使用来自体液的miRNA检测和监控帕金森病(PD)的方法
[0002] 本申请要求2013年11月18日提交的美国临时申请No.61/905,703和2014年2月4提交的美国临时申请No.61/935,806的优先权，在此将其公开内容以全文引用以作参考。
技术领域
[0003] 本
发明涉及通过定量体液中的脑富集miRNA用于帕金森病(PD)的早期诊断、进展和
治疗监控及其与其它神经退行性
疾病的区分的方法。
背景技术
[0004] 帕金森病(PD)为第二常见的神经退行性疾病。每年大约60,000美国人被诊断患有帕金森病，并且美国和全世界分别估计有50万人和7百万-1千万人带着帕金森病生活(http://www.parkinson.org/parkinson-s-disease.aspx；http://www.pdf.org/en/parkinson_statistics)。
[0005] 帕金森病在美国的年经济影响估计约$108亿并正在增长(http://www.parkinsoninfo.org/about-parkinsons-disease/economic-impact/)。
[0006] 仅在美国，帕金森病包括治疗、社会保险支付和无法工作而损失的收入在内的合并直接和间接花费估计每年就接近$250亿(http://www.pdf.org/en/parkinson_statistics)。
[0007] 尽管已描述了多种潜在的进展，对PD发展的机理了解并不充分(Walter和Schulz-Schaeffer.Acta Neuropathol.2010；120:131–143；David Sulzer.Trends in Neurosciences.2007；30:244-250)。PD以代谢紊乱为开端，包括α-突触核蛋白(其聚集形式为所谓的路易氏体(Levy bodies))的异常加工，接着突触功能紊乱、损坏，最终神经元死亡(Kazantsev AG,Kolchinsky AM.Arch Neurol.2008；65:1577-1581)。中脑中黑质的神经元在PD中最大地受损(Walte和Schulz-Schaeffer.Acta Neuropathol.2010；120:131–143)，而其他脑区如额皮质(Braak等，Neurobiology of Aging.2003；24:197–211；Hou等，J.Clin.Neuroscience.2010；17:628–633)也参与PD发展的不同阶段的病理。中脑中的黑质产生将
信号传递至参与运动调节的纹状体的多巴胺，并且多巴胺产生的显著降低引起多种PD特有的
运动障碍。后者(震颤、姿势不稳定和帕金森步态、僵化、面具脸和运动迟缓)目前是用于PD诊断的主要症状(Parkinson’s disease:Diagnosis and Clinical Management.Editors:Factor and Weiner,第2版，2008,Demos Medical Publishing,LLC,New York,NY)。某些PD患者还发展了其他症状，例如认知问题，这可导致PD痴呆、抑郁、
皮肤问题、嗅觉障碍等(Aarsland等，Mov.Disord.2005；20:1255–1263；Song等，Eur.Neurol.2008；59:49–55；Mollenhauer等，Neurology.2013；81:1226-1234)。某些数据表明PD发展中
炎症过程的参与(Tansey和Goldberg.Neurobiol.Dis.2010；37:510-518；Amor等，Immunology.2013Dec 16.[在付印前以
电子文档公开])。
[0008] 目前，尽管药物和手术可改善PD的某些症状，但还没有有效的针对PD的疗法(Gazewood等，Am.Fam.Physician.2013；87:267-273)。例如，多巴胺替代药物如L-DOPA及其与多巴脱
羧酸酶
抑制剂的组合被广泛使用。多巴胺受体激动剂、单胺
氧化酶和儿茶酚o-甲基转移酶抑制剂是其他类用于治疗PD的药物(Kansara等，J.Neural Transm.2013；120:197-210)。改变生活方式和物理疗法辅助减缓PD进展。
[0009] 如同其他神经退行性疾病，长无症状期是PD的特征，且等到PD临床表现时，产生多巴胺的神经元的60-80％已死亡。因此，对于抗PD药物的开发、临床试验、及时的疾病治疗、和疾病和治疗的监控，非常需要用于早期PD检测的
生物标记物(Lang.Neurology.2009；72(Suppl.7):S39-43；Jann MW.Am.J.Manag.Care.2011；17Suppl 12:S315-21；Sharma等，Neurochem Int.2013；63:201-229)。对于AD，成像技术(de la Fuente-Fernandez等，Expert Opin.Med.Diagn.2011；5:109-120；Huddleston等，Clin.Med.Res.2013；11:141)和
脑脊液中
蛋白质的分析(Parnetti等，Nat.Rev.Neurol.2013；9:131-140)证实了具前景的结果，但由于侵入性和高成本，这些技术不能用于初步筛选。对
血浆中α-突触核蛋白的分析数据(Foulds等，Sci.Rep.2013；3:2540)和其他方法(Sharma等，Neurochem Int.2013；63:201-229)似乎具有前景，但需要其他有效性研究。具有显著临床意义的另一问题是将PD与如阿尔茨海默病(AD)和轻度
认知障碍(MCI)等其他神经退行性疾病和综合征相区分(Pahwa and Lyons.Am.J.Manag.Care.2010；16Suppl.Implications:S94-99)。
[0010] 近来，本
发明人已提出了一种基于体液中循环的无细胞miRNA的分析的早期检测神经退行性疾病的新方法(Sheinerman等，Aging(Albany NY).2012；4:590–605；Sheinerman和Umansky.Cell Cycle.2013；12:1–2；Sheinerman和Umansky.Front Cell Neurosci.2013；7:150；Sheinerman等，Aging(Albany NY).2012；5:925-938；国际
专利公布WO2012/145363和WO2011/057003)。
[0011] 微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，其终产物为约22nt的功能性RNA分子。它们在通过结合至信使转录本的互补区以抑制其翻译或调节降解来调节靶基因中起到重要的作用(Griffiths-Jones Nucleic Acids Research.2006；34,Database issue:D140–D144)。通常，一种miRNA可靶向多种mRNA，一种mRNA可被靶向3'UTR的不同区域的多种miRNA调节。
一旦结合至mRNA，miRNA可通过影响例如mRNA的翻译和
稳定性来调控基因表达和蛋白质生产(Baek等，Nature.2008；455:64；Selbach等，Nature.2008；455:58；Ambros.Nature.2004；
431:350-355；Bartel.Cell.2004；116:281-297；Cullen.Virus Research.2004；102:3-9；
He等，Nat.Rev.Genet.2004；5:522-531；和Ying等，Gene.2004；342:25-28)。还有其他类型的特征较少的小RNA(Kim.Mol.Cells.2005；19:1-15对此作了综述)。
[0012] 许多miRNA在特定的器官/组织/细胞(参见，例如Hua等，BMC Genomics.2009；10:214；Liang等，BMC Genomics.2007；8:166；Landgraf等，Cell.2007；129:1401-1414；Lee等，RNA.2008；14:35-42)和不同的脑区如海
马、中脑、额皮质、脑下垂体，以及不同的细胞类型如神经元和神经胶质细胞(Sempere等，Genome Biol.2004；5:R13；Deo等，Dev.Din.2006；
235:2538-2548；Bak等，RNA.2008；14:432-444；Trivedi和Ramakrishna
Int.J.Neurosci.2009；119:1995–2016；Weng等，Biomed.Res.2011；32:135-141；He等，Neuron.2012；73:35-48)中特异或过表达。
[0013] 一些miRNA，包括那些细胞特异性的，在特定细胞区室中、特别是在轴突、树突和突触富集(参见，例如Schratt等，Nature.2006；439:283-289；Lugli等，J.Neurochem.2008；106:650-661；Bicker和Schratt.J.Cell.Mol.Med.2008；12:1466-1476；Smalheiser和Lugli.Neuromolecular Med.2009；11:133-140；Rajasethupathy.Neuron.2009；63:714-
716；Kye.RNA.2007；13:1224-1234；Yu等，Exp Cell Res.2008；314:2618-2633；Cougot等，J.Neurosci.2008；28:13793-13804；Kawahara.Brain Nerve.2008.60:1437-1444；Schratt G.Rev Neurosci.2009；10:842-849；Pichardo-Casas等，Brain Research.2012；1436:20-
33)。
[0014] miRNA的表达和浓度通过各种生理和病理信号调节。一些miRNA的表达变化见于帕金森病、阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病患者的神经元中(Hébert和De Strooper.Trends Neurosci.2009；32:199-206；Saba等，PLoS One.2008；3:e3652；Kocerha等，Neuromolecular Med.2009；11:162-172；Sethi和Lukiw.Neurosci Lett.2009；459:
100-104；Zeng；Mol Pharmacol.2009；75:259-264；Cogswell等，Journal of Alzheimer’s disease.2008；14:27-41；Schaefer等，J.Exp.Med.2007；204:1553-1558；Hébert.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2008；105:6415-6420；Wang等，J.Neurosci.2008；28:
1213-1223；Nelson等，Brain Pathol.2008；18:130-138；Lukiw.Neuroreport.2007；18:
297-300)。
[0015] 帕金森病(PD)中miRNA的参与的研究已集中于中脑中miRNA表达和miRNA在多巴胺能神经元的功能发挥和α-突触核蛋白合成中的作用的分析。已在多个研究中报道了PD患者(Kim等，Science.2007；317:1220-1224)和PD小鼠模型的中脑中miR-133b的下调(综述：Filatova等，Biochemistry(Mosc).2012；77:813-819；Harraz等，J.Chem.Neuroanat.2011；
42:127-130；Mouradian.Neurobiol Dis.2012；46:279-284)。已发现miR-7和miR-153下调α-突触核蛋白的合成(Doxakis.J.Biol.Chem.2010；285:12726-12734；Junn等，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2009；106:13052-13057)。由于miRNA的尺寸小，它们可穿过血脑屏障、胎盘屏障和肾脏屏障。已提出了用于检测体内细胞死亡的体液中细胞/组织特异性miRNA分析(美国专利公布No 20090081640；Laterza等，Clin.Chem.2009；55:1977-1983)。
[0016] 对于诊断法中miRNA的使用，同样重要的是miRNA分泌根据细胞生理而变化(Palma等，Nucleic Acids Res.2012；40:9125-9138；Pigati等，PLoS One.2010；5:e13515)。除了由于细胞死亡miRNA释放至细胞外空间以及随后出现在体液中以外，miRNA由于凋亡体的出泡、微泡的出芽和脱落、外来体形式和miRNA与蛋白质(AGO2、NPM1等)和高
密度脂蛋白(HDL)的
复合体形式的主动分泌而在循环中出现(综述：Sun等，Clin.Chem.Lab.Med.2012；50:2121-2126；Zandberga等，Genes Chromosomes Cancer.2013；52:356-369)。所有这些形式的无细胞miRNA在血液和其他体液中高度稳定。miRNA的分泌是选择性的并可由各种病理过程而显著改变。例如，已经证实了分泌于来自朊
病毒感染的神经元细胞的外来体中的miRNA谱与未感染细胞相比的变化(Belingham等，Nucleic Acids Res.2012；40:10937-10949)。
[0017] 两种方法广泛用于寻找体液中的各种疾病的miRNA生物标记物：
[0018] 1.使用miRNA阵列或下一代测序(NGS)对来自患有目标病理的患者和对照受试者的体液中数百种不同的miRNA的测量(Qin等，Cancer Inform.2013；12:83-101)。在该方法允许分析庞大数量的各种miRNA的同时，目前基于miRNA阵列和测序的技术对于检测体液中浓度相对低的多种miRNA并非足够敏感。结果，通过阵列和NGS可在体液中检测的大部分miRNA是在所有或多种组织中表达的遍在miRNA，并且其中很多源自血细胞(Pritchard等，Cancer Prev.Res.(Phila).2012；5:492-497；Leidner和Thompson.PLoS One.2013；8:57841)。患有一种病理的患者中此类遍在miRNA浓度变化的检出并不意味着同一种miRNA不能参与不同器官的其它疾病中。很多miRNA与特定的病理如炎症、低氧等相关，并且它们在体液中的浓度变化可与不同器官的疾病相关。例如，在患有
乳腺癌、食管癌、
肺癌、胰腺癌和淋巴瘤的患者的血液中发现miR-155浓度的变化(Blair和Yan.DNA Cell Biol.2012；
31Suppl.1:S49-61；Xie等，Bioinformatics.2013；29:638-644)。miR-21的
水平在患有骨肉瘤、膀胱癌、食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、
结直肠癌、颈部鳞状细胞癌和其它
肿瘤的患者的血浆/血清中增加(Blair和Yan.DNA Cell Biol.2012；31Suppl.1:S49-61；Farazi等，J.Pathol.2011；223:102-115；Xie等，Bioinformatics.2013；29:638-644)。由此得出结论，通过miRNA阵列发现的潜在的生物标记物应当也在其它病理中试验，而不仅仅在健康对照受试者中试验。
[0019] 2.第二种方法是基于通过比较分离自病理的和正常的组织、器官或细胞类型的miRNA而鉴定的疾病特异性miRNA的分析。这里，继疾病特异性miRNA的鉴定之后(例如，通过阵列和随后的RT-PCR)，分析它们在体液中的存在。在该策略中，由于有限数量的循环miRNA被试验，可以使用单独的RT-PCR，使得分析的敏感性和再现性增加。然而，在应用该方法时的多数情况下，并未检测到组织和体液中miRNA浓度与病理-诱导的变化的相关性(Boeri等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2011；108:3713-3718；Cuk等，Int.J.Cancer.2013；132:1602-1612)。
发明内容
[0020] 如上文背景技术部分所示，尽管近来有所发展，但本领域仍迫切需要灵敏的早期检测如帕金森病(PD)等神经退行性疾病的方法。本发明通过提供通过定量体液中的脑富集miRNA用于PD的早期诊断、进展和治疗监控及其与其它神经退行性疾病的区分的方法解决了该问题以及其它需求。
[0021] 一方面，本发明提供一种用于检测受试者中的第一神经退行性疾病的方法，所述方法包括：
[0022] a)测量从受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一脑富集miRNA在受到第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区(brain area(s))中富集；
[0023] b)测量从受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受第一神经退行性疾病的影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述第一神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0024] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0025] d)将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比进行比较，和[0026] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有所述第一神经退行性疾病，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有所述第一神经退行性疾病。
[0027] 在相关的方面，本发明提供一种用于检测受试者中的第一神经退行性疾病的方法，所述方法包括：
[0028] a)测量从受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)在受到第一神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0029] b)测量从受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中：(i)如果第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0030] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0031] d)将在步骤(c)中计算的miRNA水平比与相应的对照比进行比较，和
[0032] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有第一神经退行性疾病，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有所述第一神经退行性疾病。
[0033] 在上述两种方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下列步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种方法中的步骤(d)-(e)一起进行：
[0034] f)将步骤(c)中计算的miRNA的水平比与作为第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较，和
[0035] g)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比未落入作为第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除受试者患有第二神经退行性疾病的诊断，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比落入作为第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则不排除受试者患有第二神经退行性疾病的诊断。
[0036] 在上述两种方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下述步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种方法中的步骤(a)-(e)一起进行：
[0037] f)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第三脑富集miRNA的水平，其中所述第三脑富集miRNA在受到第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集；
[0038] g)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第四脑富集miRNA的水平，其中所述第四脑富集miRNA：(i)在不受所述第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述第二神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第三miRNA相同的脑区中富集，但在所述第二神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与所述第三miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0039] h)计算步骤(f)和(g)中测量的所述miRNA的水平比；
[0040] i)将步骤(h)中计算的所述miRNA的水平比与作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较；
[0041] j)(i)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则将所述受试者鉴定为除第一神经退行性疾病外患有所述第二神经退行性疾病，或(ii)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比未落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除所述受试者患所述第二神经退行性疾病的诊断。
[0042] 在上述两种方法的一个实施方案中，所述第一神经退行性疾病为帕金森病(PD)。
