本发明涉及分型在被感染的动物上发现的传染性海绵状脑病或朊 病毒疾病的菌株或类型的方法，也涉及在此方法中使用的诊断试剂盒 和试剂。特别地，申请人已经发现此方法提供区别羊通过实验传染的 BSE及羊天然瘙痒病的技术。

传染性海绵状脑病(TSE)包括一组进展性的神经疾病，此疾病 的特征是神经实质的空泡形成和被称作朊病毒蛋白(PrP)的宿主编 码的细胞表面唾液糖蛋白的疾病特异性同种型的累积。瘙痒病、牛海 绵状脑病(BSE)和新型克-雅氏病都属于这一疾病组。这些疾病以 不同的类型或菌株出现。

在将一系列源传染入啮齿类后，人们已经鉴别出了大量的TSE分 离物(通常指菌株)。通过口腔侵袭，仅用0.5g的大脑物质就已经将 BSE传染给了羊(Foster等，Vet Rec(1993)133：339-341)。某 些羊会自然地被BSE剂感染的可能性与人类和动物的健康有关。

目前，唯一可靠的TSE剂菌株分型的方法是基于在小鼠被连续传 染后分离物的生物学性质(Bruce等，1994，Transmission of bovine spongiform encephalopathy and scrapie to mice：strain variation and the species barrier.Philosophical Transactions-Royal Societv of London.Series B.343，405-411)。然而，这些方法极 费时间并且不是所有的瘙痒病菌株都能被容易地传染给小鼠。许多研 究显示患瘙痒病的小鼠大脑内PrP沉积的模式是菌株特异性的(Bruce M E等1989，Neuroscience Letters 102，1-6；Bruce 1996，Strain typing studies of scrapie and BSE.In Prion Diseases ed.Baker， H.F.和Ridley，R.M.pp.Totowa/NJ 07512：Humana Press Inc)。

为希望提供对菌株鉴别的更快速的应答，人们已经研究了若干其 它的方法。所有这些方法都是基于PrP的疾病特异性蛋白酶抗性片段 (PrPres)的性质，例如分子量(Parchi等，1996，Annals of Neurology 39，767-778)，PrPres片段的糖形比率(Collinge等，1996，Nature 383， 685-690；Kuczius等，1998，Journal of Infectious diseases 178， 693-699；Somerville et al.，1997a，Nature386，564-564)或PrPres 的相对蛋白酶抗性(Kuczius和Groschup，1999.Molecular Medicine 5，406-418)。

例如，一种检测PrPSc的方式是通过应用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Laemmli U.K.(1970，Nature 277：680-685)，然后应用蛋白质 免疫印迹法(Towbin H.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，76： 4350-4354)。

然而，当比较不同的菌株或分离物时，PrPres的这些性质重叠， 因此它们不能被用作最终的菌株分型。PrPres的构象分析已有描述并 且可能提供菌株分型的方法，但是这种技术的有用性还没有被承认 (Safar等，1998，Nature Medicine 4，1157-1165)。

申请人已发现对于现有的基于分子量和/或糖形比率的分型方 法，特异性PrP表位的检测能提供有用的附加，现有的分型方法不是 总能提供可靠的辨别，尤其是对于在羊中发现的TSE类型的情况下。

按照本发明，这里提供用于分型被感染动物的传染性海绵状脑病 (TSE)菌株的方法，所述方法包括a)基于分子量和/或糖形比率分 离异常的朊病毒蛋白样本，并检测被分离的类型；b)将样本与抗体 或其结合片段相接触，此抗体或结合片段与来自TSE菌株的朊病毒蛋 白结合，在样本中发现，它们与至少一种其它的TSE菌株有不同的和 可区别的结合亲和力，并检测结合的抗体或结合片段；和c)利用(a) 和(b)的结果来确定在样本中存在的TSE菌株类型。

