新型朊病毒样蛋白病用治疗药
阅读：285发布：2020-05-16
专利汇可以提供新型朊病毒样蛋白病用治疗药专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及以仙台病毒包膜作为有效成分的用于 预防 和/或 治疗 伴有 朊病毒 样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性 疾病 的药物、以及上述药物与免疫检查点 抑制剂 的组合使用。，下面是新型朊病毒样蛋白病用治疗药专利的具体信息内容。
1.一种用于预防和/或治疗伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的药物，其含有仙台病毒包膜作为有效成分。
2.如权利要求1所述的药物，其中，仙台病毒包膜为野生型仙台病毒包膜。
3.如权利要求1或2所述的药物，其中，仙台病毒包膜为灭活的仙台病毒包膜。
4.如权利要求1～3中任一项所述的药物，其中，伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病为选自阿尔茨海默型痴呆、轻度认知功能损害(MCI)、脑淀粉样血管病、唐氏综合征、黄斑变性、路易体痴呆、帕金森病、多系统萎缩、Tau蛋白病、额颞叶变性、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化、自闭症、糖尿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)和克-雅脑病中的任意一种。
5.如权利要求4所述的药物，其中，伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病为阿尔茨海默型痴呆。
6.如权利要求1～5中任一项所述的药物，其中，朊病毒样蛋白为β-淀粉样蛋白。
7.如权利要求1～6中任一项所述的药物，其与免疫检查点抑制剂组合使用。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，仙台病毒包膜和免疫检查点抑制剂同时或依次进行给药。
9.如权利要求1～8中任一项所述的药物，其中，组合含有仙台病毒包膜和免疫检查点抑制剂。
10.如权利要求7～9中任一项所述的药物，其中，免疫检查点抑制剂为选自由抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗KIR抗体、抗CD137抗体、抗LAG-3抗体、抗OX40抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H5抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体和抗BTLA抗体组成的组中的任意一种或两种以上。
11.如权利要求10所述的药物，其中，免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体。
新型朊病毒样蛋白病用治疗药
技术领域
[0001] 相关申请：
[0003] 技术领域：
背景技术
[0005] 痴呆是如下所述的一种认知功能障碍：由于后天性的脑的器质性损伤，正常发展的各种精神功能发生慢性衰退、消失，由此处于无法从事日常生活、社会生活的状态。痴呆包括阿尔茨海默型痴呆、脑血管性痴呆、路易体痴呆、额颞痴呆等几个种类，其中最多的是阿尔茨海默型痴呆，据称占痴呆病因的60％。
[0006] 关于阿尔茨海默型痴呆的病因，存在各种假说，最有力的是由β-淀粉样蛋白的蓄积引起的神经变性，还提示与免疫系统相关(非专利文献1和2)。对于痴呆、特别是阿尔茨海默型痴呆，也开发了若干药物治疗，但尚未达到根本性治疗。
[0007] 仙台病毒(日本血凝病毒，Hemaglutinating virus of Japan(HVJ))与埃利希氏(Ehrlich)肿瘤细胞的融合受到关注，在进行细胞膜融合活性(以下称为融合活性)分析的同时，对其作为基因导入载体的利用进行了研究。但是，已知HVJ的免疫原性高，特别是大量产生NP蛋白质时会诱导CTL，此外宿主的蛋白质合成的抑制也令人担忧。因此，提出了将封入有基因、蛋白质的脂质体与预先通过紫外线照射而灭活的HVJ融合来制作融合颗粒(HVJ-脂质体)的方法，由此能够向细胞、生物体中进行非侵袭性的基因导入(专利文献1、非专利文献3和4)。
[0008] 本发明人迄今为止通过具有高效的基因递送能力(高效率)的病毒与细胞毒性和免疫原性更小(低毒性)的非病毒载体组合而开发出了新型混合型基因导入载体，构建了具有HVJ来源的融合形成性包膜的融合形成性病毒脂质体。在该递送系统中，使DNA填充脂质体与UV灭活HVJ融合，形成作为融合形成性病毒-脂质体的HVJ-脂质体(直径400～500nm)。融合介质递送的优点在于，可保护被转染的DNA免受受体细胞中的内体降解和溶酶体降解。
例如，能够将摄入到HVJ-脂质体中的DNA安全地送达哺乳动物细胞中(专利文献2)。另外，RNA、寡核苷酸和药物也能够在体外和生物体内高效地被导入至细胞中。此外，本发明人通过将作为使用病毒包膜、能够安全稳定地对广泛的生物体内组织进行基因导入的具有高基因导入活性的基因导入载体的HVJ包膜(HVJ-E)进行冻融处理或与表面活性剂混合，发明出了封入有外源基因的基因导入载体(专利文献3和4)。由此，能够使用HVJ-E将物质也高效地导入至脑或中枢神经中(专利文献5和6)。此外，本发明人还发现，通过在HVJ-E中封入抗癌剂等化疗剂并将其移入细胞内或生物体内，发挥出免疫佐剂效果(专利文献7和8)。
例如，能够将摄入到HVJ-脂质体中的DNA安全地送达哺乳动物细胞中(专利文献2)。另外，RNA、寡核苷酸和药物也能够在体外和生物体内高效地被导入至细胞中。此外，本发明人通过将作为使用病毒包膜、能够安全稳定地对广泛的生物体内组织进行基因导入的具有高基因导入活性的基因导入载体的HVJ包膜(HVJ-E)进行冻融处理或与表面活性剂混合，发明出了封入有外源基因的基因导入载体(专利文献3和4)。由此，能够使用HVJ-E将物质也高效地导入至脑或中枢神经中(专利文献5和6)。此外，本发明人还发现，通过在HVJ-E中封入抗癌剂等化疗剂并将其移入细胞内或生物体内，发挥出免疫佐剂效果(专利文献7和8)。
[0009] 本发明人发现，HVJ-E其本身具有抗肿瘤免疫活化作用、癌细胞特异性细胞死亡诱导作用，作为抗癌剂有用(专利文献8和9)，还以恶性黑色素瘤患者、前列腺癌患者、恶性胸膜间质瘤患者为对象实施了医师主导型临床试验。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1：美国专利第5631237号
[0013] 专利文献2：WO2001/057204号
[0014] 专利文献3：日本特开2002-065278号
[0015] 专利文献4：WO2004/035779号
[0016] 专利文献5：WO2006/011600号
[0017] 专利文献6：WO2005/095613号
[0018] 专利文献7：WO2004/039406号
[0019] 专利文献8：WO2005/094878号
[0020] 专利文献9：WO2010/032764号
[0021] 非专利文献
[0022] 非专利文献1：Schenk et al.，Nature.1999Jul 8；400(6740)，p173-177[0023] 非专利文献2：Baruch et al.，Nature Medicine，2016Feb vol.22，No.2，p135-137
[0024] 非专利文献3：Dzau et al.，PNAS 1996，Vol.93，No.21，p11421-11425[0025] 非专利文献4：Kaneda et al.，Mol.Med.Today，1999，Vol.5，Issue 7，p298-303发明内容
[0026] 发明所要解决的问题
[0027] 本发明的课题在于发现HVJ-E的新效果、确立其临床应用。
[0028] 用于解决问题的方法
[0029] 本发明人确认了，通过对由β-淀粉样蛋白给药而制作的阿尔茨海默病的模型小鼠给药HVJ-E，观察到显著的短期记忆的改善。此外还确认了，通过将抗PD-1抗体与HVJ-E组合使用，观察到效果的协同性的提高。
[0030] 本发明是基于上述见解而完成的，涉及以下的(1)～(11)项。
[0031] (1)一种用于预防和/或治疗伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的药物，其含有仙台病毒包膜作为有效成分(即，以有效给药量含有)。
[0032] (2)如(1)所述的药物，其中，仙台病毒包膜为野生型仙台病毒包膜。