[0043] 在上述疾病区分方法的一个实施方案中，所述第一神经退行性疾病为帕金森病(PD)，所述第二神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿症(HD)、
朊病毒引起的疾病、额颞痴呆(FTD)、路易体痴呆、血管性痴呆、
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性损伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩症(MSA)、皮质基底节变性(CBGD)、皮克氏病和橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)组成的组。
[0044] 一方面，本发明提供一种用于检测受试者中的帕金森病(PD)的方法，所述方法包括：
[0045] a)测量从所述受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述脑富集miRNA为在中脑和/或额皮质中富集的神经元miRNA；
[0046] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受PD影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0047] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0048] d)将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比进行比较，和[0049] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有PD，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有PD。
[0050] 在相关的方面，本发明提供一种用于检测受试者中的帕金森病(PD)的方法，所述方法包括：
[0051] a)测量从所述受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0052] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中：(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0053] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0054] d)将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比进行比较，和[0055] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有PD，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有PD。
[0056] 在上述两种用于检测PD的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下述步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种用于检测PD的方法的步骤(d)-(e)一起进行：
[0057] f)将步骤(c)中计算的miRNA的水平比与作为不同于PD的第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较，和
[0058] g)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比未落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除所述受试者患所述第二神经退行性疾病的诊断，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则不排除所述受试者患所述第二神经退行性疾病的诊断。
[0059] 在上述两种用于检测PD的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下述步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种用于检测PD的方法的步骤(a)-(e)一起进行：
[0060] f)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第三脑富集miRNA的水平，其中所述第三脑富集miRNA在受到第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集并且为所述第二神经退行性疾病的生物标记miRNA对中预先识别的分子；
[0061] g)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第四脑富集miRNA的水平，其中所述第四脑富集miRNA为所述第二神经退行性疾病的生物标记miRNA对中预先识别的分母，并且(i)在不受所述第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述第二神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第三miRNA相同的脑区中富集，但在所述第二神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与所述第三miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0062] h)计算步骤(f)和(g)中测量的所述miRNA的水平比；
[0063] i)将步骤(h)中计算的所述miRNA的水平比与作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较；
[0064] j)(i)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则将所述受试者鉴定为除PD外患有第二神经退行性疾病，或(ii)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比未落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除所述受试者患有所述第二神经退行性疾病的诊断。
[0065] 在上述任意疾病检测的方法的一个实施方案中，所述对照比为预设值，其表示所述第一miRNA和第二miRNA的经统计学验证的
阈值水平比(单一的“截止”值)，等于年龄相称的健康受试者中相应值的范围内可能的最高值。在上述任意疾病检测的方法的另一实施方案中，所述对照比为过去采集的来自同一受试者的类似处理的体液样品中所述第一miRNA和第二miRNA的水平比。
[0066] 在上述任意疾病区分的方法的一个实施方案中，作为所述第二神经退行性疾病的特征的miRNA之比的标准范围是通过在诊断有第二神经退行性疾病的大量受试者中确定相同miRNA之比而建立的经统计学验证的预设的值的范围。在一个具体实施方案中，所述诊断有第二神经退行性疾病的大量受试者代表所述第二神经退行性疾病的发展阶段的全部范围。在另一具体实施方案中，所述诊断有第二神经退行性疾病的大量受试者代表所述第二神经退行性疾病的一个或多个发展阶段。
[0067] 在上述任意疾病检测的方法的一个实施方案中，所述第二神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿症(HD)、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆(FTD)、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性损伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩症(MSA)、皮质基底节变性(CBGD)、皮克氏病、和橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)组成的组。
[0068] 另一方面，本发明提供一种用于监控受试者中的神经退行性疾病的发展变化的方法(所述受试者例如已预先诊断有所述神经退行性疾病)，所述方法包括：
[0069] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一脑富集miRNA在受到所述神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集；
[0070] b)测量与步骤(a)相同的体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受所述神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，(ii)在不受所述神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0071] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0072] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0073] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者中的所述神经退行性疾病已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者中的所述神经退行性疾病还未进展。
[0074] 在相关的方面，本发明提供一种用于监控受试者中的神经退行性疾病的发展变化的方法(例如已预先诊断有所述神经退行性疾病的受试者)，所述方法包括：
[0075] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)在受到第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0076] b)测量与步骤(a)相同的体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0077] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0078] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0079] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者中的所述神经退行性疾病已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者中的所述神经退行性疾病还未进展。
[0080] 在相关的方面，本发明提供一种用于监控受试者中的帕金森病(PD)的发展变化的方法(例如已预先诊断有PD的受试者)，所述方法包括：
[0081] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述样品已经在间隔的时间点采集，和其中所述第一脑富集miRNA在中脑和/或额皮质中富集；
[0082] b)测量与步骤(a)中相同的体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受PD影响的脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与所述第一脑富集miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一脑富集miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0083] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0084] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0085] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者中的PD已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者中的PD还未进展。
[0086] 在另一相关的方面，本发明提供一种用于监控受试者中的帕金森病(PD)的发展变化的方法(例如已预先诊断有PD的受试者)，所述方法包括：
[0087] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述样品已经在间隔的时间点采集，和其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0088] b)测量与步骤(a)中相同的体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0089] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0090] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0091] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者中的PD已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者中的PD还未进展。
[0092] 在单独的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有神经退行性疾病的受试者的所述神经退行性疾病发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0093] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一脑富集miRNA在受到所述神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集；
[0094] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，所述第二脑富集miRNA：(i)在不受神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述神经退行性疾病发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0095] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0096] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0097] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0098] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0099] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0100] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定所述治疗对所述神经退行性疾病有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定所述治疗对所述神经退行性疾病无效。
[0101] 在相关的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有神经退行性疾病的受试者的所述神经退行性疾病发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0102] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)在受第一神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0103] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0104] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0105] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0106] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0107] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0108] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0109] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定所述治疗对所述神经退行性疾病有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定所述治疗对所述神经退行性疾病无效。
[0110] 在另一相关的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者的PD发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0111] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一miRNA在中脑和/或额皮质中富集；
[0112] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二miRNA：(i)在不受PD影响的脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与所述第一miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0113] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0114] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0115] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0116] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0117] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0118] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗无效。
[0119] 还在另一相关的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者的PD发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0120] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0121] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0122] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0123] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0124] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0125] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0126] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0127] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗无效。
[0128] 在单独的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有神经退行性疾病的受试者中使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0129] a)测量体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物
给药前从受试者采集的，和其中所述第一脑富集miRNA在受到所述神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集；
[0130] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受所述神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述神经退行性疾病发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0131] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0132] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0133] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0134] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0135] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0136] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗无用。