利用这一联合或“杂交”技术，申请人发现TSE的分型能被增强， 甚至例如当菌株的朊病毒蛋白具有相似的分子量和/或糖形比率时。

它的抗体或结合片段会适宜地与肽序列结合，此肽序列构成特定 菌株朊病毒蛋白的表位区域。在其它朊病毒蛋白中的相似的表位区域 会具有略微不同的序列，其对抗体的结合有影响，或对通过样本制备 感染蛋白质的方式有影响，其中异常的朊病毒蛋白质被从生物物质中 分离。

当在这里使用时，属于“肽序列”指序列，其是分离的不连续的 肽形式，或是部分蛋白质或被截断的蛋白质。

步骤(b)是适宜地在凝胶上利用例如蛋白质印迹的技术影响被 分离的物质，其中被结合的抗体是可见的，例如用染料。在凝胶上将 使用的其抗体或结合片段与被分离的样本相接触，然后被显现来产生 标记，这取决于结合的亲合力，此标记具有不同的强度。例如，对于 在某一物种的朊病毒蛋白(例如瘙痒病)中发现的特定的序列，当与 在另一个中(例如BSE)发现的相似的或相应的序列，以存在于样本 中的形式比较时，例如用蛋白酶处理的匀浆，抗体或结合片段具有不 同的且可区别的亲和性。

适宜通过视觉比较结果来判断差别亲和力，但是如果需要，可以 使用本领域已知的光学设备检测由结合的且可显现的抗体提供的信号 的强度。尤其优选的是，本发明方法的步骤(a)包括基于分子量分 离经过加工的脑组织，例如在凝胶上，然后检测蛋白质，例如利用其 抗体或结合片段，它们结合朊病毒蛋白，也利用蛋白质印迹技术。在 此方式中，对步骤(a)和步骤(b)可使用相似的印迹，步骤(b) 的差别结合变得更清晰。

利用计算机分析软件来通过分子量和通过构成PrPSc(糖形比率) 的三种蛋白质带中的每一个的信号强度作测量。对于前者，设置软件 来测定标准分子量标记物，然后给出正在检测的特定样本所发现的分 子量的计算出的结果。对于糖形比率，所有三个带的信号的强度被认 为是100％，并且通过绘制二糖基化蛋白质带的信号百分率(顶端带) 对单糖基化蛋白质带的信号百分率(中部带)的图来得到某些区别。 图中标绘点的相对位置可能给出PrPSc源的指示。

先前尝试用过仅仅是步骤(a)的相似方法来检测糖形比率和分 子量的差异。已知，例如可以通过蛋白质的二糖基化、单糖基化和未 糖基化类型的相对量和分子量，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，来分离PrPSc 的构成类型。随后通过蛋白质免疫印迹利用抗PrP产生的抗血清对它 们进行检测。作为TSE特定菌株的特征指出了糖形比率和分子量。

例如，这些因素中的相似性支持了vCJD人类感染起源于牛的可 能性，因为来源于CJD的偶发型或医源型的那些与来源于vCJD和BSE 的那些有很大不同(Collinge J.等Nature(1996)383：685-690； Hill A.F.等，Nature(1997)389，448-450)。

先前也已经报道了通过分子分析从被BSE菌株实验感染的羊中区 分天然羊瘙痒病的尝试，但得到了互相矛盾的结果。在一份出版物 (Hill AF，等，(1998)Neuroscience Letters 255：159-162)中 报道了，与天然瘙痒病病例比较，在BSE感染的羊中发现了较低的未 糖基化带，但是在另两份出版物中(Hope J等，(1999)Gen.Vir.80： 1-4，Hope J等，(2000)Corrigendum 81：1-4)报道当与羊BSE样 本比较时，在8个天然瘙痒病病例中的7个里发现了较低的未糖基化 带。而且，在后者的报道中，作者记录了羊中BSE与实验瘙痒病菌株 (CH1641)显示有相似的分子特征。这一菌株在羊身上增殖，并且是 在1971年从英国Cheviot羊中最初被分离出来(Foster JD等， (1988)Vet.Rec.123：5-8)。

申请人发现，利用这一方法，实验BSE的羊样本中未糖基化的蛋 白质带的分子量和糖形比率与从天然瘙痒病和BSE样本是可区分的(见 下文的实施例1)。然而这一方法需要所有菌株做平行试验。考虑到结 果的复杂性和重叠性，难以单独利用此方法作为可靠的诊断试验。

