸引物。

表2说明以adw野生型为对照，1号和2号病人血清HBsAg与单 克隆抗体的阳性/阴性结合率。

表3给出了与以前出版过的野生型序列(adw)和来源于与野生型 相同区的中国分离物比较的突变S基因的核苷酸和氨基酸序列同源性。

HBV突变更普遍地在以连续的碱基为特征的序列的特别区域中发 现。在研究中，所述的插入与连续四个腺嘌呤相关。这一区域看来是在 某些来源于中国HBsAg阴性HBV携带者的分离物中插入的“热点”。

本发明另一方面提供了制备mHBsAg和由此获得的疫苗组合物的 方法。

mHBsAg优选地由合成法(经肽合成或更优选地经重组DNA技术) 获得。

构建、操作和检定重组DNA分子和序列的方法是本领域公知的。 为了修饰HBsAg的HBV S蛋白质并获得本发明的mHBsAg，将密码子 CGG和GCA，或分别编码精氨酸和丙氨酸的其它三联密码子组合插入 到122位下游是合乎需要的。也可以将密码子CAC、GGG或GCG， 或者分别编码精氨酸、甘氨酸和丙氨酸的其它三联密码子组合插入到122 和124位核苷酸之间。

可以获得引起序列合适变化的几种方法。一种合适的方法是经亚磷 酸酯或亚磷酰胺化学，利用病毒或酵母密码子频率完全从头合成所需编 码序列。

合成DNA可以经商业途径从几个公司获得。这种基因合成的一个 例子由Hayden和Mandecki在DNA 7：571(1988)中描述，此文作 为参考。

第二种方法是如Botstein and Shortle，Science 229 1193(1982)所述 的在单链载体上从已包含HBV基因组的载体克隆合适的限制片段，然后 进行位点特异性体外诱变。大肠杆菌K12菌株C600按照布达佩斯条约 于1982年6月2日保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 39132。该菌株含有重组质粒pRIT 10601所述质粒包含克隆在pBR 322 上的ay亚型的HBV基因组。可以用标准的重组DNA技术从这种克隆切 下编码S-基因指定的226个氨基酸HBsAg蛋白质的序列或编码前S 多肽的更长的序列。

一种合适的限制片段是来源于pRIT 10601 S-基因编码区内的 575bp XbaI-AccI片段。体外诱变有用的载体系统是商业上可获得的。由 此获得的突变基因片段被再插入到S-基因中。

第三种方法是如Ho et al.，Gene 77 51(1989)描述的用聚合酶链反应 (PCR)技术进行所需的突变性改变。

在各种情况下mHBsAg编码序列可以在任何合适宿主中合适启动 子的控制下表达。

包含编码mHBsAg的DNA序列的表达载体是新的，并且构成本发 明的另一方面。用所述表达载体转化的宿主构成本发明的另一方面。

在优选的一面，啤酒糖酵母、巴斯德毕赤氏酵母或多形汉逊氏酵母 可以用作宿主，并且在母启动子，例如酵母TDH3启动子(3-磷酸甘 油醛脱氢酶基因，参见Valenzuela et al.，1982；Bitter et al.，1988)或PH05 (Miyanohara et al.，1983)、MOX、FMDH(参见EP-A-0299 108)和AOX(参见EP-A-022 6846)控制下表达。

可用常规方法培养或发酵转化的宿主以及提取和纯化mHBsAg。从 mHBsAg酵母细胞纯化HBsAg的方法是本领域公知的，可以按照美国专利 4,649,192、4,683,294、4,694,074或4,738,926 的任何方法进行。本发明的mHBsAg的纯化用类似的方式进行。

用常规技术制备包含mHBsAg的疫苗，该疫苗含有免疫保护量的 mHBsAg，mBHsAg最好在缓冲生理盐水中，并且用任何各种已知的佐 剂(包括氢氧化名和磷酸铝)搀混或吸附。“免疫保护的”一词指施用 足量的mHBsAg，使得产生足量的保护性抗体或细胞介导的免疫反应， 给出针对感染因子的保护作用，而无严重的副作用。待施用的mHBsAg 的量取决于疫苗是否含佐剂，一般包含1～100mcg的蛋白质。优选的是 使用1～200mcg的蛋白质，更优选的是5～40mcg的蛋白质。待施用 的剂量可以由涉及观察受治疗者中抗体滴度和其它应答的标准剂量范围 研究确定。

所述mHBsAg也可以与其它HBsAg(例如，普通的HBsAg或同 源的或复合的HBsAg包含用于疫苗配方的全部或部分前S1或前S2多肽 的颗粒混合。它也可以与携带有其它生物体蛋白质表位的杂交HBsAg颗 粒，和与其它免疫原混合，以形成二价或多价疫苗。“Vaccines”，edited by Voller et al.，University Park Press，Baltimore，MD，U.S.A.，1978中一般 性地描述了疫苗制备方法。

