一氧化碳(CO)气体在高浓度时是有毒的。然而，现在认识到它是一种 重要的信号分子(Verma等，Science259：381-384，1993)。已有提示表明一 氧化碳作为脑内的神经元信使分子(Id.)和下丘脑内的神经内分泌调节因子 起作用(Pozzoli等.，Endocrinology 735：2314-2317，1994)。和一氧化氮(NO)一 样，一氧化碳是平滑肌的松弛剂(Utz等，Biochem Pharmacol.47：195-201， 1991；Christodoulides等，Circulation 97：2306-9，1995)并且抑制血小板的聚 集(Mansouri等，Thromb Haemost.48：286-8，1982)。在一些模型中，吸入 低水平的一氧化碳显示具有抗炎效果。
肝炎是一种特征为肝的炎症的疾病。所述炎症可通过肝小叶的弥漫状 或片状坏死表征。肝炎的致病因子包括，例如病毒，例如特定的肝炎病毒， 例如甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和庚型肝炎病毒；酒精；和其它药物(例 如异烟肼(isoniazid)，甲基多巴(methyldopa)，对乙酰氨基酚(acetaminophen)， 胺碘酮(amiodarone)和呋喃坦丁(nitrofurantoin)(见The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，17版，第42章，第4部分)。
发明简述
本发明部分基于这样的发现：给药CO可阻止肝炎的发展。
相应地，本发明涉及治疗，预防，或降低患者患肝炎风险的方法。所 述方法包括鉴定诊断为患有或易患肝炎的患者(例如诊断为患有或易患肝炎 的患者)，以及给药该患者包含有效治疗患者的肝炎的量的一氧化碳的药物 组合物。
药物组合物可通过本领域已知的任何将气体和/或液体给药患者的方法 给药患者，例如通过吸入，吹入，输注，注射，和/或摄取。例如，在本发 明的一个实施方案中，所述药物组合物通过吸入给药患者。在另一实施方 案中，所述药物组合物通过口服给药患者。在另一实施方案中，将所述药 物组合物直接给药患者的腹腔。在另一实施方案中，所述药物组合物通过 体外膜气体交换装置(extracorporeal membrane gas exchange device)或人工肺 给药患者。在另一实施方案中，所述患者是嗜酒者(alcoholic)。
所述患者可以是动物，人或非人。例如，所述患者可以是任何哺乳动 物，例如人，其它灵长类，猪，啮齿类例如小鼠和大鼠，兔，豚鼠，仓鼠， 母牛，马，猫，狗，绵羊和山羊。肝炎可以是多种因素的结果，或者人被 认为可能由于所述多种因素患上肝炎，所述因素例如，感染(如甲型，乙型， 丙型，丁型，戊型和/或庚型肝炎病毒的感染)；饮酒(例如酗酒)；药物使用(例 如一种或多种以下药物：例如对乙酰氨基酚，麻醉药，抗肺结核药物，抗 真菌剂，抗糖尿病药物，神经抑制药物，以及用于治疗HIV感染和AIDS 的药物)；自身免疫性疾病(例如自身免疫性肝炎)；和/或外科手术。所述药 物组合物可以是任何形式，例如气体形式或液体形式。
在另一实施方案中，所述方法还包括给予所述患者至少以下治疗之一： 在患者体内诱导HO-1或铁蛋白；在患者体内表达重组HO-1或铁蛋白；以 及将包含HO-1，胆红素，胆绿素，铁蛋白，去铁铁蛋白，铁，去铁敏 (desferoxamine)或铁葡聚糖的药物组合物给药该患者。还涉及CO和上述试 剂之一在制备治疗或预防肝炎的药物中的用途。
在另一实施方案中，肝炎(或患肝炎的危险性)不是由手术(例如腹部或 移植手术)，细菌内毒素，败血症性休克，和/或系统性感染造成的。
另一方面，本发明涉及治疗或预防患者的肝炎的方法，其包括以下步 骤：鉴定患有或易患肝炎的患者(例如诊断为患有或易患肝炎的患者)，提供 包含含有一氧化碳气体的加压气体的容器，将所述加压气体从所述容器中 释放出来以形成包含一氧化碳气体的环境，以及将所述患者暴露于该环境， 所述环境中一氧化碳的量足以治疗患者的肝炎。
本发明另一方面涉及对患者进行腹部手术例如肝移植的方法，所述方 法包括鉴定需要腹部手术(其中所述腹部手术可能导致肝炎)的患者；对所述 患者进行腹部手术，并且在进行该步骤前，期间，或以后使所述患者吸入 足以降低患者患肝炎的可能性的量的一氧化碳气体。还涉及CO在制备用于 治疗或预防肝炎药物，例如气体或液体药物中的用途。
本发明还涉及治疗患有或易患不是由手术和/或内毒素导致的肝炎(例 如由本文所述任何除手术和/或内毒素导致的肝炎)的患者的肝炎的方法。所 述方法包括鉴定患有或易患不是由手术和/或内毒素导致的肝炎的患者，并 将包含治疗所述患者的肝炎的有效量的一氧化碳的药物组合物给药所述患 者。
本发明还涉及将诱导肝炎的药物(例如肝毒性药物，例如异烟肼，甲基 多巴，对乙酰氨基酚，胺碘酮或呋喃坦丁)给药患者的方法。所述方法包括 将所述药物给药该患者，并在给药所述药物之前，期间或以后将包含治疗 所述患者的肝炎的有效量的一氧化碳的药物组合物给药该患者。
另一方面，本发明提供了包含医用级压缩CO气体的容器。所述容器带 有表明该气体可用来治疗患者的肝炎的标签。可选或此外，所述容器还带 有表明该气体可以和诱导肝炎的药物(即肝毒性药物)例如对乙酰氨基酚联 合给药患者的标签。CO气体可以与氮气混合，与一氧化氮和氮气混合，或 者与含氧的气体混合。CO气体在混合物中的浓度可以是至少约0.025％，例 如至少约0.05％，0.10％，0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。
本发明还涉及CO在制备治疗或预防肝炎的药物中的用途。所述药物也 可根据本发明所述的方法用于治疗患有或易患肝炎的患者的肝炎的方法 中。所述药物可以是本文所述的任何形式，例如液体或气体CO组合物。
除非另有限定，本文的所有技术和科学术语具有的含义和本发明所属 领域的熟练技术人员通常所理解的一样。适宜的方法和材料在下文中描述， 但与其类似或对等的方法和材料也可用于本发明的实践和检测中。所有公 开出版物，专利申请，专利，和其它本文提到的参考文件的全文内容都包 含在本文中作为参考。如果有冲突，以本说明书，包括其中的定义在内为 准。所述材料，方法和实施例只作为举例，而不是意图作为限制。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下说明中详述。本发明的其 它特征，目的，和优点从说明书和权利要求书中明显可见。
附图说明
图1是柱图，其显示诱导HO-1防止小鼠肝细胞由于TNF-α/D-gal的 诱导而出现细胞死亡。CoPP＝钴原卟啉；ALT＝血清丙氨酸氨基转移酶；TNF ＝肿瘤坏死因子α。结果显示为6-8只小鼠/组的均值±SD，*P＜0.005。
图2是柱图，其显示外源性CO防止肝细胞由于TNF-α的诱导而以 cGMP/p38途径依赖的方式和NF-κB活化依赖的方式出现细胞死亡。CO＝ 一氧化碳；Air＝室内空气；TNF＝肿瘤坏死因子α；BAY＝BAY 11-7082(抑 制NF-κB活化)；IκB＝IκBα(阻止NF-κB活化)；ODQ＝1H-(1，2，4)-噁 二唑啉并(oxadiazolo)-(4，3-a)喹喔啉(quinoxalin)-1-酮(选择性鸟苷酸环化酶 抑制物)；Lac-Z＝pIEP-Lac-Z(腺病毒对照)。结果显示为四次独立试验的三 个重复孔的均值±SD(*P＜0.01)。
图3是柱图，显示外源性CO防止人肝细胞受到TNF-α/放线菌素 -D(ActD)诱导而出现细胞死亡。CO＝一氧化碳；Air＝室内空气；TNF＝TNF- α/ActD。结果显示为三次独立试验的重复孔的均值±SD。*P＜0.05。
图4是柱图，显示外源性CO导致肝细胞中NF-κB的活化增加。CO＝ 一氧化碳；Air＝室内空气；BAY＝BAY 11-7082；CM＝细胞因子混合物(TNF- α(500U/ml)，IL-1β(100U/ml)，以及IFN-δ(100U/ml))。结果显示为三次独 立试验的重复孔的均值±SE。相对于空气的*P＜0.001。
图5是聚丙烯酰胺凝胶的图片，显示了外源性CO诱导NF-κB核易位 以及DNA结合的增加，这是通过电泳位移分析(EMSA)测定的。FP＝游离 (free)探针(没有核蛋白，因此无DNA结合)；TOTAL＝没有抗体超位移 (supershift)的NFκB带。
图6A-6C是经过免疫染色(以检测p65的细胞核定位)的原代肝细胞的显 微照相，显示了外源性CO导致肝细胞中NF-κB的活化增加。图6A：暴 露于空气的肝细胞。图6B：暴露于细胞因子混合物(TNF-α(500U/ml)，IL-1 β(100U/ml)，以及IFN-δ(100U/ml))的肝细胞。图6C：暴露于CO的肝细 胞。图像代表6个不同的视野。柱表示10μm。