[0137] 在相关的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有神经退行性疾病的受试者中使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0138] a)测量体液样品中第一miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物给药前从受试者采集的，和其中所述第一miRNA在受到第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0139] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0140] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0141] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0142] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0143] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0144] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0145] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗无用。
[0146] 在另一相关的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者中使PD减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0147] a)测量体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物给药前从受试者采集的，和其中所述第一miRNA在中脑和/或额皮质中富集；
[0148] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受PD影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0149] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0150] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0151] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0152] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0153] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0154] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使PD减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使PD减缓进展或治疗无用。
[0155] 还在另一相关的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者中使PD减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0156] a)测量体液样品中第一miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物给药前从受试者采集的，和其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0157] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0158] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0159] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0160] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0161] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0162] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0163] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使PD减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则鉴定所述试验化合物对于使PD减缓进展或治疗无用。
[0164] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述神经退行性疾病为帕金森病(PD)。
[0165] 在任意上述方法的一个实施方案中，第一脑富集的miRNA为神经元miRNA。在任意上述方法的一个实施方案中，第一脑富集的miRNA为突触和/或神经突miRNA。
[0166] 在任意上述方法的一个实施方案中，第二miRNA为脑富集miRNA，其(1)在不受第一神经退行性疾病(如PD)影响的一个或多个脑区中富集，或(2)在不受第一神经退行性疾病(如PD)影响的脑细胞类型中富集。在任意上述方法的一个实施方案中，第二miRNA为选自由主要在不参与PD的脑区中表达的miRNA、主要在神经胶质细胞中表达的miRNA、和PD中下调的脑富集miRNA组成的组的脑富集miRNA。
[0167] 在涉及脑富集的第一和第二miRNA的任意上述方法的一个实施方案中，第一脑富集miRNA在神经元中富集，第二脑富集miRNA在神经胶质细胞中富集。
[0168] 在涉及脑富集的第一和第二miRNA的任意上述方法的一个实施方案中，第一miRNA和第二miRNA对选自由下列组成的组：let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-744/miR-335、miR-99b/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-9*、let-7e/miR-132、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-134、miR-107/miR-134、miR-99b/miR-134、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-323-3p、miR-107/miR-323-3p、miR-
127/miR-323-3p、miR-181b/miR-323-3p、miR-99b/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-323-3p、let-7e/miR-411、miR-107/miR-411、和miR-491-5p/miR-411。
[0169] 在涉及第一和第二miRNA的任意上述方法的一个实施方案中，其中之一为脑富集的，另一为炎症相关的，第一miRNA和第二miRNA对选自由下列组成的组：miR-155/miR-335、let-7e/miR-146b、miR-491-5p/miR-146a、let-7e/miR-146a、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-16、miR-155/miR-132、miR-155/miR-323-3p、miR-155/miR-411、miR-491-5p/miR-146b、miR-155/miR-146a、和miR-155/miR-146b。
[0170] 在涉及脑富集的第一和第二miRNA的任意上述疾病区分方法的一个实施方案中，第一miRNA和第二miRNA对选自由下列组成的组：let-7e/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-335、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-9*、miR-744/miR-335、let-7e/miR-132、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-132、let-
7e/miR-210、miR-181b/miR-9*、miR-181a/miR-335、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-
874、miR-181b/miR-874、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、miR-107/miR-323-3p、miR-127/miR-134、miR-491-5p/miR-874、miR-491-5p/miR-323-3p、miR-127/miR-432、let-
7e/miR-134、let-7e/miR-411、miR-107/miR-411、miR-491-5p/miR-411、miR-107/miR-874、miR-181a/miR-9*、miR-491-5p/miR-210、miR-181b/miR-335、miR-99b/miR-335、miR-107/miR-210、miR-127/487b、miR-181a/miR-874、miR-9/miR-9*、miR-107/miR-487b、miR-107/miR-432、miR-9/miR-335、miR-181a/miR-132、miR-181b/miR-210、和miR-99b/miR-132。在涉及脑富集的第一和第二miRNA的任意上述疾病区分方法的另一实施方案中，第一miRNA和第二miRNA对选自由下列组成的组：let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-
3p、let-7e/miR-411、miR-99b/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-127/miR-134、miR-744/miR-335、miR-9/miR-335、miR-181b/miR-335、miR-107/miR-411、miR-181a/miR-335、let-
7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-411、let-7e/miR-132、miR-181b/miR-132、miR-9/miR-9*、miR-9/miR-134、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-874、let-7e/miR-134、miR-107/miR-
132、miR-107/miR-9*、miR-127/miR-335、miR-9/miR-132、miR-181b/miR-9*、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-210、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-
323-3p、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-874、miR-181b/miR-210、miR-9/miR-874、miR-
9/miR-485-3p、miR-744/miR-134、和miR-181b/miR-323-3p。
[0171] 在涉及第一和第二miRNA的任意上述疾病区分方法的一个实施方案中，其中之一为脑富集的，另一为炎症相关的，第一miRNA和第二miRNA对选自由下列组成的组：let-7e/miR-146a、miR-107/miR-146a、miR-491-5p/miR-146a、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-146b、miR-155/miR-874、let-7e/miR-146b、miR-155/miR-9*、miR-155/miR-335、miR-155/miR-411和miR-744/miR-146a。在涉及第一和第二miRNA的任意上述疾病区分方法的另一实施方案中，其中之一为脑富集的，另一为炎症相关的，第一miRNA和第二miRNA对选自由下列组成的组：miR-107/miR-146a、miR-491-5p/miR-146a、miR-155/miR-132、miR-155/miR-335、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-146b、miR-9/miR-146a、let-7e/miR-146b、miR-9/miR-146b、let-7e/miR-146a、miR-155/miR-874、miR-155/miR-9*、miR-155/miR-
411、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-210、miR-155/miR-146b、miR-744/miR-146b、miR-
155/miR-146a、miR-155/miR-134、和miR-181b/miR-146b。
[0172] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述方法包括测量两种以上的不同miRNA对的水平并计算其水平比。在一个具体实施方案中，所述方法包括测量由选自由下述组成的组的一种以上的对组合的水平和计算其水平比：
[0173] (a)miR-181b/miR-323-3p和miR-99b/miR-9*,
[0174] (b)miR-491-5p/miR-487b加上miR-9/miR-146a，和
[0175] (c)miR-491-5p/miR-210加上miR-181a/miR-146b。
[0176] 在任意上述疾病检测或区分方法的一个实施方案中，所述方法包括测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中miRNA的水平，其中所述样品已经在间隔的时间点采集。
[0177] 在任意上述涉及已经在间隔的时间点采集的体液样品的方法的一个实施方案中，所述体液样品相隔几个月(例如相隔3-6个月)获得。
[0178] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述第一miRNA和所述第二miRNA的水平相对于标准物miRNA的水平归一化(normalizing)。在一个具体实施方案中，所述标准物miRNA为在许多组织中表达但在脑中不显著表达的miRNA。
[0179] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述受试者为人。在任意上述方法的另一实施方案中，所述受试者为实验动物(例如，神经退行性疾病如PD等的动物模型)。
[0180] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述体液选自由血浆、血清、尿液、脑脊液(CSF)和唾液组成的组。
[0181] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述方法包括从受试者采集一个或多个体液样品的步骤(例如，在步骤(a)之前)。
[0182] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述miRNA的水平使用选自由杂交、RT-PCR和测序组成的组的方法来鉴定。
[0183] 在任意上述方法的一个实施方案中，在测量miRNA的水平之前，从所述体液样品中纯化所述miRNA。
[0184] 在任意上述方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括减少或消除所述miRNA降解的步骤。
[0185] 在任意上述疾病检测和疾病监控方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括向已经诊断有所述神经退行性疾病(例如，PD)或处于进展到更严重形式的所述神经退行性疾病(例如，PD)的
风险的受试者给予治疗性治疗或
预防性治疗。在PD的情况下，有用药物治疗的非限制性实例包括例如给予多巴胺补充或多巴胺模拟药物，例如左旋多巴或左旋多巴组合治疗等，其可包括给予多巴脱羧酸酶抑制剂(如，卡比多巴、苄丝肼)；多巴胺增强剂，例如儿茶酚o-甲基转移酶(COMT)抑制剂(如，恩他卡朋(entacapone)、托卡朋(tolcapone))；多巴胺受体激动剂(如，罗皮尼罗(ropinirole)、普拉克索(pramipexole)、罗替戈汀(rotigotine)、阿扑吗啡(apomorphine)、培高利特(pergolide)、溴麦
角隐亭(bromocriptine))；单胺氧化酶(MAOIs)抑制剂，其可单独使用或与左旋多巴(如，司来吉兰、雷沙吉兰、
盐酸司来吉兰
口腔崩解片(zydis selegiline HCl salt))一起使用；金刚烷胺(用于抗震颤和抗左旋多巴施用的
副作用)；抗胆
碱能化合物(anti-cholinergenics)(如，苯海索、苯扎托品)。目前正在研究的用于治疗PD的其它潜在有用的药物包括抗谷
氨酸能化合物(antiglutamatergics)(如，美金刚、沙芬酰胺(safinomide))；神经营养因子(neurturin)治疗；抗凋亡物(如，奥米加匹(omigapil)、CEP-1347)；线粒体前体化合物(promitochondrials)(如，辅酶Q10、肌酸)；
钙通道阻断剂，包括伊拉地平，生长因子如GDNF；以及靶向α-突触核蛋白的药物或
疫苗。有用的手术治疗的非限制性实例包括，例如深部脑刺激(DBS)，涉及在脑中植入
电池供电的
电极；直接对神经组织的操作(如，丘脑切开术、苍白球切开术、丘脑底部切开术(subthalmatomy))；和多巴胺能细胞移植。还可使用饮食和体育锻炼方案(单独或与其他治疗组合)来减缓PD症状。有用的食品补充剂的非限制性实例包括，例如，抗
氧化剂如维生素C和E、钙、姜、绿茶和绿茶提取物、圣约翰草(St.John's Wort)、
银杏、乳蓟(milk thistle)、维生素B12、和叶酸。目前还不清楚PD是否可逆转。有效的治疗可意味着PD改善(生物标记物miRNA比的降低)或预防/抑制PD的进一步发展(生物标记物miRNA比保持不变或增加较缓)。
[0186] 在任意上述疾病检测和疾病进展监控方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括在临床试验中招募所述受试者。
[0187] 与本发明的上述方法结合，本发明还提供各种
试剂盒。本发明试剂盒的非限制性实例包括：
[0188] 1.一种用于检测PD的试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一对或多对miRNA特异的引物和/或探针：let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-744/miR-335、miR-99b/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-9*、let-7e/miR-132、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-134、miR-107/miR-134、miR-99b/miR-134、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-323-3p、miR-107/miR-323-3p、miR-127/miR-
323-3p、miR-181b/miR-323-3p、miR-99b/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-323-3p、let-7e/miR-411、miR-107/miR-411、and miR-491-5p/miR-411；miR-155/miR-335、let-7e/miR-
146b、miR-491-5p/miR-146a、let-7e/miR-146a、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-16、miR-
155/miR-132、miR-155/miR-323-3p、miR-155/miR-411、miR-491-5p/miR-146b、miR-155/miR-146a、和miR-155/miR-146b。
[0189] 2.一种用于将PD与MCI区分的试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一对或多对miRNA特异的引物和/或探针：let-7e/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-335、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-9*、miR-744/miR-335、let-7e/miR-132、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-132、let-7e/miR-210、miR-
181b/miR-9*、miR-181a/miR-335、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-874、miR-181b/miR-
874、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、miR-107/miR-323-3p、miR-127/miR-134、miR-491-5p/miR-874、miR-491-5p/miR-323-3p、miR-127/miR-432、let-7e/miR-134、let-
7e/miR-411、miR-107/miR-411、miR-491-5p/miR-411、miR-107/miR-874、miR-181a/miR-
9*、miR-491-5p/miR-210、miR-181b/miR-335、miR-99b/miR-335、miR-107/miR-210、miR-
127/487b、miR-181a/miR-874、miR-9/miR-9*、miR-107/miR-487b、miR-107/miR-432、miR-
9/miR-335、miR-181a/miR-132、miR-181b/miR-210、and miR-99b/miR-132；let-7e/miR-
146a、miR-107/miR-146a、miR-491-5p/miR-146a、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-