[0033] (3)如(1)或(2)所述的药物，其中，仙台病毒包膜为灭活的仙台病毒包膜。
[0034] (4)如(1)～(3)中任一项所述的药物，其中，伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病为选自阿尔茨海默型痴呆、轻度认知功能损害(MCI)、脑淀粉样血管病、唐氏综合征、黄斑变性、路易体痴呆、帕金森病、多系统萎缩、Tau蛋白病、额颞叶变性、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化、自闭症、糖尿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)和克-雅脑病中的任意一种。
[0035] (5)如(4)所述的药物，其中，伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病为阿尔茨海默型痴呆。
[0036] (6)如(1)～(5)中任一项所述的药物，其中，朊病毒样蛋白为β-淀粉样蛋白。
[0037] (7)如(1)～(6)中任一项所述的药物，其与免疫检查点抑制剂组合使用。
[0038] (8)如(7)所述的药物，其特征在于，仙台病毒包膜和免疫检查点抑制剂同时或依次进行给药。
[0039] (9)如(1)～(8)中任一项所述的药物，其中，组合含有仙台病毒包膜和免疫检查点抑制剂。
[0040] (10)如(7)～(9)中任一项所述的药物，其中，免疫检查点抑制剂为选自由抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗KIR抗体、抗CD 137抗体、抗LAG-3抗体、抗OX40抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H5抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、和抗BTLA抗体组成的组中的任意一种或两种以上。
[0041] (11)如(10)所述的药物，其中，免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体，优选为抗PD-1抗体。
[0042] 发明效果
[0043] 根据本发明，可提供治疗和/或预防以阿尔茨海默型痴呆为代表的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的新的治疗方法。HVJ-E通过与免疫检查点抑制剂组合使用，能够更有效地治疗伴有β-淀粉样蛋白这样的朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍或神经退行性疾病、例如阿尔茨海默型痴呆。HVJ-E与免疫检查点抑制剂的组合使用效果是协同性的，因此，与单独给药相比较能够减少各药剂的给药量、实现副作用的降低。附图说明
[0044] 图1示出Y型迷宫试验的装置和自主行为交替率的计算方法。图中，如计算例所示，将Y字型迷宫的各臂设为A、B、C，在动物按照ACBABACBAB的顺序移动的情况下，自主行为交替次数为ACB、CBA、BAC、ACB、CBA这5次，将其除以总进臂次数10减2而得到的8，将所得到的值乘以100而得到的数值62.5作为自主行为交替率。自主行为交替率(％)＝[5/(10-2)]×100＝62.5％
[0045] 图2示出Y型迷宫试验的结果(HVJ-E皮下给药)。图2A：总进臂次数、图2B：自主行为交替次数(正确次数)、图2C：自主行为交替率(正确率)。均是左起为阴性对照组(介质给药组)、HVJ-E给药组、抗PD-1抗体给药组、HVJ-E+抗PD-1抗体组合使用组、阳性对照组(多奈哌齐给药组)。
[0046] 图3示出被动试验(反应潜伏时间)的结果(HVJ-E皮下给药)。图3A：第1天(受试物质给药后第10天)、图3B：第2天(受试物质给药后第11天)。均是左起为阴性对照组(介质给药组)、HVJ-E给药组、抗PD-1抗体给药组、HVJ-E+抗PD-1抗体组合使用组、阳性对照组(多奈哌齐给药组)。
[0047] 图4示出Y型迷宫试验的结果(HVJ-E经鼻给药)。图4A：总进臂次数、图4B：自主行为交替次数(正确次数)、图4C：自主行为交替率(正确率)。均是左起为假手术组、阴性对照组(介质给药组)、HVJ-E经鼻给药组、HVJ-E(经鼻)+抗PD-1抗体组合使用组、阳性对照组(多奈哌齐给药组)、HVJ-E(皮下)+抗PD-1抗体组合使用组。需要说明的是，图4中，假手术(Sham-operation)是指假手术组，介质(Vehicle)是指介质给药组，i.n.是指经鼻给药，s.c.是指皮下给药。
[0048] 图5示出Y型迷宫试验的结果(HVJ-E经鼻给药)。图5A：总进臂次数、图5B：自主行为交替次数(正确次数)、图5C：自主行为交替率(正确率)。均是左起为阴性对照组(介质给药组)、HVJ-E(10mNAU/只)经鼻给药组、HVJ-E(50mNAU/只)经鼻给药组、HVJ-E(100mNAU/只)经鼻给药组、阳性对照组(多奈哌齐给药组)。需要说明的是，图5中，介质(Vehicle)是指介质给药组。
具体实施方式
[0049] 本发明涉及以仙台病毒包膜(HVJ-E)作为有效成分的、用于预防和/或治疗伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的药物。
[0050] 1.含有仙台病毒包膜的药物
[0051] “仙台病毒(HVJ)”
[0052] “仙台病毒(HVJ)”是副粘液病毒科呼吸病毒属的负单链RNA病毒，感染小鼠、大鼠，引起呼吸系统疾病。在病毒颗粒的外侧存在作为膜状结构的包膜，包覆病毒基因组、衣壳蛋白。包膜蛋白是在病毒吸附、侵入至宿主细胞中时承担细胞融合活性的膜成分，在病毒感染中发挥免疫逃逸等重要作用。
[0053] “仙台病毒包膜(HVJ-E)”
[0054] 本发明的“仙台病毒包膜(HVJ-E)”是被灭活而丧失了复制能力的灭活仙台病毒(Kaneda et al.，Hemagglutinating Virus of Japan(HVJ)Envelope Vector as a Versatile Gene Delivery System.Mol.Ther.2002，6，219-226)。HVJ-E中，病毒的基因组RNA被完全灭活，因此在宿主中不具有感染性和增殖性。
[0055] 作为HVJ-E的膜上蛋白质的血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-Neuraminidase，HN)蛋白和融合蛋白(Fusion(F)蛋白)在病毒RNA灭活后仍具有细胞膜融合能力。因此，在灭活的HVJ的包膜内封入基因或药物，能够送达对象细胞。另外，由于HVJ-E其本身具有增强肿瘤免疫的佐剂效果，因此可以单独用于癌症的治疗或者在其内部封入抗癌剂后用于癌症的治疗(上述WO2005/094878、WO2010/032764)。在本申请之前，不知晓HVJ-E对阿尔茨海默病等伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和神经退行性疾病具有预防、治疗效果。
[0056] “HVJ-E的制备”
[0057] 本发明的HVJ-E可以通过将HVJ灭活而得到。只要无损于作为药物的目的，所使用的HVJ可以为野生型，也可以为加以适当改造的突变型。作为野生型HVJ，例如可以购入ATCC(注册商标)VR-105TM、ATCC(注册商标)VR-907TM等来使用。病毒优选在灭活之前通过离心分离或超滤与离子交换柱的组合使用等进行纯化。
[0058] 作为突变型HVJ，可以列举例如：通过对mRNA使用特异性siRNA等使HN缺失而得到的HVJ-E；按照通过在构成HVJ-E的HN蛋白的特定区域的C末端侧连接所期望的多肽而在HVJ-E的外侧表面表达改造HN蛋白与所期望的蛋白质的融合蛋白的方式进行改造而得到的HVJ-E(参考日本特开2011-050292)；以及对膜蛋白进行改造而得到的HVJ-E等。
[0059] 病毒的灭活只要使病毒在宿主细胞、优选在人细胞内的复制能力丧失则没有特别限定，可以通过紫外线照射、γ射线照射、化学处理(烷基化剂处理)、热处理等来进行，从对包膜的膜上蛋白质的影响小的观点出发，优选紫外线照射或γ射线照射。在紫外线照射或γ射线照射的情况下，可以通过对HVJ的悬浮液照射紫外线(通常为约90毫焦耳/cm2～约200毫焦耳/cm2)或γ射线(通常为约5戈瑞～约20戈瑞)而将病毒灭活。另外，在烷基化剂处理的情况下，可以通过在HVJ的悬浮液中添加β-丙内酯等烷基化剂并进行温育而将病毒灭活。HVJ-E的具体制备方法详细记载在上述Kaneda et al.，2002、WO01/57204(实施例8)、日本特开2002-065278号、WO03/014338等中。