图7是柱图，显示外源性CO诱导的对肝细胞的保护与NF-κB依赖的 iNOS表达有关。CO＝一氧化碳；Air＝室内空气；BAY＝BAY 11-7082；CM＝ 细胞因子混合物。显示的结果是来自四次独立试验的三个重复孔的平均值 ±SE。相对于空气和空气/BAY处理的细胞而言，*P＜0.001。
图8是Western印迹的图，显示与单独暴露于TNF-α相比，在CO存 在下将肝细胞暴露于TNF-α，所述肝细胞中iNOS蛋白的表达明显升高。 iNOS＝可诱导的一氧化氮合酶；CO＝一氧化碳；Air＝室内空气；TNF＝TNF- α/ActD；β-肌动蛋白＝对照蛋白。所述免疫印迹代表三次独立试验。
图9是柱图，显示iNOS活性缺陷的小鼠(inos-/-)的肝细胞不受到CO针 对TNF-α诱导的细胞死亡的保护。CO＝一氧化碳；Air＝室内空气；TNF＝ TNF-α/ActD；inos-/-＝iNOS剔除小鼠；L-NIO＝L-N5-(1-亚氨基乙基)鸟氨酸 -2HCl。结果显示为四次独立试验的三个重复孔的平均值±SE。相对于非 TNF/ActD和CO/TNF/ActD-处理的细胞，*P＜0.01。
图10是柱图，显示外源性给予的CO阻止小鼠中TNF-α/D-Gal诱导 的肝损伤。ALT＝血清丙氨酸氨基转移酶；CO＝一氧化碳；Air＝室内空气。 结果表示为18-20只小鼠的均值±SD。相对于空气处理的细胞，*P＜0.001。
图11A-11H是肝样品的显微照相，显示外源性给予的CO阻止小鼠中 TNF-α/D-Gal诱导的肝损伤。图11A和11B：分别将来自小鼠的肝样品暴 露于室内空气和CO，并用苏木精(haematoxylin)和伊红(H&E)染色。图 11C和11D：将TNF-α/D-Gal处理后小鼠的肝样品分别暴露于室内空气和 CO，并用H&E染色。图11E和11F：将TNF-α/D-Gal处理后小鼠的肝样 品分别暴露于室内空气和CO，并对其染色以检测活化的capase-3。图11G 和11H：将TNF-α/D-Gal处理后小鼠的肝样品分别暴露于室内空气和CO， 且用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)进行染 色。所示图像是来自每组4只小鼠个体的15-20个切片/肝中的代表性切片。 柱表示20μm。
图12是Western印迹的图，显示暴露于TNF-α/D-Gal并用吸入CO处 理的小鼠的肝显示iNOS蛋白水平增加。野生型＝野生型小鼠；iNOS-/-＝iNOS 缺陷的小鼠；CO＝一氧化碳；Air＝室内空气；TNF＝TNF-α/D-Gal；β-肌 动蛋白＝对照蛋白。
图13A-13D是肝样品的显微照相，显示暴露于TNF-α/D-Gal并用吸入 CO处理的小鼠的肝显示iNOS蛋白水平增加。图13A：暴露于空气的小鼠 的肝样品。图13B：暴露于CO的小鼠的肝样品。图13C：暴露于TNF-α/D-Gal 和室内空气的小鼠的肝样品。图13D：暴露于TNF-α/D-Gal和CO的小鼠 的肝样品。图中所示为6只独立动物和6-10个不同的切片/肝样品的的代表 性结果。柱表示20μm。
图14是柱图，显示CO在缺乏iNOS功能/表达时对肝损害没有保护作 用。L-NIL＝L-N6(1-亚氨基乙基)-赖氨酸-二氢氯化物(iNOS的选择性抑制 物)；CO＝一氧化碳；Air＝室内空气；TNF＝TNF-α/D-Gal。结果显示为6-8 只动物/组的均值±SD。相对于CO/TNF-α/D-Gal以及空气和CO对照，*P ＜0.01。
图15是Western印迹的图，表明CO处理的小鼠的肝在存在或缺失TNF- α/D-Gal时均显示HO-1的表达增加。CO＝一氧化碳；Air＝室内空气； TNF＝TNF-α/D-Gal；β-肌动蛋白＝对照蛋白。印迹是两个独立试验的代表 性结果。
图16是Western印迹的图，表明如果用L-NIL抑制iNOS，CO处理的 小鼠的肝在存在或缺失TNF-α/D-Gal时均显示HO-1的表达增加。CO＝一 氧化碳；Air＝室内空气；TNF＝TNF-α/D-Gal；β-肌动蛋白＝对照蛋白； L-NIL＝L-N6(1-亚氨基乙基)-赖氨酸-二氢氯化物(iNOS的选择性抑制物)。 印迹是两个独立试验的代表性结果。
图17是柱图，显示CO诱导的HO-1阻止小鼠中TNF-α诱导的肝损伤。 ALT＝血清丙氨酸氨基转移酶；Air＝室内空气；TNF＝TNF-α/D-Gal；Sn＝ 锡原卟啉(HO-1的抑制物)；VP＝V-PYRRO(氧化氮供体)。结果表示为8-10 只小鼠/组的均值±SD。相对于CO/TNF/D-Gal处理的小鼠，*P＜0.05。
图18是柱图，显示HO-1的诱导防止不依赖于iNOS活性的TNF-α诱 导的肝损害。ALT＝血清丙氨酸氨基转移酶；Air＝室内空气；TNF＝TNF-α /D-Gal；L-NIL＝L-N6(1-亚氨基乙基)-赖氨酸-二氢氯化物(iNOS的选择性抑 制物)；CoPP＝钴原卟啉(HO-1的诱导物)；iNOS-/-＝iNOS缺陷的小鼠。结果 显示为6-8只小鼠/组的均值±SD。相对于Air/TNF和L-NIL/TNF，*P＜0.001。
图19是柱图，显示HO-1的表达是CO诱导的保护作用(防止小鼠肝细 胞由于TNF-α/D-gal的诱导而出现细胞死亡)所需的。野生型(黑柱)＝从野 生型C57BL/6J小鼠分离的肝细胞；homx-l-/-(白柱)＝从HO-1裸鼠中分离的 肝细胞；CO＝一氧化碳；Air＝室内空气；TNF-α＝TNF-α/ActD。相对于 CO处理过的非TNF-α/ActD处理的细胞和TNF-α/D-Gal处理的细胞，*P ＜0.01。
图20是柱图，显示显示HO-1的表达是CO诱导的保护作用(防止小鼠 肝细胞由于TNF-α/ActD的诱导而出现细胞死亡)所需的。野生型(黑柱)＝ 从野生型C57BL/6J小鼠分离的肝细胞；homx-l-/-(白柱)＝从HO-1裸鼠中分 离的肝细胞；SNAP＝另(s)-亚硝基-N-乙酰基-青霉胺(NO供体)；Air＝室内空 气；TNF＝TNF-α/ActD。相对于非TNF-α/ActD处理的细胞和TNF-α/ActD 处理也用NO处理过的的细胞，*P＜0.01。
图21是柱图，显示暴露于CO的小鼠不受对乙酰氨基酚诱导的肝损伤。 ALT＝血清丙氨酸氨基转移酶；Air＝室内空气；APAP＝对乙酰氨基酚。结 果显示为4-8只小鼠/组的均值±SD。

本文术语“一氧化碳”(或“CO”)描述了气态的，加压成液态的，或者 溶解于水溶液中的分子一氧化碳。本说明书术语“一氧化碳组合物″或“包 含一氧化碳的药物组合物”用于描述可给药患者和/或器官例如肝的、含有 一氧化碳的气体或液体组合物。熟练医师(practioner)知道在具体应用中，优 选何种形式的药物组合物，例如气体，液体，或气体和液体的形式。
本文术语“有效量”和“有效地治疗”指一段时间内(包括急性或慢性 给药以及定期的或连续的给药)给药一定量或浓度的一氧化碳，所述量或浓 度在其给药用来产生目的效果或生理结果的背景下是有效的。本发明所用 有效量的一氧化碳包括例如预防肝炎，降低患肝炎的可能性，减轻肝炎症 状，或者改善其它肝炎治疗的效果的量。
在气体的情况下，有效量的CO通常在约0.0000001％到约0.3％重量之 间，例如0.0001％到约0.25％重量，优选CO重量至少约0.001％，例如至 少0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％， 0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％重量。优选的范围包括，例如0.001％ 到约0.24％，约0.005％到约0.22％，约0.005％到约0.05％，约0.010％到 约0.20％，约0.02％到约0.15％，约0.025％到约0.10％，或约0.03％到约 0.08％，或约0.04％到约0.06％。优选的在CO溶液的情况下，有效量通常 在约0.0001到约0.0044g CO/100g溶液，例如至少0.0001，0.0002，0.0004， 0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020，0.0021， 0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或 0.0042g CO/100g水溶液。优选的范围包括，例如约0.0010到约0.0030g CO/100g液体，约0.0015到约0.0026g CO/100g液体，或者约0.0018到约 0.0024g CO/100g液体。熟练的医师应理解根据应用的情况可使用这些范围 外的量。
本说明书所用术语“患者”描述根据本发明提供的方法对其进行治疗 的动物，人或非人。本发明涉及兽医学应用。该术语包括但不限于哺乳动 物，例如人，其它灵长类，猪，啮齿类例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，仓 鼠，牛，马，猫，狗，绵羊和山羊。本文术语“治疗”是指延缓患者病情 的发生，抑制，预防或缓解患者疾病(例如肝炎)的影响。