146b、miR-155/miR-874、let-7e/miR-146b、miR-155/miR-9*、miR-155/miR-335、miR-155/miR-411、和miR-744/miR-146a。
[0190] 3.一种用于将PD与AD区分的试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一对或多对miRNA特异的引物和/或探针：let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-3p、let-7e/miR-411、miR-99b/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-127/miR-134、miR-744/miR-335、miR-9/miR-335、miR-181b/miR-335、miR-107/miR-411、miR-181a/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-411、let-7e/miR-132、miR-181b/miR-132、miR-9/miR-9*、miR-9/miR-134、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-874、let-7e/miR-134、miR-107/miR-
132、miR-107/miR-9*、miR-127/miR-335、miR-9/miR-132、miR-181b/miR-9*、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-210、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-
323-3p、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-874、miR-181b/miR-210、miR-9/miR-874、miR-
9/miR-485-3p、miR-744/miR-134、和miR-181b/miR-323-3p；miR-107/miR-146a、miR-491-
5p/miR-146a、miR-155/miR-132、miR-155/miR-335、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-
146b、miR-9/miR-146a、let-7e/miR-146b、miR-9/miR-146b、let-7e/miR-146a、miR-155/miR-874、miR-155/miR-9*、miR-155/miR-411、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-210、miR-
155/miR-146b、miR-744/miR-146b、miR-155/miR-146a、miR-155/miR-134、和miR-181b/miR-146b。
[0191] 4.一种试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一种或多种miRNA对的组合特异的引物和/或探针：
[0192] (a)miR-181b/miR-323-3p和miR-99b/miR-9*，
[0193] (b)miR-491-5p/miR-487b和miR-9/miR-146a，和
[0194] (c)miR-491-5p/miR-210和miR-181a/miR-146b。
[0195] 任何上述的试剂盒可进一步包括miRNA分离和/或纯化手段和/或使用说明。
[0196] 在一单独的方面，本发明提供用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择方法，所述方法包括下列步骤：
[0197] (a)选择至少四种已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA；
[0198] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0199] (c)计算步骤(b)中测量的各miRNA的平均水平；
[0200] (d)计算步骤(c)中所计算的miRNA的平均水平之差；
[0201] (e)在所有研究的miRNA之间将在步骤(d)中计算的miRNA的平均水平之差进行比较，将如下的miRNA对选作潜在的生物标记物对：所述miRNA对的一种miRNA在步骤(d)中计算的差是另一种miRNA计算的差的至少1.5倍；
[0202] (f)计算步骤(e)中所选择的各潜在的生物标记物miRNA对的斯皮尔曼等级相关系数(r)，和
[0203] (g)如果步骤(f)中计算的miRNA对的(r)值为至少0.8，则将所述miRNA对鉴定为适用于诊断和/或监控所述病理的生物标记物对。
[0204] 在相关的方面，本发明提供用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择方法，所述方法包括下列步骤：
[0205] (a)选择至少四种已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA；
[0206] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0207] (c)计算步骤(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0208] (d)选择步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8的那些miRNA对作为潜在的生物标记物对；
[0209] (e)计算步骤(d)中选择的各miRNA的平均水平；
[0210] (f)计算步骤(e)中计算的miRNA的平均水平之差；
[0211] (g)如果一种miRNA的步骤(f)中的计算差是另一种miRNA的计算差的至少1.5倍，则将该对鉴定为适用于诊断和/或监控所述病理的生物标记物对。
[0212] 在另一相关方面，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择方法，所述方法包括下列步骤：
[0213] (a)选择至少四种已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA；
[0214] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0215] (c)计算步骤(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0216] (d)选择步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8的那些miRNA对作为潜在的生物标记物对；
[0217] (e)针对步骤(d)中选择的各miRNA对计算两个受试者分组的P值，和
[0218] (f)如果该miRNA对以统计学上显著的P值区分两个受试者组，则将该miRNA对鉴定为适用于诊断和/或监控所述病理的生物标记物对。
[0219] 还在另一相关方面，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择的计算机实现方法，所述方法包括下列步骤：
[0220] (a)选择已知在受所述病理影响的器官中富集的一群miRNA；
[0221] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0222] (c)以电子方式计算步骤(b)中测量的各miRNA的平均水平；
[0223] (d)以电子方式计算步骤(c)中计算的miRNA的平均水平之差；
[0224] (e)从这群测量的miRNA中选择一组各自包括第一miRNA和第二miRNA的潜在的miRNA对，其中所述第一miRNA在步骤(d)中计算的平均水平之差为所述第二miRNA计算的平均水平之差的至少1.5倍；
[0225] (f)以电子方式计算(e)中选择的各潜在的miRNA对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0226] (g)从这组潜在的miRNA对中选择适用于诊断和/或监控所述病理的那些miRNA对，其中在步骤(f)中计算的所述(r)值至少为0.8，和
[0227] (h)展示在步骤(g)中选择的miRNA对的全部或部分。
[0228] 在进一步的相关方面，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择的计算机实现方法，所述方法包括下列步骤：
[0229] (a)选择已知在受所述病理影响的器官中富集的一群miRNA；
[0230] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0231] (c)以电子方式计算(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0232] (d)从这群测量的miRNA中选择一组潜在的生物标记物miRNA对，其中步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8；
[0233] (e)以电子方式计算步骤(d)中选择的各miRNA的平均水平；
[0234] (f)以电子方式计算步骤(e)中计算的miRNA的平均水平之差；
[0235] (g)从这群测量的miRNA中选择一组适合的各自包括第一miRNA和第二miRNA的miRNA生物标记物对，其中，对于各个适合的生物标记物miRNA对，第一miRNA在步骤(f)中所计算的平均水平之差为第二miRNA所计算的平均水平之差的至少1.5倍，和
[0236] (h)展示在步骤(g)中选择的适合的生物标记物miRNA对的全部或部分。
[0237] 在额外的相关方面，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择的计算机实现方法，所述方法包括下列步骤：
[0238] (a)选择已知在受所述病理影响的器官中富集的一群miRNA；
[0239] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0240] (c)以电子方式计算(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0241] (d)从测量的miRNA群中选择一组潜在的生物标记物miRNA对，其中步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8；
[0242] (e)以电子方式针对步骤(d)中选择的各miRNA对计算两个受试者分组的P值；
[0243] (f)如果miRNA对将具有统计学上显著的P值的两个受试者组区分，则选择该miRNA对作为适合的生物标记物对来诊断和/或监控所述病理，和
[0244] (g)展示在步骤(f)中选择的适合的生物标记物miRNA对的全部或部分。
[0245] 在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，miRNA水平通过选自由基于RT-PCR的方法、基于miRNA阵列的方法、新一代测序和杂交组成的组的方法来测量。
[0246] 在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，所述两个受试者组为(1)患有所述病理的受试者和(2)年龄、性别和种族相称的健康受试者。在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的另一实施方案中，两个受试者组为患有所述器官的两种不同的病理的受试者。还在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的另一实施方案中，两个受试者组为(1)较年轻的受试者和(2)较年长的受试者。在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的进一步的实施方案中，其中两个受试者组为年龄和种族相称的(1)男性和(2)女性。
[0247] 在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，体液选自由血浆、血清、脑脊液(CSF)、尿液和唾液组成的组。
[0248] 在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，受试者为人。在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的另一实施方案中，受试者为实验动物。
[0249] 在上述涉及P值的用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，P值使用曼-惠特尼检验在步骤(e)中计算。在上述涉及P值的用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，统计学上显著的P值为至少0.05。
[0250] 在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，所述病理为神经退行性疾病(例如，帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和轻度认知障碍(MCI))。
[0251] 在上述用于生物标记物miRNA对的任意选择方法中的一个实施方案中，受病理影响的器官为脑。
[0252] 在所附的
说明书、
权利要求和
附图中，本发明的这些及其它方面对于本领域技术人员将显而易见。
附图说明
[0253] 图1A-F为示出年龄相称的对照(AMC)和帕金森病(PD)患者的血浆中miRNA水平(生物标记物对)之比的图。A、C和E示出以Log10标度的框线图。框的上限和下限和框中的线分别表示第75和第25百分位数和中位数。上下水平棒分别表示第90和第10百分位数。点表示位于80％数据以外的分析值。B、D和F示出PD患者和AMC之间差异的受试者特征(Receiver-Operating Characteristic,ROC)曲线分析。针对“截止”点(表示为各图上的点)计算各生物标记物/标准物(normalizer)对的灵敏度、特异性和精确度‐“截止”点为预测精确度最高的成对miRNA的比例的值。
[0254] 图2A-F为示出MCI和PD患者的血浆中miRNA水平(生物标记物对)之比的图。A、C和E示出以Log10标度的框线图。框的上限和下限和框中的线分别表示第75和第25百分位数和中位数。上下水平棒分别表示第90和第10百分位数。点表示位于80％数据以外的分析值。B、D和F示出PD患者和AMC之间差异的受试者特征(ROC)曲线分析。针对“截止”点(表示为各图上的点)计算各生物标记物/标准物的灵敏度、特异性和精确度‐“截止”点为预测精确度最高的成对miRNA的比例的值。
[0255] 图3A-F为示出AD和PD患者的血浆中miRNA水平(生物标记物对)之比的图。A、C和E示出以Log10标度的框线图。框的上限和下限和框中的线分别表示第75和第25百分位数和中位数。上下水平棒分别表示第90和第10百分位数。点表示位于80％数据以外的分析值。B、D和F示出PD患者和AMC之间差异的受试者特征(ROC)曲线分析。针对“截止”点(表示为各图上的点)计算各生物标记物/标准物的灵敏度、特异性和精确度‐“截止”点为预测精确度最高的成对miRNA的比例的值。
[0256] 图4A-C示出PD患者和AMC(A)、PD和MCI患者(B)以及PD和AD患者(C)之间差异的受试者特征(ROC)曲线分析。针对“截止”点(表示为各图上的点)计算各生物标记物/标准物的灵敏度、特异性和精确度‐“截止”点为预测精确度最高的成对miRNA的比例的值。
具体实施方式
[0257] 本发明基于发明人作出的下述想法和发现：
[0258] (1)在脑中、更具体地在参与特定病理的脑区中富集的循环miRNA的浓度变化，比遍在的或其它脑富集的miRNA更可能反应脑中相关的病理过程；
[0259] (2)应当分析存在于神经突和突触中的miRNA，这是因为神经突和突触的功能障碍和破坏是早期阶段的神经变性的特征，因此，能够影响这些miRNA的表达和分泌；
[0260] (3)为了补偿不与特定病理直接相关的过程例如血脑屏障通透性的改变，本发明人使用了“生物标记物对”法，通过能够在不参与正被诊断的特定神经退行性疾病的早期阶段的脑区或细胞类型中表达的其它脑富集的miRNA、以及在与目标区域中富集的miRNA比较时血浆水平变化不同的miRNA来将在受损脑区的神经元中富集的miRNA归一化；
[0261] (4)生物标记物miRNA对中用作分子和分母的miRNA的血浆浓度的高度相关性对于其灵敏度和特异性非常重要。
[0262] 本发明基于对体液中循环的无细胞miRNA对的水平之比的分析，其中该对中的两种miRNA均是脑富集的，并且(i)在某些脑区中富集，参与(对于该对中的一种miRNA)或不参与(对于该对中的另一种miRNA)PD发展，或者(ii)在不同的细胞类型(例如，神经元和神经胶质细胞)中富集，或者(iii)在相同的脑区中富集但由于PD发展而使其表达和/或分泌变化不同。作为本发明的miRNA对中的分子特别有用的脑富集的miRNA包括存在于神经突和突触中的神经元miRNA(即，突触和/或神经突miRNA)，其正常功能受到PD、AD和其它神经退行性疾病的影响。本发明还包括对参与炎症过程的miRNA(如miR-155)的分析及其与在参与病理的脑区中富集的miRNA组合作为潜在的生物标记物的用途的分析。由于各种神经退行性疾病的特征在于不同脑区中的神经病理，此类生物标记物miRNA对用于可独立于其临床症状(如有的话)而将那些病理彼此区分。另外，所发现的生物标记物，反应了病理发展的重要事件，能够用于疾病和治疗监控以及药物筛选。
[0263] 使用脑富集的miRNA显著增加了其血浆的水平变化是由脑病理引起的机率，并且在特定脑区中富集的miRNA的体液浓度的变化应指示该脑部分的病理。例如，海马-或中脑-富集的miRNA的水平变化将分别与AD和PD相关，反应了这些脑区中突触和神经突的功能障碍。另外，血细胞中的器官富集miRNA的浓度低，这在血浆和血清的纯化中降低由miRNA渗漏(leakage)引起的这些体液中的污染物。
[0264] 在体液中检测的miRNA的浓度依赖于多种生物因素和技术因素。生物因素包括各种组织中的miRNA水平，分泌和排泄至细胞外空间的强度，影响它们穿过各种屏障如血脑屏障、胎盘屏障和肾屏障的能
力的循环miRNA的形式(外来体和其它囊泡、与蛋白质和脂质的复合体)，以及血液中的miRNA稳定性和
半衰期。技术因素包括体液采集和储存的方法的可变性、用于miRNA提取的方法、以及存在于体液中的影响miRNA纯化和定量的各种因素。结果，miRNA归一化(normalization)的重要性得到广泛认可(Meyer等，Biotechnol.Lett.2010；32:1777-1788)。同时，还没有普遍接受的单一归一化方法[0265] 本发明基于：代替相对于遍在RNA或众多miRNA的平均值的归一化(或除其之外)使用脑富集的miRNA对。脑富集miRNA对(在比例中一个作为分子，另一个作为分母)的使用具有多种优势。首先，任何病理通常都与某些miRNA的上调和其它miRNA的下调相关，因此考虑上调-和下调-miRNA对可增加试验灵敏度和特异性。其次，使用成对的脑富集miRNA，而不是一种脑富集的miRNA，降低了潜在的与其它器官的病理的重叠。第三，人们能够预期与目标病理不相关或非特异性的变化，例如供血、血脑通透性等变化将通过使用同一器官中富集的成对的miRNA得到更好的补偿。例如，在不同脑区或不同细胞类型(如神经元和神经胶质细胞)中富集的miRNA的相对浓度的变化可以作为疾病进展等的指示物。
[0266] 本发明中，由于各种miRNA参与了不同过程的调控，还试验了多个miRNA对的组合，来找出提供最高试验精确度的miRNA对的群组。这些群组的非限制性实例包括miR-181b/miR-323-3p加上miR-99b/miR-9*；miR-491-5p/miR-487b加上miR-9/miR-146a；miR-491-5p/miR-210加上miR-181a/miR-146b(参见图4)。
[0267] 定义
[0268] 作为与本文所使用的与脑中的富集相关的，术语“富集”意指脑中的miRNA浓度高于其他器官至少4-5倍。
[0269] 作为与本文所使用的与脑中特定区域中的富集相关的，术语“富集”意指在所述脑区中的miRNA浓度比通常在脑中的高(优选至少高2倍，更优选至少高5倍，更优选至少高10倍)。该术语是指脑区内的浓度差别(如使用qRT-PCR测量的)。
[0270] 在本发明的含义中，术语“突触和/或神经突miRNA”是指(i)为“脑富集的”和(ii)存在于突触和/或神经突(即，轴突和/或树突和/或棘状突起)中的miRNA。为了用于本发明的方法，作为它们从神经元释放(如，由于分泌、神经突/突触破坏或神经元死亡)的结果，突触和/或神经突miRNA应在体液中可检测。
[0271] 术语“轻度认知障碍”或“MCI”是指预期的正常衰老的认知减退与更严重的痴呆的减退之间的中间阶段。其可涉及比正常的衰老相关的变化更大的记忆、语言、思考和判断等问题(参见例如Jack等，Alzheimer’s and Dementia.2011,Epub April 19)。
[0272] 本文使用的术语“神经突”是指从神经元的细胞体的任何突起。该突起可为轴突、树突或棘状突起。
[0273] 术语“轴突”是指神经元的细长突起，传导电脉冲离开神经元的细胞体(cell body或soma)。通过包括形状(树突通常逐渐变细而轴突一般保持恒定的半径)、长度(树突限定在细胞体周围的小范围而轴突可更长)、和功能(树突通常接受信号而轴突通常传送信号)的多种特征将轴突与树突区分。轴突和树突与其它细胞(通常是其它神经元，有时为肌肉细胞或腺细胞)在称为突触的接点相
接触。
[0274] 术语“树突”是指神经元的分枝的突起，起到将接收自其它神经细胞的电化学刺激传导至神经元的细胞体(树突由此突起)的作用。
[0275] 术语“突触”是指特化的接点，借此神经元相互传导信号，和传导信号至非神经元细胞如肌肉或腺体中的细胞。典型的神经元产生数千个突触。大部分突触将轴突连接至树突，但还有其它类型的连接，包括轴突-至-细胞体、轴突-至-轴突、和树突-至-树突。在脑中，各神经元与许多其它神经元形成突触，同样的，各自从许多其它神经元接收突触输入。结果，神经元的输出可依赖于许多其它神经元的输入，其各自可具有不同程度的影响，取决于其突触与该神经元的强度。存在主要两大类突触，化学突触和电突触。在电突触中，细胞在大约3.5nm内彼此接近，而并非在化学突触中分隔细胞的20至40nm的距离。在化学突触中，通过借助化学递质打开离子通道而引起突触后电位，而在电突触中，其是由两个神经元之间的直接电偶联引起的。因此，电突触快于化学突触。
