抗病毒免疫的方法和组合物
阅读：193发布：2021-06-09
专利汇可以提供抗病毒免疫的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了用作抗病毒 疫苗 的包含部分糖基化的病毒糖蛋白的免疫原性组合物。用单糖基化、 二糖 基化或三糖基化病毒表面糖蛋白和多肽配制的疫苗提供了有效且广泛的抗病毒保护，即使是跨越菌株。公开了包含单糖基化的血凝素多肽的药物组合物和由其产生的疫苗以及使用它们来 预防 或 治疗 病毒感染 的方法。公开了用于流感病毒HA、NA和M2、RSV蛋白F、G和SH、登革病毒糖蛋白M或E、丙型 肝炎 病毒糖蛋白E1或E2以及HIV糖蛋白gp120和gp41的方法和组合物。，下面是抗病毒免疫的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.用于引发对病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包含：
来自所述病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的抗原糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一个糖基化位点，并且其中所述抗原糖蛋白在一个或多个糖基化位点被部分糖基化。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病原体是病毒，而且其中所述部分糖基化的抗原是病毒、病毒肽、蛋白、多肽或来源于病毒的以上的片段。
3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、衣原体、腺病毒科、哺乳动物腺病毒属、禽腺病毒属、疱疹病毒科、单纯疱疹病毒
1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5、单纯疱疹病毒6、光滑病毒科、轻小病毒属、肠杆菌噬菌体MS2、allolevirus、痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软疣痘病毒属、昆虫痘病毒亚科、乳头多瘤空病毒科、多瘤病毒属、乳头多瘤空病毒属、副粘病毒科、副粘病毒属、副流感病毒1、麻疹病毒属、麻疹病毒、腮腺炎病毒属、腮腺炎病毒、肺病毒亚科、肺病毒属、偏肺病毒属、禽肺病毒属、人类偏肺病毒属、小核糖核酸病毒科、肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、人类甲型肝炎病毒、心病毒属、andapthovirus、呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、质型多角体病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属、水稻病毒属、逆转录病毒科、B型哺乳动物逆转录病毒属、C型哺乳动物逆转录病毒属、C型鸟逆转录病毒属、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV转录病毒属、慢病毒属、人类免疫缺陷病毒1、人类免疫缺陷病毒2、泡沫病毒属、黄病毒属科、丙型肝炎病毒、黄病毒属、登革病毒、肝DNA病毒科、乙型肝炎病毒、披膜病毒科、甲病毒属辛德比斯病毒、风疹病毒属、风疹病毒、弹状病毒科、水疱性病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属、质型弹状病毒属、核型弹状病毒属、沙粒病毒科、沙粒病毒属、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒、拉沙病毒、冠状病毒科、冠状病毒属和凸隆病毒属。
4.如权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述病毒肽、蛋白、多肽或其片段是选自以下的表面糖蛋白：流感病毒神经氨酸酶，流感病毒血凝素，流感病毒M2蛋白，人类呼吸道合胞体病毒(RSV)病毒蛋白，RSV F糖蛋白，RSV G糖蛋白，单纯疱疹病毒(HSV)病毒蛋白，单纯疱疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE，衣原体MOMP和PorB抗原，登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素，单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰质炎病毒I VP1，HIV 1的包膜糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，链球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，伪狂犬病病毒g50(gpD)，伪狂犬病病毒II(gpB)，伪狂犬病病毒III(gpC)，伪狂犬病病毒糖蛋白H，伪狂犬病病毒糖蛋白E，传染性胃肠炎糖蛋白195，传染性胃肠炎基质蛋白，猪轮状病毒属糖蛋白38，猪细小病毒衣壳蛋白，猪密螺旋体痢疾保护性抗原，牛病毒性腹泻糖蛋白55，新堡病病毒血凝素-神经氨酸酶，猪流感血凝素，猪流感神经氨酸酶，口蹄疫病毒，猪霍乱病毒，猪流感病毒，非洲猪瘟病毒，猪肺炎支原体，传染性牛鼻气管炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，传染性喉气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，拉克罗斯病毒的糖蛋白，新生犊牛腹泻病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，庞塔托鲁病毒，鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，马流感病毒或马疱疹病毒的抗原，包括甲型马流感病毒/阿拉斯加株91神经氨酸酶、甲型马流感病毒/迈阿密株63神经氨酸酶、甲型马流感病毒/肯塔基株81神经氨酸酶、马疱疹病毒1型糖蛋白B和马疱疹病毒1型糖蛋白D，牛呼吸道合胞体病毒或牛副流感病毒的抗原，牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSV G)，牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白(BRSV F)，牛呼吸道合胞体病毒核壳体蛋白(BRSVN)，牛副流感病毒3型融合蛋白，牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶，牛病毒腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53，登革病毒糖蛋白E和人类丙型肝炎病毒的糖蛋白E1或E2。
5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中来自病原体的所述部分糖基化的糖蛋白是通过使用化学或酶促方法中的一种或多种进行部分去糖基化而产生的。
6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原在O-糖基化位点或N-糖基化位点被部分糖基化。
7.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原包含N-糖基化位点，所述N-糖基化位点包含天冬酰胺-Xaa-丝氨酸和天冬酰胺-Xaa-苏氨酸的氨基酸序列，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。
8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2蛋白，或以上的免疫原性片段。
9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或甘露糖糖基化的流感病毒血凝素。
10.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是选自部分糖基化的流感病毒HI、H3和H5的单糖基化的血凝素。
11.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)单糖基化的流感病毒血凝素。
12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有Sa区的N-糖基化位点。
13.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含位于第177位的天冬酰胺残基处的部分糖基化。
14.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素对于HA-受体结合展现出降低的特异性和提高的亲和力。
15.如权利要求14所述的免疫原性组合物，其中所述单GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素结合唾液酸化的HA-受体。
16.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)的多肽。
17.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)在第39位、第127位、第170位、第181位、第302位、第495位和第500位中的一个或多个位置的天冬酰胺残基处糖基化。
18.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含选自季节性NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)序列(SEQ ID NO：6)、共有H1-A(SEQ ID NO：8)和共有H1-C(SEQ ID NO：10)序列的H1多肽序列。
19.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素(HA)序列选自共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)、NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗)序列(SEQ ID NO：6)、共有H1-A(SEQ ID NO：8)和共有H1-C(SEQ ID NO：10)序列，
其中所述HA序列经修饰从而能在合适的真核细胞中表达。
20.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性H1(布里斯班株)多肽。
21.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSV F(融合)、G(附着)或以上蛋白的免疫原性片段。
22.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的RSV G蛋白序列(SEQ ID NO：12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