本文术语“肝炎”是本领域已知的术语，在文中指患者以肝炎症为部 分特征的疾病。肝炎的致病因子包括，例如感染，如具体肝炎病毒的感染， 如甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和庚型肝炎病毒的感染；或肝毒性制剂， 例如肝毒性药物(例如，异烟肼，甲基多巴，对乙酰氨基酚，胺碘酮，和呋 喃坦丁)，和毒素(例如内毒素或环境毒素)。肝炎可见于在手术后的肝移植 患者。其它可导致肝炎的药物和毒素(即，肝毒性制剂)的实例见Feldman： Sleisenger&Gordtran’s Gastrointestinal and Liver Disease，第七版，的17章 (Liver Diseases Caused by Drugs，Anesthetics，and Toxins)所述，其全部内容 包含在文中作为参考。这种实例包括，但不限于，甲基多巴和苯妥英，巴 比妥类，例如苯巴比妥；磺胺类(例如组合药物如复方新诺明(磺胺甲噁唑 (sulfamethoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprim))；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；水 杨酸类(salicylates)；双硫醒(disulfiram)；β-肾上腺能阻滞剂，例如，醋丁洛 尔(acebutolol)，拉贝洛尔(labetalol)和美托洛尔(metoprolol))；钙通道阻滞剂， 例如硝苯地平(nifedipine)，维拉帕米(verapamil)和地尔硫(diltiazem)；合成 类视黄醛(retinoids)，例如依曲替酯(etretinate)；胃酸抑制药，例如，奥美替 丁(oxmetidine)，乙溴替丁(ebrotidine)，西咪替丁(cimetidine)，雷尼替丁 (ranitidine)，奥美拉唑(omeprazole)和法莫替丁(famotidine)，纽柯春 (leukotriene)受体拮抗剂，例如扎鲁斯特(zafirlukast)；抗肺结核药物，例如 利福平和吡嗪酰胺；抗真菌剂，例如酮康唑，特比奈酚，氟康唑，和伊曲 康唑；抗糖尿病药物，例如噻唑烷二酮类(thiazolidinediones)，例如曲格列 酮和罗格列酮；用于治疗神经疾病的药物，例如神经抑制药物(neurleptic agents)，抗抑郁药(例如氟西汀(fluoxetine)，帕罗西汀(paroxetine)，万拉法新 (venlafaxine)，曲唑酮(trazodone)，托卡朋(tolcapone)，和奈法唑酮 (nefazodone)，安眠药(例如阿吡坦(alpidem)，唑吡坦(zolpidem)，和本他西泮 (bentazepam))，以及其它药物，例如单满吖啶氨(tacrine)，硝苯呋海因 (dantrolene)，利鲁唑(riluzole)，替扎尼啶(tizanidine)和双苯丙乙胺(alverine)； 非类固醇类抗炎药，例如溴芬那酸(bromfenac)；COX-2抑制物；醋酸环丙 孕酮酯(cyproterone acetate)；来氟诺米(leflunomide)；抗病毒剂，例如非阿尿 苷(fialuridine)，地达诺新(didanosine)，扎西他宾(zalcitabine)，司他夫定 (stavudine)，拉米夫定(lamivudine)，齐多夫定(zidovudine)，阿波卡韦 (abacavir)；抗癌药，例如他莫昔芬和甲胺蝶呤，毒品(recreational drug)，例 如可卡因，苯环利定(phencyclidine)，和5-甲氧基-3，4-亚甲基二氧脱氧麻黄 碱(methylenedioxymethamphetamine)；L-天冬酰胺酶；阿莫地喹 (amodiaquine)；海蒽酮(hycanthone)；麻醉剂；例如氟烷(halothane)，安氟醚 (enflurane)和异氟醚(isoflurane)；维生素，例如维生素A；以及饮食和/或环 境毒素，例如吡咯烷士啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids)，来自毒鹅膏菌 (Amanita phalloides)或其它毒蘑菇的毒素，黄曲霉素(aflatoxin)，砷(arsenic)， Bordeaux混合物(铜盐和石灰)，氯乙烯单体(vinyl chloride monomer)，四氯 化碳(carbon tetrachloride)，铍(beryllium)，二甲基甲酰胺(dimethylformamide)， 二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine)，methylenedianiline，磷，十氯酮 (chlordecone)(Kepone)，2，3，7，8-四氯-二苯并(dibenzo)p-二氧(杂)芑 (dioxin)(TCDD)，四氯乙烷，四氯乙烯，2，4，5-三硝基甲苯，1，1，1-三氯乙烷， 甲苯和二甲苯，以及已知的“草药”，例如麻黄素和丁香油酚(eugenol)。
肝炎的症状包括疲劳，食欲不良，胃不适，和/或黄疸(皮肤和/或眼睛发 黄)。对肝炎更详细的描述见，例如The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，17版，第42章，第4部分，第44章，第4部分，第40章，和第4 部分，其全部内容包含在本文中作为参考。
熟练医师应理解，医师可通过本领域已知的任何方法诊断患者患有 肝炎，例如通过，用例如血液检验中的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平， 碱性磷酸酶(AP)水平，和胆红素水平来评估肝功能。
认为可能出现肝炎的个体尤其可从本发明受益，主要是因为在出现任 何肝炎的证据以前，就可以开始预防性治疗。“易患”的个体包括，例如被 肝炎病毒感染的患者，或者患有本文所述任何疾病和具有本文所述的危险 因素的个体(例如暴露于肝毒性药物的患者)。熟练的医师应理解通过医师的 诊断可确定患者易患肝炎。
在所述患者被诊断为患有肝炎或与肝炎相关的任何疾病，或者被诊断 为具有任何与该患者患肝炎的可能性增加相关的危险因素(例如所述患者近 期已经，正在，或即将暴露于肝毒性制剂，例如肝毒性药物如对乙酰氨基 酚)的当天，将治疗肝炎有效量的CO给药该患者。患者可吸入的CO的浓 度可以从10ppm到1000ppm，例如，约100ppm到约800ppm，约150ppm 到约600ppm，或约200ppm到约500ppm。优选的浓度包括，例如，约30ppm， 50ppm，75ppm，100ppm，125ppm，200ppm，250ppm，500ppm，750ppm， 或约1000ppm。可将一氧化碳间断或连续给药患者。可给药CO约1，2，4， 6，8，10，12，14，18或20天，或者20天以上，例如1，2，3，5或6个 月，或者直到所述患者被诊断为不再易患肝炎。在给定的天数内，CO可全 天连续给药，或者间断给药，例如每天吸入CO一次(使用高浓度CO)，或 者每天吸入达23小时，例如达20，15，12，10，6，3或2小时每天，或 达1小时每天。
如果所述患者需要用肝毒性药物(例如因医师处方所开)进行治疗，所述 患者可以在给药所述药物之前，期间和/或以后用CO(例如气体CO组合物) 进行治疗。例如，可将CO间断或连续地给药所述患者，从给药所述药物前 0到20天即开始(且当给药多种药剂时，在各单独药剂以前)，例如开始于所 述给药前至少约30分钟，例如约1，2，3，5，7或10小时，或约1，2，4， 6，8，10，12，14，18或20天，或者20天以上。可选或此外，可在给药 所述药物的同时将CO给药所述患者。可选或此外，可在给药所述药物后将 CO给药所述患者，例如在所述给药后立刻开始，并继续间断性或持续给药 1，2，3，5，7或10小时，或约1，2，5，8，10，20，30，50或60天， 不定期地，或者直到医师确定不再需要给药CO(例如当所述肝毒性药物从 身体中消除或者不再对肝造成损害)。
制备气体组合物
CO组合物可以是气体一氧化碳组合物。可用于本发明的方法中的压缩 气体(compressed gas)或加压气体(pressurized gas)，可自任何商业来源获得， 并可存在于任何类型的适合保存压缩气体的容器(vessel)中。例如，压缩或 加压气体可以自任何提供医用压缩气体例如氧气的来源获得。本文术语“医 用级”气体，指适合给药本文所定义的患者的气体。提供用于本发明的方 法的包括一氧化碳的加压气体时，可使得所需的最终组合物中的所有气体 (例如，CO，He，NO，CO2，O2，N2)在同一容器内，除NO和O2不能保存 在一起的情况。可选的，本发明的方法可使用多个含有单一气体的容器进 行。例如，可提供含或不含其它气体的含一氧化碳的单个容器，其内容物 可选地与室内空气或其它容器中的内容物混合，所述其它容器例如含有氧 气，氮气，二氧化碳，压缩空气，或任何其它适合的气体或其混合物的容 器。
