猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用
阅读：936发布：2021-01-27
专利汇可以提供猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一株猪 肺 炎支原体GZ株，其具有更好的免疫原性，制备的 疫苗 组合物能对猪产生完全保护，GZ株在扩增制备中滴度高，易于培养，能产生大量 抗原 。其制备的抗原能与其他抗原同时使用，各自产生的免疫效 力 相互不受影响。，下面是猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用专利的具体信息内容。
1.猪肺炎支原体GZ株，保藏号为CCTCC NO:M2016212。
2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求1所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活抗原、活的全支原体抗原、或亚单位抗原，以及药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的猪肺炎支原体GZ株培养物为1～42代次的培养物；所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活抗原为灭活的全支原体抗原或其裂解抗原，所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的活的全支原体抗原为减毒的活的全支原体抗原，所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的亚单位抗原为抗原蛋白P97、P110、P46和P36。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活抗原的含量为灭活前≥107.0CCU/ml；优选地，所述猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活抗
7.0 10.0
原的含量为灭活前10 ～10 CCU/ml。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
优选地，所述佐剂包括Gel 01、ISA206、ISA760VG、卡波姆、氢氧化铝；
所述佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选10％V/V。
6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物还包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和白介素2。
7.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包含其他病原抗原，所述其他病原抗原包括猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪流感抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪细小病毒抗原、和/或猪乙型脑炎病毒抗原。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒抗原包括猪圆环病毒2型ZJ/H株抗原、猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株抗原、猪圆环病毒2型SD株抗原、猪圆环病毒2型ZJ/C株抗原、猪圆环病毒2型毒株PCV2SD株抗原、猪圆环病毒2型SH株抗原、或猪圆环病毒Ⅱ型PCV2/HZ09株抗原；
所述副猪嗜血杆菌抗原包括血清13型副猪嗜血杆菌GX0905株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JX1002株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌HN1009株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌YBH04株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌YBH05株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌YBH13株抗原、血清1型副猪嗜血杆菌LC株抗原、血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌FJMH10株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LZ-20100109株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LX-5株抗原、副猪嗜血杆菌血清4型JS株抗原、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原或其组合。
9.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒抗原为灭活的猪圆环病毒
5.0
抗原或亚单位抗原，所述灭活的猪圆环病毒含量为灭活前5×10 TCID50/ml，所述猪圆环病毒亚单位抗原含量为20μg/ml；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌抗原，所述灭活的副猪嗜血杆菌抗原含量为灭活前2×109CFU/ml；优选地，所述猪圆环病毒抗原为灭活的猪圆环病毒SH株抗原，所述灭活的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型抗原JS株抗原和灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原。
10.根据权利要求2～9任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪支原体肺炎和猪肺炎支原体感染相关疾病的药物中的应用。
猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of swine,MPS)又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性呼吸道传染病，以高度传染性、高发病率和低死亡率为特点，主要表现为咳嗽、呼吸困难，解剖可见肺组织肉变或大理石样病变，以肺部病变为主，尤以两肺心叶、中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为特征。其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率下降。猪肺炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛脱落、损坏，上皮细胞坏死，降低呼吸道粘膜的免疫功能，容易引起其他呼吸道病原的继发感染，导致其发病症状加重，死亡率增加。猪气喘病流行于世界各地，是世界范围内造成养猪经济损失最重要的疾病之一。