23.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。
24.如权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQ ID NO：13)是在表7所示的N-糖基化位点N67和N153中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
25.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。
26.如权利要求25所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1(SEQ ID NO：14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
27.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。
28.如权利要求27所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120(SEQ ID NO：15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
29.疫苗，包含：
(a)免疫原性多肽，所述免疫原性多肽包含在一个或多个糖基化位点部分糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒表面糖蛋白或其免疫活性片段。
(b)任选地，佐剂，其中所述疫苗能诱发抗病毒的免疫应答。
30.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2。
31.如权利要求30所述的疫苗，其中所述流感病毒选自禽流感病毒、动物流感病毒和人类流感病毒。
32.如权利要求31所述的疫苗，其中所述禽流感病毒是H5N1。
33.如权利要求31所述的疫苗，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
34.如权利要求30所述的疫苗，其中一旦将单糖基化的流感HA多肽引入个体，所述多肽诱导所述个体产生与呼吸病毒结合的抗体。
35.如权利要求34所述的疫苗，其中所述呼吸病毒是禽、动物和/或人类流感病毒或者RSV。
36.如权利要求34所述的疫苗，其中所述部分糖基化的病毒抗原在O-糖基化或N-糖基化位点被部分糖基化。
37.如权利要求34所述的疫苗，其中所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化的流感病毒HA多肽，所述单糖基化的流感病毒HA多肽包含具有天冬酰胺-Xaa-丝氨酸和天冬酰胺-Xaa-苏氨酸的氨基酸序列的部分糖基化的N-糖基化位点，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。
38.如权利要求34所述的疫苗，其中所述N-糖基化位点包含单GlcNAc糖基化的流感病毒HA多肽，并且对于HA-受体结合展现出降低的特异性和提高的亲和力。
39.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感HA多肽包含含有Sa区的N-糖基化位点。
40.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒HA多肽包含位于第177位的天冬酰胺残基处的N-糖基化位点。
41.如权利要求38所述的疫苗，其中所述单GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素与唾液酸化的HA-受体结合。
42.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)的多肽。
43.如权利要求42所述的疫苗，其中所述单糖基化的共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)在第39位、第170位、第181位、第302位和第500位中的一个或多个位置的天冬酰胺残基处糖基化。
44.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含选自NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)序列(SEQ ID NO：6)、共有H1-A(SEQ ID NO：
8)和共有H1-C(SEQ ID NO：10)序列的H1多肽序列。
45.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性H1(布里斯班株)HA多肽，而且其中一旦将所述单糖基化的HA多肽引入个体，所述H1(布里斯班株)HA多肽或诱导所述个体产生能中和NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)、WSN(H1N1)1933或A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8菌株流感病毒的抗体。
46.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含
NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)多肽，而且其中一旦将单糖基化的HA多肽引入个体，所述NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)多肽诱导所述个体产生能中和季节性H1(布里斯班株)HA、WSN(H1N1)1933或A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8菌株流感病毒的抗体。
47.如权利要求34所述的疫苗，其中所述个体是哺乳动物、禽、动物、猪、马或人。
48.如权利要求34所述的疫苗，其中所述疫苗展现出抗一种或多种流感病毒菌株的显著的抗病毒活性。
49.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSV F(融合)、G(附着)或以上蛋白的免疫原性片段。
50.如权利要求49所述的疫苗，其中所述单糖基化的RSV G蛋白序列(SEQ ID NO：12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
51.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。
52.如权利要求51所述的疫苗，其中所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQ ID NO：13)是在表7所示的N-糖基化位点N67和N153中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
53.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。
54.如权利要求53所述的疫苗，其中所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1(SEQ ID NO：14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
55.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。
56.如权利要求55所述的疫苗，其中所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120(SEQ ID NO：15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
57.如权利要求29所述的疫苗，其中所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝和磷酸铝两者、弗氏不完全佐剂(IFA)、角鲨烯、明矾和MF59。
58.对哺乳动物进行抗病毒感染免疫的方法，所述方法包括：
向易受呼吸病毒感染的所述哺乳动物给予包含免疫原性多肽的疫苗，所述免疫原性多肽包含部分糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒糖蛋白，或其免疫活性片段，其中所述疫苗能诱发抗所述病毒的免疫应答。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述疫苗通过肠胃外给药被给予。
60.如权利要求58所述的方法，其中通过鼻内给予所述疫苗。
61.如权利要求58所述的方法，其中通过吸入给予所述疫苗。
62.如权利要求58所述的方法，其中通过预防性给予所述疫苗。
63.如权利要求58所述的方法，其中所述疫苗诱发抗病毒或抗同一病毒的不同菌株的免疫应答，所述同一病毒的不同菌株与从中选择部分糖基化的病毒糖蛋白的来源病毒不同。
64.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2糖蛋白。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是包含含有共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)的多肽的单糖基化的流感血凝素(HA)。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感血凝素(HA)，所述单糖基化的流感血凝素包含选自NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)序列(SEQ ID NO：6)、共有H1-A(SEQ ID NO：8)和共有H1-C(SEQ ID NO：10)序列的H1多肽序列。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述疫苗诱发抗流感病毒菌株的免疫应答，所述流感病毒菌株与从中选择部分糖基化的病毒糖蛋白的来源流感病毒菌株不同。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感血凝素(HA)。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感神经氨酸酶(NA)或M2蛋白。
70.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSV F(融合)、G(附着)或以上蛋白的免疫原性片段。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述单糖基化的RSV G蛋白序列(SEQ ID NO：12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