所述mHBsAg作为免疫学试剂包含在用于变体HBV病毒感染等的 检测试剂盒中是有用的。它也可以用于用已知方法产生多克隆和单克隆 抗体，该单克隆抗体中的某些可能是对变体抗原特异性的，并且不识别 普通HBsAg。

在本发明的另一个实施方案中，与包含突变HBV抗体和其复合物 发生免疫反应的多肽和产生的针对这些多肽中的突变HBV特异性表位 的抗体在检测生物试验样品中突变HBV抗体存在或病毒和/或病毒抗原 存在的免疫测定中是有用的。可以变化这些免疫测定的方案，这些变化 是本领域公知的，其中一种变化已在本文中描述。所述免疫测定可以使 用一种病毒抗原，例如，得自含有突变HBV核酸序列的任何克隆的多 肽，或得自这些克隆中突变HBV核酸序列的复合核酸序列的我肽，或得 自衍生这些克隆中核酸序列的突变HBV基因组的多肽。或者，所述免疫 测定可以使用这些来源的病毒抗原的组合。可以使用例如针对相同病毒 抗原的单克隆抗体，或者针对不同病毒抗原的多克隆抗体。测定可以包 括但不限于基于竞争、直接反应或夹心面包型测定的那些测定。测定可 以使用固相或者可以经免疫沉淀或不采用固相的任何其它方法完成。本 文描述了使用作为信号产生化合物的标记的测定的例子和那些标记。也 可以用如未决美国专利申请608,849、070,647、418,981和 687,785中描述的生物素和抗生物素蛋白、酶标记或生物素抗生物素系 统扩增信号。包括突变HBV免疫显性区表位的重组多肽在感染病人的生 物试验样品中检测病毒抗体上是有用的。也期望抗体在辨别急性和非急 性感染中是有用的。通过包装合适的材料与进行测定所需的其它试剂和 材料，以及合适的测定说明构建适用于免疫诊断并含有合适的反应剂的 试剂盒，所述材料包括本发明的含有突变HBV表位的多肽或在合适容器 中的针对突变HBV表位的抗体。

本发明优选的一面提供了用于接种后体外诊断检测生物介质中抗 mHBsAg抗体，特别是中和抗体的试剂盒，其特征在于它包括：

a)本文所限定的mHBsAg，和

b)用于检测抗原-抗体反应的方法。

本发明另一方面提供了用于诊断、预防或治疗人乙型肝炎感染的包 含抗-mHBsAg抗体的抗体制剂。也提供了用有效量的这种抗- mHBsAg抗体处理人以预防或治疗乙型肝炎感染的方法。

本发明将由下列实施例说明。 实施例

1号病人是一名58岁男性，患非甲非乙型慢性肝炎6年。1992年8 月，在不存在HBsAg和其它HBV标记下用PCR发现HBV-DNA(图 1)。在这一阶段，病人已肝硬变。

2号病人是一名中国南方23岁女性，在1993年3月的常规化验中 她具有稍微升高的血清转氨酶(ALT)水平，HBsAg和HBeAg阳性，但 免疫球蛋白(Ig)M和IgG抗-HBs阴性。此后在1994年元月，她继 续发展为HBV-DNA阳性，现在抗-HB也是阳性，但HBsAg、HBeAg 和抗-HBs阴性(图2)。

两个病人都是丙型肝炎病毒(HCV)和HCV-RNA阴性。研究 了相同地区的30个慢性肝脏疾病或肝细胞癌的HBsAg阳性中国病人。 血清学研究。

用商业上可获得的酶免疫测定法(Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois，U.S.A)试验HBsAg、HBeAg、总抗-HBc、IgM抗 -HBs和抗-HBs。在英国证实了HBsAg和抗-Hbs结果。 单克隆抗体结合

将一组已知结合到“a”决定簇的抗-HBs单克隆抗体用于确定在 “a”决定族表位中更特异性的变化。用抗体RFHBS-1、RFHBs- 2和RFHBs-7涂覆聚苯乙烯珠(Northumbria Biologicals， Northumberland，UK)，然后与血清样品一起温育，所述血清样品是以 在磷酸盐缓冲盐水(pH7.2)中的50％新生小牛血清1∶2稀释的。用 “AusRIA II”试剂盒(Abbott Diagnostics)的125I-抗-HBs检测 结合的HBsAg。RFHBs-1和RFHBs-2结合到含有序列氨基酸124 -137的环状肽，RFHBs-7结合到HBsAg的氨基酸139-147环状 肽上。 肝炎标记

用酶免疫测定法(Abbott Laboratories，North Chicago，IL)试验 HBsAg、HBeAg、总抗-HBc、IgM抗-HBs和抗Hbs。 斑点印迹杂交

用改进的Weller et al.J.Med.Virol 9 273-280(1982)中详细描述的 方法经斑点印迹杂交测定HBV-DNA。 HBV-DNA的抽提、PCR和直接测序