[0003] 据文献资料报道，世界各地分离的猪肺炎支原体均属于同一个血清型，但分离株之间的抗原性存在很大差异，Frey于1992年首次证实了猪肺炎支原体不同分离株之间抗原性的差异。猪肺炎支原体对培养基的要求极高，生长缓慢，这极大地增加了疫苗的生产成本。因此，从国内临床病例中分离出免疫原性较好、生长速度较快且活菌滴度较高的新的猪肺炎支原体菌株对于我国猪支原体肺炎的防治尤为重要。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种经分离鉴定为免疫原性更好的猪肺炎支原体毒株，所述毒株为猪肺炎支原体GZ(Mycoplasma hyopneumoniae strain GZ)，保藏号为：CCTCC NO：M2016212，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年4月20日。
[0005] 本发明的毒株不仅较现有的商业用的疫苗株具有更好的免疫原性，还具有良好的培养增殖滴度，培养容易，易于获得大量的抗原的优点。
[0006] 本发明涉及一种疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体毒株或其培养物的抗原和药学上可接受的载体。
[0007] 本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，能对猪肺炎支原体的感染进行完全的保护。
[0009] 本发明提供的疫苗株培养滴度高，免疫原性好，有效降低使用量，制备的疫苗组合物在临床上可有效控制猪群中肺炎支原体的感染。
具体实施方式
[0010] 以下，对本发明的实施方式进行说明。
[0011] 本发明涉及猪肺炎支原体GZ株，也称为猪肺炎支原体GZ，保藏号为CCTCC NO:M2016212。
[0012] 本发明的猪肺炎支原体GZ株具有较现有的商业用的疫苗株具有更好的免疫原性，且其易培养，适宜在产业上应用。本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活抗原、活的全支原体抗原、或亚单位抗原，以及药学上可接受的载体。
[0013] “培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
[0014] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0015] 作为本发明的一种实施方式，本发明猪肺炎支原体GZ株培养物为1～42代次的培养物。
[0016] 本发明所用术语“疫苗组合物”指含有猪肺炎支原体免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对肺炎支原体的免疫反应。所述疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。
[0017] 本发明所用的术语“灭活疫苗”，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的猪肺炎支原体GZ株可以通过灭活的方法制备成灭活疫苗。
[0018] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活抗原为灭活的全支原体抗原或其裂解抗原，所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的活的全支原体抗原为减毒的活的全支原体抗原，所述的猪肺炎支原体GZ株或其培养物的亚单位抗原为抗原蛋白P97、P110、P46和P36。
[0019] 作为本发明的一种实施方式，本发明猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活的全支原体抗原可以使用本领域公知的灭活方法制备。
[0020] 作为本发明的一种实施方式，本发明猪肺炎支原体GZ株或其培养物的裂解抗原可使用非离子表面活性剂处理，以获得、富集细胞膜上的抗原成分。
[0021] 作为本发明的一种实施方式，本发明猪肺炎支原体GZ株或其培养物的抗原蛋白P97、P110、P46和P36可以使用基因工程方法制备、也可以直接合成。
[0022] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体GZ株或其培养物的灭活抗原的含量为灭活前≥107.0CCU/ml。
[0023] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪肺炎支原7.0 10.0
体GZ株或其培养物的灭活抗原的含量为灭活前10 ～10 CCU/ml。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。
体GZ株或其培养物的灭活抗原的含量为灭活前10 ～10 CCU/ml。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。
[0024] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂；所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种。
[0025] 优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。
[0026] 优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其，特别是L121))。
[0027] 优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P。
[0028] 优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA。
[0029] 优选地，所述佐剂包括Gel 01、ISA206、ISA760VG、卡波姆、氢氧化铝。
[0030] 所述佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选10％V/V。
[0031] 已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成。
[0032] 尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical Application ofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
[0033] 特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
[0034] 本发明所用的佐剂还包括Gel 01(法国SEPPIC)、ISA206(法国SEPPIC)、ISA760VG(法国SEPPIC)的一种或几种的组合。
[0035] 优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel 01(法国SEPPIC)、氢氧化铝。
[0036] 最优选地，发明所述的疫苗佐剂为Gel 01(法国SEPPIC)。
[0037] 在最终疫苗组合物中，佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选10％V/V。