然而，在某些情况下，利用抗体更清楚地区分菌株是可能的，这 些抗体与在瘙痒病PrPSc中存在的序列有很强的亲合力并且与牛PrPSc 的亲合力大大降低。达到这一结果的特定的抗体是，针对相应于朊病 毒蛋白或其表位区域的氨基酸84-105的肽的抗体(例如相应于羊的 氨基酸89-104的肽)。

通过用对上面描述的两种菌株显示不同的亲合力的抗体或其结合 片段和用结合所有菌株的抗体或其结合片段，其优选有强亲合力，来 探测被分离的类型，并比较结果，最好地说明了这一点。

在特定的具体实施方案中，本发明方法的步骤因此包括离心来自 怀疑患有TSE的动物的匀化组织的样本，使产品与消化普通蛋白质的 酶接触，但是异常朊病毒蛋白对于此酶是抗性的(例如蛋白酶K)，在 凝胶上分离因此形成的混合物，用(i)对朊病毒肽是特异性的抗体 或其结合片段，和(ii)抗体或其结合片段，其对于来源于TSE某一 菌株的朊病毒肽具有强亲合力，且对于来源于TSE其它菌株的朊病毒 肽具有较弱的亲合力，来探测被分离的混合物，并在产生的信号的性 质的基础上分型TSE菌株。

例如，可以使用此方法来检测被实验感染的羊BSE，其中在步骤 (i)中使用的抗体是序列，此抗体在氨基酸位点144-152结合牛PrP 蛋白质，在步骤(ii)中使用的抗体是在绵羊PrP蛋白质氨基酸位点 89-104识别氨基酸序列的抗体。

具体地，在这一情况下，如果(i)的抗体不结合，则没有分子 量可以被测量。与(i)的抗体(例如mAb 6H4)的强信号相比，如果 它与(ii)的抗体(例如mAb P4)微弱地结合，则分子量有差异，并 且这一样本的糖形比率也可以被考虑来在羊疑似病例中诊断可能的 BSE。因此对不同的抗体亲和性可以有视觉的比较，使用对于所有三 条规则的全部的结果来作出最终的判断。

对反刍动物大脑组织的板(panel)进行蛋白质免疫印迹技术， 并利用识别朊病毒蛋白的单克隆抗体探测凝胶。已发现，被用BSE实 验感染的具有ARQ/ARQ基因型的Romney羊和具有AHQ/AHQ基因型的 Cheviot羊给出的分子量值，与从绵羊瘙痒病获得的相比，与从牛BSE 获得的更相似。主要的区别与未糖基化蛋白质带有关，与绵羊瘙痒病 病例相比，其对于羊BSE病例其始终较低。这与法国试验的羊BSE的 发现相似(Baron TGM等，(2000)Neuroscience Letters 284： 175-1)。结果也显示，与从所有其它的样本获得的值相比较，CH1641 对于所有三个带得到了较低的分子量值。CH1641菌株的这些值与从BSE 羊获得的那些更接近，至于更小的范围，相比于从天然羊瘙痒病和 SSPB1菌株中获得的那些，其与牛BSE值更接近。SSPB1的分子量值 与从天然瘙痒病获得的分子量无法区分。这些与由其它研究者公布的 那些发现也是相似的(Hope J等，(1999)Gen.Vir.80：1-4，Baron TGM等，(2000)Neuroscience Letters 284：175-178)。两个牛BSE 样本的分子量，与用BSE试验接种的Cheviot和Romney品种羊的分 子量相比，好像与天然羊瘙痒病和SSPB1的分子量更接近。