[0060] “含有HVJ-E的药物”
[0061] 本发明的含有HVJ-E的药物可以含有药理学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，可以列举例如赋形剂、粘结剂、润滑剂、溶剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、无痛化剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、着色剂、缓冲剂、流动性促进剂等，但不限于这些，可以适当使用其他常用的载体、添加物。
[0066] 作为崩解剂，可以列举低取代羟丙基纤维素、化学修饰的纤维素或淀粉类等。
[0070] 作为稳定剂，可以列举聚乙二醇、葡聚糖硫酸钠、其他氨基酸类等。
[0072] 作为防腐剂，可以列举对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
[0073] 作为抗氧化剂，可以列举作为水溶性抗氧化剂的抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、作为脂溶性抗氧化剂的抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、以及作为金属螯合剂的柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸。
[0074] 作为矫味矫臭剂，可以列举药物领域中通常使用的甜味剂、香料等，作为着色剂，可以列举药物领域中通常使用的着色料。
[0076] 本发明的药物的给药途径没有特别限定，可以为经口给药也可以为非经口给药。作为非经口给药，具体而言，可以列举注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药，可以例示静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、骨髓内注射、髓腔内注射、皮内注射。给药方法可以根据患者的年龄、症状而适当选择。
[0077] 本发明的药物的给药量根据其使用目的、给药途径等而适当决定。在给药于人的情况下，例如每次给药以HVJ-E计可以在200mNAU至20000mNAU的范围内选择给药量。或者，例如对于每个患者可以在3000～60000mNAU/位的范围内选择给药量。
[0078] 只要无损于本发明的目的，本发明的药物也可以与其他药剂组合使用。如上所述，可以在HVJ-E的内部封入核酸、药剂等。本发明中，也可以在无损于本发明的目的的范围内在HVJ-E中封入对认知功能障碍或神经退行性疾病的治疗有用的药剂等。
[0079] “认知功能障碍和/或神经退行性疾病”
[0080] 含有HVJ-E的药物对于伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或朊病毒样蛋白的蓄积的神经退行性疾病的治疗和/或预防有用。
[0081] “朊病毒样蛋白”是被认为通过所释放的错误折叠蛋白质传播至附近的细胞而产生病灶扩大的蛋白质，可以列举例如β-淀粉样蛋白、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白、磷酸化Tau等。朊病毒样蛋白的代表例为后述的“β-淀粉样蛋白”和“α-突触核蛋白”。
[0082] “β-淀粉样蛋白”是作为老年斑的主要构成成分的肽，老年斑是阿尔茨海默型痴呆的主要的病理变化。β-淀粉样蛋白(以下也记为“Aβ”)是由β-分泌酶和γ-分泌酶从前体蛋白(β-淀粉样蛋白前体；APP：Amyloidβprotein precursor)切出而生成的疏水性高的肽，有由40个氨基酸构成的Aβ1-40和由42个氨基酸构成的Aβ1-42。Aβ1-42比Aβ1-40容易凝聚，提出了Aβ1-42发生凝聚、Aβ1-40以其为核发生凝聚而进行纤维形成的假说，但认为其蓄积需要由其他风险因子(ApoE、早老素1、2等)进行的修饰。Aβ具有神经细胞毒性，会引起坏死等。
[0083] “α-突触核蛋白”主要见于神经组织内，是由SNCA基因编码的140个氨基酸残基构成的功能不明的蛋白质。关于α-突触核蛋白，最初其片段是作为在阿尔茨海默病中蓄积的淀粉样蛋白中的成分被发现的，认为其是以帕金森病为代表的神经退行性疾病的病因。
[0084] 作为“伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病”，可以列举例如阿尔茨海默型痴呆、轻度认知功能损害(MCI)、脑淀粉样血管病、唐氏综合征、黄斑变性、路易体痴呆、帕金森病、多系统萎缩、Tau蛋白病、额颞叶变性、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化、自闭症、糖尿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、克-雅脑病等，但不限于这些。
[0085] 本发明中，“治疗”这一术语是指，通过将本发明的药物给药于受试者，由伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病引起的各种症状得到改善。另外，“预防”这一术语是指，防止伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的发病或恶化。
[0086] 2.HVJ-E与免疫检查点抑制剂的组合
[0087] 本发明人确认了，通过将免疫检查点抑制剂给药于阿尔茨海默病的模型小鼠，观察到行为学的改善，同时还证实了，关于其效果，通过与HVJ-E组合使用，协同性地显示出效果。即，本发明还提供将仙台病毒包膜(HVJ-E)和免疫检查点抑制剂组合(组合使用或配合)而用于预防和/或治疗伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的药物。
[0088] “组合含有HVJ-E和免疫检查点抑制剂的药物”
[0089] 本发明中，“组合含有HVJ-E和免疫检查点抑制剂的、用于预防和/或治疗伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的药物”是指，在神经退行性疾病的预防和/或治疗中，为了同时、分别或依次给药而将HVJ-E与免疫检查点抑制剂组合而得到的药物。在一个实施方式中，本发明的药物以同时含有HVJ-E和免疫检查点抑制剂的配合剂的形式提供。另外，在另一实施方式中，本发明的药物以将分开含有HVJ-E和免疫检查点抑制剂的各药剂组合使用的形式提供，可同时或依次进行使用。此外，在另一实施方式中，本发明的药物可以以由含有HVJ-E和免疫检查点抑制剂的药剂构成的试剂盒的形式提供。
[0090] 本发明中，HVJ-E与免疫检查点抑制剂的“组合使用”是指，将HVJ-E与免疫检查点抑制剂共同给药或使用，并非对给药的顺序和给药间隔等进行限定性解释。另外，HVJ-E与免疫检查点抑制剂的“配合剂”是指将HVJ-E与免疫检查点抑制剂以一定量组合并进行制剂化而成的药物(固定剂量复方药物，fixed dose combination drug)。
[0091] 通过将HVJ-E和免疫检查点抑制剂组合给药(使用)，能够以比单独使用任意一者时的给药量更少的给药量进行给药，因此，能够降低副作用的可能性。
[0092] “免疫检查点抑制剂”
[0093] “免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点，对抑制获得性免疫防御系统的物质、分子的作用进行抑制。免疫检查点是抑制针对癌细胞、细菌或病毒等病原体的获得性免疫防御系统的分子，除了例如表达在效应T细胞表面的PD-1、表达在肿瘤细胞表面的PD-L1或PD-L2、表达在活化T细胞或抑制性T细胞Treg的表面的CTLA-4、表达在树突细胞表面的CD80(B7-1)或CD86(B7-2)以外，还可以列举B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)、KIR、CD137、LAG-3、TIM-3、TIGIT、OX40、BTLA等。