[0039] 优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和白介素2。本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物进一步包含其他病原抗原，所述其他病原抗原包括猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪流感抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪细小病毒抗原、和/或猪乙型脑炎病毒抗原。作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物还包括免疫量的选自下列抗原中的任意一种抗原：猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原。
[0040] 作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒抗原包括猪圆环病毒2型ZJ/H株抗原、猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株抗原、猪圆环病毒2型SD株抗原、猪圆环病毒2型ZJ/C株抗原、猪圆环病毒2型毒株PCV2SD株抗原、猪圆环病毒2型SH株抗原、或猪圆环病毒Ⅱ型PCV2/HZ09株抗原；所述副猪嗜血杆菌抗原包括血清13型副猪嗜血杆菌GX0905株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JX1002株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌HN1009株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌YBH04株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌YBH05株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌YBH13株抗原、血清1型副猪嗜血杆菌LC株抗原、血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌FJMH10株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LZ-20100109株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LX-5株抗原、副猪嗜血杆菌血清4型JS株抗原、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原或其组合。
[0041] 猪圆环病毒2型ZJ/H株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6391，公开于中国专利申请CN102787100A；猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.3064，公开于中国专利申请CN101549155A；猪圆环病毒2型SD株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5774，公开于中国专利申请CN102732486A；猪圆环病毒2型ZJ/C株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201251，公开于中国专利申请CN103285385A；猪圆环病毒2型毒株PCV2SD株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7707，公开于中国专利申请CN103421748A；猪圆环病毒2型SH株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.2389，公开于中国专利申请CN101240264A；猪圆环病毒Ⅱ型PCV2/HZ09株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201312，公开于中国专利申请CN103436498A。
[0042] 血清13型副猪嗜血杆菌GX0905株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014125，公开于中国专利申请CN104498384A；血清5型副猪嗜血杆菌JX1002株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014127，公开于中国专利申请CN104388340A；血清4型副猪嗜血杆菌HN1009株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014126，公开于中国专利申请CN104312964A；血清4型副猪嗜血杆菌YBH04株、血清5型副猪嗜血杆菌YBH05株、血清13型副猪嗜血杆菌YBH13株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号YBH04株为CGMCC NO.5479、YBH05株为CGMCC NO.5480、YBH13株为CGMCC NO.5501，公开于中国专利申请CN102499982A；血清1型副猪嗜血杆菌LC株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5257，公开于中国专利申请CN102399724A；血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014261，公开于中国专利申请CN104450556A；血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014260，公开于中国专利申请CN104450557A；血清13型副猪嗜血杆菌FJMH10株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014262，公开于中国专利申请CN104450555A；血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2013094，公开于中国专利申请CN103194413A；血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2013095，公开于中国专利申请CN103194412A；血清5型副猪嗜血杆菌LZ-20100109株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5802，公开于中国专利申请CN102851249A；血清5型副猪嗜血杆菌LX-5株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10230，公开于中国专利申请CN104611274A；副猪嗜血杆菌血清4型JS株、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号4型JS株为CCTCC NO.M2011172、5型ZJ株为CCTCC NO.M2011173、12型HeB株为CCTCC NO.M2011174，公开于中国专利申请CN102908615A。