在其它出版物中(Collinge J等，(1996)Nature383：685-690， Hill AF等，(1997)Nature 389，448-450)，也使用了对于每一糖 形蛋白质的不同量的比率来测定菌株类型或种类差别。利用这一杂交 技术，还不能使用糖形比率来从天然牛BSE样本中区分天然绵羊瘙痒 病样本。然而，试验的羊BSE样本的糖形比率好像确实位置远离天然 瘙痒病和BSE样本(图3)。对于所有其它的糖形比率，SSPB1的糖形 比率给出最始终不同的图，而CH1641给出的糖形图与从Cheviot ARQ/ARQ天然瘙痒病病例获得的图很相似。当分子量差异被用来区分 时，对于获得的那些，这些结果好像是不一致的。经观察，通过分子 量差异，两个牛BSE病例与瘙痒病可能能区分(图1)，但是在糖形比 率分散图(图3)中它们的位置的特征在于平均值标准差重叠。

按照本发明，可以获得进一步的区分，例如，通过使用mAb P4， 使用这一特定的方法学，其似乎与瘙痒病PrPSc有强亲合力，并与牛 PrPSc亲合力大大降低。

利用这一技术，通过mAb P4抗血清没有检测在Prionics试验试 剂盒中提供的普通牛对照以及阳性样本BSE1和BSE2的信号。对于此 的解释可能是，mAb P4的表位邻近绵羊PrP蛋白质的氨基末端，并且 位于紧接近蛋白酶K的分裂位点。使用不同的技术，分裂位点可能不 会精确地在相同的位置，并且看起来在杂交过程中用于BSE识别的表 位的重要的部分会被部分地或全部地破坏，因此降低这一抗体与BSE PrPSc结合的能力。如果羊BSE与牛BSE具有相同的PrPSc构象，可以 相信表位也会以同样的方式被影响，尽管为试验羊BSE留下的残端信 号显示对于表位的略有不同的影响。在技术赋予构象差异中，在蛋白 质折叠中的差异也是有可能的，并且它伪装BSE PrPSc的表位，PrPSc 并部分地伪装羊样本BSE的表位，但是对于瘙痒病PrPSc的表位没有 影响。

已报道mAb P4表位的氨基酸序列是GGGGWGQGGSHSQWNK绵羊89- 104(Harmeyer S等，(1998)Gen.Virol.79：937-945)。牛的等 同序列是GGGGWGQGGTHGQWNK，只有两个残基不同，在绵羊PrP位点98 和100。在用来免疫印迹的强变性状况下，mAbs被认为是主要结合线 性的，非-构象-特异性表位(Harmeyer S等，(1998)Gen.Virol. 79：937-945)。利用杂交技术显示的对牛PrPSc完全缺乏亲合力和对 羊样本BSE的亲合力降低因此似乎暗示了BSE PrPSc和瘙痒病PrPSc的 这一表位的结构的差异。识别绵羊和牛来源PrP的差异可以被简单地 解释为通过两个氨基酸取代的结果。然而，从BSE侵袭的羊提取的PrPSc 在其基本结构中是绵羊的，并且物种差别不再适用。然而，有可能， 来自药剂的不同菌株的异常PrP中的主要的蛋白酶K开裂位点在这里 应用的蛋白水解的条件下会变化。因此，对于来自PrPSc的瘙痒病， 表位和抗性核部分保持完整，但是对于来自PrPSc的BSE，主要的开裂 点在mAb P4表位中或在其C-末端。

已经发现，偶联mAb P4的Prionics-Check试验(无离心步骤) 对于牛BSE PrPSc不很敏感。与利用mAb 6H4免疫反应的结果相比， 对于mAb P4的二糖基化带被限制在弱信号(结果未显示)。本发明的 杂交技术和因此添加的离心步骤似乎使得BSE PrPSc甚至更少被检测 到。这可能是因为离心优选浓缩了PrP被截短的C-末端至P4表位， 或者相反地，在小量蛋白质水解后，表位只留下了作为相对可溶的PrP 物质。这可能是蛋白酶K消化和离心步骤的组合作用，在限定mAbs 对反刍动物PrPSc的亲合力中，PrPSc的不同构象是重要的。