[0276] 本文使用的术语“标准物miRNA”是指考虑到影响血浆中miRNA的表观和稳定性的各种因素而用于将miRNA浓度归一化的miRNA。
[0277] 本文使用的术语“神经退行性疾病”是指脑部病理，例如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿症(HD)、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆(FTD)、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性损伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩症(MSA)、皮质基底节变性(CBGD)、皮克氏病、橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)，及特征为代谢变化、随后突触功能障碍、神经突和突触破坏和最终的神经元死亡的其它病理。
[0278] 如本文所述，术语“神经退行性疾病的发展阶段”是指神经退行性疾病的特定的严重程度(如，无症状阶段、具有某些症状的疾病早期、疾病的晚期阶段等)。
[0279] 本文使用的术语“神经退行性疾病的发展”是指单个神经元中的代谢的和/或结构的改变的程度/严重性的任意负变化和/或受影响的神经元的数目增加。短语“神经退行性疾病的改善”及类似的术语是指单个神经元中的代谢的和/或结构的改变的程度/严重性的任意正变化和/或受影响的神经元的数目降低。
[0280] 术语“与……相关”用于包括任何相关性、并发性和任意因果关系。
[0281] 本文使用的术语“微小RNA”或“miRNA”是指一类小的大约22nt的长非编码RNA分子。它们通过结合至信使转录本(mRNA)的互补区以抑制其翻译或调节降解而在靶基因调节中起到重要作用(Griffiths-Jones Nucleic Acids Research,2006,34,
数据库：D140-D144期)。通常，一种miRNA可靶向多种mRNA，并且一种mRNA可受多种靶向3'UTR的不同区域的miRNA调节。一旦结合至mRNA，miRNA可通过影响例如mRNA翻译和稳定性来调控基因表达和蛋白质生产(Baek等，Nature 455(7209):64(2008)；Selbach等，Nature455(7209):58(2008)；Ambros,2004,Nature,431,350-355；Bartel,2004,Cell,116,281-297；Cullen,2004,Virus Research.,102,3-9；He等，2004,Nat.Rev.Genet.,5,522-531；和Ying等，
2004,Gene,342,25-28)。除非另有说明，否则特定miRNA的名称是指成熟miRNA序列。根据现有命名规则，人miRNA的前面加上前缀"hsa-"(即，智人(Homo sapiens)的缩写)。在整个说明书和附图中，出于简化目的可省略hsa-前缀，因而，例如“hsa-miR-155”和“miR-155”将表示相同的RNA序列。
[0282] 用于本发明方法的神经突和/或突触miRNA的实例包括，但不限于，Let-7e、miR-7、miR-9、miR-98、miR-99、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-128a、miR-132、miR-134、miR-135a、miR-137、miR-138、miR-154、miR-182、miR-183、miR-213、miR-218、miR-323-3p、miR-
329、miR-337、miR-369-3、miR-369-5p、miR-370、miR-381、miR-382、miR-409-3p、miR-425、miR-433-5p、miR-483-3p、miR-485-5p、miR-487b、miR-491-5p、miR-494、miR-495、miR-496、miR-541、miR-543、miR-656、miR-668、miR-874、miR-889、miR-935、miR-939、miR-9*和miR181a-1*。目前大部分已知的miRNA的信息可见于miRNA数据库miRBase(可在网址为mirbase.org的
万维网获得)。还参见Burside等，BMC Genomics 9:185(2008)；Williams等，BMC Genomics 8:172(2007)；Landgraf等，Cell 129:1401(2007)。
[0283] 术语“miRNA阵列”是指用于分子生物学和医学的多重技术。其由排列的一系列寡核苷酸的多重(如，数千)微观阵点组成，其中各自包含与特定靶miRNA互补的特定序列(探针)。在探针-靶标在高度严格条件下杂交后，产生的杂交体通常可通过定量
荧光团-、银-、或
化学发光-标记的靶标来检测和定量以确定miRNA的相对丰度。在本发明的方法中，可使用定制的和市售的miRNA阵列。有用的市售miRNA阵列的实例(基于靶标标记、杂交检测和分析的各种方法)包括由Agilent、Illumina、Invitrogen、Febit和LC Sciences生产的阵列。
[0284] 术语“下一代测序技术”广义上是指产生多个并行测序反应的测序方法。这使得数据的产量和产率剧增。常用的下一代测序平台的非限制性实例包括Helicos小RNA测序、miRNA BeadArray(Illumina)、Roche 454(FLX-Titanium)和ABI SOLiD。
[0285] 如本文所使用的，“个体”或“受试者”或“动物”是指人、兽用动物(如，猫、狗、
牛、马、羊、猪等)和神经退行性疾病的实验动物模型。在优选的实施方案中，受试者为人。
[0286] 本文所使用的术语“纯化的”是指已在减少或消除不相关材料、即污染物、的存在的条件下分离的材料，包括从中得到该材料的天然材料。例如，RNA纯化包括消除体液中存在的蛋白质、脂质、盐和其它相关化合物。另外，对于某些分析方法，纯化的miRNA优选基本上不含体液样品中所含的其它RNA寡核苷酸(如，rRNA和mRNA
片段、遍在miRNA，其在几乎所有组织中高水平表达[如miR-16]等)。本文所使用的术语“基本上不含”在材料的分析试验的上下文中可操作地使用。优选的，基本上不含污染物的纯化材料为至少50％纯；更优选至少90％纯，还更优选至少99％纯。纯度可通过色谱法、凝胶
电泳、组成分析、生物学分析和本领域已知的其它方法来评价。
[0287] 本所使用的术语“类似处理的”是指已使用相同方法获得的样品(如，体液样品或纯化的RNA)。
[0288] 术语“约”或“大约”意指在统计学上有意义的范围内的值。此类范围可在给定值或范围的优选50％内、更优选20％内、还更优选10％内、甚至更优选5％内的数量级内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许偏差取决于特定的被研究体系，并且本领域技术人员可容易地理解。
[0289] 根据本发明，可采用本领域技术范围内的常规分子生物学、
微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中作了充分说明。参见，例如Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989(这类“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编辑(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；Ausubel,F.M.等(编辑).Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons,Inc.,1994。这些技术包括下述定点诱变：Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)，U.S.专利No.5,071,743，Fukuoka等，Biochem.Biophys.Res.Commun.263:357-360(1999)；Kim和Maas,BioTech.28:196-198(2000)；Parikh和Guengerich,BioTech.24:4 28-431(1998)；Ray和Nickoloff,BioTech.13:342-346(1992)；Wang等，BioTech.19:556-559(1995)；Wang和Malcolm,BioTech.26:680-682(1999)；Xu和Gong,BioTech.26:639-641(1999)，U.S.专利No.5,789,166和5,932,419，Hogrefe,Strategies l4.3:74-75(2001)，U.S.专利No.5,702,
931、5,780,270和6,242,222，Angag和Schutz,Biotech.30:486-488(2001)，Wang和Wilkinson,Biotech.29:976-978(2000)，Kang等，Biotech.20:44-46(1996)，Ogel和McPherson,Protein Engineer.5:467-468(1992)，Kirsch和Joly,Nucl.Acids.Res.26:
1848-1850(1998)，Rhem和Hancock,J.Bacteriol.178:3346-3349(1996)，Boles和Miogsa,Curr.Genet.28:197-198(1995)，Barrenttino等，Nuc.Acids.Res.22:541-542(1993)，Tessier和Thomas,Meths.Molec.Biol.57:229-237，和Pons等，Meth.Molec.Biol.67:209-
218。
[0290] 诊断性miRNA对的鉴定方法
[0291] 为了鉴定最具前景的生物标记物对，发明人使用了下列方法：从那些循环miRNA中为各对选择在不同个体的各自的体液中显著相关(斯皮尔曼等级相关系数r>0.8)的各对的分子和分母。miRNA在血浆中的浓度取决于多种因素，包括(i)miRNA在各种器官和组织中的表达水平；(ii)miRNA从不同细胞类型分泌的水平；(iii)miRNA在细胞外空间的稳定性及其在血浆中不同形式的呈现，例如外来体和其它微囊，与蛋白质、脂质和可能的其它分子的复合体；和(iv)脑富集miRNA的血脑屏障通透性。病理过程可影响某些或所有这些因素。发明人提出有效的生物标记物miRNA对的分子和分母应当共有这些基本的常见因素中的一些(例如，二者均为脑富集的并在外来体中分泌)，并且响应病理而将不同地变化。这并不意味着任何相关的miRNA都会形成好的生物标记物对，这是因为如果它们由病理而类似地变化，则它们的比例将掩盖那些变化。
[0292] 本发明提供一种“具前景的”miRNA对的选择方法，所述方法包括下列步骤：
[0293] 1.在至少两个比较组(如，诊断试验的疾病和对照，能够区别两种病理的试验的两种疾病，处于病理过程发展的不同阶段的疾病，或监控试验的治疗之前和之后的疾病)的体液(如，血浆、血清、脑脊液(CSF)、唾液、尿液)中测量基于其在目标器官(如，脑)中的富集而预选的miRNA的浓度。
[0294] 2.计算比较组的各miRNA浓度的平均值。
[0295] 3.计算来自两个比较组的各miRNA的平均值之差并将miRNA分成两个群组：(i)具高差值；和(ii)具低差值或具相反符号差值。
[0296] 4.如果在步骤3中确定的参数差别至少1.5倍，则将来自不同群组的miRNA组合为潜在的生物标记物对。在潜在的“具前景的”miRNA对中将一种miRNA用作分子，另一种miRNA用作分母。
[0297] 5.为了进一步减少血浆或其它体液中各特定miRNA浓度的个体差异的影响，选择具高正相关(在比较的群组中对所有样品计算的斯皮尔曼等级相关系数r≥0.8)的miRNA作为生物标记物对的分子和分母。该步骤显著降低了潜在的生物标记物miRNA对的数目，减少了由与区别两个比较组的过程不相关的因素所引起的所选生物标记物的差异，并显著增加了试验灵敏度和特异性。
[0298] 步骤3-4和步骤5的顺序可交换如下：
[0299] 步骤1后，计算所有体液样品在步骤1中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)。接着选择具高正相关(r≥0.8)的miRNA作为潜在的生物标记物对，比较两个受试者组中各所选miRNA对的miRNA浓度之比，如果该miRNA对以统计学上显著的P值区分两个受试者组，则将该对确定为适合的生物标记物。
[0300] 选择用于生物标记物对的miRNA是基于体液中的无细胞循环miRNA研究筛选、诊断和监控试验的重要步骤。本发明通过提供下列选择有效的生物标记物对的方法解决了该问题。
[0301] 在一个实施方案中，本发明提供用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择方法，所述方法包括下列步骤：
[0302] (a)选择至少四种已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA；
[0303] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0304] (c)计算步骤(b)中测量的各miRNA的平均水平；
[0305] (d)计算步骤(c)中所计算的miRNA的平均水平之差；
[0306] (e)在所有研究的miRNA之间将在步骤(d)中计算的miRNA的平均水平之差进行比较，和将如下的miRNA对选作潜在的生物标记物对：所述miRNA对的一种miRNA的步骤(d)中计算的差是另一种miRNA计算的差的至少1.5倍；
[0307] (f)计算步骤(e)中所选择的各潜在的生物标记物miRNA对的斯皮尔曼等级相关系数(r)，和
[0308] (g)如果步骤(f)中计算的miRNA对的(r)值为至少0.8，则将所述miRNA对鉴定为适用于诊断和/或监控所述病理的生物标记物对。
[0309] 在另一实施方案中，本发明提供用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择方法，所述方法包括下列步骤：
[0310] (a)选择至少四种已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA；
[0311] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0312] (c)计算步骤(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0313] (d)选择步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8的那些miRNA对作为潜在的生物标记物对；
[0314] (e)计算步骤(d)中选择的各miRNA的平均水平；
[0315] (f)计算步骤(e)中计算的miRNA的平均水平之差；
[0316] (g)如果一种miRNA的步骤(f)中的计算差是另一种miRNA的计算差的至少1.5倍，则将该对鉴定为适用于诊断和/或监控所述病理的生物标记物对。
[0317] 在进一步的实施方案中，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择方法，所述方法包括下列步骤：
[0318] (a)选择至少四种已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA；
[0319] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0320] (c)计算步骤(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0321] (d)选择步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8的那些miRNA对作为潜在的生物标记物对；
[0322] (e)针对步骤(d)中选择的各miRNA对计算两个受试者分组的P值，和
[0323] (f)如果该miRNA对以统计学上显著的P值区分两个受试者组，则将该miRNA对鉴定为适用于诊断和/或监控所述病理的生物标记物对。
[0324] 在另一实施方案中，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择的计算机实现方法，所述方法包括下列步骤：
[0325] (a)选择已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA群；
[0326] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0327] (c)以电子方式计算步骤(b)中测量的各miRNA的平均水平；
[0328] (d)以电子方式计算步骤(c)中计算的miRNA的平均水平之差；
[0329] (e)从这群测量的miRNA中选择一组各自包括第一miRNA和第二miRNA的潜在的miRNA对，其中所述第一miRNA在步骤(d)中计算的平均水平之差为所述第二miRNA计算的平均水平之差的至少1.5倍；
[0330] (f)以电子方式计算(e)中选择的各潜在的miRNA对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0331] (g)从这组可能的miRNA对中选择适用于诊断和/或监控所述病理的那些miRNA对，其中在步骤(f)中计算的所述(r)值为至少0.8，和
[0332] (h)展示在步骤(g)中选择的miRNA对的全部或部分。
[0333] 还在另一实施方案中，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择的计算机实现方法，所述方法包括下列步骤：
[0334] (a)选择已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA群；
[0335] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0336] (c)以电子方式计算(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0337] (d)从这群测量的miRNA中选择一组潜在的生物标记物miRNA对，其中步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8；
[0338] (e)以电子方式计算步骤(d)中选择的各miRNA的平均水平；
[0339] (f)以电子方式计算步骤(e)中计算的miRNA的平均水平之差；
[0340] (g)从这群测量的miRNA中选择一组适合的各自包括第一miRNA和第二miRNA的miRNA生物标记物对，其中，对于各个适合的生物标记物miRNA对，第一miRNA在步骤(f)中所计算的平均水平之差为第二miRNA所计算的平均水平之差的至少1.5倍，和
[0341] (h)展示在步骤(g)中选择的适合的生物标记物miRNA对的全部或部分。
[0342] 在进一步的实施方案中，本发明提供一种用于诊断和/或监控病理的生物标记物miRNA对的选择的计算机实现方法，所述方法包括下列步骤：
[0343] (a)选择已知在受所述病理影响的器官中富集的miRNA群；
[0344] (b)测量来自两个受试者组的体液样品中在步骤(a)中所选择的各miRNA的水平；
[0345] (c)以电子方式计算(b)中测量的单个miRNA的所有可能之对的斯皮尔曼等级相关系数(r)；
[0346] (d)从测量的miRNA群中选择一组潜在的生物标记物miRNA对，其中步骤(c)中计算的(r)值为至少0.8；
[0347] (e)以电子方式针对步骤(d)中选择的各miRNA对计算两个受试者分组的P值；
[0348] (f)如果miRNA对以统计学上显著的P值区分两个受试者组，则选择该miRNA对作为适合的生物标记物对来诊断和/或监控所述病理，和
[0349] (g)展示在步骤(f)中选择的适合的生物标记物miRNA对的全部或部分。
[0350] 在本发明的上述任意方法中，可用于测量miRNA水平的方法的非限制性实例包括，例如基于RT-PCR的方法、基于miRNA阵列的方法、新一代测序和杂交。
[0351] 可用于本发明的上述任意方法中的体液样品的非限制性实例包括例如血浆、血清、脑脊液(CSF)、尿液和唾液。
[0352] 在本发明的上述任意方法中，受试者可为例如人或实验动物。
[0353] 在本发明的上述任意方法中，可比较任意两组。这样的组的非限制性实例包括例如病理与对照[例如，年龄、性别和种族相称的健康受试者]，器官的一种病理与同一器官的另一病理，两个年龄组[例如，20-50岁与60-80岁]，男性与女性[例如，年龄和种族相称的]，两个不同种族或民族的群组[例如，年龄和性别相称的]等)。
[0355] 其中
[0356] xi为分子miRNA的值；
[0357] yi为分母miRNA的值；
[0358] 为分子值的平均值，
[0359] 为分母值的平均值。
[0360] 本发明的上述方法中足以获得两组间统计学上显著的差异的样品的最小数可通过病例-对照研究(case-control study)的标准式计算(参见，例如，Eng J.Radiology 2003,227:309-313)。
[0361] 本发明的方法中，统计学上显著的P值可使用本领域已知的任何方法计算。此类方法的非限制性实例为学生t检验(针对正态分布的样品)和曼-惠特尼检验(针对非随机分布的样品)(Mann和Whitney,Annals Math Stat.1947,18:50-60)。P值≥0.05通常接受为统计学上显著的。如果检验多个潜在的生物标记物，则可适用Bonferroni校正。
[0362] 本发明的诊断、监控和筛选方法
[0363] 本发明提供新的高度灵敏性和无创或微创的诊断和监控受试者中的帕金森病(PD)的方法，所述方法包括确定两种以上的特定miRNA在来自受试者的体液(例如，血浆、血清、尿液、脑脊液(CSF)、唾液)中的水平之比。
[0364] 在本发明的诊断方法中对于特定的miRNA对的使用允许非常高的灵敏度和可靠性，并使得能够早期诊断PD病和将其与其它神经退行性疾病和病况(如，轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD))区分。由于可检测和定量神经元中各种特定的事件(如，miRNA谱的变化、它们的分泌、神经突退化、突触丧失和最终神经元死亡)，该方法还提供监控PD发展和治疗有效性的详细且全面的信息。