[0094] 上述免疫检查点抑制剂的氨基酸序列和对其进行编码的基因的碱基序列是已经公知的，公开在公共数据库中(核酸序列：GenBank、DDBJ、EMBL；氨基酸序列：SwissProt、PIR、PDB)。例如，关于人PD-1的基因(人程序性死亡基因1，Homo sapiens programmed cell death1(PDCD1)，mRNA)，以GenBank登记号NM_005018进行了信息公开，关于蛋白质(人程序性死亡蛋白1前体，programmed cell death protein 1precursor[Homo sapiens])，以登记号NP_005009进行了信息公开(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005018.2；和https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/167857792)。后述的免疫检查点抑制剂(例如反义核酸、siRNA，shRNA、抗体等)可以基于这些公开的信息使用该领域中公知的技术来设计、获得。以下，总结示出关于免疫检查点抑制剂的信息。
[0095] [表1]
[0096]免疫检查点 mRNA，GenBank登记号 碱基序列(cDNA) 氨基酸序列
hPD-1 NM_005018.2(基因ID：5133) 序列号1 序列号2
hPD-L1 NM_001267706.1(基因ID：29126) 序列号3 序列号4
hPD-L2 NM_025239.3(基因ID：80380) 序列号5 序列号6
hCTLA-4 NM_001037631.2(基因ID：1493) 序列号7 序列号8
hCD80(B7-1) NM_005191.3(基因ID：941) 序列号9 序列号10
hB7.2(B7-2) NM_001206924.1(基因ID：942) 序列号11 序列号12
hB7-H3 NM_001024736.1(基因ID：80381) 序列号13 序列号14
hB7-H4 NM_001253849.1(基因ID：79679) 序列号15 序列号16
hB7-H5(VISTA) NM_022153.1(基因ID：64115) 序列号17 序列号18
hKIR： NM_001322168.1(基因ID：3811) 序列号19 序列号20
hCD137 NM_001561.5(基因ID：3604) 序列号21 序列号22
hLAG-3 NM_002286.5(基因ID：3902) 序列号23 序列号24
hTIM-3 NM_032782.4(基因ID：84868) 序列号25 序列号26
hTIGIT NM_173799.3(基因ID：201633) 序列号27 序列号28
h0X40 NM_003327.3(基因ID：7293) 序列号29 序列号30
hBTLA NM_001085357.1(基因ID：151888) 序列号31 序列号32
hPD-1 NM_005018.2(基因ID：5133) 序列号1 序列号2
hPD-L1 NM_001267706.1(基因ID：29126) 序列号3 序列号4
hPD-L2 NM_025239.3(基因ID：80380) 序列号5 序列号6
hCTLA-4 NM_001037631.2(基因ID：1493) 序列号7 序列号8
hCD80(B7-1) NM_005191.3(基因ID：941) 序列号9 序列号10
hB7.2(B7-2) NM_001206924.1(基因ID：942) 序列号11 序列号12
hB7-H3 NM_001024736.1(基因ID：80381) 序列号13 序列号14
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hB7-H5(VISTA) NM_022153.1(基因ID：64115) 序列号17 序列号18
hKIR： NM_001322168.1(基因ID：3811) 序列号19 序列号20
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h0X40 NM_003327.3(基因ID：7293) 序列号29 序列号30
hBTLA NM_001085357.1(基因ID：151888) 序列号31 序列号32
[0097] 本发明中，“免疫检查点抑制剂”只要是抑制上述免疫检查点的表达或活性的物质则没有特别限制。
[0098] “抑制免疫检查点的表达的物质”可以在免疫检查点的基因转录的水平、转录后调节的水平、向蛋白质进行翻译的水平、翻译后修饰的水平等中的任意阶段发挥作用。因此，作为抑制免疫检查点的表达的物质，包括例如抑制该基因的转录的物质、抑制从初始转录产物向mRNA加工的物质、抑制mRNA向细胞质输送的物质、促进mRNA分解的物质、抑制从mRNA向蛋白质翻译的物质、抑制免疫检查点的翻译后修饰的物质等。在任意阶段发挥作用的物质均可以优选使用，但从直接抑制免疫检查点产生的含义上来说，优选抑制从mRNA向蛋白质翻译的物质。
[0099] 作为特异性地抑制从免疫检查点的mRNA向蛋白质翻译的物质，可以列举例如包含与编码免疫检查点的mRNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的核酸。
[0100] 作为与免疫检查点的mRNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列，可以列举：
[0101] (a)与编码免疫检查点的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列；或者
[0102] (b)在高严格条件下与编码免疫检查点的碱基序列的互补链序列杂交、与编码具有与免疫检查点实质上同质的活性的蛋白质的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列。
[0103] “实质上互补”是指在碱基序列间具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、最优选约95％以上的互补性。另外，“活性”是指抑制T细胞对癌细胞的抗肿瘤活性的作用等。“实质上同质”表示，它们的活性在定性上(例如在生理学上或药理学上)是相同的。因此，它们的活性的程度(例如约0.1倍～约10倍、优选约0.5倍～约2倍)、蛋白质的分子量等定量因素可以不同。免疫检查点的活性的测定可以依照本身公知的方法来进行。
[0104] 作为高严格条件，可以列举例如在6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中、45℃下的杂交反应后，在0.2×SSC/0.1％SDS中65℃下进行一次以上的清洗等。
[0105] 关于“与免疫检查点的mRNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列的一部分”，只要能够特异性地与免疫检查点的mRNA结合、且能够抑制从该mRNA进行蛋白质翻译，则对其长度、位置没有特别限制，从序列特异性的方面出发，包含至少10个碱基以上、优选约15个碱基以上、更优选约20个碱基以上的与靶序列互补或实质上互补的部分。
[0106] 具体而言，作为包含与免疫检查点的mRNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的核酸，优选例示下述(i)～(iii)中的任一者。
[0107] (i)针对免疫检查点的mRNA的反义核酸
[0108] (ii)针对免疫检查点的mRNA的siRNA
[0109] (iii)能够生成针对免疫检查点的mRNA的siRNA的核酸
[0110] (i)针对免疫检查点的mRNA的反义核酸
[0111] 本发明中的、针对免疫检查点的mRNA的反义核酸(本发明的反义核酸)是指，包含与该mRNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分、通过与标靶mRNA形成特异性且稳定的双链来进行结合从而具有抑制蛋白质合成的功能的核酸。反义核酸可以为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、DNA：RNA杂交体中的任意一种。
[0112] 关于反义核酸的靶区域，只要通过该反义核酸的杂交、结果可抑制免疫检查点的翻译，则对其长度没有特别限制，可以为编码这些蛋白质的mRNA的全长序列，也可以为部分序列，短的可以列举约10个碱基左右，长的可以列举mRNA或初始转录产物的全长序列。若考虑合成的容易度和抗原性、细胞内转移性的问题等，则优选由约10个～约40个碱基、特别是约15个～约30个碱基构成的寡核苷酸，但不限于此。具体而言，可以选择免疫检查点的基因的5’端发夹环、5’端6碱基对重复序列、5’端非翻译区、翻译起始密码子、蛋白质编码区、ORF翻译终止密码子、3’端非翻译区、3’端回文区或3’端发夹环等作为反义核酸的优选靶区域，但不限于这些。
[0113] 构成反义核酸的核苷酸分子可以为天然型的DNA或RNA，为了提高稳定性(化学稳定性和/或对酶的稳定性)、比活性(与RNA的亲和性)，可以包含各种化学修饰。反义核酸可以为反基因的形态。这样的包含各种修饰的反义核酸可以利用本身公知的方法进行化学合成。