利用杂交技术，在这里提出的结果显示牛BSE和羊BSE分子量与 糖形比率间的差异，而mAb P4似乎根本不检测天然牛病例，某些残 基信号为羊BSE和CH1641菌株出现的。这可能是由于宿主因素或在 蛋白酶抗性中的可能的差异。然而，结果可能也显示BSE PrPSc在绵 羊宿主内经历了某些变化或可能产生了药剂的不同的菌株；但是后者 可能与我们现有的知识相悖，关于发明了牛BSE的小鼠内和用BSE试 验侵袭的羊具有相似的温育期间和损伤图(Bruce M等，(1994) Philos Trans R Soc Lond Ser B 343：405-411)。对杂交技术，增 加蛋白酶K浓度和温育时间或减少mAbP4稀释会进一步减少这一残基 信号。

通常，通过蛋白质免疫印迹法的诊断样本的常规试验只能被用来 获得定性的结果，但是它不给出在绵羊和牛样本之间差异的精确量。 在每一凝胶上，包含的适当的绵羊和牛阳性对照对于帮助区分羊样本 中的BSE是有帮助的。当以此方式处理时，绵羊瘙痒病、羊BSE和牛 BSE之间最大的差异是未糖基化带的分子量，但是通过电泳泳动条件 的变化性易被曲解的分子量微小差异的潜在性是一个问题。这能通过 事实解释，在8个不同的凝胶上，对于每个单个样本，分子量的值不 是精确相同的。能够评价，组织的特定板是无价值的，申请人发现在 每一凝胶上使用合适的比较对照，并严格控制和监控试验的所有方面 对于分子量图和糖形比率的差异的再现性是极重要的。将清除离心步 骤加入Prionics技术中似乎改进了溶解并通过蛋白质带的更清楚的 划分提高了分子量的差别(Prionics方法和杂交方法之间比较的结果 没有显示)。

本发明方法的结果的解释需要小心的进行。在分析数据中遇到的 困难的例子是在本研究中说明在CH1641和羊BSE分子量图之间哪有 相似性，和当应用mAb P4时对这一菌株的信号减小的发生，会指示 瘙痒病菌株起源于牛BSE的可能性。然而，分子量图不是相同的，并 且糖形比率更像瘙痒病。

这些结果暗示，分子量差异、糖形图和两个特异性抗体的组合能 被用来提供试验英国羊群中BSE的良好方法。

在另外的具体实施方案中，本发明提供用于分型传染性海绵状脑 病(TSE)菌株的试剂盒，所述试剂盒包含抗体或其结合片段，它们 与朊病毒蛋白结合，并且当与TSE的第二菌株比较时，抗体或其结合 片段对特定的TSE菌株具有不同的和可识别的亲合力。

现在将通过实施例及附图具体地描述本发明，其中：

图1显示利用杂交技术和mAb 6H4抗血清的样本板的平均带分子 量。羊BSE(Rom和Chev BSE)和牛BSE样本(BSE1和BSE”)与天 然瘙痒病样本(Romney VRQ/VRQ，Cheviot ARQ/ARQ，Cheviot VRQ/VRQ， Swaledale ARQ/VRQ)和羊传代瘙痒病菌株SSBP1重叠，它们的二糖 基化带对样本板显示较小分子量差异。对于样本板，单糖基化带和未 糖基化带几乎给出相同的差别图，虽然对于未糖基化带，样本间的差 异较大。这似乎是模式，CH1641给出最低平均值，然后是羊BSE的较 高值，然后是牛BSE，最后是天然绵羊瘙痒病样本和SSBP1给出最高 分子量值。

图2显示利用杂交技术和mAb P4的天然绵羊瘙痒病和SSBP/1 羊传代瘙痒病样本的平均带分子量。所有三种蛋白质带对于这些来自 瘙痒病的样本显示非常小的差异，对于绵羊瘙痒病样本(Romney VRQ/VRQ，CheviotARQ/ARQ，Cheviot VRQ/VRQ，Swaledale ARQ/VRQ) 板和羊传代菌株SSBP1的板给出几乎相同的分子量图。