[0365] 用于本发明方法的miRNA对的非限制性实例包括，例如：
[0366] 用于检测PD的miRNA对
[0367] 脑富集的：
[0368] let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-744/miR-335、miR-99b/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-9*、let-7e/miR-132、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-134、miR-107/miR-134、miR-99b/miR-134、miR-
491-5p/miR-134、let-7e/miR-323-3p、miR-107/miR-323-3p、miR-127/miR-323-3p、miR-
181b/miR-323-3p、miR-99b/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-323-3p、let-7e/miR-411、miR-
107/miR-411、miR-491-5p/miR-411。
[0369] 炎症的：
[0370] miR-155/miR-335、let-7e/miR-146b、miR-491-5p/miR-146a、let-7e/miR-146a、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-16、miR-155/miR-132、miR-155/miR-323-3p、miR-155/miR-411、miR-491-5p/miR-146b、miR-155/miR-146a、miR-155/miR-146b。
[0371] 用于区分PD和MCI的miRNA对
[0372] 脑富集的：
[0373] let-7e/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-335、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-9*、miR-744/miR-335、let-7e/miR-
132、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-132、let-7e/miR-210、miR-181b/miR-9*、miR-181a/miR-335、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-874、miR-181b/miR-874、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、miR-107/miR-323-3p、miR-127/miR-134、miR-491-5p/miR-874、miR-
491-5p/miR-323-3p、miR-127/miR-432、let-7e/miR-134、let-7e/miR-411、miR-107/miR-
411、miR-491-5p/miR-411、miR-107/miR-874、miR-181a/miR-9*、miR-491-5p/miR-210、miR-181b/miR-335、miR-99b/miR-335、miR-107/miR-210、miR-127/487b、miR-181a/miR-
874、miR-9/miR-9*、miR-107/miR-487b、miR-107/miR-432、miR-9/miR-335、miR-181a/miR-
132、miR-181b/miR-210、miR-99b/miR-132。
[0374] 炎症的：
[0375] let-7e/miR-146a、miR-107/miR-146a、miR-491-5p/miR-146a、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-146b、miR-155/miR-874、let-7e/miR-146b、miR-155/miR-9*、miR-
155/miR-335、miR-155/miR-411、miR-744/miR-146a。
[0376] 用于区分PD和AD的miRNA对
[0377] 脑富集的：
[0378] let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-3p、let-7e/miR-411、miR-99b/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-127/miR-134、miR-744/miR-335、miR-9/miR-335、miR-181b/miR-335、miR-107/miR-411、miR-181a/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-411、let-7e/miR-132、miR-181b/miR-132、miR-9/miR-9*、miR-9/miR-134、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-874、let-7e/miR-134、miR-107/miR-132、miR-107/miR-9*、miR-
127/miR-335、miR-9/miR-132、miR-181b/miR-9*、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-210、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-
134、let-7e/miR-874、miR-181b/miR-210、miR-9/miR-874、miR-9/miR-485-3p、miR-744/miR-134、miR-181b/miR-323-3p。
[0379] 炎症的：
[0380] miR-107/miR-146a、miR-491-5p/miR-146a、miR-155/miR-132、miR-155/miR-335、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-146b、miR-9/miR-146a、let-7e/miR-146b、miR-9/miR-146b、let-7e/miR-146a、miR-155/miR-874、miR-155/miR-9*、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-210、miR-155/miR-146b、miR-744/miR-146b、miR-155/miR-146a、miR-155/miR-
134、miR-155/miR-411、miR-181b/miR-146b。
[0381] 一方面，本发明提供一种用于检测受试者中的第一神经退行性疾病的方法，所述方法包括：
[0382] a)测量从受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一脑富集miRNA在受到第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集；
[0383] b)测量从受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受第一神经退行性疾病的影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述第一神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0384] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0385] d)将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比进行比较，和[0386] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有所述第一神经退行性疾病，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有所述第一神经退行性疾病。
[0387] 在相关的方面，本发明提供一种用于检测受试者中的第一神经退行性疾病的方法，所述方法包括：
[0388] a)测量从受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)在受到第一神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0389] b)测量从受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中：(i)如果第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0390] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0391] d)将在步骤(c)中计算的miRNA水平比与相应的对照比进行比较，和
[0392] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA水平比高于相应的对照比时，将受试者鉴定为患有第一神经退行性疾病，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有所述第一神经退行性疾病。
[0393] 在上述两种方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下列步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种方法中的步骤(d)-(e)一起进行：
[0394] f)将步骤(c)中计算的miRNA的水平比与作为第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较，和
[0395] g)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比未落入作为第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除受试者患有第二神经退行性疾病的诊断，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比落入作为第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则不排除受试者患有第二神经退行性疾病的诊断。
[0396] 在上述两种方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下述步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种方法中的步骤(a)-(e)一起进行：
[0397] f)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第三脑富集miRNA的水平，其中所述第三脑富集miRNA在受到第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集；
[0398] g)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第四脑富集miRNA的水平，其中所述第四脑富集miRNA：(i)在不受所述第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述第二神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第三miRNA相同的脑区中富集，但在所述第二神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与所述第三miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0399] h)计算步骤(f)和(g)中测量的所述miRNA的水平比；
[0400] i)将步骤(h)中计算的所述miRNA的水平比与作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较；
[0401] j)(i)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则将所述受试者鉴定为除第一神经退行性疾病外患有所述第二神经退行性疾病，或(ii)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比未落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除所述受试者患所述第二神经退行性疾病的诊断。
[0402] 在上述两种方法的一个实施方案中，所述第一神经退行性疾病为帕金森病(PD)。
[0403] 在上述疾病区分方法的一个实施方案中，所述第一神经退行性疾病为帕金森病(PD)，所述第二神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿症(HD)、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆(FTD)、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性损伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩症(MSA)、皮质基底节变性(CBGD)、皮克氏病和橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)组成的组。
[0404] 一方面，本发明提供一种用于检测受试者中的帕金森病(PD)的方法，所述方法包括：
[0405] a)测量从所述受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述脑富集miRNA为在中脑和/或额皮质中富集的神经元miRNA；
[0406] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受PD影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0407] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0408] d)将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比进行比较，和[0409] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有PD，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有PD。
[0410] 在相关的方面，本发明提供一种用于检测受试者中的帕金森病(PD)的方法，所述方法包括：
[0411] a)测量从所述受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0412] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中：(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0413] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0414] d)将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比与相应的对照比进行比较，和[0415] e)(i)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为患有PD，或(ii)当在步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于相应的对照比时，将所述受试者鉴定为未患有PD。
[0416] 在上述两种用于检测PD的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下述步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种用于检测PD的方法的步骤(d)-(e)一起进行：
[0417] f)将步骤(c)中计算的miRNA的水平比与作为不同于PD的第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较，和
[0418] g)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比未落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除所述受试者患所述第二神经退行性疾病的诊断，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则不排除所述受试者患所述第二神经退行性疾病的诊断。
[0419] 在上述两种用于检测PD的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括通过下述步骤细化诊断，这些步骤可彼此同时或顺序进行和/或与上述两种用于检测PD的方法的步骤(a)-(e)一起进行：
[0420] f)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第三脑富集miRNA的水平，其中所述第三脑富集miRNA在受到第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集并且为所述第二神经退行性疾病的生物标记miRNA对中预先识别的分子；
[0421] g)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第四脑富集miRNA的水平，其中所述第四脑富集miRNA为所述第二神经退行性疾病的生物标记miRNA对中预先识别的分母，并且(i)在不受所述第二神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述第二神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第三miRNA相同的脑区中富集，但在所述第二神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与所述第三miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0422] h)计算步骤(f)和(g)中测量的所述miRNA的水平比；
[0423] i)将步骤(h)中计算的所述miRNA的水平比与作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围进行比较；
[0424] j)(i)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则将所述受试者鉴定为除PD外患有第二神经退行性疾病，或(ii)如果步骤(h)中计算的miRNA的水平比未落入作为所述第二神经退行性疾病的特征的所述miRNA之比的标准范围，则排除所述受试者患所述第二神经退行性疾病的诊断。
[0425] 在任意上述疾病检测方法的一个实施方案中，对照比为预设值，其表示所述第一miRNA和第二miRNA的经统计学验证的阈值水平比(单一的“截止”值)，等于年龄相称(例如±2.5岁)的健康受试者中相应值的范围内可能的最高值。此类经统计学验证的阈值(“截止”值)可通过分析所选年龄-相称的群体中的大量健康个体并使用适合的统计模型(参见，例如Knapp,R.G.,和Miller,M.E.(1992)Clinical Epidemiology and Biostatistics,William and Wilkins,Harual Publishing Co.Malvern,Pa.)来建立。在任意上述疾病检测方法的另一实施方案中，所述对照比为过去采集的来自同一受试者的类似处理的体液样品中所述第一miRNA和第二miRNA的水平比。
[0426] 由于通常在同一患者的脑中观察到各种神经退行性疾病的特征的病理过程(Hu WT等，Acta Neuropathol.2010；120:385-399；Farlow MR等，Dement.Geriatr.Cogn.Disord.Extra 2013；3:281-290；Stern RA等，2011；3:S460-S467；
Costanza A.等，Neuropathol.2011；37:570-584)，本发明还提供用于区分诊断的方法，所述方法可涉及使用两种以上不同的生物标记物对，并排除其它病理的存在或者证实此类其它病理同时存在(即，混合病理)。
[0427] 在本发明的诊断方法中，为了进一步细化PD与其它神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿症(HD)、朊病毒引起的疾病、额颞痴呆(FTD)、路易体痴呆、血管性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、慢性损伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、多系统萎缩症(MSA)、皮质基底节变性(CBGD)、皮克氏病和橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)等)之间的诊断和区分，受试者的样品中生物标记物对内部的miRNA的水平比将与患有PD或不同神经退行性疾病的受试者(优选年龄相称的，例如±2.5岁)中发现的相同miRNA的水平比的标准范围进行比较。此类“细化”比较可在初始诊断(即，与健康对照阈值的比较)之后或与这类初始诊断同时进行。此类“细化”比较可对几种不同疾病同时或顺序进行。用于“细化”比较的疾病特异性的比的标准范围通常是经统计学验证的预设的值的范围，其可通过在所选群体(优选年龄相称的，例如±2.5岁)中分析诊断有特定神经退行性疾病的大量个体并使用统计模型来建立。不仅确定特定疾病、而且还确定该疾病的进展程度的进一步“细化”可通过使用用于比较的标准疾病阶段特异性比例范围来进行(所述标准范围通过分析被诊断有特定神经退行性疾病的特定阶段的大量个体来建立)。