[0114] (ii)针对免疫检查点的mRNA的siRNA
[0115] 本说明书中，由与免疫检查点的mRNA互补的寡聚RNA和其互补链构成的双链RNA、即所谓的siRNA也被定义为包括在包含与免疫检查点的mRNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的核酸中。siRNA可以基于作为标靶的mRNA的碱基序列信息使用市售的软件(例如RNAi Designer；Invitrogen)进行适当设计。
[0116] 另外，为了提高稳定性、比活性等，构成siRNA的核糖核苷酸分子也可以接受与上述反义核酸的情况下同样的修饰。但是，在siRNA的情况下，若将天然型RNA中的全部核糖核苷酸分子用修饰型进行置换，有时会丧失RNAi活性，因此需要进行RISC复合物能够发挥功能的最低限度的修饰核苷酸的导入。
[0117] siRNA可以如下制备：利用DNA/RNA自动合成仪分别合成mRNA上的靶序列的有义链和反义链，在适当的退火缓冲液中在约90℃～约95℃下变性约1分钟左右，然后在约30℃～约70℃下退火约1小时～约8小时。另外，也可以通过合成作为siRNA的前体的短发夹RNA(shRNA)并使用Dicer酶将其切断来制备。
[0118] (iii)能够生成针对免疫检查点的mRNA的siRNA的核酸
[0119] 本说明书中，以能够在生物体内生成针对上述免疫检查点的mRNA的siRNA的方式设计的核酸也被定义为包括在包含与免疫检查点的mRNA的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列或其一部分的核酸中。作为这样的核酸，可以列举上述的shRNA或以表达该shRNA的方式构建的表达载体等。shRNA可以如下制备：设计一种寡聚RNA，其包含在mRNA上的靶序列的有义链和反义链之间插入能够形成适当环结构的长度(例如15个至25个碱基左右)的间隔序列而连接成的碱基序列，利用DNA/RNA自动合成仪合成该寡聚RNA。包含shRNA的表达盒的表达载体可以通过利用常规方法制作编码上述shRNA的双链DNA后、插入至适当的表达载体中而制备。作为shRNA的表达载体，可以使用具有U6、H1等Pol III系启动子的表达载体。
[0120] 这些核酸的免疫检查点表达抑制活性可以使用导入有免疫检查点的基因的转化体、生物体内或生物体外的免疫检查点的基因表达系统、或者生物体内或生物体外的免疫检查点的蛋白质翻译系统来考察。
[0121] 本发明中的抑制免疫检查点的表达的物质不限于上述的核酸，只要直接或间接地抑制免疫检查点的产生，也可以为低分子化合物等其他物质。
[0122] 本发明中，关于“抑制免疫检查点的活性的物质”，只要抑制对T细胞针对癌细胞的抗肿瘤活性进行调控的作用，则可以为任意物质。
[0123] 具体而言，作为“抑制免疫检查点的活性的物质”，可以列举免疫检查点的特异性抗体。抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种。这些抗体可以根据本身公知的抗体或抗血清的制造方法来制造。抗体的同种型没有特别限定，优选列举IgG、IgM或IgA，特别优选列举IgG。另外，抗体只要至少具有用于特异性地识别并结合靶抗原的互补决定区(CDR)则没有特别限制，除了完整抗体分子以外，还可以是Fab、Fab’、F(ab’)2等片段、scFv、scFv-Fc、微抗体、双特异性抗体等利用基因工程方法制作的偶联分子、或者用聚乙二醇(PEG)等具有蛋白质稳定作用的分子等进行了修饰的这些抗体的衍生物等。
[0124] 作为“免疫检查点抑制剂”的优选例，可以列举例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗KIR抗体、抗CD 137抗体、抗LAG-3抗体、抗OX40抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H5抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体和抗BTLA抗体。其中，优选抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体，更优选抗PD-1抗体。
[0125] 本发明中使用的“抗PD-1抗体”只要与PD-1结合且能够抑制其作为免疫检查点的功能，则没有特别限定。作为抗PD-1抗体，有已经作为药物被许可销售的抗PD-1和开发中的抗PD-1，可以优选利用这些抗PD-1。作为这样的“抗PD-1抗体”，可以列举纳武单抗(Nivolumab)(OPDIVO(GSK/小野化学品))、作为人源化IgG4型抗体的派姆单抗(Pembrolizumab)(MK-3475(默克))、Pidilizumab(CT-011(CureTech))、REGN-2810/SAR-
439684(Regeneron)、PDR-001(Novartis)、AMP-514/MEDI-0680(Amplimmune)、TSR-042(AnaptyBio)、PF-06801591(Pfizer)、JS-001(上海君实生物医药科技)、IBI-308(Innovent Biologics)、BGB-A317(BeiGene)，但不限于这些。
439684(Regeneron)、PDR-001(Novartis)、AMP-514/MEDI-0680(Amplimmune)、TSR-042(AnaptyBio)、PF-06801591(Pfizer)、JS-001(上海君实生物医药科技)、IBI-308(Innovent Biologics)、BGB-A317(BeiGene)，但不限于这些。
[0126] 本发明中使用的“抗PD-L1抗体”只要与PD-L1且能够抑制其作为免疫检查点的功能，则没有特别限定。作为抗PD-L1抗体，有已经作为药物被许可(销售)的抗PD-L1抗体和开发中的抗PD-L1抗体，可以优选利用这些抗PD-L1抗体。作为这样的“抗PD-L1抗体”，可以列举阿替利珠单抗(Atezolizumab)(MPDL3280A/RG-7446(Roche/中外)、度伐鲁单抗(Durvalumab)(MEDI4736(阿斯利康))、Avelumab(MSB0010718C(默克))、MED10680/AMP-514(Medimmune)、MDX-1105/BMS-936559(BMS)、INCAGN-1876(Agenus)、LY-3300054(Eli Lilly)、CA-170(Aurigene Discovery Tcehcnology)等，但不限于这些。
[0127] 本发明中使用的“抗CTLA-4抗体”只要与CTLA-4结合且能够抑制其作为免疫检查点的功能，则没有特别限定。作为抗CTLA-4抗体，有已经作为药物被许可(销售)的抗CTLA-4抗体和开发中的抗CTLA-4抗体，可以优选利用这些抗CTLA-4抗体。作为这样的“抗CTLA-4抗体”，可以列举伊匹单抗(Ipilimumab)(MDX-010)、替西木单抗(Tremelimumab)(CP675/206(Pfizer))、AGEN-1884(4-Antibody)，但不限于这些。
[0128] 除上述以外，作为抗杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)抗体的利丽单抗(1irilumab)(IPH2102/BMS-986015)、作为抗CD137抗体的Urelumab(BMS-663513)、PF-
05082566、作为抗LAG-3抗体的BMS-986016、作为抗OX40抗体的MEDI6469、作为以PD-LA和TGF-β为标靶的双功能融合蛋白质的MSB0011359C/M-7824(默克)等作为免疫检查点抑制剂正在开发中。
05082566、作为抗LAG-3抗体的BMS-986016、作为抗OX40抗体的MEDI6469、作为以PD-LA和TGF-β为标靶的双功能融合蛋白质的MSB0011359C/M-7824(默克)等作为免疫检查点抑制剂正在开发中。
[0129] 上述抗体可以基于常规方法进行制作。这种情况下，为了降低对人的异种抗原性，抗体优选为嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、或者为全人抗体。
[0130] 本发明的“免疫检查点抑制剂”可以含有药理学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，可以列举例如赋形剂、粘结剂、润滑剂、溶剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、无痛化剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、着色剂、缓冲剂、流动性促进剂等，但不限于这些，也可以适当使用其他常用的载体、添加物。载体和添加物的具体例如上所述。