72.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQ ID NO：13)是在表7所示的一个或多个N-糖基化位点N67和N153的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
74.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1(SEQ ID NO：14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
76.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120(SEQ ID NO：15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。
78.制备方法，包括：
提供糖基化的病毒表面糖蛋白或其免疫活性片段；以及
去除与所述蛋白上的一个或多个糖基化位点结合的至少一部分聚糖，从而形成部分糖基化的蛋白，其中至少一种聚糖仍然与所述蛋白上的部分糖基化的位点结合，并且其中所述蛋白保持免疫活性构象。
79.如权利要求78所述的方法，还包括：
提供包含构建体的真核宿主细胞，所述构建体适于表达重组多肽或其免疫活性片段，包括病毒糖蛋白的氨基酸序列；以及
从所述真核宿主分离所述糖基化的重组病毒糖蛋白多肽。
80.如权利要求78所述的方法，其中所述部分糖基化的蛋白保持病毒糖蛋白在其天然状态的三级构象。
81.如权利要求78所述的方法，其中使用糖苷酶、神经氨酸酶、α-1-甘露糖苷酶、内F-N聚糖酶或选择性消化N-或O-连接的糖基化位点的碳水化合物的酶去除所述一部分聚糖。
82.如权利要求78所述的方法，其中使用选择性消化N-或O-连接的糖基化位点的碳水化合物的化学方法去除所述一部分聚糖。
83.如权利要求79所述的方法，其中所述真核宿主选自酵母、昆虫细胞、杆状病毒、哺乳动物细胞和人细胞。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述真核宿主是HEK293E细胞。
85.如权利要求78所述的方法，其中所述部分糖基化位点保留一个、两个或三个聚糖。
86.如权利要求78所述的方法，其中所述病毒表面糖蛋白选自：
病毒肽、蛋白、多肽或其片段，所述病毒肽、蛋白、多肽或其片段选自以下的表面糖蛋白：流感病毒神经氨酸酶，流感病毒血凝素，流感病毒M2蛋白，人类呼吸道合胞体病毒(RSV)病毒蛋白，RSV F糖蛋白，RSV G糖蛋白，单纯疱疹病毒(HSV)病毒蛋白，单纯疱疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE，衣原体MOMP和PorB抗原，登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素，单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰质炎病毒I VP1，HIV 1的包膜糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，链球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，伪狂犬病病毒g50(gpD)，伪狂犬病病毒II(gpB)，伪狂犬病病毒III(gpC)，伪狂犬病病毒糖蛋白H，伪狂犬病病毒糖蛋白E，传染性胃肠炎糖蛋白195，传染性胃肠炎基质蛋白，猪轮状病毒属糖蛋白
38，猪细小病毒衣壳蛋白，猪密螺旋体痢疾保护性抗原，牛病毒性腹泻糖蛋白55，新堡病病毒血凝素-神经氨酸酶，猪流感血凝素，猪流感神经氨酸酶，口蹄疫病毒，猪霍乱病毒，猪流感病毒，非洲猪瘟病毒，猪肺炎支原体，传染性牛鼻气管炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，传染性喉气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，拉克罗斯病毒的糖蛋白，新生犊牛腹泻病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，庞塔托鲁病毒，鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，马流感病毒或马疱疹病毒的抗原，包括甲型马流感病毒/阿拉斯加株91神经氨酸酶、甲型马流感病毒/迈阿密株63神经氨酸酶、甲型马流感病毒/肯塔基株81神经氨酸酶、马疱疹病毒1型糖蛋白B和马疱疹病毒1型糖蛋白D，牛呼吸道合胞体病毒或牛副流感病毒的抗原，牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSV G)，牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白(BRSV F)，牛呼吸道合胞体病毒核壳体蛋白(BRSVN)，牛副流感病毒3型融合蛋白，牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶，牛病毒腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53，登革病毒糖蛋白E和人类丙型肝炎病毒的糖蛋白E1或E2。
抗病毒免疫的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2009年3月27日提交的美国临时专利申请系列第61/164,385号，题目为“抗流感免疫的方法和组合物”、2009年3月28日提交的美国临时专利申请系列第61/164,387号，题目为“抗人类免疫缺陷病毒免疫的方法和组合物”、2009年3月28日提交的美国临时专利申请系列第61/164,388号，题目为“抗黄病毒属免疫的方法和组合物”、
2009年3月28日提交的美国临时专利申请系列第61/164,389号，题目为“制备抗病毒感染疫苗的方法”、2010年3月12日提交的美国临时专利申请系列第61/313,676号，题目为“抗流感免疫的方法和组合物”的权益，所有申请的内容在此通过引用整体并入。
2009年3月28日提交的美国临时专利申请系列第61/164,389号，题目为“制备抗病毒感染疫苗的方法”、2010年3月12日提交的美国临时专利申请系列第61/313,676号，题目为“抗流感免疫的方法和组合物”的权益，所有申请的内容在此通过引用整体并入。
[0004] 本申请包含序列表。序列表的计算机可读副本作为2010年3月24日产生的，名称为SEQ_LIST_OPK50101_ST25的ASCII文件由EFS-Web同时传送，该文件大小为42,952字节。序列表中所包含的信息在此通过引用整体并入。
[0005] 发明的技术领域
[0006] 本发明通常涉及部分糖基化的病毒多肽，其用于产生可有效抗病毒的有效的、广泛反应性的免疫原性组合物。具体而言，本发明涉及利用单糖基化的流感病毒血凝素(HA)肽产生的疫苗，该疫苗表现出抗流感病毒的有效活性。本发明涉及包含糖蛋白的药物组合物和由其产生的疫苗，以及涉及利用去糖基化的HA多肽预防和治疗流感病毒感染的方法。
[0007] 发明背景
[0008] 在真核生物中，糖残基通常与四种不同的氨基酸残基连接。这些氨基酸残基被分成O-连接的(丝氨酸、苏氨酸和羟基赖氨酸)和N-连接的(天冬酰胺)。O-连接的糖在高尔基体或糙面内质网(ER)中由核苷酸糖合成。N-连接的糖由共同的前体合成，然后被加工。已知添加N-连接的碳水化合物链对于糖蛋白的折叠稳定、防止在内质网中降解、寡聚化、生物学活性和运输至关重要。将N-连接的寡糖添加到特定的Asn残基在调节病毒成熟蛋白的活性、稳定性或抗原性中起着重要作用(Opdenakker G.et al FASEB Journal7，1330-1337 1993)。还认为N-连接的糖基化是糖蛋白的折叠、运输、细胞表面表达、分泌(Helenius，A.，Molecular Biology of the Cell5，253-265 1994)、保护免受蛋白水解降解和增加糖蛋白溶解性(Doms et al.，Virology 193，545-562 1993)所必需的。病毒的表面糖蛋白不仅是蛋白正确折叠所必需的，而且还作为“聚糖盾牌”提供针对中和抗体的保护。
因此，强烈的宿主特异性选择通常与可能的N-连接糖基化的密码子位置相关。因此N-连接的糖基化位点在菌株和进化枝间趋向于保守。
因此，强烈的宿主特异性选择通常与可能的N-连接糖基化的密码子位置相关。因此N-连接的糖基化位点在菌株和进化枝间趋向于保守。
[0009] 有三种主要类型的流感病毒：甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒菌株能导致严重的疾病，并且是能导致人类流行性的唯一类型。H5N1菌株是甲型流感病毒。乙型菌株导致偶发的人类病症和小规模的爆发。丙型菌株仅很少导致人类感染，并且不会导致大规模的爆发。在甲型流感病毒中，只有H1、H2和H3亚型易于在人类之间传播。
[0010] 甲型流感病毒的爆发持续引起世界范围内的广泛的发病率和死亡率。仅美国，估计每年就有5％至20％的人口受到甲型流感病毒的感染，导致大约200,000人住院和36,000人死亡。广泛的疫苗接种策略的建立是限制流感发病率的有效措施。然而，病毒频繁的遗传漂移需要每年都要重新配制疫苗，这可能会导致疫苗中存在的病毒菌株和流通的病毒菌株之间发生错配。因此，针对流感病毒的抗病毒疗法是限制疾病严重性和传播的重要工具。
[0011] 自从2003年至今，高致病性H5N1流感病毒已在家禽和野生禽类中引起爆发(Li KS et al.(2004)Nature 430：209-213)。自2010年2月起，这些病毒不仅感染了禽类而且还感染了超过478个人，其中286例被证实是致命的(www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html)。高致病性H5N1和2009猪源性甲型流感(H1N1)病毒导致全球爆发，并引起对病毒中可能发生的其他改变会导致致命的流行性的强烈关注(Garten RJ，et al.(2009)Science 325：197-201，Neumann G，et al.(2009)Nature 459：931-939)。更关注流感病毒可能会获得在人之间有效传播的能力，进而成为流行性威胁。流感疫苗因而一定是任何流行性应对计划不可或缺的部分。
[0012] 流感病毒被划分为负链RNA病毒，且属于正粘病毒家族。甲型流感病毒由9种结构蛋白组成，并额外编码一种具有调节功能的非结构NS1蛋白。非结构NS1蛋白在生殖周期过程中大量合成，并定位在受感染细胞的胞液和细胞核中。在不同的病毒菌株混合感染细胞的过程中，病毒基因组的节段性特性允许发生遗传重组机制(基因组节段的交换)。根据展示在其表面上的不同的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)病毒蛋白，可进一步将甲型流感病毒分类成不同的亚型。甲型流感病毒亚型通过两种病毒表面糖蛋白来鉴定，即血凝素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)。每种流感病毒亚型通过其H和N蛋白的组合来鉴定。有16种已知的HA亚型和9种已知的NA亚型。甲型流感病毒可以感染人、禽、猪、马和其他动物，但是野生禽类是这些病毒的天然宿主。目前只有一些甲型流感亚型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人之间传播，但是16种H亚型和9种NA亚型的所有组合均在禽类中，尤其在野生水鸟和滨鸟中鉴定到。此外，越来越多的证据表明H5和H7流感病毒还可以引起人类疾病。