图3是天然牛BSE(BSE1和BSE2)、天然瘙痒病(Romney VRQ/VRQ， CheviotVRQ/VRQ，Cheviot ARQ/VRQ，SwaledaleARQ/VRQ)、两种羊传 代瘙痒病菌株(SSBP1和CH1641)和试验传染BSE的绵羊(Romney ARQ/ARQ和CheyiotAHQ/AHQ)的二糖基化带和单糖基化带中异常蛋 白质的比例的糖形比率的散点图。羊BSE样本给出唯一的糖形比率， 但是在牛BSE天然病例和Romney VRQ/VRQ和Swaledale绵羊瘙痒病 之间有相当大的结果的重叠。CH1641菌株给出了更接近于Cheviot ARQ/ARQ瘙痒病羊的比率。

图4显示利用杂交方法，对脑样本板获得的免疫印迹。用mAb 6H4， 识别牛PrP蛋白质氨基酸位点144-152序列的鼠IgG1抗体来探测膜 a)。用p4探测膜b)，其在小鼠中增加，并识别在绵羊PrP蛋白质中 在氨基酸位点89-104的氨基酸序列。

用mAb 6H4探测的膜a)，两种BSE瘙痒病样本都显示强信号，并 且分子量之间的差异也清晰可见。

用mAb P4探测的膜b)，瘙痒病样本(泳道2、3、10和11)和SSBP1 (泳道12)显示强信号，但是用BSE试验感染的绵羊(泳道5、6、8 和9)和CH1641菌株(泳道4)信号弱。天然BSE病例(泳道1和13) 和Prionics普通牛脑对照(泳道1)不显示可见信号。利用mAb P4， 分子量之间差异很小。

实施例1

用于区分羊动物和组织中BSE及瘙痒病的杂交方法

从Romney品种羊(AA136RR154QQ171基因型)和Cheviot品种羊 (AA136HH154QQ171基因型)获得来自脑干区域的冷冻的存档的大脑组织， 它们都通过实验感染了BSE。两种羊都是通过口服5克阳性牛BSE大 脑物质被感染。羊PrP基因产生256个氨基酸的蛋白质，在基因中它 们中的每一个都被三个DNA碱基(一个密码子)编码。对于瘙痒病的 易感性已经显示与PrP蛋白质基因型有关，其通过在密码子136、154 和171被编码的氨基酸的变异被定义，并且被称作多态性。已经发现 了至少五种与感染瘙痒病的风险有关的变异体等位基因，它们被写作 ARQ，ARR，VRQ，AHQ和ARH。在每个密码子，编码呈现氨基酸的多态 性，即A136R154Q171(ARQ)，在这里A＝丙氨酸，R＝精氨酸，Q＝谷氨酰 胺。另外两种氨基酸是H＝组氨酸和V＝缬氨酸。遗传自公羊和母羊 的两等位基因的纯合配对和杂合配对因此导致了发现的PrP基因型的 重要的变异。这一风险水平的变化取决于品种类型和在羊群中发现的 基因型(Hunter N(1997)Trends in Microbiology 5：331-334， Dawson M等，(1998)Vet.Rec.6：623-625)。天然瘙痒病大脑组 织源自常规诊断提交物并且包括下面的品种和基因型；Romney VRQ/VRQ，Cheviot VRQ/VRQ和Cheviot ARQ/ARQ。我们不能获得来自 与那些用来试验BSE接种的有相似的基因型的羊的天然瘙痒病样本， 但是品种应该匹配，并且加入有杂合的基因型ARQ/VRQ的Swaledale 品种羊来进一步比较。

