一种山羊朊病毒基因敲除方法
阅读：453发布：2020-05-17
专利汇可以提供一种山羊朊病毒基因敲除方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 学领域，具体涉及一种山羊 朊病毒 siRNA以及一种山羊朊病毒基因敲除方法。所说的山羊朊病毒siRNA，其正义链序列如SEQIDNO.1所示，反义链序列如SEQIDNO.2所示。所说的山羊朊病毒基因敲除方法，是将所述山羊朊病毒siRNA通过载体导入靶细胞内表达，降低山羊朊病毒mRNA 水 平。本发明为后续的抗朊病毒转基因山羊育种材料的获得提供了技术 支撑 。，下面是一种山羊朊病毒基因敲除方法专利的具体信息内容。
1.一种山羊朊病毒siRNA，其特征在于，其正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示。
一种山羊朊病毒基因敲除方法
技术领域
背景技术
[0002] 朊病毒又称Prion蛋白，它是一组至今不能查到任何核酸、对各种理化作用具有很强抵抗力、具传染性、分子重量在27 000-30 000道尔顿的蛋白质浸染颗粒，它们是在人和动物中引起可传递海绵脑病的特殊病因。在特定条件下，蛋白质发生突变或构型变化，致使由良性变为恶性，即变为具有传染性的浸染颗粒，可引起人和动物脑内神经元空泡变性（即海绵状变性），所以这类病毒引起的疫病被称为传染性海绵状脑病（TSE），又称为朊病毒病。目前已知由Prion蛋白引起的人畜共患性传染病约有30余种，其中包括人类朊病毒病：如库鲁(kuru)病、克雅病(creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、吉斯综合征(gerstmann-straussler syndrome，GSS)、致死性家族失眠症(fatal familia insomnia，FFI)等；动物朊病毒病：如疯牛病(madcowdisease，MCD)、绵羊瘙痒症(scrapie of sheep)、山羊瘙痒症(scrapie of goats)、传染性水貂脑病(transmissible mink encephalopa-thy，TME)、糜鹿慢性消瘦病(chronic wasting disease，CWD)、猫海绵脑病(feline spongiformencephalopathy，FSE)等。
[0003] 随着第一种被人类认知的朊蛋白疾病羊痒病(scrapie)在英国的出现，至今朊蛋白疾病已经存在200多年，而且可以感染不同种属动物的朊蛋白疾病仍在陆续出现，对人类的健康造成了巨大的威胁，但其发病机制至今尚未完全阐明。朊病毒病至今尚无有效疗法，90%病例均在一年内死亡，故在朊病毒病治疗方面各国进行了大量的研究。朊病毒的研究不仅具有重大的理论意义，而且具有重大的应用价值。进一步揭示朊病毒疾病的机理，可以使人们更深入地认识朊病毒疾病，进而有效地预防、控制和治疗朊病毒疾病。同时，对该病的研究有助于探索其他神经进行性紊乱疾病的病因和病理，如阿尔茨海默氏病、帕金森病和肌萎缩性脊髓侧索硬化等疾病的研究与治疗。
[0004] 由于致病因子Prion的特殊性，使人们对朊蛋白疾病的防控研究相对局限。但目前多种体外合成生物技术的出现和应用，为人们提供了一个新的途径去接近Prion的致病机理，为防治朊蛋白疾病提供丰富的研究资源。RNA干扰技术，则是可以进行研究利用的一个重要手段。
[0005] RNA干扰（RNA interference， RNAi）是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活性及基因表达的监控机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA （double-stranded RNA， dsRNA），在细胞内特异地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程。由于这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。研究中导入的双链RNA多为21-23nt的小分子干扰RNA片段（small inter-fering RNAs，简称siRNAs，又称引导RNAs），引起的RNAi效应较强。