[0013] 甲型流感病毒的HA包含两段结构不同的区域，即球状头区和茎区。球状头区包含受体结合位点，其负责病毒附着于靶细胞和参与HA的血细胞凝集活性。茎区包含融合肽，其是病毒包膜和细胞内体膜之间的膜融合所必需的，并因此涉及融合活性(Wiley et al.，Ann.Rev.Biochem.，56：365-394(1987))。
[0014] 对了解流感感染的重要贡献来自对血凝素(HA)的研究，血凝素是与呼吸道中的特定唾液酸化的聚糖受体结合，从而允许病毒进入细胞的病毒衣壳糖蛋白(Kuiken T，et al.(2006)Science 312：394-397；Maines TR，et al.(2009)Science 325：484-487；Skehel JJ，Wiley DC(2000)Ann Rev Biochem 69：531-569；van Riel D，et al.(2006)Science312：399-399)。为了跨越物种障碍和感染人群，禽类HA必须改变其受体结合偏好性，从包含α2，3(禽类)-连接的唾液酸基序的末端唾液酸化的聚糖变成包含α2，6(人类)-连接的唾液酸基序(Connor RJ，et al.(1994)Virology 205：17-23)，并且如同在1918年的流行性中(Tumpey TM，et al.(2007)Science315：655-659)，该转变可能仅通过两次突变而发生。因此，了解影响流感病毒与聚糖受体结合的因素是开发控制具有流行性潜能的流感菌株在将来可发生任何转型的方法的关键。
[0015] 为了满足制备能诱导抗H5N1流感病毒不同菌株的有效中和抗体的候选流感疫苗的需要，基于共有H5N1血凝素(HA)序列的疫苗能诱发中和一组已用多种H5N1进化枝的HA进行假性处理的病毒体的抗体。(Chen MW，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：13538-13543)。
[0016] HA是同源三聚体跨膜蛋白，具有由球状头区和茎区组成的胞外结构域(Kuiken T，et al.(2006)Science 312：394-397)。两个区域均携带N-连接的寡糖(Keil W，et al.(1985)EMBO J 4：2711-2720)，该寡糖影响HA的功能特性(Chen ZY，et al.(2008)Vaccine 26：361-371；Ohuchi R，et al.(1997)J Virol 71：3719-3725)。在甲型流感病毒的不同亚型中，头区的糖基化位点有广泛的变异，而茎区的寡糖更保守，且为融合活性所需(Ohuchi R，et al.(1997)J Virol 71：3719-3725)。抗原肽表位附近的聚糖干扰抗体识别(Skehel JJ，et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：1779-1783)，HA的蛋白水解激活位点附近的聚糖调节切割，并影响流感病毒的感染力(Deshpande KL，et al.(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84：36-40)。HA糖基化位点的突变缺失能影响病毒的受体结合(Gunther I，et al.(1993)Virus Res27：147-160)。
[0017] 糖基化位点处或附近的肽序列的改变可以改变HA的3D结构，并因此改变其受体结合特异性和亲和力。的确，来自不同H5N1亚型的HA具有不同的聚糖结合模式(Stevens J，et al.(2008)J Mol Biol381：1382-1394)。在整个病毒系统中研究了H1和H3上的糖基化位点的诱变(Chandrasekaran A，et al.(2008)Nat Biotechnol 26：107-113；Deom CM，et al.(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83：3771-3775)。然而，还不了解糖基化的改变如何影响受体结合特异性和亲和力，尤其对于大多数致病性H5N1 HA来说。
[0018] 自从制备出来开始，流感疫苗必须每年都改变，因为，血凝素的非高糖基化区域或非糖基化区域一直在突变以逃避宿主的免疫系统。
[0019] 针对异源病原体的疫苗设计的目标是鉴定和设计有效且广泛保护性的抗原。就流感而言，过去大量的工作针对保守线性序列和区域的实验测定，但是成绩较小。导致这些失败的可信服的理由是有关这方面知识的缺乏，即在真正感染的条件下，针对抗原性测试颗粒的集中应答是用于中和病原体上的抗原的真正有效的位点。
[0020] 发明概述
[0021] 具体而言，需要可在疫苗产生过程的设计和确认中使用的交叉中和单克隆抗体，所述设计和确认维持或增强目前和将来制备的疫苗中的交叉中和表位的质量和抗原性。假设与疫苗结合的抗体反映出结构完整性和抗原潜能，可以评价交叉中和抗体，例如去糖基化的HA多肽与这种疫苗加工衍生物的结合，从而定量地评价它们的交叉中和潜能。为了使对这些通用表位的应答最大化，可以制备衍生物，以增强对这些通用表位的免疫原性。
[0022] 按照本发明，公开了利用这些原理的疫苗。抗原通过以下产生：从病毒糖蛋白部分地去除糖以暴露糖基化位点(其是高度保守的，并且不会突变或不会激烈突变)，同时保留足够的糖，以保持所述糖蛋白的三级结构。部分糖基化的病毒糖蛋白通过所述糖蛋白的部分去糖基化，使得特定糖基化位点保留一个、两个或三个糖单元而产生。在某些方面，可以通过在一个或多个特定糖基化位点提供去糖基化的蛋白或多肽，并使该糖基化位点连接一个、两个或三个糖来产生部分糖基化的糖蛋白。
[0023] 公开了包含至少一种部分糖基化的HA、NA或M2糖蛋白和药物可接受的载体的疫苗。在一些实施方案中，所述部分糖基化的HA糖蛋白选自部分糖基化的流感病毒HI、H3和H5。在一些实施方案中，所述部分糖基化的HA糖蛋白是在H5HA的第39位、第127位、第170位、第181位、第302位、第495位和第500位的一个或多个位置中的天冬酰胺残基处糖基化。在一些实践中，所述天冬酰胺残基位于第177位。
[0024] 公开了包括向易患流感的个体给予疫苗的方法，所述疫苗包含至少一种去糖基化的HA糖蛋白和药物可接受的载体。在一些实施方案中，所述去糖基化的HA糖蛋白选自HI、H3和H5。
[0025] 在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点保留单糖基化(留下1个糖)。在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点保留二糖基化(留下2个糖)。在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点保留三糖基化(留下3个糖)。在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的至少一个糖基化位点保留单糖基化、二糖基化和三糖基化中的至少一种。
[0026] 本发明涉及用于引发对病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包含：来自病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的抗原糖蛋白，其中所述糖蛋白是部分糖基化的。
[0027] 在一些方面中，所述病原体是病毒，且所述部分糖基化的抗原是病毒、病毒样颗粒、病毒肽、蛋白、多肽、或来自病毒的片段、或部分包含病毒蛋白序列的融合蛋白。
[0028] 所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、衣原体、腺病毒科、哺乳动物腺病毒属、禽腺病毒属、疱疹病毒科、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5、单纯疱疹病毒6、光滑病毒科、轻小病毒属、肠杆菌噬菌体MS2、allolevirus、痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软疣痘病毒属、昆虫痘病毒亚科、乳头多瘤空病毒科、多瘤病毒属、乳头多瘤空病毒属、副粘病毒科、副粘病毒属、副流感病毒1、麻疹病毒属、麻疹病毒、腮腺炎病毒属、腮腺炎病毒、肺病毒亚科、肺病毒属、偏肺病毒属、禽肺病毒属、人类偏肺病毒属、小核糖核酸病毒科、肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、人类甲型肝炎病毒、心病毒属、andapthovirus、呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、质型多角体病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属、水稻病毒属、逆转录病毒科、B型哺乳动物逆转录病毒属、C型哺乳动物逆转录病毒属、C型鸟逆转录病毒属、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV转录病毒属、慢病毒属、人类免疫缺陷病毒1、人类免疫缺陷病毒2、HTLV-I和HTLV-II病毒、SARS冠状病毒属、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒属、肝炎病毒(HCV、HAV、HBV、HDV、HEV)、刚地弓形虫病毒、梅毒螺旋体病毒、人类T淋巴细胞病毒、脑炎病毒、西尼罗病毒、登革病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹、腮腺炎、风疹、泡沫病毒属、黄病毒属科、丙型肝炎病毒、肝DNA病毒科、乙型肝炎病毒、披膜病毒科、甲病毒属辛德比斯病毒、风疹病毒属、风疹病毒、弹状病毒科、水疱性病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属、质型弹状病毒属、核型弹状病毒属、沙粒病毒科、沙粒病毒属、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒、拉沙病毒、冠状病毒科、冠状病毒属和凸隆病毒属。