两种牛样本BSE是存档的组织，其从普通诊断提交物 (Submission)获得。来自羊的组织传代瘙痒病菌株，SSBP1和CH1641 主要通过Cheviot羊传代[Wilson DR等，(1950)J.Comp.Pathol. 60：267-275]并且现在已知是指定为A族菌株的瘙痒病菌株的混合物 [Dickinson AG等，(1979)Slow Transmissible Diseases of the Nervous System Vol.1，Eds S.B.Prusiner，W.J.Hadlow.New York. Academic Press p367]。CH1641最初来源于Cheviot瘙痒病的天然病 例[Dickinson AG等，(1986)Unconventional Viruses and Central Nervous System Diseases，Part III chapter 9 446-460 Eds.L.Court. D.Dormont.D.Kingsbury.Moisdon la Riviere，Abbaye de Mellaray]并且特征在于羊的连续的传代，是单独的菌株或是菌株的 未决混合物。与族A菌株比较，在第二和第三传代的接种性质上有它 有不寻常的变化，并被分类为C族菌株[Foster JD等，(1988)Vet. Rec.123：5-8，Dickinson AG，et al.，(1988)Novel Infectious Agents and the Central Nervous System.Ciba Foundation Symposium No.135.Eds G.Bock，J.Marsh，Chichester，Wiley p63]。

蛋白质免疫印迹技术

杂交技术，其是加入了离心步骤[Collinge J等，(1996)Nature 383：685-690]的改进的基于Prionics的技术[Schaller O等，(1999) Acta.Neuropathol.98：437-443]，被用来检测PrPSc。基本上，将1.5 μl的10％的匀浆(prionics)在1127g离心5分钟(TLA 45 rotor-Beckman)。将蛋白酶K(Roache)(5μl的1mg/ml的储存液来 达到最终浓度为50μg/ml)加入到100ml上清液中，并将其在37℃ 温育1h。加入Pefabloc(Boehringer to 1mM)和100ml样本缓冲 液(Prionics)并在100℃温育10min。在微离心机(14,000转，5 分钟)中进行离心，并将10μl上清液上放置在12％Bis-Tris聚丙 烯酰胺凝胶上(Invitrogen)。在200v进行电泳35分钟，并在聚乙 二烯二氟化物PVDF膜(Millipore)上在150v进行蛋白质免疫印迹 法1h。将印迹在50ml封闭缓冲液(Prionics)中封闭1h并在4℃在 1∶5000的第一抗体稀释液(在封闭缓冲液中的6H4 Prionics)中温 育过夜。将膜在TBS(含0.05％吐温20)中洗涤4×7分钟并在室温下 在第二抗体(1∶5000)(与碱性磷酸酶共轭的山羊抗小鼠抗体) (Prionics)中温育1小时。然后再将它们在TBST中洗涤4×7分钟， 并在发光缓冲液(Prionics)中温育5min。通过增强的化学发光系统 (CPD-Star Tropix)可见标记。利用Fluor S Multimager计算机 分析(Quantity One software，Biorad UK Ltd)定性信号。利用这 一系统，通过与凝胶上的biotinylated标记物比较来测量分子量， 并记录每一样本带的中心位置作为分子量。至于糖形分析，此中心点 再一次被用作读点。结合的信号被定义为100％，并加和每一个带的 浓度作为总体的百分率。

抗血清

至于单克隆抗体(mAb)P4试验，用mAb 6H4替代此抗血清，并 使用1∶2500稀释液。mAb 6H4是小鼠IgG1抗体，其在氨基酸位电144 -152识别牛PrP蛋白质中的序列[Korth C等，(1997)Nature 390： 74-77]。mAb P4在小鼠中被建立，并在氨基酸位点89-104识别绵羊 PrP蛋白质中的氨基酸序列。[Harmeyer S等，(1998)Gen.Virol.79： 937-945]。

凝胶设计

在每个凝胶上建立17个孔，泳道1包含Prionics对照样本，此 样本包含分子量标记物和正常牛大脑组织的混合物，为了下一步分子 量测量的准确性，三个孔包含biotinylated分子量标记物(泳道2、 9和14)。凝胶余下的部分从左到右设计如下：Romney VRQ/VRQ天然 瘙痒病，CheviotARQ/ARQ天然瘙痒病，CH1641，Cheviot羊BSE，Romney 羊BSE，牛BSE 1，Cheviot羊BSE的复制样本，Romney羊BSE的复 制样本，Cheviot VRQ/VRQ天然瘙痒病，Swaledale ARQ/VRQ天然瘙 痒病，SSBP1，牛BSE 2和正常牛阴性。利用与每个抗血清相同的匀 浆处理凝胶的八个复制品，总共16个凝胶。无论使用的抗血清是mAb 6H4或是mAb P4，凝胶设计是相同的。