[0428] 另一方面，本发明提供一种用于监控受试者中的神经退行性疾病的发展变化的方法(所述受试者例如已预先诊断有所述神经退行性疾病)，所述方法包括：
[0429] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一脑富集miRNA在受到所述神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集；
[0430] b)测量与步骤(a)相同的体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受所述神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，(ii)在不受所述神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述神经退行性疾病的发展中其表达和/或分泌与第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0431] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0432] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0433] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者的神经退行性疾病已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者的神经退行性疾病还未进展。
[0434] 在相关的方面，本发明提供一种用于监控受试者中的神经退行性疾病的发展变化的方法(所述受试者例如已预先诊断有所述神经退行性疾病)，所述方法包括：
[0435] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)在受到第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0436] b)测量与步骤(a)相同的体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0437] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0438] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0439] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者的神经退行性疾病已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者的神经退行性疾病还未进展。
[0440] 在相关的方面，本发明提供一种用于监控受试者中的帕金森病(PD)的发展变化的方法(所述受试者例如已预先诊断有PD)，所述方法包括：
[0441] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述样品已经在间隔的时间点采集，和其中所述第一脑富集miRNA在中脑和/或额皮质中富集；
[0442] b)测量与步骤(a)中相同的体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受PD影响的脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与所述第一脑富集miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一脑富集miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0443] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0444] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0445] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者的PD已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者的PD还未进展。
[0446] 在另一相关的方面，本发明提供一种用于监控受试者中的帕金森病(PD)的发展变化的方法(所述受试者例如已预先诊断为PD)，所述方法包括：
[0447] a)测量从所述受试者采集的两个以上的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述样品已经在间隔的时间点采集，和其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0448] b)测量与步骤(a)中相同的体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0449] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0450] d)在先采集的和后采集的一个或多个体液样品之间将在步骤(c)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0451] e)(i)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比增加，则鉴定所述受试者的PD已经进展，或(ii)如果后采集的一个或多个体液样品与先采集的一个或多个样品相比，步骤(c)中计算的miRNA的水平比未变化，则鉴定所述受试者的PD还未进展。
[0452] 在单独的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有神经退行性疾病的受试者的所述神经退行性疾病发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0453] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一脑富集miRNA在受到所述神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集；
[0454] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，所述第二脑富集miRNA：(i)在不受所述神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述神经退行性疾病发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0455] c)计算各体液样品在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0456] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0457] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0458] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0459] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0460] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则将所述治疗鉴定为对所述神经退行性疾病有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则将所述治疗鉴定为对所述神经退行性疾病无效。
[0461] 在相关的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有神经退行性疾病的受试者的所述神经退行性疾病发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0462] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)在受第一神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0463] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0464] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0465] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0466] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0467] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0468] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0469] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则将所述治疗鉴定为对所述神经退行性疾病有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则将所述治疗鉴定为对所述神经退行性疾病无效。
[0470] 在另一相关的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者的PD发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0471] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中所述第一miRNA在中脑和/或额皮质中富集；
[0472] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二miRNA：(i)在不受PD影响的脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与所述第一miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0473] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0474] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0475] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0476] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0477] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0478] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗无效。
[0479] 还在另一相关的方面，本发明提供一种用于监控对已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者的PD发展的治疗效果的方法，所述方法包括：
[0480] a)测量在治疗开始之前从所述受试者采集的体液样品中第一miRNA的水平，其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0481] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0482] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0483] d)测量在治疗期间或之后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0484] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0485] f)计算各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0486] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和任选地在步骤(d)中的不同样品之间将在步骤(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0487] h)(i)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗有效，或(ii)如果步骤(c)中计算的miRNA的水平比不高于步骤(f)中计算的相应比，则鉴定PD治疗无效。
[0488] 在单独的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有神经退行性疾病的受试者中使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0489] a)测量体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物给药前从受试者采集的，和其中所述第一脑富集miRNA在受到所述神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集；
[0490] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受所述神经退行性疾病影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受所述神经退行性疾病影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在所述神经退行性疾病发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0491] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0492] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0493] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0494] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0495] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0496] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗无用。
[0497] 在相关的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有神经退行性疾病的受试者中使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0498] a)测量体液样品中第一miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物给药前从受试者采集的，和其中所述第一miRNA在受到第一神经退行性疾病的影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0499] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0500] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0501] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0502] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0503] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0504] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0505] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使所述神经退行性疾病减缓进展或治疗无用。
[0506] 在另一相关的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者中使PD减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0507] a)测量体液样品中第一脑富集miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物给药前从受试者采集的，和其中所述第一miRNA在中脑和/或额皮质中富集；
[0508] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二脑富集miRNA的水平，其中所述第二脑富集miRNA：(i)在不受PD影响的一个或多个脑区中富集，或(ii)在不受PD影响的脑细胞类型中富集，或(iii)在与第一miRNA相同的脑区中富集，但在PD发展中其表达和/或分泌与所述第一miRNA的表达和/或分泌不同地变化；
[0509] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0510] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0511] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0512] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0513] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0514] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使PD减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使PD减缓进展或治疗无用。
[0515] 还在另一相关的方面，本发明提供一种鉴定化合物的方法，所述化合物对于在已预先诊断有帕金森病(PD)的受试者中使PD减缓进展或治疗有用，所述方法包括：
[0516] a)测量体液样品中第一miRNA的水平，其中一个或多个所述体液样品是在试验化合物给药前从受试者采集的，和其中所述第一miRNA：(i)为在中脑和/或额皮质中富集的脑富集神经元miRNA，或(ii)为炎症相关miRNA；
[0517] b)测量从所述受试者采集的相同体液样品中第二miRNA的水平，其中(i)如果所述第一miRNA为脑富集miRNA，则所述第二miRNA为炎症相关miRNA，或(ii)如果所述第一miRNA为炎症相关miRNA，则所述第二miRNA为脑富集miRNA；
[0518] c)计算在步骤(a)和(b)中测量的miRNA的水平比；
[0519] d)测量在试验化合物给药后从所述受试者采集的一个以上的体液样品中与步骤(a)中相同的第一miRNA的水平；
[0520] e)测量在与步骤(d)相同的一个或多个体液样品中与步骤(b)相同的第二miRNA的水平；
[0521] f)计算在试验化合物给药后从所述受试者采集的各体液样品在步骤(d)和(e)中测量的miRNA的水平比；
[0522] g)将在步骤(c)和(f)中计算的miRNA的水平比进行比较，和
[0523] h)(i)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使PD减缓进展或治疗有用，或(ii)如果步骤(f)中计算的miRNA的水平比不低于步骤(c)中计算的相应比，则将所述试验化合物鉴定为对于使PD减缓进展或治疗无用。
[0524] 本发明的方法基于体液中特定miRNA的水平的测量。可通过无创或微创技术(如，与脑内检测相反的)采集的体液的使用允许成本有效性并且微创或无创的诊断过程。优选的用于本发明方法的体液为血浆、血清、尿液、脑脊液(CSF)、和唾液。然而，任何其它体液也可使用。
[0525] 用于测量体液中miRNA水平的有用方法的实例包括与选择性探针杂交(例如，使用Northern印迹、基于珠的流式细胞术、寡核苷酸微芯片[微阵列]、或溶液杂交分析如Ambion mirVana miRNA检测试剂盒)，基于聚合酶链式反应(PCR)的检测(例如，茎-环逆转录-聚合酶链式反应[RT-PCR]、基于定量RT-PCR的阵列法[qPCR-阵列])，通过下一代测序技术之一直接测序(例如，Helicos小RNA测序、miRNA BeadArray(Illumina)、Roche 454(FLX-Titanium)和ABI SOLiD)，或者各种
微流体技术。对于其它适用技术的综述，参见例如Chen等，BMC Genomics,2009,10:407；Kong等，J Cell Physiol.2009；218:22-25。优选技术类型之一为基于RT-PCR的技术，因为此类技术可以实现良好的灵敏度和特异性。
[0526] 某些实施方案中，miRNA在定量前纯化。miRNA可通过各种方法从体液中分离纯化，所述方法包括使用市售试剂盒(例如，miRNeasy试剂盒[Qiagen]、MirVana RNA分离试剂盒[Ambion/ABI]、miRACLE[Agilent]、高纯miRNA分离试剂盒[Roche]、和miRNA纯化试剂盒[Norgen Biotek Corp.])，Trizol提取(参见下文
实施例1)，以阴离子交换剂浓缩和纯化，由RNA-结合物质被覆(covered)的
磁性珠，或互补寡核苷酸对于特定miRNA的
吸附。
[0527] 某些实施方案中，体液样品中和/或miRNA纯化期间的miRNA降解被减少或消除。用于减少或消除miRNA降解的有用方法包括，但不限于，加入RNase抑制剂(如RNasin Plus[Promega]、SUPERase-In[ABI]等)，使用盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸、十二烷基
硫酸钠(SDS)、或其组合。当在miRNA定量之前要求储存和转运样品时，减少体液样品中的miRNA降解特别重要。