[0029] 病毒肽、蛋白、多肽或其片段选自流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素、人类呼吸道合胞体病毒(RSV)病毒蛋白、RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)病毒蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE、衣原体MOMP和PorB抗原、登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素、单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB、脊髓灰质炎病毒1 VP1、HIV1的包膜糖蛋白、乙型肝炎表面抗原、白喉毒素、链球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋白、伪狂犬病病毒g50(gpD)、伪狂犬病病毒II(gpB)、伪狂犬病病毒III(gpC)、伪狂犬病病毒糖蛋白H、伪狂犬病病毒糖蛋白E、传染性胃肠炎糖蛋白195、传染性胃肠炎基质蛋白、猪轮状病毒属糖蛋白38、猪细小病毒衣壳蛋白、猪密螺旋体痢疾保护性抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新堡病病毒血凝素-神经氨酸酶、猪流感血凝素、猪流感神经氨酸酶、口蹄疫病毒、猪霍乱病毒、猪流感病毒、非洲猪瘟病毒、猪肺炎支原体、传染性牛鼻气管炎病毒、传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G、传染性喉气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I、拉克罗斯病毒的糖蛋白、新生犊牛腹泻病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、庞塔托鲁病毒、鼠白血病病毒、小鼠乳腺瘤病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或以上蛋白的片段或衍生物、马流感病毒或马疱疹病毒的抗原(包括甲型马流感病毒/阿拉斯加株91神经氨酸酶、甲型马流感病毒/迈阿密株63神经氨酸酶、甲型马流感病毒/肯塔基株81神经氨酸酶、马疱疹病毒1型糖蛋白B和马疱疹病毒1型糖蛋白D)、牛呼吸道合胞体病毒或牛副流感病毒的抗原、牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSV G)、牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白(BRSV F)、牛呼吸道合胞体病毒核壳体蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3型融合蛋白、牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶、牛病毒腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53、登革病毒糖蛋白E和人类丙型肝炎病毒的糖蛋白E1或E2。
[0030] 在一些方面中，所述去糖基化的病毒抗原是单、二或三糖基化的流感病毒血凝素。在一些实施方案中，所述去糖基化的病毒抗原是选自流感病毒HI、H3和H5的单糖基化的血凝素。在一些实施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含N-糖基化位点，所述N-糖基化位点包含天冬酰胺-Xaa-丝氨酸和天冬酰胺-Xaa-苏氨酸的的氨基酸序列，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。在一些方面中，在糖基化位点包含单个GlcNAc糖的单糖基化的血凝素对于HA-受体结合展现出特异性降低，但是亲和力增高。
[0031] 在一些实施方案中，所述去糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或甘露糖二糖基化或三糖基化的流感病毒血凝素。在一些方面中，所述去糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)糖基化的单糖基化的流感病毒血凝素。
[0032] 在一些方面中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)的多肽。在一些实施方案中，所述单糖基化的共有H5HA序列(SEQ ID NO：4)在第39位、第170位、第181位、第302位和第495位的一个或多个天冬酰胺残基处糖基化。在其他方面中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含选自NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)序列(SEQ ID NO：6)、共有H1-A(SEQ ID NO：8)和共有H1-C(SEQ ID NO：10)序列的H1多肽序列。在一些实施方案中，所述HA序列被修饰，以便能在合适的真核细胞中表达。
[0033] 在一实施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性H1(布里斯班株)多肽。
[0034] 本发明还涉及包含免疫原性多肽并任选地包含佐剂的疫苗，所述免疫原性多肽包含去糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒糖蛋白，其中所述疫苗能诱发抗呼吸病毒的免疫应答。在一些实施方案中，所述呼吸病毒是流感病毒，且病毒糖蛋白是血凝素(HA)。
[0035] 在一些方面中，所述流感病毒选自禽流感病毒和季节性流感病毒。在一些实施方案中，所述禽流感病毒是H5N1。在一些实施方案中，所述流感病毒是甲型流感病毒。
[0036] 一方面，所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSV F(融合)，G(附着)，或其免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的RSV G蛋白序列(SEQ ID NO：12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
[0037] 一方面，所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQ ID NO：13)是在表7所示的N-糖基化位点N67和N153中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
[0038] 一方面，所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1(SEQ ID NO：14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
[0039] 一方面，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gp120(SEQ ID NO：15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。
[0040] 本发明还涉及包含流感HA多肽和药物可接受的载体的疫苗组合物，其中所述流感HA多肽被去糖基化至单糖基化状态，并且其中一旦将所述单糖基化的HA多肽引入个体，所述多肽诱导所述个体产生与流感病毒结合的抗体。
[0041] 在一些方面中，将单糖基化的HA多肽引入个体导致所述个体产生中和季节性流感病毒和禽流感病毒两者的抗体。
[0042] 在一实施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性H1(布里斯班株)HA多肽，并且一旦将所述单糖基化的HA多肽引入个体，所述H1(布里斯班株)HA多肽诱导所述个体产生中和NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)流感病毒的抗体。
[0043] 在另一施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)多肽，并且一旦将所述单糖基化的HA多肽引入个体，所述NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)多肽诱导所述个体产生中和季节性H1(布里斯班株)HA流感病毒的抗体。
[0045] 本发明涉及对哺乳动物进行抗病毒呼吸道感染免疫的方法，所述方法包括：向易受呼吸病毒感染的哺乳动物给予包含免疫原性多肽的疫苗，所述免疫原性多肽包含去糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒糖蛋白，其中所述疫苗能诱发抗呼吸病毒的免疫应答。在一些实施方案中，所述呼吸病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是血凝素(HA)。可以通过肠胃外给药、吸入方式、鼻内给药、且有时通过预防性给药来给予所述疫苗。
[0046] 在一些方面中，所述疫苗引起抗流感病毒菌株的免疫应答，所述流感病毒菌株与从中选择去糖基化的病毒糖蛋白的来源流感病毒菌株不同。在一些实施方案中，所述去糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感血凝素(HA)。
[0047] 本发明提供了有效抗甲型流感病毒的疫苗。在一实施方案中，所述疫苗包含在功能上模拟本文所述分子的中和表位的肽或多肽。在另一实施方案中，所述疫苗有效抗包含肽或多肽的病毒抗原，所述肽或多肽在功能上模拟本文所述分子的中和表位。在一实施方案中，所述病毒抗原来自流感病毒或HIV-1或HIV-2病毒或诸如登革病毒或丙型肝炎病毒的黄病毒属。
[0048] 在另一实施方案中，所述疫苗是有效抗甲型流感病毒的疫苗，包含在功能上模拟本文所述分子的中和表位的肽或多肽。在一实施方案中，所述分子是抗体。在另一实施方案中，所述抗体结合HA抗原。在另一实施方案中，所述HA抗原是H5亚型。在另一实施方案中，所述HA抗原是H1亚型。在另一实施方案中，所述抗原展示在甲型流感病毒的表面。在另一实施方案中，所述肽或多肽包含引发中和抗体的抗原决定簇。
[0050] 附图简要说明
[0052] 图1A-1C显示不同糖基化的HA的图解概述和圆二色光谱。(图1A)不同糖基化的HA的四种变体：HAfg，在HEK293E细胞中表达的具有典型复合型N-聚糖的HA(共有序列(Chen MW，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：13538-13543)；HAds，NA处理的导致从HAfg去除唾液酸的HA；HAhm，在GnTI-HEK293S细胞中表达的具有高甘露糖型N-聚糖的HA；以及HAmg，Endo H处理的在N-糖基化位点仅具有GlcNAc的HA。(图1B)在其N-糖基化位点连接不同N-聚糖的HAfg、HAds、HAhm和HAmg的结构代表。蛋白结构用Protein Data Bank ID code 2FK0(Viet04 HA)产生，颜色为灰色，并且N-连接的聚糖显示为绿色。所有的N-聚糖均通过GlyProt(Bohne-Lang A，et al.(2005)Nucleic Acids Res 33：W214-W219)被模式化，并且图形由PyMOL(www.pymol.org)生成。(图1C)HAfg、HAds、HAhm和HAmg的圆二色性光谱显示，不同糖基化的四种HA蛋白的二级结构是相似的。