在0.5％十二烷基硫酸钠、25mM乙酸钠、25mmMEDTA 1mg/ml 蛋白酶K(Boehringer Mannheim，Lewes，UK)存在下在200μl体积 中于68℃消化50μl血清2小时。在两次苯酚-氯仿提取后进行两次氯 仿提取，HBV-DNA用乙醇沉淀、用70％乙醇洗涤两次后，将DNA 沉淀重新悬浮到10μl水中。

将5μl抽提的HBV-DNA用作PCR扩增的模板。一组引物(adw 亚型)、PO5′(5′-TGCGGGTCACCATAT，2818-2833位)和POL3 (5′-AAGGATCCAGTTGGC，1409-1395位)(表2)用于获得 包括前-S1、前-S2和S基因的1800bp片段(图3)。另一组引物 M3(5′-CTGGGAGGAGTTGGGGAGGAGATTT，1781-1755 位)和3C(5′-CTAACATTGAGATTCCCGAGA，2460-2439位) 用于扩增前-C和C区。用不同组引物独立地在中国和英国分析相同的 血清样品。

用“fmol”测序试剂盒(Promega Co，Southampton，England) 进行PCR产物的直接测序。用25μCi 32P-腺苷三磷酸酶 (Amersham International，Amersham，UK)在10μl体积中用10单 位的多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)于37℃未端标记测序引 物(表1)10分钟。将1.5μl反应混合物直接用于测序反应中。用等 体积的4mol/l乙酸钠和α体积的异丙醇在室温下沉淀90μl PCR产物 10分钟，将沉淀离心10分钟，然后用70％乙醇洗涤两次。在重新悬浮 到20μl水中后，将9.5μl DNA和5单位的Taq酶(Promega Co.) 加入到具有未端标记的引物的反应缓冲液中。按照制造商的说明进行双 脱氧核苷酸终止测序。将循环测序进行30圈。分别进行变性、退火和抽 提步骤30秒、30秒和1分钟。 S基因的克隆和测序

直接测序结果表明2号病人的第一血清(1993年2月)具有野生型 和突变病毒混合物的迹象。将这一血清样品的PCR产物和2号病人的后 续产物克隆到pUC19载体以证实直接测序结果。用测序酶DNA测序试 剂盒(2.0型，USB，Cambridge，England)测定扩增HBV-DNA的 核苷酸序列。 疏水性图

分别用Prosis软件(Pharmacia，St.Albans，England)分析野生型 和变体病毒分离物HBsAg的“a”决定簇的氨基酸122到137和122到 139或140(包括插入的氨基酸)。 斑点印迹杂交

在两种单独的场合下PCR扩增后，1号病人血清中的HBV-DNA 是可检测的。在2号病人中，1993年3月和1993年9月在10μg/50 μl血清时，HBV-DNA是可以用斑点印迹杂交检测的。假如1.0μg HBV-DNA相当于2.3×106HBV基因组，则估计这一病人血清每ml 含有约4.6×107个病毒粒子。HBsAg在第一个样品中是可检测，但在 第二个样品中是不可检测的。在1994年元月，HBV-DNA仅可用PCR 检测，而HBsAg仍是不可检测的。 单克隆抗体结合研究

以HBsAg阳性病人为对照(adw)的1号和2号病人的结合研究 表明，在2号病人中，血清中HBsAg结合到所有三种单克隆抗体上，并 且可以用AusRIAII试剂盒多克隆抗-HBs检测(表2)。 前S-S基因和前C/C区的测序

分离物1和分离物2中前S基因分别由687bp和690bp组成，野生 型中由681bp组成。将突变体的S核苷酸和氨基酸序列与公开的相同亚 型(adw)的序列比较，也与相同地区的HBeAg阳性携带者的野生型 株比较(如表3所示)。

测序结果揭示出S基因中的插入(图4)。分离物1中密码子122 和123之间的插入序列编码两个额外的氨基酸(Arg-Ala)，分离物2 中密码子123和124之间的插入序列编码三个额外的氨基酸(Arg-Gly- Ala)(图5)。这些插入刚好出现在HBsAg“a”决定簇之前。这种 插入在公开的已知HBV亚型的序列中还未见描述，它不在从中国相同地 区的30个中国HBsAg阳性病人获得的共有序列中。

直接测序结果被克隆测序证实。在从2号病人取得的第一血清的10 个克隆中，8个具有以上描述的同相插入，其中的2个是野生型，而第 二和第三血清样品中的所有15个克隆都是变体的。因此，2号病人的第 一血清具有野生型和突变病毒混合的迹象，表明突变体的逐渐出现，所 述突变体在随后的血清中成为占优势的物种。以前没有有关前-S1、前 -S2基因中氨基酸缺失或取代的描述。 疏水图

按照Kyte和Doolittle的方法进行，给出下列平均疏水性指数：野 生型“a”决定簇的氨基酸122-137、-0.48；分离物1的氨基酸 122-139，-O；分离物2的氨基酸122-140，-0.89。因此突变 体“a”决定簇比野生型病毒的相同区疏水性更强。

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