[0043] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒抗原为灭活的猪圆环病毒抗原或亚单位抗原，所述灭活的猪圆环病毒含量为灭活前5×105.0TCID50/ml，所述猪圆环病毒亚单位抗原含量为20μg/ml；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌抗原，所述灭活的副猪嗜血杆菌抗原含量为灭活前2×109CFU/ml。
[0044] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪圆环病毒抗原为灭活的猪圆环病毒SH株抗原，所述灭活的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株抗原和灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，包含免疫量的猪肺炎支原体GZ株灭活的全支原体抗原、猪圆环病毒SH株灭活的全病毒抗原，所述灭活的猪肺炎支原体GZ株全支原体抗原含量为灭活前5×
108CCU/ml，所述灭活的猪圆环病毒含量为灭活前5×105.0TCID50/ml。
108CCU/ml，所述灭活的猪圆环病毒含量为灭活前5×105.0TCID50/ml。
[0045] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，包含免疫量的猪肺炎支原体GZ株灭活的全支原体抗原、猪圆环病毒亚单位抗原，所述灭活的猪肺炎支原体GZ株全支原体抗原含量为灭活前5×108CCU/ml，所述猪圆环病毒亚单位抗原含量为20μg/ml。
[0046] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，包含免疫量的猪肺炎支原体GZ株灭活的全支原体抗原、猪圆环病毒SH株灭活的全病毒抗原、副猪嗜血杆菌血清4型JS株灭活的全菌抗原、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株灭活的全菌抗原，所述灭活的猪肺炎支原体GZ株全支原体抗原含量为灭活前5×108CCU/ml，所述灭活的猪圆环病毒含量为灭活前5×105.0TCID50/ml，所述灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株抗原含量为灭活前2×109CFU/ml，所述灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原含量为灭活前2×109CFU/ml。
[0047] 作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，包含免疫量的猪肺炎支原体GZ株灭活的全支原体抗原、猪圆环病毒亚单位抗原、副猪嗜血杆菌血清4型JS株灭活的全菌抗原、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株灭活的全菌抗原，所述灭活的猪肺炎支原体GZ株全支原体抗原含量为灭活前5×108CCU/ml，所述猪圆环病毒亚单位抗原含量为20μg/ml，所述灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株抗原含量为灭活前2×109CFU/ml，所述灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原含量为灭活前2×109CFU/ml。
[0048] 本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪支原体肺炎和猪肺炎支原体感染相关疾病的药物中的应用。术语“预防”指通过其与猪肺炎支原体相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与猪肺炎支原体相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
[0049] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0050] 实施例1猪肺炎支原体GZ株的分离鉴定
[0051] 1.病料来源
[0052] 病料来源于2016年从河南省某猪场采集的疑似猪支原体肺炎病变肺脏，共20份。
[0053] 2.病料多重PCR鉴定
[0054] 2.1引物设计与合成
[0055] 多重PCR(猪肺炎支原体、猪絮状支原体及猪鼻支原体)引物参考文献(T.stakenbory等.A multiplex PCR to Identify Porcine Mycoplasma Present in Broth Cultures)进行合成：
[0056] mhp-f：5’-TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3’；
[0057] mhr-f：5’-GGGAAGAAAAAAATTAGGTAGGG-3’；
[0058] mfl-f：5’-CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3’；
[0059] m-r：5’-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3’；
[0060] 预计猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体扩增片段长度分别为1000bp、1129bp、754bp。
[0061] 2.2DNA模板提取及PCR鉴定
[0062] 无菌取病健交界处肺组织，用动物组织基因组提取试剂盒提取DNA模板，按照以下反应体系进行PCR扩增：模板DNA 2μl，d NTP 10nmol/L，10×buffer 5.0μl，上游引物均为8pmol，下游引物为12pmol，Ex Tag聚合酶0.5μl，加入双蒸水至50μl；PCR反应条件为：95℃
5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，扩增30个循环；72℃延伸10分钟；2-8℃保存。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果筛选出5份猪肺炎支原体阳性且无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的病肺组织。
5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，扩增30个循环；72℃延伸10分钟；2-8℃保存。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果筛选出5份猪肺炎支原体阳性且无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的病肺组织。
[0063] 3.菌株的分离与培养