根据本发明给药患者的气体组合物通常含有0％到约79％重量的氮气， 约21％到约100％重量的氧气和约0.0000001％到约0.3％重量(相当于约1 ppb或0.001ppm到约3,000ppm)的CO。优选气体组合物中氮气量是约79％ 重量，氧气量是约21％重量，且CO量是约0.0001％到约0.25％重量。CO的量优选是至少约0.001％，例如，至少约0.005％，0.010％，0.02％，0.025％， 0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％， 或0.24％重量。CO的优选范围包括约0.005％到约0.24％，约0.01％到约 0.22％，约0.015％到约0.20％，约0.08％到约0.20％，和约0.025％到约0.1％ 重量。注意到根据应用情况，可短期(例如一次或数次呼吸)使用具有高于 0.3％(例如1％或更高)的CO浓度的气体CO组合物。
可用气体CO组合物产生包含CO气体的环境(atmosphere)。包含适当 水平的CO气体的环境可通过例如以下方式产生：提供含有包含CO气体的 加压空气的容器，并将所述加压气体从所述容器中释放到小室(chamber)或 空间内，在该小室或空间内形成包括CO气体的环境。可选地，所述气体可 被释放到使该气体在呼吸面罩或呼吸管内达到最高浓度的一种仪器中，从 而在呼吸面罩或呼吸管中创造出包含CO气体的环境，使得患者成为该室内 唯一暴露于明显水平的CO的人。
环境中CO的水平可通过本领域已知的任何方法检测或监测。这种方法 包括电化学检测，气相色谱，放射性同位素计数，红外吸收，比色法，和 基于选择性膜的电化学方法(见例如Sunderman等，Clin.Chem.28： 2026-2032，1982；Ingi等，Neuron 16：835-842，1996)。亚百万分数级(sub-parts per million)CO水平可通过例如，气相色谱和放射性同位素计数检测。此外， 本领域已知亚-ppm范围内的CO水平可通过中红外气体传感器(midinfrared gas sensor)在生物组织中检测(见例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart. Circ.Physiol 280：H482-H488，2001)。CO传感器和气体检测仪可自多种商 业来源获得。
制备液体组合物
CO药物组合物也可以是液体CO组合物。液体可通过本领域已知的任 何使气体溶于液体的方法制成CO组合物。例如，所述液体可以置于所谓的 “CO2温育箱”中并暴露于持续的CO气流，优选由二氧化碳平衡，直到液 体中CO达到所需的浓度。另一实施例中，CO气体可直接″吹入(bubbled)″ 液体中，直到液体中CO达到所需的浓度。溶解于给定水溶液中的CO量随 温度的降低而增加。在另一实施例中，适宜的液体可流经允许气体扩散的 管道系统(tubing)，该管道系统在包含CO的环境(例如利用如体外膜氧合器 (extracorporeal membrane oxygenator)的仪器)中运行。CO扩散进入液体产生 液体CO组合物。
很可能地，这种用于引入活动物体内的液体组合物，当其被引入动物 体内时，温度为或约为37℃。
液体可以是本领域熟练技术人员已知的任何适合给药患者的液体(参 见，例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。通常，所述液体是水溶液。溶液的实例包括磷酸盐缓冲的盐 水溶液(PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，柠檬酸盐溶液， 和成斯康星大学(University of Wisconsin)(UW)溶液(Oxford Textbook of Surgery，Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。在本发明的一个 实施方案中，所述液体是林格氏液(Ringer′s solution)，例如，乳酸盐林格氏 溶液，或任何可输注入患者体内的其它液体。在另一实施方案中，液体包 括血液，例如全血。
任何适合的液体可通过气体扩散器饱和到设定的CO浓度。可选地，可 用经质量控制含有给定水平的CO的预制溶液。可通过使用带有与CO分析 仪连接的透气但不透液的膜的仪器进行测定来对剂量进行精确控制。可将 溶液饱和到所需有效浓度并保持在这些水平。
用CO组合物治疗患者
可用本领域已知的任何将气体和/或液体给药患者的方法使用一氧化碳 组合物治疗患者。一氧化碳组合物可给药诊断为，或者确定易患肝炎的患 者。本发明还涉及将液体或气体一氧化碳系统地给药患者(例如通过吸入和/ 或摄取)，以及将所述组合物局部地给药患者的肝(例如通过导入腹腔)。
系统地递送CO
气体CO组合物可系统地递送给患者，例如诊断为，或者确定易患肝炎 的患者。气体CO组合物通常通过嘴或鼻道吸入肺内给药，在肺内CO很容 易地被吸收到患者的血流内。治疗性气体组合物中所用活性化合物(CO)的 浓度有赖于CO的吸收，分布，灭活和排出(通常通过呼吸)速率以及本领域 熟练技术人员已知的其它因素。还应理解，对于任何具体受试者而言，具 体的剂量方案应根据个体需要和实施或监督组合物给药的人员的职业判断 随时间进行调整，而且前述的浓度范围只是示例性的，而不是为限制所要 求的组合物的范围或实践。可监控治疗并调整CO剂量来确保对患者的最适 治疗。本发明还涉及CO的急性，亚急性和慢性给药，所述给药方式有赖于 例如患者肝炎的严重性或持续性。CO可在足以治疗病情并显示预期药理学 或生物学效应的一段时间内(包括不定时地给药)递送给患者。
以下是一些可用于对患者给药气体CO组合物的方法和器械的实例。
呼吸机(ventilator)
可购买医用级CO(可有多种浓度)，所述CO与空气或其它含有氧气的 气体混合于加压气体标准罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述气体为非反 应活性(non-reactive)的，而本发明方法所需浓度远远低于可燃范围(空气中 10％)。在医院中，推定要将气体递送到床边，在那里使之与氧气或室内空 气在混合器(blender)内混合，达到所需的ppm浓度(百万分之几)。患者通过 呼吸机吸入气体混合物，呼吸机的流率根据患者的舒适程度和需要来设定。 通过肺图(即呼吸速率，潮气量等)可确定该流率。可将防止患者不必要地接 受超过所需量的一氧化碳的自动防故障机制(fail-safe mechamism)设计在递 送系统中。患者的CO水平可通过研究以下指标进行监测：(1)静脉血中可 测的碳氧血红蛋白(COHb)，和，(2)从呼吸机侧部收集的呼出CO。可根据 患者的健康状况和标志物调节CO暴露。如果有必要，还可通过吸入100％ 的氧气洗出CO。CO是不被代谢的，因此除很小一部分被转化成CO2，无 论吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治疗性递送 CO而不导致随后的低氧状况。
面罩和幕(Tent)
含有CO的气体混合物如上述方法制备，从而允许患者通过面罩或幕被 动吸入。吸入浓度可改变，并通过简单地换成吸入100％的O2进行洗涤。 可用自动防故障机制在面罩或幕或在其附近监测CO水平，所述自动防故障 机制可防止吸入过高浓度的CO。
便携式吸入器(Portable inhaler)
加压CO可被包装入便携式吸入器并吸入经过计量的剂量，例如使得不 住院的受体接受间歇性治疗。可将不同浓度的CO包装到容器中。该仪器可 简单到只是带有开-关阀和管子的含有稀释CO的小储罐(例如低于5kg)，从 所述管子中，患者可根据标准方案或需要吸入CO。
静脉内人工肺(Intravenous Artificial Lung)
设计为递送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中气体交换的导管器械) 可用于CO递送。该导管植入后，定位于一根大静脉中并可系统性递送所需 浓度的CO或将其递送到局部位点。所述递送可以是短时间内局部递送高浓 度CO到手术位点例如邻近肝的局部递送(所述高浓度在血流中迅速稀释)， 或者相对较长的时间内暴露于较低浓度的CO(见例如，Hattler等，Artif. Organs 18(11)：806-812(1994)；和Golob等，ASAIO J.，47(5)：432-437 (2001)).