[0131] 本发明的“免疫检查点抑制剂”的给药途径没有特别限定，优选非经口给药，具体而言，可以列举注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药，可以例示静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射。给药方法可以根据患者的年龄、症状而适当选择。
[0132] 本发明的药物中，在免疫检查点抑制剂和HVJ-E含有在不同的药剂中而提供的情况下，这些药剂的剂型、给药途径可以相同也可以不同。另外，可以进一步组合一种以上的不同制剂。
[0133] 本发明的“免疫检查点抑制剂”的给药量根据其使用目的、给药途径等而适当决定。以带来作为目标的最佳应答(例如治疗应答)的方式进行调节。有效成分为抗体，因此给药量为约0.0001mg/kg～100mg/kg、通常为0.01～5mg/kg患者体重的范围。例如，给药量为约0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重、或者为1～10mg/kg的范围。典型的治疗方法中，例如为每周1次给药、每隔2周1次给药、每隔3周1次给药、每隔4周1次给药、每月1次给药、每隔3个月1次给药或每隔3～6个月1次给药等。例如，在静注给药的情况下，为1mg/kg体重或3mg/kg体重。给药次数根据症状而适当设定，可以单次大剂量给药，也可以分多次间隔时间地给药。例如，对于6次给药，有时隔4周、接着隔3周进行给药，有时每隔3周进行给药，还有时以3mg/kg体重给药1次、接着隔3周以1mg/kg体重给药。
[0134] 在组合使用本发明的HVJ-E和免疫检查点抑制剂的情况下，其给药顺序没有限定，可以在免疫检查点抑制剂给药后进行HVJ-E给药，可以两者同时给药，也可以在HVJ-E给药后进行免疫检查点抑制剂给药。优选在HVJ-E给药后进行免疫检查点抑制剂给药。
[0135] 在依次进行HVJ-E和免疫检查点抑制剂的给药的情况下，HVJ-E和免疫检查点抑制剂的给药间隔没有特别限定，可以考虑给药途径、剂型、给药量、残留浓度等进行设定以得到所期望的组合使用效果。例如，给药间隔为0小时～7天、优选为0小时～3天、更优选为0～24小时、进一步优选为0小时～12小时。给药间隔例如可以基于利用公知的方法分析患者体内的药剂及其代谢物的血中浓度而得到的结果来决定。
[0136] 实施例
[0137] 以下，使用实施例更详细地对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[0138] 实施例1：HVJ-E和抗PD-1抗体的单剂和联合给药对β-淀粉样蛋白单次给药模型小鼠的学习障碍的改善作用
[0139] 1.材料和方法
[0140] 试验物质：
[0141] (1)HVJ-E(批号：140523、GenomIdea株式会社)
[0142] (2)LEAFTM纯化抗小鼠CD279(抗PD-1抗体、批号：B203991、BioLegend Inc.)[0143] 阳性对照物质
[0144] Aricept(注册商标)片5mg(多奈哌齐盐酸盐、批号：61A53K、卫材株式会社)[0145] 介质：
[0146] (1)Metolose(注册商标)SM-100(甲基纤维素(以下记为MC)、批号：5065340、信越化学工业株式会社)
[0147] (2)注射用水(批号：5C74N、株式会社大塚制药工厂)
[0148] 5％海藻糖溶液(批号：160523、GenomIdea株式会社)
[0149] (3)磷酸缓冲盐(批号：1259290、DS Pharma Biomedical株式会社)
[0150] 模型制作用物质：
[0151] β-淀粉样蛋白(25-35)(β-淀粉样蛋白、批号：AW14089、PolyPeptide Laboratories)
[0152] 模型制作用物质用介质：
[0153] 注射用水(批号：K5F71、株式会社大塚制药工厂)
[0154] 给药样本：
[0155] 介质(0.5％MC)的制备
[0156] 称量(使用电子天平：XP205DR、PB3002-S/FACT中的任意一种、Mettler Toledo株式会社)所需量的MC后，以达到0.5w/v％浓度的方式用注射用水搅拌制备。制备后的0.5％MC溶液在冷藏(管理温度：2.0～8.0℃)的条件下保存，制备后7天以内使用。
[0157] 介质(PBS)的制备
[0158] 将每片磷酸缓冲盐用100mL的注射用水溶解，利用0.22μm的过滤器(MILLIPORE)进行过滤灭菌。
[0159] 受试物质(HVJ-E)的制备
[0160] 将所需量的受试物质恢复至室温，从小瓶上完全取下铝盖而仅保留橡胶塞。在安装有注射针(泰尔茂株式会社)的1mL聚丙烯制一次性注射器(泰尔茂株式会社)中填充注射用水1mL。用酒精棉擦拭橡胶塞的外侧后，将上述安装有注射针的1mL聚丙烯制一次性注射器刺入橡胶塞中，以使注射用水遍及壁面的方式在每小瓶中加入1mL注射用水。在注意不使液体起泡且不接触橡胶塞的同时以画圆的方式转动小瓶，使其完全溶解而制成均匀的白色溶液。将此时的HVJ-E的浓度设为10000mNAU/mL(含有5％海藻糖)。取下橡胶塞，在注意不使液体起泡的同时使用微量移液器全部移至聚丙烯制的管中。
[0161] 将转移有溶解液的管立即在冰上静置，使用5％海藻糖水溶液进行稀释而制备规定浓度(2000mNAU/mL)的给药液。制备后在冰上保存，在即将给药前恢复至室温。
[0162] 受试物质(抗PD-1抗体)的制备
[0163] 直接(1小瓶：1mg/mL)使用。在冰上保存至给药为止，在即将给药前恢复至室温。
[0164] 阳性对照物质的制备
[0165] 换算成盐而进行制备(换算系数：1.10)。
[0166] 将所需片数的多奈哌齐放入玛瑙研钵中，充分磨碎，逐次少量地加入0.5％MC，制成规定浓度。
[0167] 模型制作用物质的制备
[0168] 将β-淀粉样蛋白用注射用水以达到2mM的方式溶解，在37℃下温育4天，制备β-淀粉样蛋白溶液。需要说明的是，操作在超净工作台内进行，并使用灭菌完毕的器具和容器。
[0169] 制备频率
[0170] 0.5％MC每周制备1次以上，模型制作用物质在给药4天前制备1次，介质(PBS)、受试物质和阳性对照物质在用时制备。
[0171] 试验系统
[0172] 动物种类和系统
[0173] 小鼠(SPF)：S1c：ddY
[0174] 雄性、5周龄、50只
[0175] 获得后1天的体重范围(23～28g)
[0176] 供给源：日本SLC株式会社
[0177] 检疫和驯化
[0178] 获得的动物设置5天的检疫期间、然后设置4天的驯化期间。在此期间，进行3次体重测定(使用电子天平：PB3002、PG2002-S、PB3002-S/FACT、MS1602S/02中的任意一种、Mettler Toledo株式会社)和1天1次的一般状态的观察，作为检疫和驯化。将体重变化和一般状态未见异常的动物用于分组。对于体重变化和一般状态观察到异常的动物，使用二氧化碳使其安乐死。
[0179] 分组法
[0180] 关于分组，使用计算机系统(IBUKI、Nihon Bioresearch Inc.)，按体重分层后，利用随机抽样法以各组的平均体重基本相等的方式进行分组。分组后的剩余动物在分组日使用二氧化碳使其安乐死。
[0181] 个体识别方法
[0182] 动物通过在获得日组合使用油性墨的尾部标记法和四肢的色素涂布法来进行识别。分组后，使用与笼标签同色(其中假手术组为黑色)的油性墨，在尾部标记动物编号来进行识别。各笼上，在检疫、驯化期间安装记有试验编号、获得年月日、检疫、驯化动物编号的标签，在分组后安装记有试验编号、组名称、给药量和动物编号且按组区分颜色的标签。
[0183] 环境条件和饲养方法
[0184] 在维持为管理温度：20.0～26.0℃、管理湿度：40.0～70.0％、明暗各12小时(照明：上午6时～下午6时)、换气次数：12次/小时(通过过滤器后的新鲜空气)的饲养室(E栋9号室、其中检疫期间在E栋10号室)中饲养动物。动物使用放有高压釜处理后的敷料的塑料制笼(W：310×D：360×H：175mm)，每笼至多10只、分组后每笼至多5只进行组饲养。每2周进行1次以上的投食器的更换，每周进行2次以上的给水瓶、塑料制笼的更换。每天进行动物饲养室的清扫、消毒。
[0185] 饲料