[0064] 取PCR鉴定为猪肺炎支原体阳性且无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的肺脏，在超净台内用无菌手术剪刀剪取发病部位边缘组织，放入无菌平皿，将病肺组织剪成1-2mm碎块，接种Friis肉汤，37℃培养，每日观察培养液的pH值变化。培养液变色时，取第一代经0.45μm过滤器过滤的培养物0.5ml接种到1.5ml含青霉素2000IU/ml的Friis肉汤培养基中，
37℃继续培养，培养基变黄后直接取培养物进行移植传代，如培养物变色，进行涂片，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检。如革兰氏染色未发现细菌，同时瑞氏染色发现支原体样菌体时，取0.2m1培养物涂布于Friis平板固体培养基表面，置37℃，5％CO2条件下培养，每日观察是否有支原体样菌落。取支原体样单个菌落接种于Friis肉汤，培养基颜色变黄后取
0.2m1培养物涂布于Friis平板固体培养基表面置37℃，5％CO2条件下进行纯化培养，如此进行纯化培养2次。将最后一次纯化培养生长的支原体样菌落接种Friis液体培养基，待培养基颜色变黄后保存菌种。
37℃继续培养，培养基变黄后直接取培养物进行移植传代，如培养物变色，进行涂片，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检。如革兰氏染色未发现细菌，同时瑞氏染色发现支原体样菌体时，取0.2m1培养物涂布于Friis平板固体培养基表面，置37℃，5％CO2条件下培养，每日观察是否有支原体样菌落。取支原体样单个菌落接种于Friis肉汤，培养基颜色变黄后取
0.2m1培养物涂布于Friis平板固体培养基表面置37℃，5％CO2条件下进行纯化培养，如此进行纯化培养2次。将最后一次纯化培养生长的支原体样菌落接种Friis液体培养基，待培养基颜色变黄后保存菌种。
[0065] 4.猪肺炎支原体GZ株生物学特性
[0066] 4.1培养特性
[0067] GZ株在Friis液体培养基(pH值7.4～7.6)中生长良好，37℃培养3～5天，培养物p H下降至6.8～7.0，呈现轻度均一浑浊。培养物中活菌滴度可达到1010～1011CCU/ml(CCU为颜色变化单位)。接种固体培养基，37℃培养3～5日后，菌落生长入培养基内部，呈典型油煎蛋状，与支原体菌落形态相符。
[0068] 4.2形态和生化特性
[0069] 本菌为革兰氏染色阴性，菌液涂片姬姆萨染色后，油镜观察呈环状、球状、丝状、点状、杆状或两极状等，无细胞壁。
[0070] 生化试验参考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49～50，126～129，371～373.)。主要进行洋地黄皂甙敏感性试验、尿素酶试验、葡萄糖分解试验、精氨酸水解试验、三苯基氯化四氮唑(TTC)还原试验、七叶甙水解试验、甘露醇分解试验、薄膜和斑点形成试验，结果见表1。
[0071] 表1 Mhp GZ株生化试验结果
[0072]
[0073] 注:+阳性，-阴性；洋地黄皂苷敏感试验出现1mm以上抑制带者为支原体；TTC还原试验猪肺炎支原体阴性，猪鼻支原体阳性；(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49～50，126～129，371～373.)。
[0074] 4.3血清学特性
[0075] Friis平板接种0.1ml对数生长期的猪肺炎支原体培养物，将未稀释的兔抗猪肺炎支原体血清25μl吸附于灭菌的6mm滤纸片，将该滤纸片贴附于平板表面，培养至菌落可见。正常兔血清处理的纸片作为阴性对照。培养观察圆纸片周围有菌落抑制环的产生。抑制宽度达2.42mm，可判为猪肺炎支原体阳性。
[0076] 5.分离菌株的致病性
[0077] 将分离菌株培养物经气管注射1～2周龄健康易感猪3头，每头5ml(108CCU/ml)。另设3头条件相同的对照猪，各气管注射培养基5ml，作为空白对照。试验猪、对照猪隔离饲养。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察28日，每日测体温。攻毒注射28日后剖检，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。试验组与对照组进行肺病变指数差异分析。对试验猪及对照猪进行猪肺炎支原体的分离，并对分离株进行PCR鉴定。
[0078] 临床症状观察结果为攻毒10日后试验猪均相继出现咳嗽、气喘等症状，对照猪未出现该症状；攻毒后28日剖检可见试验猪肺部均有不同程度的病变，对照猪未见异常。临床症状观察及肺部病变结果见表2。
[0079] 对试验组3头猪进行猪肺炎支原体分离，对其变色液体培养物扩增猪肺炎支原体特异性P46基因进行PCR鉴定，结果扩增出1200bp的目的条带，证明分离病原为猪肺炎支原体。
[0080] 表2 Mhp GZ株对仔猪的致病力试验结果
[0081]
[0082] 注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)。
[0083] 从具有猪支原体肺炎典型病变、经猪支原体多重PCR检测为猪肺炎支原体阳性且无猪鼻支原体和猪絮状支原体污染的病肺中分离到了疑似猪肺炎支原体的微生物，经各项鉴定符合猪肺炎支原体的特性，生长抑制试验、PCR鉴定及测序结果表明该微生物属于猪肺炎支原体，命名为猪肺炎支原体GZ株。猪肺炎支原体GZ株在Friis培养基中培养含量可达1010～1011CCU，对健康易感猪具有较强的毒力，可致其咳嗽、气喘、呼吸困难等支原体肺炎典型的临床症状及肺部病变。
[0084] 实施例2猪支原体肺炎GZ株灭活疫苗的制备
[0085] 1.生产用菌种的制备
[0086] 猪肺炎支原体GZ株冻干菌种启封后，按10％接种量接种液体培养基，37℃培养3～5日，待pH值降至6.8～7.0时收获，经纯粹检验，作为一级生产种子。取一级种子按5％接种量接种液体养基，37℃培养3～5日，待pH值降至6.8～7.0时收获，经纯粹检合格，作为二级生产种子。
[0087] 液体培养基配方:牛心浸出液(BD公司)300ml，双蒸水360m1，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟，再加入下列过滤除菌成分：Hank's平衡盐溶液(10×)40m1,0.25(W/V)酚红10m1,马血清200m1，5％(W/V)水解乳蛋白100m1，25％W/V酵母浸出液20m1，10000IU/ml青霉素10ml。
[0088] 2.菌液的培养制备
[0089] 将鉴定合格的猪肺炎支原体GZ株二级种子分别按5％(v/v)接种于液体培养基，37℃培养3～5日，待pH值降至6.8～7.0时收获。
[0090] 3.猪肺炎支原体活菌计数测定
[0091] 将含酚红指示剂的液体培养基分装至10ml西林瓶中，设两排，每排13个，1.8ml/瓶，取0.2ml待检培养物接种至第1个西林瓶，混匀后依次10倍稀释，直至稀释至第12个西林瓶，第13瓶为空白对照，置37℃培养，记录21天为止产生颜色变化的最高瓶数，以判定CCU滴度，取两排结果的平均值，结果活菌滴度为1011CCU/ml。
[0092] 4.菌液的灭活
[0093] 收获的菌液经纯粹检验、活菌计数后加入终浓度为0.01％的硫柳汞，混合均匀后置于2～8℃灭活12小时，期间振摇3次。
[0094] 5.灭活检验及无菌检验