正常气压小室(Normobaric chamber)
在某些情况下，需要将患者整体暴露于CO。患者须位于充满CO的密 闭舱中，其中CO的水平不会对患者造成危险，或者该水平造成可接受的危 险但不会使旁观者处于被暴露的危险。完成暴露后，用空气(例如，21％O2， 79％N2)充满该舱，并使用CO分析仪分析样品，以保证在允许患者离开暴 露系统前没有任何CO存留。
系统性递送液体CO组合物
本发明还涉及，可产生包含CO组合物的水溶液用于系统地递送给患 者，例如从口递送和/或输注到患者体内，例如通过静脉内，动脉内，腹 膜内和/或皮下。例如，液体CO组合物，如CO饱和的林格氏溶液，它可 以输注给患肝炎或易患肝炎的患者。可选或此外，被CO部分或完全饱和的 全(或部分)血可输注入此患者。
本发明还涉及应用能够递送可用的CO气体组合物或液体CO组合物的 剂量的制剂(例如CO释放性胶，乳膏，软膏剂，锭剂或膜片)。
使用一氧化碳对器官进行局部治疗
可选或此外，一氧化碳组合物还可直接给药肝，例如整个肝，或给药 肝的任何部分。气体组合物可通过本领域已知的将气体吹入患者的任何方 法，直接给药患者的肝。例如，在腹腔镜操作中，气体如二氧化碳通常进 入患者的腹腔从而辅助检查(见例如Oxford Textbook of Surgery，Morris和 Malt编，Oxford University Press(1994))。熟练医师将理解类似的方法可以用 于将一氧化碳组合物直接给药患者的肝。
液体CO组合物也可局部给药患者的肝。液体形式的组合物可通过本领 域已知的任何将液体给药患者的方法给药。和气体组合物一样，液体组合 物可直接给药肝。液体，例如含有溶解的CO的盐水溶液，可以在腹腔镜手 术中注入患者的腹腔。熟练医师将理解类似的方法可以用于将液体一氧化 碳组合物直接给药患者的肝。此外，原位暴露可以通过使用液体一氧化碳 组合物在冲洗肝或其一部分来进行(见例如Oxford Textbook of Surgery， Morris和Malt编，Oxford University Press(1994))。
血红素加氧酶-1，其它化合物以及其它治疗在肝炎中的应用
本文还涉及随同一氧化碳的给药而诱导或表达血红素加氧酶-1(HO-1)。 例如，HO-1可以在患有或易患肝炎的患者体内诱导。本文术语“诱导”指 用细胞本身编码蛋白的内源性(例如非重组的)基因，造成分离的细胞或组 织，器官或动物的细胞中上述蛋白例如HO-1的生成增加。
HO-1可通过本领域任何已知的方法在患者体内诱导。例如HO-1的产 生可通过氯高铁血红素(hemin)，铁原卟啉，或钴原卟啉诱导。各种非血红 素(non-heme)制剂包括重金属，细胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，内毒 素和热休克也强烈诱导HO-1表达(Otterbein等，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.279：L1029-L1037，2000；Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 15：9-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；和 Tenhunen等，J.Lab.Clin.Med.75：410-421，1970)。多种导致氧化物应激的 制剂和条件可高度诱导HO-1，所述制剂和条件包括过氧化氢，谷胱甘肽耗 竭物，UV辐射和氧过多(Choi等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15：9-19，1996； Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37：517-554，1997；and Keyse等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86：99-103，1989)。“包含HO-1诱导物的药物组合物” 指包括任何能够在患者体内诱导HO-1的试剂的药物组合物，例如任何上述 的试剂，例如NO，氯高铁血红素，铁原卟啉，和/或钴原卟啉。
通过基因转移可增加细胞中HO-1的表达。本文术语“表达”指通过外 源给药基因(例如重组基因)造成分离的细胞或组织，器官或动物的细胞中的 蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或铁蛋白。HO-1或铁蛋白优选是与受 体的同一物种的(例如人，小鼠，大鼠等)，从而最小化任何免疫反应。可通 过组成型启动子(例如巨细胞病毒启动子)或组织特异的启动子(例如用于哺 乳动物细胞的乳清蛋白启动子或用于肝细胞的白蛋白启动子)驱动表达。编 码HO-1或铁蛋白的适宜基因治疗载体(例如逆转录病毒，腺病毒，腺伴随 病毒(AAV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人类免疫缺陷病毒(HIV)，小鼠极小病 毒(minute virus of mice)，乙型肝炎病毒，流感病毒，单纯疱疹病毒-1型， 和慢病毒)可通过口服，吸入或注入肝来给药患有或易患肝炎的患者。类似 的，编码HO-1或去铁铁蛋白的质粒载体可作为例如裸露的DNA的形式， 位于脂质体中的形式，或位于微颗粒中的形式给药。
此外，外源性HO-1蛋白可通过本领域已知的任何方法直接给药患者。 外源性HO-1可直接给药，作为上述在患者体内诱导或表达HO-1的方法的 补充或替换。所述HO-1蛋白可在脂质体内，和/或作为融合蛋白例如TAT 融合蛋白(见例如，Becker-Hapak等，Methods 24：247-256，2001)的形式递 送患者。
可选或此外，HO-1的任何代谢产物例如胆红素，胆绿素，铁，和/或铁 蛋白可与一氧化碳联合给药患者，以防止或治疗肝炎。此外，本发明涉及 将除铁蛋白以外的铁结合分子，例如去铁敏(desferoxamine)(DFO)，铁右旋 糖苷，和/或去铁铁蛋白，给药患者。本发明还涉及可抑制催化任何这些产 物降解的酶(例如胆绿素还原酶)以创造/增强所需的效果。上述任何物质均 可给药，例如经口服，静脉内，腹膜内，或直接给药肝。
本发明的方法中也可以使用在给药化合物后，将CO释放到机体的化合 物(例如释放CO的化合物，如光可激活的的释放CO的化合物)，例如十羰 基二锰(dimanganese decacarbonyl)，三羰基二氯钌(II)二聚体，和二氯甲烷(例 如，在400-600mg/kg之间，例如约500mg/kg的剂量)，也可以在本发明方 法中使用碳氧血红蛋白以及供给CO的血红蛋白替代物。
可以以任何方式给药患者上述任何物质，例如通过口服，静脉内，或 动脉内给药。上述任何化合物可局部和/或系统地给药患者，并且可以联合 给药。
本发明还涉及通过将CO与任何其它已知治疗肝炎的方法或化合物联 合给药所述患者来治疗/预防肝炎，停止或减少给药致病药物；将皮质类固 醇类和/或α-干扰素或其它抗病毒制剂给药所述患者；和/或对患者进行手 术，例如肝移植。
以下实施例说明了本发明的一部分，所述实施例不应理解为从任何方 面限制本发明。
实施例1一氧化碳减弱肝损害
动物
雄性C57BL/6J(Charles Rivers Laboratories，Bar Harbor，ME)，8-12周 大小的inos-/-小鼠和野生型同窝幼仔(在Pittisburgh大学喂养/寄存)用于体内 试验中。
急性肝炎损伤模型
将TNF-α/D-gal(分别为0.3μg/8mg/小鼠，腹膜内)给药多组小鼠。根据 试验条件，一些小鼠接受CO(250ppm)，选择性NO供体O2-乙烯基1-(吡 咯啶-1-基)二氮烯-1-鎓-1，2-diolate(O2-vinyl 1-(pyrrolidin-1-yl)diazen-1-ium-1，2-diolate)(V-PYRRO；10mg/kg皮下注射 (s.c.)，Alexis Biochem.，San Diego，CA)或钴原卟啉(CoPP，5mg/kg，腹膜内 (i.p.)，Frontier Scientific，Logan，UT)。此外，必要时，给药iNOS L-N6-(1- 亚氨基乙基)-赖氨酸-二氢氯化物(L-NIL；5mg/kg，腹膜内，Alexis Biochemicals)或HO-1抑制物锡原卟啉(Snpp；50μmol/kg，腹膜内，Frontier Scientific)。必要时，给药(500mg/kg，腹膜内)对乙酰氨基酚(Sigma Chem.Co.； St Louis，MO)。
肝细胞培养
小鼠原代肝细胞获自C57BL/6J，mmk3-/-，inos-/-(圈养群)或hmox-l-/-小鼠， 如Kim等所述(J.Biol.Chem. 272：1402-1411(1997))。收获后1-3天使用肝细胞。
诱导肝细胞死亡/凋亡
细胞用TNF-α(10ng/ml)和放线菌素-D(Act-D；200ng/ml， SigmaChemical Co.St.Louis，MO)处理以诱导细胞死亡。TNF-α/ActD处理 已经显示在原代肝细胞中可诱导细胞死亡，尤其是凋亡(见，例如Kim等 (J.Biol.Chem. 272：1402-1411(1997))。使用CO，NO供体另(s)-亚硝基-N-乙 酰基-青霉胺(SNAP；250-750μM)和/或其它指定的药剂来处理肝细胞。 TNF-α/ActD处理12小时后，洗涤细胞，并用结晶紫染色，以如前述( Id.) 测定细胞生存力。必要时，给药iNOS的选择性体外抑制物，L-N5-(1-亚氨 基乙基)鸟氨酸-2HCl(LNIO；1-2mM；Calbiochem，San Diego，CA)。