[0053] 图2A-2B显示不同糖基化的HA的聚糖微阵列分析。(图2A)显示HA变体HAfg、HAds、HAhm和HAmg的聚糖微阵列谱型。聚糖的相关连接按颜色进行分组，主要为17种α2，3唾液酸苷(黄色)或7种α2，6唾液酸苷(蓝色)。阵列上聚糖的结构显示在图2B中。用HA变体响应α2，3唾液酸苷1-15的KA，surf值来显示HA变体HAfg、HAds、HAhm和HAmg的缔合常数。
[0054] 图3显示自从2000年开始，最近的HAH1、H3和H5的布里斯班株H1，加利福尼亚株H1、H3和H5的序列比对。季节性流感HA来自A/布里斯班株/59/2007。流行性流感HA来自A/加利福尼亚株/07/2009。H5来自A/越南株/1203/2004。H3来自A/布里斯班株/10/2007。以红框显示H5HA上的N-糖基化位点。比较显示H1和H5HA在其N-糖基化位置之间的相似性，而H3具有保守性较小的糖基化位置，且不同于H1和H5。
[0055] 图4A-4F显示来自于HA聚糖相互作用的糖或修饰的结合能贡献，所述HA聚糖相互作用响应于不同糖基化的HA。这些值通过减去所示的参照聚糖(以红框突出；参见表S3)的ΔG值得到。(图4A)聚糖2、3、6和8-10具有与二糖聚糖1相同的主链，而仅在非还原末端的第三个糖不同。计算出ΔΔG值以显示由于改变第三个糖而结合能的差异。(图4B)聚糖10-12和15具有与二糖聚糖8相同的主链，但是由于线性延长糖结构上或增加分支糖而不同。(图4C)聚糖4和5具有与三糖聚糖3相同的主链，但是在非还原末端第三位的分支海藻糖或硫酸盐基团上不同。(图4D)聚糖6和7在聚糖7的非还原末端第三位的硫酸盐基团上不同。(图4E)聚糖13和14是α2，3二天线唾液酸苷，但是在内部糖的改变上不同。(图4F)聚糖16和17和α2，6唾液酸苷(第21-27号)对HA表现出很少的结合或不结合。
[0056] 图5A-5D显示HAfg和HAmg作为疫苗的比较。(图5A)用ELISA分析来自HAfg和HAmg的抗血清与各种HA之间的结合。与HAfg抗血清相比，HAmg抗血清表现出更好地对H5(越南株1194/2004和CHA5)的结合。此外，HAmg抗血清还与H1(加利福尼亚株07/2009和WSN)结合。(图5B)用HAfg和HAmg抗血清对H5N1(NIBRG-14)病毒的微量中和。与HAfg抗血清相比，HAmg抗血清表现出更好的对MDCK细胞抗流感病毒感染的中和活性(P＜0.0001)。(图5C)对H5N1病毒致死剂量激发的疫苗保护。用HA蛋白疫苗HAfg、HAmg和对照PBS的两次注射免疫BALB/c小鼠。免疫的小鼠用致死剂量的H5N1(NIBRG-14)病毒通过鼻内激发。激发后，记录存活持续14天。(图5D)通过ELISA进行的来自HAmg的兔抗血清与不同HA的结合。抗HAmg的兔抗血清表现出与H5(CHA5和越南株/1194)的强烈结合。此外，还观察到与H5(安徽株和ID5/2005)和H1(新喀里多尼亚株/1999)的相互作用。
[0057] 图6A-6C显示H5HA蛋白的构建、纯化和凝胶过滤色谱分析。(图6A)将编码具有改变切割位点的HA的胞外域的DNA克隆进哺乳动物表达载体，pTT(Durocher Y，et al.(2002)Nucleic Acids Res 30：E9)中，从而允许从HEK293细胞培养物有效分泌HA蛋白。HA的原始蛋白酶切割位点被突变成PQRERG，以避免HA0加工成HA1和HA2。为了稳定HA蛋白的三聚体构象，将噬菌体三聚片段“折叠子(foldon)”序列工程改造进质粒构建体，并将组氨酸标签添加到COOH末端，用于纯化目的。用表达载体的瞬转进行HA蛋白的表达。(图6B)用SDS/PAGE分析纯化的HA蛋白。Mindicates标志物。泳道1：HAfg，从293E细胞纯化的HA；泳道2：HAds，通过NA消化的HAfg；泳道3：HAhm，从293S细胞纯化的HA(Reeves PJ，et al.(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：13419-13424)；泳道4：HAmg，通过Endo H消化的HAhm。(图6C)通过凝胶过滤色谱法分析HA纯化的蛋白。凝胶过滤后的洗脱峰显示HAfg三聚体＞200kDa(红线)，HAds三聚体＞200kDa(黑线)，HAhm三聚体＞200kDa(蓝线)和HAmg三聚体＞180kDa(绿线)。图显示了覆盖有蛋白标志物(虚线)的HA蛋白的叠加洗脱图谱。
[0058] 图7A-7C显示来自不同HA蛋白的过甲基化的N-聚糖的质谱分析。来自不同HA蛋白的过甲基化的N-聚糖的MS分析。(图7A)MALDI-MS图谱显示，HEK293E所表达的HA的N-聚糖主要包含核心岩藻糖化的、二天线、三天线和四天线复合型N-聚糖结构，这解释了所检测到的主峰并列于表S1。分配基于组成，仅有有限的几个进一步通过MS/MS分析来证实。不同程度的唾液酸化是主要特征。(图7B)用NA处理，指定为唾液酸化N-聚糖的所有的信号(例如m/z 2605、3054、3503、3864、4226)都不再能检测到，伴随非唾液酸化的三天线和四天线结构(m/z 2693，3142)的信号强度增加，这与唾液酸的完全去除完全相符。(图7C)来源于GnTI 缺陷型HEK293S菌株所表达的HA的N-聚糖的MALDI-MS图谱显著性地显示出，对应于m/z 1579处的Man5GlcNAc2的信号，伴随糖基化途径中不完全平衡的高甘露糖型N-聚糖(m/z 1783至2396；Hex6HexNAc2-Hex9HexNAc2)的最小峰。
[0059] 图8A-8D显示对HA变体的MALDI-TOF分析。(图8A)HAfg的分子量是75186.343，(图8B)HAds是75290.023，(图8C)HAhm是69314.645和(图8D)HAmg是63314.761。
[0060] 图9显示在HA三聚体的过甲基化N-聚糖的MALDI光谱中所观察到的主要分子离子的分配。ND表示未确定。
[0061] 图10显示对应于α2，3唾液酸苷1-15的HA糖基化变体的ΔΔG。值表示ΔΔG，kcal/mol。最左栏的项目通过前面的HA的-G值减去后面的HA的-G值得到(例如，ΔΔG(HAfg-＞HAds)＝ΔG(HAds)-ΔG(HAfg))。ND表示未确定。
[0062] 图11显示响应于HA变体的不同唾液酸苷配体的结合自由能变化差异。值表示ΔΔG，kcal/mol。最左栏的项目通过前面的HA的ΔG值减去后面的HA的ΔG值得到(例如，ΔΔG(1-＞2)＝ΔG(2)-ΔG(1)。ND表示未确定。
[0063] 图12显示从完全糖基化、高甘露糖和单糖基化的H5HA产生的抗血清抑制越南株1203HA假型病毒转导进入HEK293细胞中的能力。高甘露糖和单糖基化的HA抗血清两者均抑制病毒进入，但是完全糖基化的HA抗血清则不会抑制。
[0064] 图13A-13B显示利用兔HAfg和HAmg抗血清进行血细胞凝集测定的结果。图13A显示血细胞凝集测定中完全糖基化的共有H5HA抗血清对H1、H3和H5的结果。图13B显示利用单糖基化的H5HA抗血清的结果。单糖基化的H5HA抗血清不仅对H5表现出良好的血细胞凝集抑制活性，而且对H1也表现出良好的血细胞凝集抑制活性。H3血细胞凝集不受两种抗血清的影响。
[0065] 图14显示H5和H1的蛋白结构( 的均方根偏差(RMSD))彼此之间比与H3的蛋白结构( 的均方根偏差(RMSD))更相似。
[0066] 图15A-15C显示使用单糖基化的H1(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清对NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)的抑制。图15A显示对NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒凝集红细胞能力的抑制。图15B显示对NIBRG-121(流行性
2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图15C显示对BALB/c小鼠免受NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)流感病毒感染的保护。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5μg)免疫的小鼠，并且用于激发的病毒是NIBRG-121(100×LD50)。
2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图15C显示对BALB/c小鼠免受NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)流感病毒感染的保护。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5μg)免疫的小鼠，并且用于激发的病毒是NIBRG-121(100×LD50)。
[0067] 图16A-16C显示使用单糖基化的H1(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清对WSN(H1N1)1933的抑制。图16A显示对WSN(H1N1)1933病毒凝集红细胞能力的抑制。图16B显示对WSN(H1N1)1933病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图16C显示对BALB/c小鼠免受WSN(H1N1)1933流感病毒感染的保护。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5μg)免疫的小鼠，并且用于激发的病毒是WSN(H1N1)1933(100×LD50)。
[0068] 图17A-17C显示使用单糖基化的H1(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清对A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8的抑制。图17A显示对PR8病毒凝集红细胞能力的抑制。图17B显示对PR8病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图17C显示对BALB/c小鼠免受PR8流感病毒的保护。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5μg)免疫的小鼠，并且用于激发的病毒是(100×LD50)。
[0069] 图18A-18B显示使用单糖基化的H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株；在图中显示为加利福尼亚株/2009)HA作为抗原所产生的抗血清对WSN(H1N1)的抑制。图18A显示对WSN(H1N1)病毒凝集红细胞能力的抑制。图18B显示对WSN(H1N1)病毒感染MDCK细胞能力的抑制。