[0095] 灭活检验：取1ml灭活菌液接种50ml液体培养基，37℃培养，于第5、10日各移植一次，最后一次移植后继续培养观察11日，培养基pH值不降低，培养基颜色未发生变化。
[0096] 无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无杂菌生长。
[0097] 6.疫苗配制
[0098] 取检验合格的猪肺炎支原体GZ株灭活抗原液与Gel01佐剂按照90∶10(V/V)的比例混合，用pH为7.2的无菌PBS补充体积后以300rpm/min搅拌30min，分别配制成抗原含量不同的3种灭活疫苗，疫苗的具体配方及含量见表3。
[0099] 表3猪支原体肺炎灭活疫苗配方及含量
[0100]
[0101] 实施例3猪支原体肺炎GZ株灭活疫苗的检验
[0102] 1.性状检验
[0103] 疫苗为淡黄色水溶液，久置后会出现少量沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
[0104] 2.无菌检验
[0105] 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0106] 3.安全检验
[0107] 3.1BALB/c小鼠安全性检验
[0108] 16～18g BALB/c小鼠30只，分为3组，10只/组，第1组、第2组、第3组分别每只皮下注射疫苗1、疫苗2、疫苗3各0.5ml，免疫后观察14日，观察小鼠是否健活，包括采食、饮水、精神、行为状况等。
[0109] 结果显示3种疫苗分别免疫的3组BALB/c小鼠，精神状态良好，采食及饮水正常，无不良反应，无死亡情况。证明本发明猪支原体肺炎灭活疫苗对小鼠是安全的。
[0110] 3.2仔猪的安全性检验
[0111] 选取14～21日龄猪肺炎支原体阴性的健康仔猪15头，分为3组，5头/组，第1组、第2组、第3组分别每头仔猪颈部肌肉注射疫苗1、疫苗2、疫苗3 4ml，免疫后所有仔猪连续观察14日，包括精神、采食、饮水、行为状况等有无异常，同时观察疫苗注射部位有无红肿等异常，14日后剖检注射部位取样制作组织切片，观察有无炎症、疫苗残留、肉芽肿等。结果显示疫苗免疫仔猪观察14日均未见不良反应，精神状态良好，采食、饮水正常，无死亡情况。剖杀后所有脏器未见异常变化，疫苗注射部位剖检未见疫苗残留，组织切片观察未见炎症、肉芽肿、坏死等异常情况。证明本发明不同抗原含量的猪支原体肺炎灭活疫苗对仔猪具有较好的安全性。
[0112] 4.效力检验
[0113] 4.1仔猪的效力检验
[0114] 选取14～21日龄猪肺炎支原体ELISA抗体阴性、PRRSV抗原阴性的健康易感猪20头，随机分为4组。第1组各颈部肌肉注射疫苗1(1ml)，第2组各颈部肌肉注射疫苗2(1ml)，第3组各颈部肌肉注射疫苗2(1ml)，第4组不免疫作为攻毒对照，同条件下隔离饲养。免后35日，对所有猪只气管注射CVCC354株组织强毒(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)，5ml/头(100MID)，观察28日，剖杀取肺，按28分法对试验猪的气喘病肺炎病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。
[0115] 肺炎病变减少率＝(攻毒对照猪肺炎病变平均分-免疫猪肺炎病变平均分)/攻毒对照猪肺炎病变平均分×100％
[0116] 攻毒保护结果见表4。结果表明，疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与对照组平均肺病变存在极显著差异，表明猪肺炎支原体GZ株具有良好的免疫原性。
[0117] 表4仔猪效检攻毒保护结果
[0118]组别 疫苗 动物数量 平均肺病变指数±标准差 肺炎病变减少率
第1组 疫苗1 5 2.8±1.48Bb 79％
Bb
第2组 疫苗2 5 1.8±1.30 84.2％
第3组 疫苗3 5 0.8±0.84Bc 92.9％
第4组 攻毒对照 5 11.4±5.12Aa /
第1组 疫苗1 5 2.8±1.48Bb 79％
Bb
第2组 疫苗2 5 1.8±1.30 84.2％
第3组 疫苗3 5 0.8±0.84Bc 92.9％
第4组 攻毒对照 5 11.4±5.12Aa /
[0119] 注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
[0120] 实施例4猪支原体肺炎灭活疫苗(GZ株)与进口苗的效力比较
[0121] 取实施例2中制备的疫苗1免疫14～21日龄健康仔猪5头，1ml/头，猪支原体肺炎进口灭活苗疫苗4(P株，7.5×108CCU/头份)免疫14～21日龄健康仔猪5头，2ml/头份，同时设置5头猪不免疫作为攻毒对照组，同条件下隔离饲养。免后35日，对所有猪只气管注射CVCC354株组织强毒(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)，5ml/头(100MID)，观察28日，剖杀取肺，按28分法对试验猪的气喘病肺炎病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。
[0122] 肺炎病变减少率＝(攻毒对照猪肺炎病变平均分-免疫猪肺炎病变平均分)/攻毒对照猪肺炎病变平均分×100％
[0123] 攻毒保护结果见表5。结果表明，疫苗1、进口苗免疫组攻毒对照组相比，免疫组与对照组平均肺病变存在极显著差异，疫苗1与进口苗免疫组保护效果相当，略高于进口苗。然而，本发明达到上述效果所用的抗原含量远远低于对照疫苗组，进一步说明本发明的疫苗株具有良好的免疫原性。
[0124] 表5仔猪免疫保护结果
[0125]
[0126] 实施例5猪圆环病毒2型抗原的制备
[0127] 1.生产用菌(毒)种的制备
[0128] 将毒种PCV2SH株用MEM液体培养基(用购自美国Invitrogen公司的MEM干粉培养基按说明书配制)作1:9稀释，然后按细胞培养液体积的5％接种于PK15(ATCC，保藏号为CCL-33)单层细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液(MEM液体培养基中添加4％犊牛血清和
2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，37℃培养4日，冻融2～3次，收获病毒，病毒滴度为
106.5TCID50/ml。
2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，37℃培养4日，冻融2～3次，收获病毒，病毒滴度为
106.5TCID50/ml。
[0129] 2.病毒液的培养与制备
[0130] 用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液(MEM液体培养基中添加6％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，将毒种液体积比按0.1～0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转培养(10～12转/小时)。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存。
[0131] 3.病毒液的处理与浓缩