基因转移/质粒
在一些实验中，利用腺病毒载体(10pfu/细胞)对IκBα抑制物 (Hellerbrand等，Hepatology，27：1285-1295(1998))或β-半乳糖苷酶进行 基因转移是在TNF-α/ActD处理前12小时。NF-κB活化利用萤光素酶报 道物分析评估，如Chow等所述(J.Biol.Chem. 274：10689-10692(1999))。简 而言之，按产品说明，利用LipofectinTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)将肝细 胞用NF-κB受体构建体(pGL3-kappaβ萤光素酶，100ng/孔；和pIEP-Lac-z 0.5μg/孔)共转染。利用萤光素酶报道物分析(reporter assay)进行iNOS表达 的评估，如Lowenstein等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 90：9730-9734(1993))。简言之，如上述将肝细胞用iNOS启动子报道物构建 体(pXP2；1μg/孔)和pIEP-LacZ(0.5μg/孔)进行共转染。
萤光素酶报道物分析
如上述用质粒转染肝细胞，并在转染后24小时使用各种刺激对其进 行处理。萤光素酶活性(以任意单位报告，A.U.)在处理起始6小时后，利 用萤光素酶分析试剂盒(Promega，Madison，WI)和Berthold发光计进行测 定。结果根据转染效率和蛋白浓度进行校正。
电泳位移分析
在处理后从细胞中提取细胞核。使用[δ-32P]-ATP标记双链DNA NF- κB共有序列(GGGGACTTTCCC(SEQ ID NO：1))；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，并和5mg总核蛋白一同保温。一些保温 是在抗p65/RelA的抗体或抗p50(Santa Cruz Biotech)的抗体存在的条件下 进行的，以便评估超位移(supershift)。电泳位移分析(EMSA)如Taylor等 (J.Biol.Chem. 273：15148-15156(1998))所述进行。
免疫印迹分析
对培养基或肝匀浆物中的原代肝细胞进行Western印迹分析，利用以 下物质的抗体：iNOS(TransductionLaboratories，Lexingtong，Kentucky；1∶ 1000)，HO-1(Calbiochem，1∶2000)，或β-肌动蛋白(Sigma Chemical；1∶ 5000)。来自细胞培养实验的30μg蛋白或来自肝匀浆的100μg蛋白上样 各孔中进行SDS-PAGE。
组织学/免疫组化
为进行组织学和免疫组化分析，将肝固定在2％的多聚甲醛中，并随 后在液氮中迅速冷冻。随后对肝进行切片(7微米厚)，并用苏木精和伊红 (H&E)进行染色。肝切片还使用试剂盒(Promega)根据产品说明进行TUNEL 和活化caspase-3染色。用于iNOS免疫组化分析的切片用5％山羊血清(含 0.2％牛血清白蛋白)封闭。随后，将所述切片在室温和抗iNOS抗体 (TransductionLaboratories，1∶300)一起保温1小时，然后进行洗涤并用二级 抗体(与Alexa-488(Molecular Probes，Eugene，OR)偶联)进行检测(probe)。细 胞核用Hoechst染料染色。利用Olympus Provus显微镜获得图像。培养物中 的肝细胞铺于凝胶化的盖玻片上，如需要进行刺激，且随后在2％的多聚甲 醛(含0.1％的Triton X-100)中固定。封闭和染色步骤与对肝切片的相似，只 是利用的是抗-p65/RelA抗体(Santa Cruz Biotechnology；1∶350)。
CO暴露
所述动物暴露于CO(浓度250ppm)。简言之，将空气中的1％的CO与空气(含21％氧气)在不锈钢圆柱混合器中进行混合，然后以12L/分的流 速将混合物导入3.70ft3玻璃暴露小室中。利用CO分析仪(Interscan， Chatsworth，CA)持续测定所述小室中的CO水平。使CO水平一直保持在 250ppm。按需要将小鼠置于暴露小室中。
HO-1防止肝损伤
研究了HO-1是否防止急性肝衰竭。结果显示于图1。将钴原卟啉 (5mg/kg，腹膜内)给药雄性C57BL/6J小鼠。24小时后，将TNF-α/D-gal(分 别为0.3μg/8mg/小鼠，腹膜内)给药小鼠。在给药TNF-α/D-gal8小时后测 定小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。HO-1的诱导防止肝损伤，如测 定的血清ALT水平所示。
外源性CO保护肝细胞
研究了外源性CO是否在体外防止肝细胞死亡。结果显示于图2和图 3。为获得图2所示的数据，将小鼠肝细胞与CO(250ppm)共同预孵育1小 时(所有试验的标准预处理时间)，然后加入TNF-α/Act-D(分别为 10ng/200ng/ml)。在实验过程中一直将细胞保持在CO中。12小时后，如 Kim等所述(J.Biol.Chem. 272：1402-1411(1997))测定细胞生存力。腺病毒实 验涉及将肝细胞和10pfu/细胞的腺病毒共同保温过夜，然后加入TNF-α /Act-D，随后使用结晶紫测定生存力。信号分子鸟苷酸环化酶和p38 MAPK 的作用也在该模型中进行研究。为评估cGMP的作用并确定NF-κB的作 用，分别用可溶的鸟苷酸环化酶(sGC)抑制物1H-(1，2，4)噁二唑啉并-(4，3-a) 喹喔啉-1-酮(ODQ；Calbiochem；2-10μM)或NF-κB抑制物BAY 11-7082(10μM)处理肝细胞。用所述抑制物处理细胞1小时，然后用Co 预处理1小时。然后加入TNF-α/ActD并在12小时后测定所述细胞生存 力。当cGMP不参与时，NF-κB活化对于CO激发的保护作用非常重要。 暴露于CO导致与没有暴露于CO相比，细胞死亡明显减少(*P＜0.01)。
为获得图3所示的数据，将来自供体的切除肝的人原代肝细胞用CO和TNF-α/ActD如上述进行处理。
使原代小鼠，大鼠和人肝细胞暴露于CO抑制TNF-α诱导的凋亡。肝 细胞凋亡的抑制不依赖于cGMP的生成，这是由于选择性鸟苷酸环化酶抑 制物ODQ不能逆转CO提供的保护作用(图2)。此外，CO处理在 SB203580(3-30μM，Calbiochem)(p38 MAPK活化的选择性抑制物)以及p38 的显性上游激酶(在来自mkk3-/-小鼠的肝细胞中)(数据未显示)存在下，抑制 细胞死亡。因此，CO的作用不依赖于cGMP/p38 MAPK途径。在这些实 验中，肝细胞用CO预处理1小时，然后将TNF-α/Act-D加入培养基。如 果CO处理在加入TNF-α后开始，观察到的保护作用较小(数据未显示)。
NF-κB在CO保护作用中的作用
研究了CO诱导的对肝细胞的保护作用是否依赖于NF-κB。图4，5 和6A-6C显示的数据说明，CO诱导小鼠肝细胞中NF-κB核易位以及DNA 结合的增加，如NF-κB萤光素酶报道物分析活性(EMSA)所测，以及免疫 染色RelA/p65核易位所分别测定的那样。
为获得图4中的数据，对NF-κB活化的评估是利用如Chow等 (J.Biol.Chem. 274：10689-10692(1999))所述的萤光素酶报道物分析进行的。简 言之，肝细胞用NF-κB报道物构建体和pIEP-Lac-z共转染24小时，然后 加入BAY 11-7082(10μM)或载体(vehicle)。将细胞保温1小时后用 CO(250ppm)处理。萤光素酶活性(以任意单位报告；A.U.)在暴露于CO或细 胞因子混合物(CM)6小时后测定，该细胞因子混合物由TNF-α(500U/ml)， IL-1β(100U/ml)，和IFN-δ(100U/ml)组成，并用作NF-κB活化的阳性对照。 结果根据转染效率和蛋白浓度进行校正。
为获得图5的数据，利用EMSA测定CO(250ppm)处理的肝细胞中的 NF-κB DNA结合。注意到NF-κB结合(总)随时间增加，其表达在1小时(泳 道1，4，7)达峰值。随后对提取物进行超位移分析，以利用抗p50的抗体(泳 道2，5，8)和抗p65的抗体(泳道3，6，9)鉴定不同的NF-κB二聚体。
为获得图6A-6C的数据，将原代肝细胞暴露于CO(250ppm)一小时后进 行免疫染色以测定核p65定位。图像显示在CM(用作阳性对照)和CO处理 的细胞中NF-κB的核易位(指向绿色细胞核的箭头显示了NF-κB的易位)， 与此相比在空气处理的细胞中没有定位(指向蓝色细胞核的箭头)。NF-κB 萤光素酶报道物实验活性在将所述细胞置于CO环境中1小时后达到峰值。 细胞因子混合物(CM)包含在处理组中作为阳性信号以及最大报道物活性的 标准(通过其评估CO的效应)。原代肝细胞中的转染效率不明显，而其报道 物活性非常显著(与对照相比*p＜0.001)。这些数据结合阳性免疫染色以及 EMSA结果支持了CO诱导NF-κB的适度增加本身就可部分导致选择性基 因表达这一观点。为评估NF-κB活性是否为CO介导的保护作用所需，利 用IκBα的腺病毒基因转移来预防NF-κB易位并用BAY 11-7082(1-10mM，Calbiochem)来抑制NF-κB的活化。CO的保护效应通过 抑制NF-κB的活化而被消除。
NF-κB依赖的iNOS表达在CO保护作用中的作用
研究了CO介导对肝细胞的保护是否需要iNOS的表达以及NO的生成。 所述结果表示在图7，8和9中。