[0186] 在投食器中放入制造后5个月以内的不含乳蛋白的固体饲料(MF、Oriental酵母工业株式会社)，使小鼠自由摄取。对于使用的全部批次的饲料，确认了饲料中的污染物质浓度、细菌数和营养成分含量适合试验设施的允许标准。
[0187] 分析机构：Eurofins Scientific Analytics(污染物质)和Oriental酵母工业株式会社(细菌数和营养成分)
[0188] 给药途径
[0189] 介质(0.5％MC)和阳性对照物质：经口
[0190] 使用安装有一次性小鼠用经口导管(FUCHIGAMI器械有限公司)的聚丙烯制一次性注射器(泰尔茂株式会社)，进行强制经口给药。给药操作时，按只将各给药样本颠倒混合，抽吸至注射器中。
[0191] 给药液量：由给药日的体重值按10mL/kg算出。
[0192] 给药次数：1天1次、合计11次。
[0193] 给药时刻：设定在上午9时～上午12时之间。其中，在β-淀粉样蛋白注入日和检查日如下进行。
[0194] β-淀粉样蛋白注入日：在β-淀粉样蛋白注入后(苏醒后)给药。
[0195] 检查日：在测定前约1小时(+10分钟)给药。
[0196] 选择理由：为试验设施中使用的常规方法。
[0197] 介质(5％海藻糖溶液)和HVJ-E：皮下(颈背部)
[0198] 使用安装有一次性注射针(泰尔茂株式会社)的聚丙烯制一次性注射器(泰尔茂株式会社)，在颈背部皮下给药。给药操作时，按只将各给药样本颠倒混合，抽吸至注射器中。
[0199] 给药液量：由给药日的体重值按5mL/kg算出。
[0200] 给药次数：隔日，1天1次、合计6次。
[0201] 给药时刻：设定在上午9时～上午12时之间。其中，在β-淀粉样蛋白注入日和检查日如下进行。
[0202] p-淀粉样蛋白注入日：在β-淀粉样蛋白注入后(苏醒后)给药。
[0203] 检查日：在测定前约1小时(+10分钟)给药。
[0204] 介质(PBS)和抗PD-1抗体：腹腔内
[0205] 使用安装有一次性注射针(泰尔茂株式会社)的聚丙烯制一次性注射器(泰尔茂株式会社)，进行腹腔内给药。给药操作时，按只将各给药样本颠倒混合，抽吸至注射器中。
[0206] 给药液量：每只给药0.25mL。
[0207] 给药次数：1天1次、给药第1天和给药第4天、合计2次。
[0208] 给药时刻：设定在上午9时～上午12时之间。
[0209] 选择理由：为试验设施中使用的常规方法。
[0210] [表2]
[0211] 组构成和给药量
[0212]
[0213] *经口给药0.5％MC。
[0214] **皮下给药HVJ-E，腹腔内给药介质(PBS)。
[0215] ***腹腔内给药抗PD-1抗体，在颈背部皮下给药介质(5％海藻糖溶液)。
[0216] 给药量设定的理由
[0217] 关于HVJ-E和抗PD-1抗体的给药量，将预测到表现出充分的药理作用的用量包括在内而进行设定。关于多奈哌齐，基于试验设施的背景数据而设定显示出充分的药理作用的用量。
[0218] 观察和检查项目
[0219] 实验日程
[0220] 将给药样本的给药开始日作为给药第1天，在给药第3天注入β-淀粉样蛋白。然后，在给药第9天进行Y型迷宫试验，在给药第10～11天进行被动回避试验，在被动回避试验(保持测试)结束后摘除脑。
[0221] 一般状态
[0222] 关于一般状态，在给药前1天1次进行观察。
[0223] 需要说明的是，将观察到濒死(自主运动降低、呼吸、脉搏异常、体温降低、取侧臥、俯臥等姿势、对来自外部的刺激的反应降低的状态)时作为仁慈终点，对于该动物，使用二氧化碳使其安乐死。
[0224] 体重测定
[0225] 体重在每个给药日进行测定(使用电子天平：PB3002、PG2002-S、PB3002-S/FACT、MS1602S/02中的任意一种、Mettler Toledo株式会社)。体重测定在给药前进行。
[0226] β-淀粉样蛋白的注入
[0227] 用戊巴比妥钠(东京化成工业株式会社)40mg/kg对动物进行腹腔内给药(给药液量：10mL/kg)，将其麻醉。麻醉后，在头皮处皮下给药(0.1mL)盐酸左布比卡因(POPSCAINE(注册商标)0.25％注射剂、丸石制药株式会社)。剃除动物的头顶部的毛，将头部固定在脑定位固定装置上。用碘酊消毒头皮后将其切开，露出颅骨，用棉棒去除颅骨上的结缔组织后，用鼓风机干燥，使前囟点(bregma)的位置易于看到。使用齿科用钻在前囟点的侧方1mm(右侧)、后方0.2mm的颅骨上开出不锈钢管刺入用的孔。从骨表面将与外径0.5mm的硅管和微量注射器连接的不锈钢管垂直地刺入至2.5mm的深度。利用微量注射泵用3分钟向脑室内注入β-淀粉样蛋白溶液3μL(6μmol/3μL)。注入后，在插入有不锈钢管的状态下静置3分钟，轻轻地拆下不锈钢管。然后，去除不锈钢管，用非吸收性骨髓止血剂(NESTOP(注册商标)、Alfresa Pharma株式会社)塞住颅骨孔，缝合头皮。将动物从脑定位固定装置上取下，放回至饲养笼中。需要说明的是，不锈钢管和硅管使用灭菌完毕的管。
[0228] Y型迷宫试验(自主交替行为试验)
[0229] 装置(图1)
[0230] 试验中，使用每条臂的长度为39.5cm、地板的宽度为4.5cm、壁的高度为12cm、3条臂分别以120度分支的塑料制Y字型迷宫(Unicom有限公司)。测定前，以装置的地板面的照度为10～40Lux的方式进行调节。
[0231] 测定方法
[0232] 在给药约1小时后进行。将动物置于Y字型迷宫的任意一条臂中，使其在迷宫内自由探索8分钟。记录动物在测定时间内移动的臂的顺序，计数移动至臂内的次数，作为总进臂次数。接着，考察其中连续地选择不同的3条臂的组合，将该数作为自主行为交替次数。进一步使用下式算出自主行为交替率。
[0233] 自主行为交替率(％)＝[自主行为交替次数/(总进臂次数-2)]×100
[0234] 被动回避试验
[0235] 试验中，使用具备被中央的闸门分隔开的明箱(W：100×D：100×H：300mm)和从地板的栅极施加电刺激的暗箱(W：240×D：245×H：300mm)的步入(step through)型被动回避反应装置(明暗箱：本公司制、扰频器：Unicom有限公司)。将动物放入明箱中，10秒后安静地打开闸门，测定动物进入暗箱所需的时间(反应潜伏时间)。
[0236] 习得测试(第1天)中，在动物进入暗箱的同时关闭闸门，施加电刺激(0.2mA、2秒、加扰方式)，确认电刺激负荷时有无动物的叫声。反应潜伏时间最长设定至300秒。
[0237] 保持测试(第2天)中，以动物进入暗箱、或者在明箱中经过300秒后作为结束。
[0238] 保持测试结束后的动物使用二氧化碳使其安乐死。
[0239] 结果的分析
[0240] 各评价项目中，算出各组的平均和标准误差，如下进行分析。
[0241] 统计分析方法
[0242] 关于显著差异检验，对于介质对照组和HVJ-E组、介质对照组和抗PD-1抗体组、介质对照组和HVJ-E+抗PD-1抗体组、HVJ-E组和HVJ-E+抗PD-1抗体组、抗PD-1抗体组和HVJ-E+抗PD-1抗体组、介质对照组和多奈哌齐组进行2组间比较检验。
[0243] 2组间比较检验利用F检验进行等分散性的检验，在等分散的情况下进行学生t检验，在不等分散的情况下进行Aspin-Welch检验。
[0244] 显著水平设定为5％，分成小于5％(p＜0.05)和小于1％(p＜0.01)来表示。需要说明的是，显著差异检验中使用市售的统计程序(SAS系统、SAS Institute Japan株式会社)。
[0245] 结果
[0246] (1)Y型迷宫试验(自主行为交替次数、自主行为交替率)
[0247] 将Y型迷宫试验的结果示于图2。与介质对照组相比，HVJ-E+抗PD-1抗体组合使用组显示出显著高的自主行为交替率(P＜0.01)，其数值与多奈哌齐组相当。另外，与各单独给药(HVJ-E组或抗PD-1抗体组)相比，HVJ-E+抗PD-1抗体组合使用组的自主行为交替率显示出显著高的自主行为交替率，在累加性交互作用(Additive interaction)和累乘性交互作用(Multiplicative interaction)方面观察到正向相互作用，显示出协同性效果。
[0248] (2)被动回避试验(反应潜伏时间)
[0249] 将被动试验(反应潜伏时间)的结果示于图3。抗PD-1抗体组和HVJ-E+抗PD-1抗体组合使用组虽然稍逊于多奈哌齐组，但与介质对照组相比显示出显著高的效果。另外，HVJ-E+抗PD-1抗体组合使用组的反应潜伏时间与HVJ-E单独给药组相比显示出显著差异。
[0250] 考察
[0251] Schenk等人报道了：通过用Aβ1-42对过量产生Aβ的阿尔茨海默病模型病小鼠进行免疫，观察到疾病学的改善(上述Nature 400：173-，1999)和行为学的改善(Nature 408：979-and 982-，2000)；进一步，通过外周给药抗Aβ抗体，观察到病理学的改善(Nature Med