[0132] 将上述病毒液用中空纤维滤柱(Millipore公司孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片后用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作5倍(体积比)浓缩。
[0133] 4.猪圆环病毒SH株病毒液的含量测定
[0134] 将病毒液用MEM液体培养基按本领域技术人员通用方法作10倍系列稀释，取10-5、-6 -710 、10 3个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO2的温箱中继续培养24小时，换细胞维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50，结果为5×106.0TCID50/ml。
[0135] 5.病毒液的灭活及灭活效果测定
[0136] 将检验合格的病毒液加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活病毒液置2～8℃保存。
[0137] 取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，应无细胞病变(CPE)，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用间接免疫荧光法(IFA)检测，无绿色PCV2阳性细胞产生，说明灭活彻底。
[0138] 实施例6猪圆环病毒2型亚单位抗原的制备
[0139] 按照专利CN103173470A制备PCV2蛋白病毒样颗粒抗原，含量为1.3mg/ml。
[0140] 实施例7副猪嗜血杆菌抗原的制备
[0141] 1.生产用菌(毒)种的制备
[0142] 将副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株划线接种于含5％新生牛血清和0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美国BBI公司)的胰蛋白大豆琼脂(TSA，购自美国BD公司)平板(简称TSA/NAD平板)，37℃培养24～48小时，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级种子接入含5％新生牛血清和0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美国BBI公司)的胰蛋白大豆肉汤(TSA，购自美国BD公司)(简称TSB/NAD液体培养基)，
37℃摇床180rpm振荡培养12小时，
37℃摇床180rpm振荡培养12小时，
[0143] 同时取样进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合副猪嗜血杆菌的形态特征，无任何杂菌生长，作为二级种子。
[0144] 2.副猪嗜血杆菌(4型JS株与5型ZJ株)菌液的制备
[0145] 将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型JS株与副猪嗜血杆菌5型ZJ株的二级种子分别按1:100(v/v)接种于TSB/NAD液体培养基，置37℃摇床200rpm培养。培养至12～16小时，收获。
[0146] 3.菌液的处理
[0147] 将副猪嗜血杆菌4型ZJ株与5型JS株分别以连续离心机(10000rpm/min)离心后再以PBS(pH值为7.2～7.4)复溶至离心前的体积，再用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300KDa)作5倍(体积比)浓缩。
[0148] 4.副猪嗜血杆菌4型ZJ株与5型JS株菌液活菌数测定
[0149] 菌液取样，按本领域技术人员熟知的方法作10倍系列稀释，取10-6、10-7 2个稀释度接种于前述TSA/NAD固体培养基，每个平板接种0.1ml，37℃培养24小时后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数，4型ZJ株与5型JS株菌液计数结果均为5×109CFU/ml。
[0150] 5.菌液的灭活及灭活检验
[0151] 将上述制备的两种不同血清型的菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％(V/V)，37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2～8℃保存。
[0152] 制备6个平皿的TSA/NAD固体培养基，无菌操作将灭活的菌液在其中3个TSA/NAD固体培养基平皿上滴加1滴，用接种环划线，置37℃普通温箱培养，同时设立3个不接菌的TSA/NAD固体培养基作对照。24小时后观察，平皿无任何细菌生长，同时对照未接菌的2个培养基也无细菌生长，继续观察结果至48小时6个平皿中都无细菌生长，说明灭活彻底。
[0153] 实施例8猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪支原体肺炎抗原疫苗组合物的制备
[0154] 取实施例2、4、5、6制备的猪肺炎支原体抗原、PCV2抗原、PCV2亚单位抗原以及副猪嗜血杆菌抗原，将四种抗原液根据联苗最终的抗原含量制备成混合抗原液或直接制备成抗原液，然后将抗原液与Gel 01佐剂(法国赛比克SEPPIC公司生产)按90:10(V/V)混合，用pH为7.2的PBS液补充体积以500rpm/min搅拌30min，分别配制成5种不同的灭活疫苗，疫苗的具体配方及含量见表6。
[0155] 表6疫苗组合物配方及含量
[0156]
[0157]
[0158] 对制备的5种疫苗分别进行性状、无菌及安全检验均合格，可用于后续试验。
[0159] 实施例9猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原不同的疫苗组合物对猪的免疫效果试验
[0160] 1.试验用疫苗免疫仔猪
[0161] 选14～21龄仔猪100头，共20组，5头/组。免疫组15组，其中，第8组、第9组免疫疫苗5，第10组、第11组免疫疫苗6，第12组、第13组和第14组免疫疫苗7，第15组、第16组、第17组和第18组免疫疫苗8，第19组、第20组、第21组和第22组免疫疫苗9；对照组5组，其中，第23组、第24组、第25组和第26组为攻毒对照组，第27组为正常对照组。具体免疫分组见表7。
[0162] 表7免疫分组
[0163]
[0164]
[0165] 2.仔猪免疫后攻毒
[0166] 2.1PCV2攻毒
[0167] 在免疫后35d，取免疫组第8组、第10组、第15组和第19组4组共20头，第23组对照组仔猪1组5头，免疫组和对照组仔猪各用PCV2SH株(含106.0TCID50/ml)滴鼻1ml/头、肌肉注射2ml/头，攻毒后第4、7日，分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。
[0168] 2.2副猪嗜血杆菌4、5型攻毒
[0169] 在免疫后35d，取免疫组第12组、第16组和第20组3组共15头、第24组对照组仔猪1组5头，用4型菌株进行攻毒，腹腔注射3ml菌液，攻毒剂量为4型9.0×109CFU/头、5型6.0×109CFU/头，攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察；取免疫组第13组、第17组和第21组3组共15头、第25组对照组仔猪1组5头，用5型菌株进行攻毒，腹腔注射