为获得图7中的数据，利用萤光素酶报道物实验如Lowenstein等所述 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A  90：9730-9734(1993))对iNOS的表达进行评估。简 言之，用iNOS启动子报道物构建体和pIEP-LacZ共转染肝细胞，然后将所 述细胞暴露于BAY 11-7082(10mM)或载体。细胞和BAY一同保温1小时后 暴露于CO(250ppm)。如上述测定萤光素酶活性(以任意单位报告；A.U.)。 细胞因子混合物(CM；见上文)用作诱导iNOS表达的阳性对照，并且根据转 染效率和蛋白浓度校正结果。
为获得图8的数据，利用免疫印迹技术评估iNOS蛋白的表达。简言之， 在存在或缺失CO(250ppm)的条件下，用TNF-α/Act-D处理肝细胞的细胞 提取物6-8小时。对照细胞用单独的空气或CO处理。注意图8中，TNF- α诱导的iNOS的表达最低，而用TNF-α在存在CO的条件下处理的细胞 显示对iNOS蛋白的诱导明显更高。
为获得图9的数据，从inos-/-或野生型C57BL/6J小鼠中分离小鼠肝细 胞，并随后用L-NIO(1mM)预处理所述细胞1小时以在给药CO前抑制iNOS。 使暴露于CO的组接受一个小时的预处理，然后向其中加入TNF-α/Act-D， 并随后再进行CO暴露。在其中iNOS的表达缺失或被抑制的细胞中，CO没有对细胞起保护作用(如12小时后通过结晶紫排除法(crystal violet exclusion)所评估)。
在iNOS萤光素酶报道物实验中，将肝细胞暴露于CO导致活性显著增 高(图7)。再次将细胞因子混合物用作这些低效率转染中的阳性对照，并作 为标准来评价CO的效应。与iNOS表达的NF-κB依赖性一致，在用BAY 11-7082处理的肝细胞中观察到报道物活性降低(图7)。此外，与单独存在 TNF-α相比，在CO存在时，由对TNF-α的反应而产生的iNOS蛋白明显 增加(图8)。利用来自iNOS敲除小鼠(inos-/-)的肝细胞和用选择性iNOS抑制 物L-NIO(1mM，Calbiochem)处理的野生型小鼠肝细胞，申请人研究了在缺 乏iNOS活性的条件下，CO是否防止TNF-α诱导的细胞死亡。CO不能防 止缺乏iNOS活性的肝细胞不受TNF-α诱导的细胞死亡，而其对野生型肝 细胞则有保护作用(图9)。总而言之，这些数据显示，CO需要NF-κB的活 化和iNOS表达以防止肝细胞在体外死亡。
吸入的CO防止肝衰竭
在爆发性肝衰竭的TNF-α/D-gal模型中研究了吸入CO是否防止肝损 伤。结果显示在图10和11A-11H中。
为获得图10的数据，用CO(250ppm)预处理小鼠一小时，然后用TNF- α/D-gal(分别为0.3μg/8mg/小鼠；腹膜内)处理。接受TNF-α/D-gal处理后， 小鼠回到CO暴露小室中，并且6-8小时后分析其血清的ALT。没有暴露于 CO的情况下，肝衰竭出现在6-8小时内，主要由上述体外模型中的肝细胞 凋亡造成。CO处理的小鼠的血清ALT比暴露于空气的小鼠的血清ALT低 74％。
为获得图11A-11H的数据，在存在或缺乏CO(250ppm)的条件下，对取 自TNF-α/D-gal处理8小时的小鼠的肝样品进行切片，并进行以下染色： 苏木精和伊红(H&E)，活化caspase-3(如红色强度增加所示)，以及TUNEL 阳性细胞(如增强的绿色细胞染色分界所示；细胞死亡的标志)。细胞核染成 蓝色。暴露于CO显著降低了TNF-α/D-gal诱导的肝损伤(如H&E染色所 示)。暴露于CO的小鼠的肝也显示TUNEL阳性细胞较少，显示活化 caspase-3的染色较少，并具有正常的结构(architecture)。接受TNF-α/D-gal 的暴露于空气的对照小鼠显示明显的肝炎症，水肿，出血以及结构丧失。
上述讨论的结果用脂多糖(LPS，也称为内毒素)替代TNF来证实。在这 些证实性研究中，给药LPS/D-gal导致血清ALT水平从对照的20+/-5IU/ml 升高到＞1000IU/ml(如给药LPS/D-gal8小时后所测)。在用250ppm CO预处 理的小鼠中，ALT的升高降低了75％，为250+/-75IU/ml。为进一步说明 在该模型中观察到的CO的效应，测定血清白介素-6，并发现呼吸CO的动 物与呼吸空气的对照相比其血清白介素-6降低了65％(数据未显示)。这些 小鼠的肝组织的组织病理学与使用TNF-α/D-gal处理的小鼠的相似。未处 理的和CO处理的小鼠(无LPS/D-gal)没有任何损伤迹象，而用空气和 LPS/D-gal处理的小鼠显示明显的损伤，包括水肿，出血，嗜中性细胞浸润， 以及正常形态和结构的总体破坏。反之，用CO以及LPS/D-gal处理的小鼠 的肝和用CO以及TNF-α/D-gal处理的小鼠的肝受到保护的程度相同。在 炎症标志物(水肿，出血，嗜中性细胞浸润)中几乎观察不到改变。其结构保 持，且显示与未处理的和CO(无LPS/D-gal)处理的小鼠中很相似。总之，使 用LPS/D-gal诱导急性肝炎对应并证实了使用TNF/D-gal处理所得的数据。
iNOS在CO预防肝损害的保护作用中的作用
利用免疫印迹技术和免疫组化研究了用TNF-α/D-gal处理后，暴露于 CO的小鼠的肝中iNOS蛋白的水平是否增加。此外，研究了CO是否保护 inos-/-小鼠或用选择性iNOS抑制物L-NIL(10mg/kg，腹膜内；每两小时给药) 处理的野生型小鼠，以确定iNOS表达是否具有功能性作用。结果显示为图 12，13A-13D，和14。
为获得图12的数据，用空气或CO(250ppm)处理雄性C57BL/6J小鼠一 小时，然后给药TNF-α/D-gal(分别为0.3μg/8mg/小鼠；腹膜内)。6小时后， 收获肝以通过免疫印迹来评估iNOS表达。结果显iNOS表达在空气TNF- α/D-gal处理的小鼠中轻度(modestly)增加，但在用TNF-α/D-gal和CO处 理的小鼠中明显增加。如预期那样，inos-/-小鼠显示不表达iNOS蛋白。
为获得图13A-13D的数据，对小鼠肝切片进行iNOS表达的免疫染色。 肝切片得自存在或缺乏CO时用TNF-α/D-gal处理的小鼠，以及没有用 TNF-α/D-gal处理的空气和CO对照。来自暴露于CO并没有接受TNF-α /D-gal处理的小鼠的肝显示iNOS表达轻度增加。然而，在暴露于CO并接 受TNF-α/D-gal处理的小鼠的肝中观察到所述表达明显大幅增加(表示为绿 色染色细胞增加)。所述增加的表达显示定位在血管周围。
为获得图14的数据，利用inos-/-或用L-NIL(iNOS的选择性抑制物 (L-NIL；5mg/kg，腹膜内，每两小时给药)处理的野生型小鼠，在缺乏iNOS 活性的条件下，检测CO诱导的保护的效率。L-NIL在给药CO前两小时给 药。随后预处理CO处理的动物(250ppm)一小时，然后用TNF-α/D-gal处 理。缺乏iNOS功能/表达的条件下，CO不能防止肝不受损伤(如通过血清 ALT和组织病理学评估的那样)。
因此，可见吸入CO对TNF-α诱导的肝衰竭的保护效应有赖于iNOS 活性。
HO-1在CO防止急性肝衰竭的保护作用中的作用
研究了CO和NO是否通过HO-1依赖的机制显示预防急性肝衰竭的保 护作用。数据显示于图15，16，17，和18。
为获得图15的数据，进行免疫印迹以观察在存在或缺乏CO(250ppm) 时接受TNF-α/D-gal处理的小鼠的肝中HO-1的表达。在存在或缺乏 TNF-α/D-gal的条件下，CO-处理的小鼠显示HO-1表达均明显增加。
为评估iNOS对TNF-α/D-gal-诱导的HO-1在肝中的表达(数据显示于图 16中)，将L-NIL(5mg/kg，腹膜内)在给药小鼠，2小时后用CO(250ppm) 预处理，并在此后每两小时处理一次。对照小鼠接受L-NIL并保持于室内 空气中。注意图16中，CO增加载体处理的小鼠中的HO-1的表达，但在iNOS 受抑制时不能诱导表达。单独的L-NIL处理对HO-1的表达具有最小的影响。
为检验CO-诱导的HO-1(数据显示于图17)的保护性作用，在用CO处 理5小时前，将SnPP(50pmol/kg，皮下)，HO-1的选择性抑制物，给药小鼠。 可选地，将VPYRRO(VP)，NO供体(10mg/kg，皮下)给药小鼠。VP被选择 性设计为直接将NO递送到肝。最初的VP给药后一小时，将动物暴露于 CO一小时，然后给药TNF-α/D-gal(见上文)。在6-8小时后测定血清ALT 水平。注意CO不能对其中HO-1活性被阻断的动物提供保护。当VP在2 小时前给药，并在其后每两小时给药一次时，其对损伤提供保护作用，如8 小时后测定的血清ALT所示。
为获得图18的数据，野生型C57BL/6J小鼠用L-NIL(饮用水中，4.5mM) 预处理24小时，如Stenger等(J.Exp.Med.183：1501-1514(1996))所述。随 后将CoPP给药这些小鼠和inos-/-小鼠。L-NIL在整个试验过程中一直保持 在水中。对照和inos-/-小鼠接受正常的饮用水。给药CoPP 24小时后，将 TNF-α/D-gal给药，并在6-8小时后测定血清ALT。注意图18中，无论是否 存在iNOS，HO-1的诱导都提供了保护作用。
在存在或缺失TNF-α/D-gal的条件下，来自用CO处理的小鼠的肝提取 物的免疫印迹显示HO-1的上调(图15)。将iNOS抑制物L-NIL加入这些组 消除了保护作用(图17)，也阻止了HO-1的上调(图16)。为测定HO-1对于 CO激发的肝保护作用而言是否很重要，锡原卟啉-IX(SnPP，50μmol/kg，皮 下，Frontier Scientific)被用作HO-1活性的选择性抑制物。SnPP显著降低该 模型中CO的保护作用(图17)。在缺乏TNF-α/D-gal时给药SnPP没有任何 有害或保护性作用(数据未显示)。这些结果提示，HO-1的上调对于CO的 保护效应很重要。