[0070] 图19显示对H1HA蛋白上的糖基化位点的结构比较。
[0071] 图20显示3型登革病毒包膜糖蛋白E二聚体的完全糖基化形式(图20A)和单糖基化形式(图20B)。模型由PDB代码2BF1产生，利用GlyProt服务器具有4个可能的复合型N-聚糖。
[0073] 发明的详细描述
[0074] 在下面参照附图对本公开的实施方案的详细描述中，其中相似的参考数字表示相似的元件，并且其中以列举可实施本公开的具体实施方案的方式显示。对这些实施方案的详述足以使本领域技术人员能实施本公开，并且应当理解，可以使用其他实施方案，且只要不脱离本公开的范围，可以作出合理的、结构的、功能的和其他的改变。以下详细描述因而不应被理解为限制性含义。
[0075] 流感病毒的血凝素(HA)是同源三聚体跨膜蛋白，具有由球状头区和茎区组成的胞外结构域。两个区域均携带N-连接的寡糖，这些寡糖的生物合成按照N糖基化的常规途径。HA的功能特性受特定位点的糖基化影响。抗原肽表位周围的碳水化合物干扰抗体接近，并且该影响可导致流感病毒的抗原性漂移。之前对HA的研究还揭示，具有糖基化的肽序列是高度保守的，并且HA受体结合特异性由于受体结合位点附近复合聚糖链的缺失而受到影响。此外，HA的蛋白水解活性还受到切割位点附近的聚糖的调节，从而影响流感病毒的感染力。头区糖基化位点的结构和数量的广泛变异已在甲型流感病毒的不同亚型中得到显示，而茎区寡糖更保守，且为融合活性所需。所有这些发现均表明HA糖基化对其活性的重要性。
[0076] 病毒传播从血凝素(HA)糖蛋白和含有聚糖的唾液酸(SA)之间的重要相互作用开始，所述血凝素糖蛋白是流感病毒衣壳，所述唾液酸位于宿主细胞表面。为了阐明HA糖基化在该重要的相互作用中的作用，制备了各种确定的HA糖型，并利用合成的SA微阵列研究它们的结合亲和力和特异性。截断HA上的N-聚糖结构增加SA结合亲和力，但降低了对不同SA配体的特异性。SA配体结构中每种单糖和硫酸盐基团对HA结合能的贡献在数量上均是可分析的。发现硫酸盐基团对完全糖基化的HA的结合能增加将近100倍(2.04kcal/mol)，并且二天线的聚糖对单糖基化的HA糖型的结合能同样增加将近100倍。仅在每个糖基化位点携带一个N-连接的GlcNAc的由HA蛋白引发的抗体比完全糖基化的HA所激发的抗体对流感病毒亚型表现出更好的结合亲和力和中和活性。因此，去除病毒表面糖蛋白上的结构上非必需的聚糖对于针对流感病毒和其他人类病毒的疫苗设计来说是非常有效且常用的方法。
[0077] 除非另外定义，本文所用的技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton et al.，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994)为本领域技术人员提供了对本申请所用的诸多术语的通用指导。
[0078] 本领域技术人员应当意识到，与本文所描述的相似或等同的诸多方法和材料可用于实施本发明。确实，本发明绝非限制于所述的方法和材料。为了本发明的目的，下面定义以下术语。
[0079] 术语“甲型流感亚型”或“甲型流感病毒亚型”可交替使用，是指用血凝素(H)病毒表面蛋白表征的甲型流感病毒变体，并因此用H的数量来标记，诸如例如H1、H3和H5。此外，亚型可进一步用神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白表征，用N的数量表示，诸如例如N1和N2。同样，亚型可以通过H和N的数量两者来表征，诸如例如H1N1、H5N1和H5N2。本术语具体包括每种亚型内的所有菌株(包括灭绝的菌株)，这些菌株通常由突变产生，并表现出不同的病原谱。这类菌株还被称为病毒亚型的各种“隔离体”，包括所有过去的、当今的和未来的隔离体。因此，在该语境下，术语“菌株”和“隔离体”可交替使用。亚型含有基于甲型流感病毒的抗原。所述抗原可以基于血凝素病毒表面蛋白，并可被称为“HA抗原”。在某些情况下，这类抗原基于特定亚型的蛋白，诸如例如H1亚型和H5亚型，其可以分别被称为H1抗原和H5抗原。
[0080] 如本公开中所用的，术语“去糖基化的”或“部分糖基化的”蛋白是指从完全糖基化状态的蛋白的聚糖结构去除一个或多个糖的蛋白，并且其中所述蛋白基本保持其天然的构象/折叠。“去糖基化的”蛋白包括部分糖基化的蛋白，其中去糖基化过程在糖蛋白上存在的一个或多个糖基化位点处保留单糖基化、二糖基化或三糖基化。
[0081] “部分糖基化的”蛋白包括其中在每个糖基化位点处保留一个或多个糖的“去糖基化的”蛋白，并且每个部分糖基化位点与完全糖基化状态的糖蛋白相比包含较小的聚糖结构(包含较少的糖单元)，并且部分糖基化的蛋白基本保持其天然的构象/折叠。“部分糖基化的”蛋白通过在完全糖基化状态的糖蛋白的至少一个糖基化位点的聚糖结构处部分去糖基化来产生。“部分糖基化的”蛋白还通过在蛋白的非糖基化位点导入糖基化，使得添加的糖基化序列小于完全糖基化状态的糖蛋白该位点处的聚糖结构来产生。“部分糖基化的”蛋白还通过合成病毒糖蛋白序列或其片段，在该序列的糖基化位点处导入糖基化的氨基酸单元(例如，GlcNAc-精氨酸部分)，使得添加的聚糖结构小于完全糖基化状态的糖蛋白该位点处的聚糖结构来产生。
[0082] 术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可交替使用，是指单链或双链RNA、DNA或混合的多聚体。多核苷酸可以包括基因组序列、基因组外序列和质粒序列，以及表达多肽或可适合表达多肽的较小的工程化基因节段。
[0083] “分离的核酸”是基本上从天然伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及蛋白或诸如核糖体或多聚酶的复合体分离的核酸。该术语包括从其天然存在的环境移出的核酸序列，并包括重组的或克隆的DNA分离体和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指原始分离的核酸，并且不排除之后通过人工添加到该分离的核酸的基因或序列。
[0084] 术语“多肽”以其常规含义使用，即氨基酸序列。所述多肽并不限制于特定长度的产物。肽、寡肽和蛋白均包括在多肽的定义内，并且这类术语在本文可交替使用，除非具有指出不是这样。该术语还不是指或排除翻译后修饰的多肽，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域内已知的天然存在的和非天然存在的其他修饰。多肽可以是完整的蛋白或其子序列。本发明背景下的特定目的多肽是包含CDR并能与抗原或HIV感染的细胞结合的氨基酸子序列。
[0085] “分离的多肽”是从其天然环境组分中鉴定并分离和/或回收到的多肽。在优选的实施方案中，所述分离的多肽可被纯化至(1)如通过Lowry方法所测定的大于95％重量比的多肽，并且最优选至大于99％的重量比，(2)纯化至足以通过使用旋杯式测序仪来获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)纯化至通过使用考马斯亮蓝或优选银染在还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到的均一性。分离的多肽包括重组细胞原位的多肽，因为所述多肽的天然环境的至少一种组分不再存在。然而通常，分离的多肽将通过至少一步纯化步骤来制备。
[0086] “天然序列”多核苷酸是与来自自然的多核苷酸具有相同核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是与来自自然(例如来自任何物种)的多肽(例如抗体)具有相同氨基酸序列的多肽。这类天然序列多核苷酸和多肽可以从自然分离得到，或可以通过重组或合成方式产生。
[0087] 如本文所用的术语多核苷酸“变体”是存在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文所具体公开的多核苷酸的多核苷酸。这类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如通过修饰本发明的一种或多种多核苷酸序列，并按本文所述和/或使用本领域内公知的多种技术中的任何一种评价所编码的多肽的一种或多种生物学活性。
[0088] 如本文所用的术语多肽“变体”是存在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文所具体公开的多肽的多肽。这类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如通过修饰本发明的一种或多种上述多肽序列，并按本文所述和/或使用本领域内公知的多种技术中的任何一种评价所述多肽的一种或多种生物学活性。
[0089] 修饰可以在本发明的多核苷酸和多肽结构中进行，并且仍可获得编码具有所需特性的变体或衍生多肽的功能性分子。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生本发明多肽的等同的或甚至是改进的变体或部分时，本领域技术人员通常改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
[0090] 例如，在蛋白结构中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不会造成其与其他多肽(例如抗原)或细胞结合能力的明显损失。由于是蛋白的结合能力和特性限定了该蛋白的生物功能活性，因此可以在蛋白序列和其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且仍能获得具有相似特性的蛋白。因而应当考虑可以在所公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应的DNA序列中进行各种改变，只要不会造成其生物学功能或活性的明显损失。
[0091] 在进行这些改变时，还应当考虑氨基酸的亲水指数。本领域内普遍理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物学功能中的重要性(Kyte and Doolittle，1982)。被接受的是氨基酸的相对亲水特性与得到的蛋白的二级结构有关，而该二级结构随之限定了该蛋白与诸如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等其他分子的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸具有指定的亲水指数(Kyte and Doolittle，1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。本领域内已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，而仍产生具有相似生物学活性的蛋白，即仍获得生物学功能等同的蛋白。在进行这些改变时，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选的是在±0.5以内的那些氨基酸的取代。