3ml菌液，攻毒剂量为5型6.0×109CFU/头，攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。
3ml菌液，攻毒剂量为5型6.0×109CFU/头，攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。
[0170] 2.3猪肺炎支原体攻毒
[0171] 在免疫后35d，取免疫组第9组、第11组、第14组、第18组和第22组5组共25头、第26组对照组仔猪5头，进行猪肺炎支原体攻毒试验，免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察28天，剖杀取肺，按28分法对试验猪的气喘病肺炎病变进行评分，按下列公式计算肺炎病变减少率。
[0172] 肺炎病变减少率＝(攻毒对照猪肺炎病变平均分-免疫猪肺炎病变平均分)/攻毒对照猪肺炎病变平均分×100％
[0173] 3.攻毒结果
[0174] 3.1PCV2攻毒
[0175] PCV2攻毒后，体温变化情况见表8，疫苗5、疫苗6、疫苗8和疫苗9免疫组仔猪仅有个别猪只出现一过性体温升高现象，体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症状；对照组猪只攻毒后所有猪只体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。
[0176] 攻毒后发病及保护情况见表9、10。疫苗5、疫苗6、疫苗8和疫苗9免疫仔猪攻毒后无明显临床症状，未观察到特异性病理变化，抗原PCR检测均为阴性，保护效果达5/5；而对照组仔猪全部发病，临床症状，病理变化明显，病原PCR检测均为阳性。至攻毒观察结束，疫苗5、疫苗6、疫苗8和疫苗9免疫仔猪平均日增重无显著差异，与对照组相比，疫苗5、疫苗6、疫苗8和疫苗9免疫仔猪平均日增重均极显著高于对照组。表明疫苗疫苗5、疫苗6、疫苗8和疫苗9免疫后对PCV2的攻毒保护效果良好。
[0177] 表8 PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较
[0178]
[0179] 表9 PCV2攻毒后各组试验动物发病判定结果
[0180]
[0181] PCV2攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。
[0182] A：临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；
[0183] B：病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。
[0184] 组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；
[0185] C：病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。
[0186] 表10免疫仔猪PCV2攻毒后保护情况
[0187]组别 仔猪数量 攻毒保护率 平均日增重(kg)
第8组 5 5/5 0.0251Bb
第10组 5 5/5 0.0255Bb
第15组 5 5/5 0.0249Bb
Bb
第19组 5 5/5 0.0253
第23组 5 0/5 0.0149Aa
第8组 5 5/5 0.0251Bb
第10组 5 5/5 0.0255Bb
第15组 5 5/5 0.0249Bb
Bb
第19组 5 5/5 0.0253
第23组 5 0/5 0.0149Aa
[0188] 注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
[0189] 3.2副猪嗜血杆菌攻毒
[0190] 副猪嗜血杆菌4、5型菌株攻毒后，试验结果如表11。结果为疫苗3、疫苗4及疫苗5对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护分别为4/5(80％)～5/5(100％)。
[0191] 表11副猪嗜血杆菌攻毒后免疫仔猪保护情况
[0192]组别 动物数量(头) 4型JS株攻毒保护率 5型ZJ株攻毒保护率
第12组 5 5/5 /
第13组 5 / 4/5
第16组 5 5/5 /
第17组 5 / 5/5
第20组 5 5/5 /
第21组 5 / 5/5
第24组 5 0/5 /
第25组 5 / 0/5
第12组 5 5/5 /
第13组 5 / 4/5
第16组 5 5/5 /
第17组 5 / 5/5
第20组 5 5/5 /
第21组 5 / 5/5
第24组 5 0/5 /
第25组 5 / 0/5
[0193] 注：副猪嗜血杆菌病发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5日)、精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱等临床症状。对濒死猪剖检，可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎)、关节炎和脑膜炎等病变，各浆膜面(关节囊、心包膜、胸膜和腹膜)出现浆液性或纤维素性渗出物。
[0194] 3.3猪肺炎支原体攻毒
[0195] 猪肺炎支原体攻毒保护结果见表12。结果表明，各疫苗组合物免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与对照组平均肺病变存在极显著差异。
[0196] 表12仔猪效检攻毒保护结果
[0197]组别 动物数量 平均肺病变指数±标准差 肺炎病变减少率
第9组 5 2.4±1.14Bb 85.6％
第11组 5 2.0±0.71Bb 85.0％
Bb
第14组 5 2.2±0.84 84.3％
第18组 5 1.8±1.30Bb 84.7％
第22组 5 1.6±1.14Bb 86.4％
第26组 5 11.8±3.96Aa /
第9组 5 2.4±1.14Bb 85.6％
第11组 5 2.0±0.71Bb 85.0％
Bb
第14组 5 2.2±0.84 84.3％
第18组 5 1.8±1.30Bb 84.7％
第22组 5 1.6±1.14Bb 86.4％
第26组 5 11.8±3.96Aa /
[0198] 注：差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)
[0199] 综上，从以上不同疫苗组合物对PCV2、副猪嗜血杆菌4型JS株及5型ZJ株、猪肺炎支原体的攻毒保护结果来看，各疫苗组合物均能达到较好的保护效果，说明本发明中新分离的猪肺炎支原体GZ株与PCV2抗原、PCV2亚单位抗原、副猪嗜血杆菌4型JS株及5型ZJ株抗原制备成不同的疫苗组合物时仍能达到或超过单苗的免疫保护效果，不受其他抗原的影响。
[0200] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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