[0528] 为了考虑给定miRNA在纯化，潜在的RT-PCR抑制(RT-PCR inhibition)、来源于样品分离和处理期间死亡或受损的血细胞或尿细胞的miRNA污染物、肾滤过时的变化等期间的可能的损失，可采用实验数据归一化的各种其它方法。例如，下列
质量控制(QC)和归一化方法可用于本发明：
[0529] a)遍在miRNA可通过将其在受试者血浆中的浓度与预先建立的标准值比较来用于QC。
[0530] b)合成小RNA(如，非人miRNA)寡核苷酸可合成并用作纯化和RT-PCR抑制中的损失对照(通过在RNA纯化前将其添加至液体样品)。
[0531] c)为了考虑肾滤过中的变化(当以尿液样品工作时)，尿液中的miRNA浓度可基于肌酸酐和/或
白蛋白水平归一化。
[0532] 本发明的试剂盒
[0533] 与上述诊断、监控和筛选方法相关，本发明提供包括对诊断性miRNA对的检测特异的一个或多个引物和/或探针组的各种试剂盒。
[0534] 本发明的试剂盒的非限制性实例包括：
[0535] 1.一种用于检测PD的试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一对或多对miRNA特异的引物和/或探针：let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-744/miR-335、miR-99b/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-9*、let-7e/miR-132、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-134、miR-107/miR-134、miR-99b/miR-134、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-323-3p、miR-107/miR-323-3p、miR-127/miR-
323-3p、miR-181b/miR-323-3p、miR-99b/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-323-3p、let-7e/miR-411、miR-107/miR411、miR-491-5p/miR-411；miR-155/miR-335、let-7e/miR-146b、miR-491-5p/miR-146a、let-7e/miR-146a、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-16、miR-155/miR-132、miR-155/miR-323-3p、miR-155/miR-411、miR-491-5p/miR-146b、miR-155/miR-
146a、和miR-155/miR-146b。
[0536] 2.一种用于将PD与MCI区分的的试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一对或多对miRNA特异的引物和/或探针：let-7e/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-335、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-9*、miR-744/miR-335、let-7e/miR-132、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-132、let-7e/miR-210、miR-181b/miR-9*、miR-181a/miR-335、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-874、miR-181b/miR-874、miR-107/miR-132、miR-491-5p/miR-132、miR-107/miR-323-3p、miR-127/miR-
134、miR-491-5p/miR-874、miR-491-5p/miR-323-3p、miR-127/miR-432、let-7e/miR-134、let-7e/miR-411、miR-107/miR-411、miR-491-5p/miR-411、miR-107/miR-874、miR-181a/miR-9*、miR-491-5p/miR-210、miR-181b/miR-335、miR-99b/miR-335、miR-107/miR-210、miR-127/487b、miR-181a/miR-874、miR-9/miR-9*、miR-107/miR-487b、miR-107/miR-432、miR-9/miR-335、miR-181a/miR-132、miR-181b/miR-210、和miR-99b/miR-132；let-7e/miR-
146a、miR-107/miR-146a、miR-491-5p/miR-146a、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-
146b、miR-155/miR-874、let-7e/miR-146b、miR-155/miR-9*、miR-155/miR-335、miR-155/miR-411、和miR-744/miR-146a。
[0537] 3.一种用于将PD与AD区分的试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一对或多对miRNA特异的引物和/或探针：let-7e/miR-335、miR-107/miR-335、miR-127/miR-323-3p、let-7e/miR-411、miR-99b/miR-335、miR-491-5p/miR-335、miR-127/miR-134、miR-744/miR-335、miR-9/miR-335、miR-181b/miR-335、miR-107/miR-411、miR-181a/miR-335、let-7e/miR-9*、miR-491-5p/miR-411、let-7e/miR-132、miR-181b/miR-132、miR-9/miR-9*、miR-9/miR-134、miR-107/miR-134、miR-181b/miR-874、let-7e/miR-134、miR-107/miR-
132、miR-107/miR-9*、miR-127/miR-335、miR-9/miR-132、miR-181b/miR-9*、miR-491-5p/miR-132、let-7e/miR-210、miR-491-5p/miR-9*、miR-107/miR-323-3p、miR-491-5p/miR-
323-3p、miR-491-5p/miR-134、let-7e/miR-874、miR-181b/miR-210、miR-9/miR-874、miR-
9/miR-485-3p、miR-744/miR-134、miR-181b/miR-323-3p；miR-107/miR-146a、miR-491-5p/miR-146a、miR-155/miR-132、miR-155/miR-335、miR-107/miR-146b、miR-491-5p/miR-
146b、miR-9/miR-146a、let-7e/miR-146b、miR-9/miR-146b、let-7e/miR-146a、miR-155/miR-874、miR-155/miR-9*、miR-155/miR-411、miR-744/miR-146a、miR-155/miR-210、miR-
155/miR-146b、miR-744/miR-146b、miR-155/miR-146a、miR-155/miR-134、和miR-181b/miR-146b。
[0538] 4.一种试剂盒，其包括对选自由下列组成的组的一种或多种miRNA对的组合特异的引物和/或探针：
[0539] (a)miR-181b/miR-323-3p和miR-99b/miR-9*，
[0540] (b)miR-491-5p/miR-487b和miR-9/miR-146a，和
[0541] (c)miR-491-5p/miR-210和miR-181a/miR-146b。
[0542] 这些试剂盒可进一步包括用于检测QC和其它标准物miRNA的引物和/或探针组。
[0543] 这些试剂盒可用于从患者分离的体液样品中的直接miRNA检测或可用在纯化的RNA样品上。
[0544] 本发明的试剂盒还可提供引物延伸和扩增反应的试剂。例如，某些实施方案中，试剂盒可进一步包括一种以上的下列组分：逆转录酶、DNA聚合酶(例如
热稳定性DNA聚合酶等)、聚合酶链式反应缓冲液、逆转录缓冲液、和脱氧核苷三
磷酸(dNTPs)。可选地(或另外地)，试剂盒可包括用于进行杂交分析的试剂。检测试剂可包括核苷酸类似物和/或标记部分，例如，直接可检测部分如荧光团(
荧光染料)或
放射性同位素，或间接可检测部分如结合对(binding pair)的成员，例如生物素、或能够催化非可溶性比色或发光反应的酶。另外，试剂盒可进一步包括至少一个含有用于检测进行电泳过的核酸的试剂的容器。此类试剂包括直接检测核酸的那些，例如荧光嵌入剂或银染试剂，或者旨在检测标记的核酸的那些试剂，例如但不限于，ECL试剂。试剂盒可进一步包括miRNA分离或纯化手段以及阳性和阴性对照。试剂盒还可包括与之随附的管理
诊断试剂盒的制造、使用或销售的政府机构
指定形式的须知。试剂盒也可提供使用、储存和故障检修的详细说明。试剂盒还可任选地提供于优选用于高通量设定的自动化处理(robotic handling)的适当的壳体中。
[0545] 试剂盒的组分可作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，粉末可通过加入适当的
溶剂来复原。可以想象的是，溶剂也可提供在另一容器中。容器通常将包括其中放置溶剂(任选等分的)的至少一种小瓶(vial)、试管、烧杯、烧瓶、
注射器和/或其它容器装置。试剂盒还可包括用于包含无菌的、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器装置。
[0546] 在试剂盒中存在不止一种组分时，试剂盒还通常将包含第二、第三或其它额外的容器，其中可独立地放置其它组分。然而，一个容器中可包含组分的各种组合。
[0547] 此类试剂盒还可包括保存或维持DNA或RNA的组分，例如避免核酸降解的试剂。例如，此类组分可为无核酸酶或RNase或者避免RNase。本文所述的任意组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
[0548] 实施例
[0549] 还借助下列实施例描述和阐释本发明。然而，本说明书任何部分所使用的这些及其他实施例仅仅是说明性的，决不限制本发明的或任何所示例的术语的范围和含义。同样地，本发明不限于这里所述的任何特定的优选实施方案。事实上，本发明的许多修饰和更改对于在阅读本说明书的本领域技术人员可以是明显的，并且可在不偏离本发明的精神或范围下作出此类更改。因此，本发明仅受限于所附的权利要求的术语以及所述权利要求的等同方案的全部范围。
[0550] 实施例1：试验用miRNA的选择
[0551] 本发明的方法基于作为分子和分母的在不同脑区中富集的miRNA的使用，其显著改善了试验灵敏度和特异性。下表1示出脑富集的miRNA、在突触、轴突、树突和棘状突起中富集的miRNA(“突触和/或神经突miRNA”)和在不同脑区中富集的miRNA的列表。
[0552] 表1.脑、不同脑区和神经元区室中富集的miRNA
[0553]
[0554] 由于神经炎症过程参与PD病理，还试验了多种与炎症过程相关的miRNA(miR-146a,b、miR-155和miR-31)。还分析了与低氧相关的miR-210与脑富集的miRNA的组合，并试验了肌肉富集的miR-206，以检查作为PD的特征的运动障碍是否影响其在血浆中的浓度。最后，试验了实际并未在脑中表达的遍在的miR-16和miR-196a作为潜在的分母。
[0555] 试验的miRNA最初基于下述来选择：它们在脑区室中的富集和在神经突(即，轴突和/或树突和/或棘状突起)和/或突触中的存在的文献数据(Hua等，BMC Genomics.2009；10:214；Liang等，BMC Genomics.2007；8:166；Landgraf等，Cell.2007；129:1401-1414；Lee等，RNA.2008；14:35-42；Schratt等，Nature.2006；439:283-289；Lugli等，J.Neurochem.2008；106:650-661；Bicker和Schratt.J.Cell Mol.Med.2008；12:1466-
1476；Smalheiser和Lugli.Neuromolecular Med.2009；11:133-140；
Rajasethupathy.Neuron.2009；63:714-716；Kye.RNA.2007；13:1224-1234；Yu等，Exp.Cell Res.2008；314:2618-2633；Cougot等，J.Neurosci.2008；28:13793-13804；Kawahara.Brain Nerve.2008；60:1437-1444；Schratt.Rev.Neurosci.2009；10:842-849；Pichardo-Casas等，Brain Research.2012；1436:20-33)以及被暗示了的它们在神经突-相关过程和突触-相关过程中的参与(miR-本体数据库：http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/)。由于存在显示参与PD和其它神经退行性疾病的发展的炎症过程的数据，还预选了多种炎症相关miRNA以及与低氧相关的miR-210。最后，发明人试验了在肌肉细胞中富集的miR-206，这是由于运动障碍是PD的特征，并试验了几种遍在miRNA作为潜在的分母。接着，发明人分析文献找出了何种miRNA在血浆中可检测。本研究中分析了32个miRNA(表2)。
[0556] 表2.用于本研究的miRNA
[0557]
[0558]
[0559] Cer–小脑；FC–额皮质；Hip–海马；MB–中脑；PG–脑下垂体
[0560] 实施例2：定量分析
[0561] 使用曼-惠特尼U检验来通过各种生物标记物miRNA对评价任意两个患者群的差异的显著性。Bonferroni校正用于估算显著的P值。在所有实验(PD与年龄相称的对照[AMC]、MCI和AD的区分)中，试验了32个miRNA，因而P值<0.0001(根据0.05/496计算；这里的496表示所检测的miRNA对的总数)视为显著。病例-对照研究的标准式(Eng J.Radiology.2003；227:309-313)用于估算所需的样本量，从而产生统计功效(statistical power)0.90。
[0562] 实施例3：PD患者与年龄相称的对照(AMC)的区分
[0563] 从20名PD患者和20名AMC(±2.5岁)获得血浆样品。使用含有针对各单个的miRNA的引物和探针(Life Technologies)的RT-qPCR分析脑富集的miRNA、炎症相关miRNA、肌肉富集的miR-206和血浆中的几种遍在miRNA的浓度。各RT反应中取相当于25μL血浆的RNA的量，并将相当于2μL血浆的miRNA(cDNA)的量加入至最终的PCR。各miRNA的所得结果相对于-ΔCt潜在的标准物miRNA进行归一化，根据ABI方案(2 )转化为miRNA的相对浓度(RC)，并且与来自年龄相称的对照(AMC)的miRNA谱进行比较。如上所述选择生物标记物对。两种方法给出了相似的结果。最佳miRNA对的血浆浓度的相关性、将PD患者与AMC区分的P值和AUC(ROC曲线下的面积(Area under ROC curve))列于表3和图1。
[0564] 表3.用于将PD患者与AMC区分的生物标记物miRNA对
[0565]标记物 R 标记物 R
let-7e/miR-335 0.95 let-7e/miR-9* 0.97
miR-107/miR-335 0.91 miR-491-5p/miR-9* 0.95
miR-491-5p/miR-335 0.93 Let-7e/miR-323-3p 0.85
miR-744/miR-335 0.98 miR-107/miR-323-3p 0.84
miR-99b/miR-335 0.91 miR-127/miR-323-3p 0.84
miR-155/miR-335 0.93 miR-181b/miR-323-3p 0.89
let-7e/miR-411 0.89 miR-99b/miR-323-3p 0.90
miR-107/miR-411 0.90 miR-155/miR-323-3p 0.83
miR-491-5p/miR-411 0.89 miR-491-5p/miR-323-3p 0.84
miR-155/miR-411 0.93 let-7e/miR-146a 0.97
let-7e/miR-132 0.94 let-7e/miR-146b 0.96
miR-107/miR-132 0.95 miR-491-5p/miR-146a 0.97
miR-491-5p/miR-132 0.94 miR-491-5p/miR-146b 0.97
miR-155/miR-132 0.92 miR-744/miR-146a 0.98
Let-7e/miR-134 0.92 miR-155/miR-146a 0.96
miR-107/miR-134 0.94 miR-155/miR-146b 0.97
miR-491-5p/miR-134 0.91 miR-155/miR-16 0.95
[0566] R–分子和分母miRNA的相关系数；表中示出P<0.0001的miRNA对。
[0567] 结论：
[0568] 1.在PD中影响的脑区中脑(如let-7e)和额皮质(如，miR-107)中富集的miRNA，和存在于神经突和突触中的miRNA是miRNA对中最佳的分子，证实了与AMC相比，来自PD患者的miNRA比增加。尽管发明人不能鉴定文献数据中的miR-491-5p在特定脑区中的富集，但其表现为miRNA对中非常好的分子，将PD和MCI受试者区分。
[0569] 2.miRNA对中最佳的分母是来自不参与PD或明显受损少的脑区的脑富集的miRNA，其能够将PD和AMC区分(例如，miR-132和miR-335-5p，在海马中富集)。
[0570] 3.炎症相关miRNA分成两组。miR-155和miR-31(程度较低)是良好的分子，miR-146a和miR-146b是良好的分母，这表明它们在PD发展中起到不同的作用或者
定位在不同的细胞类型中。
[0571] 4.肌肉富集的miR-206不是针对PD检测的良好标记物。
[0572] 实施例4：PD与MCI患者之间的区分
[0573] 实验方案与上述实施例2中所述的相同，而将PD患者与MCI患者比较来找出能够将PD、MCI(其为异质的综合征，其为AD、额颞痴呆、血管性痴呆的早期阶段的特征，某些情况下为PD与其它神经退行性疾病的特征)区分的生物标记物miRNA对。各种miRNA对区分PD和MCI患者的能力的数据示于图2和表4。所示出的结果表明，区分PD和AMC的miRNA对与区分PD和MCI的大部分是相同的。
[0574] 表4.用于区分PD患者和MCI患者的生物标记物miRNA对
[0575]
[0576]
[0577] R–分子和分母miRNA的相关系数；表中示出P<0.0001的miRNA对。
[0578] 实施例5：PD和AD患者之间的区分
[0579] 再次，实验方案与上述实施例2中所述的相同，而将PD患者与AD患者比较来找出能够区分这两种神经退行性疾病的生物标记物miRNA对。各种miRNA对区分PD和AD患者的能力的数据示于图3和表5。所示出的结果再次表明，区分PD与AMC和MCI的miRNA对与区分PD和AD的大部分是相同的。有趣的是，在后两种情况(将PD与AD和MCI区分)中，与低氧相关的miR-210表现为良好的分母。
[0580] 表5.用于区分PD患者和AD患者的生物标记物miRNA对
[0581]
[0582]
[0583] R–分子和分母miRNA的相关系数；表中示出AUC>0.9和P<0.0001的miRNA对。
[0584] 总结
[0585] PD检测和与MCI和AD的区分的灵敏度和特异性非常高，某些对达到100％的精确度：
[0586] PD与AMC
[0587] let-7e/miR-335；let-7e/miR-411；miR-107/miR-146a；miR-107/miR-335；miR-107/miR-411；miR-155/miR-335；miR-181b/miR-335；miR-491-5p/miR-335；miR-491-5p/miR-411；miR-155/miR-146a
[0588] PD与MCI
[0589] let-7e/miR-146a；let-7e/miR-335；let-7e/miR-miR-411；miR-107/miR-146a；miR-107/miR-335；miR-127/miR-323-3p；miR-491-5p/miR-146a；miR-491-5p/miR-335；
miR-491-5p/miR-9*；miR-744/miR-335；miR-491-5p/miR-146b
[0590] PD与AD
[0591] miR-107/miR-146a；miR-107/miR-335；miR-127/miR-323-3p；let-7e/miR-411；miR-99b/miR-335；miR-491-5p/miR-146a；miR-491-5p/miR-335；miR-155/miR-132；miR-
155/miR-335；miR-744/miR-335.
[0592] 同样重要的还有，以较低精确度检测PD或将其与其它神经退行性疾病区分的某些生物标记物miRNA对结合也显示出高灵敏度和特异性(图4)。表6示出了展示生物标记物miRNA对中的分子和分母之间的相关性的显著性的典型数据–相关性越高，区分两个受试者组的P值越低。
[0593] 表6.生物标记物miRNA对中分子和分母之间的相关性的重要性
[0594]
[0595] 比较–比较受试者组。R–分子和分母miRNA的相关系数。P–P值。
[0596] 表7表示在最佳生物标记物miRNA对中用作分子和分母的miRNA的列表(能够将PD与AMC、MCI和AD区分，P值<2E-04)。
[0597] 表7.能够区分各种受试者组的生物标记物miRNA对中最常见的分子和分母的列表[0598]
[0599]
[0600] 本发明不限于本文所记载的特定实施方案的范围。实际上，除了本文所记载的以外，根据前述说明，本发明的各种
修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改预定落入所附权利要求的范围内。
[0601] 本文所引的所有专利、申请、公布、试验方法、文献和其它材料在此犹如在本说明书中实际存在一样以其全部内容引入作为参考。