[0006] 由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，它正在基因表达调控和基因功能研究中发挥重要作用。目前，RNAi已发展成为一种广泛的、用于产生遗传敲除的技术，并且用于通过反向遗传学研究基因功能。RNAi技术作为一个强有力的反向遗传学工具，不仅提供了高效、特异性的抑制基因表达的手段，而且正成为基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治疗研究的重要技术方法。目前应用RNA干扰技术尝试抗病毒治疗研究正成为传染病学研究领域的热点之一。抗病毒治疗研究的主要原理是通过抑制病原体本身的复制及翻译，或抑制某些与病毒感染有关的内源性基因的表达来实现治疗目的。目前多数的研究是通过直接合成特异的siRNA以降解病毒RNA或其mRNA，也有通过RNAi抑制参与病毒复制过程的宿主细胞的某些基因的表达而发挥抗病毒作用。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种特异的siRNA以特异性降低山羊朊病毒mRNA水平。
[0008] 本发明所述的山羊朊病毒特异siRNA，其正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 本发明还提供了一种山羊朊病毒基因敲除方法，是将上述山羊朊病毒特异siRNA[0010] 通过载体导入靶细胞内表达，降低山羊朊病毒mRNA水平。
[0011] 本发明中介导特异siRNA的载体是pSilencer 4.1-CMVneo。具体体过程是；将两条单链siRNA经退火处理后形成双链siRNA，将pSilencer 4.1-CMVneo载体用BamH I和Hind III双酶切后，与退火处理后的双链siRNA做连接反应， PCR筛选阳性克隆命名为pSilencer4.1-siRNA1，用pSilencer4.1-siRNA1转染靶细胞。
[0012] 为了验证本发明的效果，将pSG5载体用EcoR I 单酶切后加CIAP作去磷酸化处理，以防止载体自身连接。用两端都含EcoR I 酶切位点的引物，将一个约250bp的片段（包含有siRNA所识别的山羊朊病毒基因序列）扩增后克隆入pSG5载体，PCR筛选阳性克隆，该阳性克隆与pSilencer4.1-siRNA1共转染293T细胞，RT-PCR以判断siRNA效果。表明pSilencer4.1-siRNA1能特异性地降低山羊朊病毒mRNA水平。为后续的抗朊病毒转基因山羊育种材料（胚胎、个体）的获得提供了技术支撑。附图说明
[0013] 图1：重组siRNA载体构建
[0014] Lane 1: Markers
[0015] Lane 2: pSilencer 4.1-CMV-siRNA1
[0016] Lane 3: pSilencer 4.1-CMV-siRNA2
[0017] Lane 4: pSilencer 4.1-CMV-siRNA3
[0018] Lane 5: 阳性对照。
[0019] 图2：表达部分山羊朊病毒基因序列的pSG5-prion载体构建
[0020] Lane 1: pSG5-prion 1
[0021] Lane 2: pSG5-prion 2
[0022] Lane 3: pSG5-prion 3
[0023] Lane 4: Markers。
[0024] 图3：pSilencer4.1-siRNA1能特异性地降低山羊朊病毒mRNA水平
[0025] Lane 1: siRNA1引物，cDNA来源于pSilencer4.1-siRNA1和pSG5-prion1转染后的RNA
[0026] Lane 2: siRNA1引物，cDNA来源于pSilencer4.1-siRNA3和pSG5-prion1转染后的RNA
[0027] Lane 3: Actin引物，cDNA来源于pSilencer4.1-siRNA1和pSG5-prion1转染后的RNA
[0028] Lane 4: Actin引物，cDNA来源于pSilencer4.1-siRNA3和pSG5-prion1转染后的RNA
[0029] Lane 5: Markers。
具体实施方式
[0030] 1. 特 征性 材料：pSilencer 4.1-CMVneo载体（Ambion/Invitrogen公司 # AM5779，siRNA专用载体，用于装载siRNA）；pSG5载体（Stratagene公司#216201， 用于装载包括被siRNA所识别的山羊朊病毒基因序列以便在哺乳动物细胞内表达）；特异性siRNA（序列如SEQ ID NO.1-6，由上海Invitrogen公司合成）。
[0031] 2. 根据山羊朊病毒基因序列（GenBank: X74758.1），利用Ambion网页上提供的程序，在线设计三对siRNA如下：
[0032] siRNA1：正义链：AACCUGGCGGAGGAUGGAAtt （SEQ ID NO.1）
[0033] 反义链: UUCCAUCCUCCGCCAGGUUtt（SEQ ID NO.2）
[0034] siRNA2: 正义链：GCCACAUAGGCAGUUGGAUtt （SEQ ID NO.3）
[0035] 反义链: AUCCAACUGCCUAUGUGGCtt （SEQ ID NO.4）