6：916-，2000)。另外，Baruch等人报道了：通过对阿尔茨海默病模型小鼠给药PD-1抗体，观察到病理学的改善(上述Nature Med 22：135-，2016)。
6：916-，2000)。另外，Baruch等人报道了：通过对阿尔茨海默病模型小鼠给药PD-1抗体，观察到病理学的改善(上述Nature Med 22：135-，2016)。
[0252] 根据本实施例的结果和上述事实可以认为，HVJ-E和抗PD-1抗体(免疫检查点抑制剂)均通过激活天然免疫和获得性免疫来排除作为异物的Aβ，从而改善阿尔茨海默病的病情。但是，通过HVJ-E和抗PD-1抗体的组合使用，与单独给药相比得到显著高的效果，这暗示两者的作用机制可能不同。另外，HVJ-E在单独给药时也显示出高的改善效果，这暗示HVJ-E仅通过获得性免疫激活以外的途径而有助于病情改善。根据本实验表明，通过单独使用HVJ-E或者组合使用HVJ-E和免疫检查点抑制剂，可以期待对以阿尔茨海默型痴呆为代表的伴有Aβ等朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍、神经退行性疾病的更有效的治疗成为可能。
[0253] 实施例2：HVJ-E和抗PD-1抗体的单剂和联合给药对β-淀粉样蛋白单次给药模型小鼠的学习障碍的改善作用(HVJ-E皮下给药和经鼻给药的比较)
[0254] 在皮下给药HVJ-E的组的基础上，还设定经鼻给药的组，除此以外利用与实施例1同样的方法实施Y型迷宫试验。给药途径和组构成如下所示。
[0255] 给药途径
[0256] 介质(0.5％MC)和阳性对照物质：经口
[0257] 如实施例1所述
[0258] 介质(5％海藻糖溶液)和HVJ-E：鼻腔内或皮下
[0259] 经鼻给药使用微量移液器(Eppendorf株式会社)对鼻腔内进行给药。皮下给药与实施例1同样，使用安装有一次性注射针(泰尔茂株式会社)的聚丙烯制一次性注射器(泰尔茂株式会社)对皮下进行给药。给药操作时，按只将各给药样本混合，抽吸至注射器中。
[0260] 经鼻给药在下述条件下进行给药。
[0261] 给药液量：每只以单侧鼻5μL的液量对两鼻腔内(10μL/两侧鼻)进行给药。
[0262] 给药次数：1天1次、合计9次。
[0263] 皮下给药在下述条件下进行给药。
[0264] 给药液量：由给药日的体重值按5mL/kg算出。
[0265] 给药次数：隔日，1天1次、合计6次。
[0266] 对于经鼻给药和皮下给药，给药时刻均设定为上午9时～上午12时之间。其中，在β-淀粉样蛋白注入日和检查日如下进行。
[0267] β-淀粉样蛋白注入日：在β-淀粉样蛋白注入后(苏醒后)给药。
[0268] 检查日：在测定前约1小时(+10分钟)给药。
[0269] 介质(PBS)和抗PD-1抗体：腹腔内
[0270] 如实施例1所述
[0271] [表3]
[0272] 组构成和给药量
[0273]
[0274] *经鼻给药介质(5％海藻糖溶液)，腹腔内给药介质(PBS)。
[0275] **经口给药0.5％MC。
[0276] ***经鼻给药HVJ-E，腹腔内给药介质(PBS)。
[0277] ****经鼻给药HVJ-E，腹腔内给药抗PD-1抗体。
[0278] *****皮下给药HVJ-E，腹腔内给药抗PD-1抗体。
[0279] 结果
[0280] Y型迷宫试验(自主行为交替次数、自主行为交替率)
[0281] 将Y型迷宫试验的结果示于图4。与介质对照组相比，HVJ-E经鼻给药组显示出显著高的自主行为交替次数(P＜0.05)和自主行为交替率(P＜0.01)，其数值与多奈哌齐组相当。另一方面，与抗PD-1抗体组合使用时，HVJ-E(经鼻给药)+抗PD-1抗体给药组与介质对照组相比未见显著差异，与此相对，HVJ-E(皮下给药)+抗PD-1抗体给药组与介质对照组相比观察到显著高的自主行为交替率(P＜0.01)。
[0282] 考察
[0283] 在本实施例记载的试验中，确认到：与介质给药组相比，HVJ-E经鼻给药组(未给药抗PD-1抗体的组)的小鼠的学习障碍得到显著改善。另外，在本实施例记载的试验中，确认到：HVJ-E与抗PD-1抗体的组合使用在经鼻给药和皮下给药时效果存在差异。认为HVJ-E通过由肿瘤细胞、树突细胞、巨噬细胞等诱导趋化因子产生而将NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞吸引至肿瘤灶，诱导Thl优势型转化，提高NK细胞、效应T细胞的抗肿瘤效果(Cancer Res.2007)。另外，还报道了HVJ-E对中性粒细胞也起作用，诱导N1优势型转化而提高抗肿瘤效果(Chang CY，et al.，Oncotarget.2016Jul 5；7(27)：42195-42207)。PD-1除了主要在T细胞、B细胞等淋巴细胞中表达之外，在骨髓系细胞、巨噬细胞中也有表达(Yuan B，et al.，Immunol Lett.2016Nov；179：114-121，认为HVJ-E如上所述也对多种免疫细胞发挥作用，在HVJ-E或HVJ-脂质体的经鼻给药中，认为粘膜免疫和全身性免疫同时被活化(Yasuoka E，et al.，J Mol Med(Berl).2007Mar；85(3)：283-92，Sakaue G，et al.，J Immunol.2003Jan 1；170(1)：495-502)，因此还认为经鼻给药与皮下给药的差异与该HVJ-E的作用机制相关。无论原因为何，通过优化制剂配方、给药途径，可以期待HVJ-E能够更有效地治疗以阿尔茨海默型痴呆为代表的伴有Aβ等朊病毒样蛋白蓄积的认知功能障碍、神经退行性疾病。
[0284] 实施例3：HVJ-E的单剂经鼻给药对β-淀粉样蛋白单次给药模型小鼠的学习障碍的改善作用(剂量反应性试验)
[0285] 在实施例1和2中，对通过β-淀粉样蛋白的脑室内单次给药而诱发了学习障碍的动物进行HVJ-E和抗PD-1抗体的单剂和联合给药，结果，通过HVJ-E单剂经鼻给药，对Y型迷宫试验(短期记忆障碍)显示出改善作用。因此，此次为了确认HVJ-E单剂经鼻给药的剂量反应性，使用作为阿尔茨海默病模型的β-淀粉样蛋白脑室内单次给药小鼠，采用Y型迷宫试验评价了各浓度的HVJ-E单剂经鼻给药对学习障碍的改善作用。
[0286] 改变HVJ-E的给药量，除此以外利用与实施例1同样的方法实施Y型迷宫试验。给药途径和组构成如下所示。
[0287] 给药途径
[0288] 阳性对照物质：经口
[0289] 如实施例1所述
[0290] 介质(5％海藻糖溶液)和HVJ-E：鼻腔内
[0291] 经鼻给药使用微量移液器(Eppendorf株式会社)对鼻腔内进行给药。皮下给药与实施例1同样，使用安装有一次性注射针(泰尔茂株式会社)的聚丙烯制一次性注射器(泰尔茂株式会社)对皮下进行给药。给药操作时，按只将各给药样本混合，抽吸至注射器中。
[0292] 经鼻给药在下述条件下进行给药。
[0293] 给药液量：每只以单侧鼻5μL的液量对两鼻腔内(10μL/两侧鼻)进行给药。
[0294] 给药次数：1天1次、合计9次。
[0295] 给药时刻设定为上午9时～上午12时之间。其中，在β-淀粉样蛋白注入日和检查日如下进行。
[0296] β-淀粉样蛋白注入日：在β-淀粉样蛋白注入后(苏醒后)给药。
[0297] 检查日：在测定前约1小时(+10分钟)给药。
[0298] [表4]
[0299] 组构成和给药量
[0300]
[0301] *经鼻给药介质(5％海藻糖溶液)。
[0302] 结果
[0303] Y型迷宫试验(自主行为交替次数、自主行为交替率)
[0304] 将Y型迷宫试验的结果示于图5。与实施例2的结果同样，与介质对照组相比，HVJ-E(100mNAU/只)经鼻给药组显示出显著高的自主行为交替率(P＜0.01)，其数值与多奈哌齐组相当。
[0305] 对HVJ-E给药组和介质组这两组间进行t检验，结果，50mNAU/只和10mNAU/只的p值分别为0.0204和0.0515，在50mNAU/只时有显著差异，在10mNAU/只时也观察到该倾向(100mNAU/只的p值为0.0000368)。由以上可以确认到HVJ-E单剂经鼻给药的剂量依赖性效果。此外，还可以期待通过优化给药量、给药途径而提高HVJ-E的效果。
[0306] 产业上的可利用性
[0307] 本发明对伴有朊病毒样蛋白的蓄积的认知功能障碍和/或神经退行性疾病的预防和/或治疗有用。
[0308] 将本说明书中引用的全部发行物、专利和专利申请直接以参考的形式并入本说明书中。
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