结果

分子量分析

所有样本给出了相应于PrPSc三个糖形的特征性蛋白质带模式， 二糖基化的(顶端带)显示最强的信号，单糖基化的(中间带)显示 第二强的信号，然后是未糖基化的(底部带)显示最弱的信号。利用 mAb 6H4抗血清从8个重复的样本的板获得的所有三个带的平均分子 量和标准偏差以柱状图显示在图1中。对于单糖基化带和未糖基化带， 似乎是模式，CH1641给出最低平均分子量，然后是羊BSE给出较高的 值，然后是牛BSE，最后是天然绵羊瘙痒病样本和SSBP1给出最高的 分子值。样本板这一完全的结果模式与单糖基化的和未糖基化的蛋白 质带类似，只是差异大于未糖基化带。二糖基化带不能被用来通过分 子量区分样本板。

对于所有三个带，获得的CH1641瘙痒病菌株的分子量与所有其 它的样本比，始终给出较低的分子量，但是与瘙痒病与SSBP1样本获 得的分子量比，此值更接近于羊BSE和牛BSE分子量。SSBP1分子量 被认为不能从其它获得的天然瘙痒病样本区分。

从每个样本的八个泳道(runs)获得的蛋白质带的平均分子量和 标准偏差显示在图2中，利用mAb P4抗血清(天然羊瘙痒病样本和 SSBP1)其给出可检测的信号。所有这些瘙痒病样本的分子量图相似， 但是所有三个带的分子量都高于用mAb 6H4获得的那些。

糖形比率

关于用mAb 6H4抗血清获得的糖形比率，高分子量糖形(二糖基 化带)和低分子量糖形(单糖基化带)的平均值的比率标绘在散点图 中(图3)。SSBP1的比率似乎远离其他的(45∶32)。CH1641比率(53∶ 29)与由Cheviot ARQ/ARQ(52∶30)天然羊样本获得的比率很类似。 CheviotVRQ/VRQ，(57∶27)Romney VRQ/VRQ(57∶25)和Swaldale ARQ/VRQ(58∶25)天然瘙痒病样本给出的比率与由牛BSE样本中的 一个(60∶26)获得的比率类似。另一个牛BSE样本比率与羊BSE样 本比率接近，关于它的较低的分子量(59∶22)。来自通过试验接种 (incolulated)BSE的Cheviot的两个复制样本的比率是65∶23和 66∶23。来自通过试验接种BSE的Romney的两个复制样本的比率是65∶ 22和66∶21。八个泳道的糖形比率的标准偏差变化，牛BSE倾向于 与Cheviot VRQ/VRQ，Romney VRQ/VRQ和Swaldale ARQ/VRQ瘙痒病 样本重叠。然而，CH1641和Cheviot ARQ/ARQ比率几乎不重叠，羊BSE 和SSBP1比率似乎不与任何其它的糖形比率重叠。

利用mAb P4获得的平均糖形比率通常高于利用mAb 6H4抗血清 的从天然羊中获得的那些；SSBP1(46∶31)，Cheviot ARQ/ARQ (57∶27)，CheviotVRQ/VRQ，(62∶23)  Romney VRQ/VRQ(59∶25) 和SwaldaleARQ/VRQ(62∶24)。它们与利用mAb 6H4发现的羊BSE糖 形比率都不相似。

利用mAb 6H4和mAb P4的差异

样本板的两个有代表性的凝胶结果都显示在图4中。上面那行的 免疫印迹显示利用本发明的杂交技术和mAb 6H4抗血清的结果，下面 那行显示利用mAb P4抗血清的结果。当使用mAb P4抗血清时，观察 是所有绵羊瘙痒病样本和SSBP1都给出强染色带。在所有三个带中， CH1641和羊BSE样本的信号都很小，对于牛BSE样本根本检测不到信 号。提供的正常牛大脑样本，作为Prionics对照，也未检测到信号。 对于凝胶的八个重复也发现了完全相同的结果。