[0036] siRNA3: 正义链：AAGCCACAUAGGCAGUUGGtt （SEQ ID NO.5）
[0037] 反义链: CCAACUGCCUAUGUGGCUUtt（SEQ ID NO.6）；
[0038] 每对引物的两条单链siRNA经退火处理后形成双链siRNA。
[0039] 3. 将pSilencer 4.1-CMVneo载体用BamH I和Hind III双酶切后，与退火处理后的双
[0040] 链siRNA（ siRNA1、siRNA2、siRNA3）做连接反应，分别获得重组质粒pSilencer4.1- siRNA1、pSilencer 4.1- siRNA2和pSilencer 4.1- siRNA3，PCR筛选后测序备用（图
1）。采用其推荐的公用引物测序（PCR产物约240bp）：
1）。采用其推荐的公用引物测序（PCR产物约240bp）：
[0041] 上游引物: 5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3'（SEQ ID NO.9）
[0042] 下游引物: 5'-CGGTAGGCGTGTACGGTG-3'（SEQ ID NO.10）。
[0043] 4. 将pSG5载体用EcoR I 单酶切后加CIAP作去磷酸化处理以防止载体自身连接；用两端都含EcoR I 酶切位点的引物（上游序列：5'- CCGAATTCAGGCGATTAAGTTGGGTA-3'（SEQ ID NO.7），下游序列：5'- GCGAATTCCGGTAGGCGTGTACGGTG-3'（SEQ ID NO.8），将一个包含有siRNA所识别的山羊朊病毒基因序列pSG5-si1、pSG5-si2或pSG5-si3的约250bp的片段扩增后分别克隆入前述pSG5载体，获得重组质粒pSG5-prion1、pSG5-prion2和pSG5-prion3。本发明选取pSG5-prion1进行后续实验。PCR筛选阳性克隆后备用（图2），该克隆操作是提供siRNA的靶序列之用，单酶切后插入的方向性不会影响对siRNA效果的判断。siRNA所识别的山羊朊病毒相关基因pSG5-si1、pSG5-si2、pSG5-si3的序列分别如SEQ ID NO.11-13所示。
[0044] 5. 共转染293T细胞，RT-PCR以判断siRNA效果：
[0045] 1）质粒组pSilencer4.1-siRNA1和pSG5-prion1包括的siRNA及其靶序列是一致的，共转染293T细胞后预期应出现RNAi现象；而质粒组pSilencer4.1-siRNA2、pSilencer4.1-siRNA3和pSG5-prion1包括的siRNA及其靶序列都是不一致的，共转染293T细胞后预期都不应出现RNAi现象，随机选取pSilencer4.1-siRNA3作为对照组进行验证。
[0046] 2）在试验的前一天向6-孔培养板内接种人源性293T细胞(每孔约10E+6个细胞)，以实验时细胞密度达到75-85%为宜。
[0047] 3) 转染开始时先吸弃过夜培养基，加入1.5 ml无添加物的纯DMEM培养基；以同样的纯DMEM培养基分别稀释GeneTran转染试剂和DNA，混合后置室温孵育20分钟；逐滴加至已适应了纯DMEM培养基的293T细胞中，4小时后加入0.5 ml DMEM+20%
[0048] FBS培养基（计2ml/孔）。
[0049] 4）预实验时在24h，48h，及72h时间点收获细胞提取总RNA后做逆转录反应以获得cDNA模板，PCR扩增后即可判断效果；正式实验时只采用48h。作为不同样品间RNA用量的内参，人beta-Actin引物也与siRNA特异性引物同一批次用于扩增：
[0050] Actin-F: TATGTGGGCGACGAGGCCCA（SEQ ID NO.14）
[0051] Actin-R: AGTGGTACGGCCAGAGGCGT （SEQ ID NO.15）（PCR产物约300bp）。
[0052] 6. siRNA效果：
[0053] 通过RT-PCR检测重组质粒pSilencer4.1-siRNA对与其相对应的山羊阮病毒基因mRNA表达的干扰情况（图3）。结果显示，对照组人β-actin基因扩增良好，pSilencer4.1-siRNA3由于其siRNA与其靶序列不一致，不会产生RNAi现象，扩增出了相应的山羊阮病毒基因序列；而重组质粒pSilencer4.1-siRNA1 其siRNA与其靶序列一致，产生了RNAi现象，并呈现出了很高的基因封闭效果，完全封闭了与其相对应的山羊阮病毒基因mRNA的表达。这表明，所构建的方法，可以实现山羊朊病毒的基因敲除。
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