为测定如果保护作用由NO启动，HO-1的上调是否也是需要的，用药 理学NO供体V-PYRRO/NO处理小鼠。该试剂在肝中代谢，导致肝细胞释 放NO。V-PYRRO/NO也在给药LPS/D-gal或TNF-α/D-gal后提供保护。将 小鼠随机化，并用TNF-α/D-gal(有或没有SnPP)处理以评估HO-1的作用。 V-PYYRO/NO有保护作用(如血清ALT所分析)。但SnPP消除了该NO供体 防止肝损伤的能力(图17)。因此，似乎CO-或NO-启动的肝保护作用至少部 分依赖于HO-1。
由于这些数据显示，CO和NO需要HO-1活性以防止TNF-α-诱导的肝 细胞死亡，研究了HO-1介导的保护作用是否需要iNOS活性。利用inos-/- 小鼠，通过给药CoPP诱导HO-1。24小时后(HO-1表达高峰)，注入 TNF-α/D-gal，并在6-8小时后评估肝损伤。所述结果显示HO-1的诱导能不 依赖于iNOS活性而明显防止肝损伤，导致血清ALT降低＞50％(图18)。这 些结果通过使用L-NIL证实。用含L-NIL(4.5mM)的饮用水预处理小鼠24 小时。该方法有效抑制NOS活性。对照小鼠接受正常水。随后，将CoPP 给药以诱导HO-1表达，并在24小时后，用TNF-α/D-gal攻击小鼠。单独 的I-NIL治疗不改变该模型中诱导的损伤的严重性。所有接受CoPP(有或没 有L-NIL)的动物中的肝损伤都可得到预防(图18)。
研究了HO-1表达是否是CO或NO诱导的对TNF-α/ActD-诱导的肝细 胞死亡的预防作用所需的。数据显示于图19和20。
为获得图19的数据，从HO-1裸鼠(hmox-l-/-)和野生型(C57BL/6J)同窝 幼鼠中分离小鼠肝细胞，用CO(250ppm)预处理1小时，并用TNF-α/ActD 进行处理。如上述测定生存力。CO明显保护野生型肝细胞，但不能保护从 hmox-l-/-小鼠中分离的肝细胞。
为获得图20的数据，从HO-1裸鼠(hmox-l-/-)和野生型(C57BL/6J)同窝 幼鼠中分离小鼠肝细胞，用NO供体SNAP(500μM)预处理1小时后用 TNF-α/ActD进行处理。已经证实SNAP保护该模型中的肝细胞。SNAP明 显防止野生型肝细胞的细胞死亡，但不提供防止从hmox-l-/-小鼠中分离的肝 细胞出现细胞死亡的明显保护作用。
如上述，空气处理的野生型和暴露于TNF-α/ActD的hmox-l-/-细胞如预 期那样出现细胞死亡，而CO-或NO-处理的野生型细胞在TNF-α/ActD存在 时受到保护(图19和20)。CO和NO显示的保护作用在缺乏功能型 HO-1(hmox-l-/-)的细胞中丧失。因此，似乎HO-1在该模型中提供的保护作 用与iNOS无关，表明HO-1或其一或多种催化产物可在该模型中部分显示 细胞保护作用。
吸入CO预防对乙酰氨基酚诱导的肝炎
研究了吸入的CO是否预防对乙酰氨基酚(APAP)-诱导的肝炎。数据显 示于图21。
为获得图21的数据，给药APAP(500mg/kg，腹膜内)一小时前或4小 时后，将雄性C57BL/6J小鼠暴露于CO(250ppm)。随后在整个实验过程中 将小鼠保存在CO中。给药APAP 20小时后，测定血清ALT水平。对照小 鼠接受APAP，并保持在空气中。该方案的设计是在给药CO前让肝炎发展 4小时。CO明显减少对肝的损伤(如血清ALT测定所示(622±44对175± 137，与对照目比p＜0.01)。
所述保护与各组在给药APAP前已用CO预处理的动物中观察到的一 样。这些数据支持了CO在临床相关情况中的治疗用途，其中治疗可在肝炎 开始后开始。
此实施例中讨论的结果显示，在CO诱导的防止肝受到TNF-α/D-gal造 成的损伤中，低浓度的CO可防止TNF-α/D-gal-诱导的爆发性肝炎，并显示 对HO-1和iNOS的独特且以前未认识到的依赖性。
不受理论所限，可能CO介导的保护通过活化NF-κB，其在存在炎性 刺激的条件下，导致iNOS的上调以及随后的NO生成。除了诱导iNOS以 外，其它NF-κB依赖的抗凋亡/保护基因也可被诱导。在用CO进行1小时 的预处理的过程中以及用TNF-α处理所述细胞前，存在NF-κB的明显活 化，其可以是上述细胞器激发(priming)的一部分。CO对NF-κB的活化可 能部分由于来自线粒体(初步观察)的反应性氧样品(species)生成的轻度增 加。一个小时可能使得NF-κB依赖的抗凋亡基因表达。这种假想模型中的 下一步可能导致iNOS上调之后的NO生成。NO导致HO-1上调，其活性 显示保护效应。HO-1的保护效应可能是由于去掉了血红素，或者由于其三 种产物中的任何一或多种：CO，胆绿素/胆红素，或铁/铁蛋白。在整个实验 过程中一直给药外源性CO的情况下，似乎内源生成的CO不可能单独介导 HO-1保护。然而，CO与HO-1的其它产物的结合或单独的这些其它产物可 能与此有关。
在上述研究中，在临床相关的对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝炎模型中 给药CO，该模型的时间过程与人的急性肝炎的发展相似。该数据显示，给 药APAP(500mg/kg，腹膜内)4小时后暴露于CO导致肝损伤降低62％(图 21)。在该APAP-诱导的肝损伤模型中，小鼠早在APAP给药2-4小时后就 显示了肝炎的症状，并在24-48小时后出现死亡。因此，在肝损伤开始后给 药CO。与APAP模型的数据一致的是出血性休克小鼠模型中的结果，其中 2.5小时的休克期过后，复苏(resuscitation)过程中吸入CO治疗的开始产生 对肝损伤的保护作(24小时血清ALT降低＞65％，p＜0.01；n＝6-10/组)。
总之，利用主要由TNF-α诱导的凋亡造成的肝损伤模型，可证实以下 结论：首先，吸入CO可防止该模型中的肝炎；其次，CO的保护作用需要 第二气体分子NO的生成；第三，NO至少部分通过HO-1上调显示其有益 效应；且第四，HO-1的上调无需iNOS/NO活性，即无需循环的强制(obligate) 持续即可起保护作用。
实施例2：治疗肝炎的方案
以下实施例阐述了用于处理诊断为患有肝炎的患者的方案。该实施例 还阐述了在手术前，期间，和/或以后处理患者的方案，所述手术例如肝移 植手术。熟练医师将理解本文所述任何方案可根据患者的个别需要进行调 整，并可调整所述方案以和任何其它肝炎治疗联用。
治疗患者
用CO治疗患者可在患者被诊断为患有肝炎(例如由病毒感染和/或酗酒 造成的肝炎)的当天开始。所述患者可由医师利用任何已知方法诊断。例如， 以是可利用获自血液检测的数据进行这样的诊断，例如检测血清ALT水平 的实验和检测患者是否被特定病毒(例如，任何已知的肝炎病毒)感染的实 验。此外，医师可根据患者的病史作出这样的诊断(例如患者是否是嗜酒者 或慢性药物使用者)。所述患者每天可吸入浓度为约250-500ppm的CO一 小时。这种治疗可持续约30天，或者直到所述患者被诊断为不再患有或不 再易患肝炎。
肝移植的方法
肝供体的处理
获取肝或其部分前，可使用吸入的一氧化碳(250ppm)处理供体一小时。 给药处理的剂量可从10ppm到1000ppm，时间从一小时到六小时，或者从 开始可能处理脑死亡(尸体)供体到该器官被取出的时间的整个阶段。对于人 类供体，宣布脑死亡后应尽早进行处理。在一些应用中，需要在脑死亡前 进行处理。
对于非人动物(例如猪)用作异种移植供体的情况，如需要可用相对高水 平的吸入的一氧化碳处理活供体动物，只要由此产生的碳氧血红蛋白不损 害待移植器官的生存力和功能。例如，可使用高于500ppm(例如，1000ppm 或更高，甚至达10,000ppm，特别是短时间使用)的浓度。
肝的原位处理
从供体获取肝以前，可以在肝仍在供体体内时用溶液，例如缓冲液或 介质对其进行冲洗或灌洗。目的是使用用一氧化碳饱和的溶液冲洗肝，并 将肝保持在一氧化碳的环境中，使得一氧化碳的含量保持饱和。冲洗可进 行至少10分钟，例如1小时，几小时或更长。较理想的是，该溶液将可能 的最高浓度的一氧化碳递送到肝(或其一部分)的细胞。
肝的活体外(ex vivo)处理
将肝从供体取出后到将其移植给受体这段时间内，可将其保存在包含 一氧化碳的介质中。这可通过将肝保存在含有一氧化碳的介质中进行，或 者通过用这种介质灌注肝来进行。由于这种情况出现在活体外而不是动物 体内，可使用非常高浓度的一氧化碳气体(例如，10,000ppm)使该介质被一 氧化碳饱和。
处理肝受体
用一氧化碳处理受体可在移植手术当天手术开始前至少30分钟开始处 理。可选地，可以于在受体内再灌注器官前至少30分钟开始。可持续至少 30分钟，例如一小时。可将10ppm到3000ppm的一氧化碳剂量递送不同时 间，例如数分钟或数小时，并可在移植当天和移植后数天给药。例如，所 述患者可在三次连续10秒的深呼吸(breath hold)中吸入例如3000ppm浓度 的一氧化碳。可选地，也可以采用规律呼吸而不是深呼吸的方式间断或连 续地递送较低浓度的气体，递送较长时间。碳氧血红蛋白浓度可指导对患 者适当地给药一氧化碳。通常，受体的处理不应导致碳氧血红蛋白水平升 高到被认为可能给需要移植的患者造成可接受的危险的程度。
本发明描述了一些实施方案。但应理解可进行多种修饰而不偏离本发 明的精神和范围。因此，其它实施方案也在权利要求的范围内。
相关申请的参考
本申请要求2002年5月17日提交的美国临时申请60/381,527的优 先权，其全文内容包含在本文中作为参考。
联邦政府资助研究的声明
本发明是在政府的支持下进行的，美国国立卫生研究院(NIH)许可号为 R01-44100，HL58688，HL55330和AI42365。政府对本发明具有一定的权 利。