[0092] 本领域内还应当理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利第4,554,101号陈述，蛋白的最局部的平均亲水性，如通过其邻近的氨基酸的亲水性所控制，与所述蛋白的生物学特性相关。如美国专利第4,554,101号详述，已将下述亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一氨基酸取代，且仍获得生物学上等同的尤其是免疫学上等同的蛋白。在这类改变中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选的是在±0.5以内的那些氨基酸的取代。
[0093] 如上文所述，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对的相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。综合考虑了上述各种特性的示例性取代是本领域技术人员所公知的，并且包括：精氨酸与赖氨酸、谷氨酸与天冬氨酸、丝氨酸与苏氨酸、谷氨酰胺与天冬酰胺、以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。
[0094] 多肽在蛋白的N末端可以包含信号(或前导)序列，其在翻译的同时或在翻译后指导蛋白的转移。多肽还可以与连接物或其他序列缀合，以便于多肽的合成、纯化或鉴定(例如，多聚组氨酸)，或用于增强多肽与固相支持物的结合。
[0095] 多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。“序列子”是蛋白中的三个连续氨基酸序列，其可以充当与称为N-连接的聚糖的多糖(糖)的连接位点。这是一种通过天冬酰胺(Asn)侧链的氮原子与蛋白连接的多糖。序列子是Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中这些三肽序列中的任何一种的存在会产生可能的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的为丝氨酸或苏氨酸，但是也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。尽管序列子Asn-X-Ser/Thr是N-连接的寡糖与糖蛋白连接所绝对必需的(Marshall RD，Biochemical Society Symposia40，17-26 1974)，但是其存在并非总是导致糖基化，糖蛋白中的一些序列子可以保持非糖基化(Curling EM，et al.，Biochemical Journal 272，333-3371990)。
[0096] 聚糖微阵列是研究碳水化合物-蛋白相互作用的有力工具，并为流感病毒亚分型提供新的平台(Blixt O，et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA101：17033-17038；Chandrasekaran A，et al.(2008)Nat Biotechnol26：107-113；Liang PH，et al.(2007)J Am Chem Soc 129：11177-11184；Stevens J，et al.(2008)J Mol Biol 381：1382-1394)。
它们模拟细胞表面的聚糖，表现出高亲和力和特异性的多价相互作用。利用该技术，对各种天然的和突变的HA的受体特异性进行表征，从而为区分流感病毒亚型提供新的平台。
它们模拟细胞表面的聚糖，表现出高亲和力和特异性的多价相互作用。利用该技术，对各种天然的和突变的HA的受体特异性进行表征，从而为区分流感病毒亚型提供新的平台。
[0097] 尽管是有力的方法，但是通过聚糖阵列分析来理解HA-聚糖相互作用由于两个问题而复杂化：第一，HA结合特异性受阵列聚糖的空间排列和组成以及所用的结合检测方法影响(Srinivasan A，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：2800-2805)。第二，糖基化位点处或附近的肽序列的改变可以改变HA的3D结构，并因此改变受体结合特异性和亲和力。的确，来自不同H5N1亚型的HA具有不同的聚糖结合模式(Stevens J，et al.(2008)J Mol Biol 381：1382-1394)。在整个病毒系统中研究了H1和H3上的糖基化位点的诱变(Chandrasekaran A，et al.(2008)Nat Biotechnol26：107-113；Deom CM，et al.(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83：3771-3775)。然而，还不了解糖基化的改变如何影响受体结合特异性和亲和力，尤其对于大多数致病性H5N1HA来说。为了解决这些问题，开发出了定量聚糖微阵列谱方法，以克服传统HA结合实验的限制。
[0098] 之前的研究使用昆虫细胞表达的HA(Chandrasekaran A，et al.(2008)Nat Biotechnol 26：107-113)。但是昆虫细胞中的糖基化与哺乳动物细胞不同，明显的差异是昆虫细胞中不产生以半乳糖和唾液酸为末端的复合型N-聚糖。
[0099] 从人类细胞表达的HA糖基化的变体
[0100] 为了在人类细胞中解决如何使糖基化发生影响受体结合特异性和亲和力的改变，利用流感H5N1HA共有序列(Chen MW，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：13538-13543)制备包含HA结合配体的广泛结构类似物的聚糖微阵列和数种确定的HA糖型，用于进行定量结合分析。
[0101] CHA5的密码子用人类密码子进行表达优化。如表1所示，原始的病毒蛋白酶切割位点PQRERRRKKRG(SEQ ID NO：1)被突变成PQRERG(SEQ ID NO：2)，以便防止蛋白从酶促切割形成HA1和HA2。跨膜区(残基：533-555)用HA构建体的C末端处的其他残基GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG (SEQ ID NO：3)取代，其中凝血酶切割位点为斜体，噬菌体T4fibritin折叠子三聚序列用下划线表示，并且组氨酸标签为粗体(Stevens J.et al.(2006)Science 312：404-410)。
[0102] 表1.共有H5血凝素序列
[0103]
[0104]
[0105] H5共有序列用于产生从HEK293人类细胞表达的HA糖基化的变体。为了产生高甘露糖型糖基化(HAhm)，使用N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI-)缺陷的HEK293S细胞。为了进一步解决HA糖基化对受体结合亲和力和特异性的影响，将HA上的糖从天然复合型N-聚糖顺序移除(图1A)。通过神经氨酸酶(NA)处理从HAfg去除唾液酸残基，从而产生去唾液酸的HA(HAds)。糖苷内切酶H(Endo H)用于将所有的聚糖结构截短至单个GlcNAc残基，从而产生单糖基化的HA(HAmg)。因此，共产生四种糖型的HA：HAfg：来自人HEK293E细胞的完全糖基化的HA；HAds：用神经氨酸酶(NA)处理HAfg产生的去唾液酸的HA；HAhm：来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶I缺陷(GnTI-)型HEK293S细胞的高甘露糖型HA；和HAmg：用糖苷内切酶H(Endo H)处理HAhm产生的在其糖基化位点具有单个N-乙酰葡糖胺残基的HA(图1A和图6)。聚糖结构通过质谱分析证实(图7、8、9)。变体的圆二色性证实它们的结构是相似的(图1C)。然后研究N-聚糖对不同糖型的HA的独特影响，假设这些样品的蛋白3D结构相似，并且在分析中没有引起偏差(图1B)。注意，在大肠杆菌中表达功能性HA的尝试失败了，因为其中没有糖基化。
[0106] 此外，质谱法分析证实(a)HAfg主要含有复合型N-聚糖(图7A)；(b)唾液酸已从HAds上的复合型N-聚糖移除(图7B)；(c)HAhm主要含有高甘露糖型N-聚糖(图7C)；以及(d)HAmg表现出在HA上仅有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)(图1和图8)。
[0107] HA糖基化变体的聚糖微阵列谱型
[0108] 用传统的三明治方法检验HA糖基化变体HAfg、HAds、HAhm和HAmg的聚糖微阵列谱型。设计由17种α2，3(聚糖1-17)唾液酸苷和7种α2，6(聚糖21-27)唾液酸苷组成的合成的唾液酸聚糖阵列，以研究流感病毒的聚糖特异性(参见图4)。制备以胺为末端具有五碳连接物的合成的唾液酸苷，并通过于室温水性条件下形成酰胺键共价连接于NHS包被的玻璃载玻片上。印刷步骤基于标准微阵列自动印刷技术，如之前所报道的(Blixt O，et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101：17033-17038；Wang CC，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：11661-11666)。将HA变体施加于唾液酸载玻片上，然后与一抗杂交，随后用偶联于Cy3的二抗检测。该项分析表明，H5N1HA共有序列特异地与α2，3唾液酸苷结合，但是不与α2，6唾液酸苷结合(图2A)，这与之前的报道一致(Chandrasekaran A，et al.(2008)Nat Biotechnol 26：107-113；Stevens J，et al.(2008)J Mol Biol 381：1382-1394)。出乎意料的是，经由相对荧光强度的定性结合，与α2，3唾液酸苷的结合强度从HAfg、HAds和HAhm向HAmg依次增强(图2A)。
[0109] HA与设计用于流感病毒的含有17种α2，3(聚糖1-17)唾液酸苷和7种α2，6(聚糖21-27)唾液酸苷的合成的聚糖阵列接触(图4)，然后使HA蛋白与未标记的一抗杂交，随后通过加Cy3标签的二抗检测。该分析表明，共有序列的流感H5NI血凝素可特异性地与α2-3唾液酸苷结合，但是不与α2-6唾液酸苷结合(图2A)。出乎意料的是，在聚糖阵列分析的强度比较中，与α2，3唾液酸苷的结合从HAfg、HAds和HAhm向HAmg依次增强(图2A)。
[0110] 定量的聚糖微阵列
[0111] 聚糖阵列谱型分析受限于结合事件研究中的定性特性，因为其仅提供相对的荧光强度，并且用户不能区别与不同实验的受体的结合亲和力。为了精确测定结合事件，扩展该微阵列平台，以定量地测定HA-聚糖相互作用的解离常数。
[0112] 设计定量阵列，以测定表面解离常数(Liang PH，at el.(2007)J Am Chem Soc 129：11177-11184)。为了避免抗体层积的任何相位差，用荧光染料Cy3直接标记HA(Srinivasan A，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA105：2800-2805)。通过系列稀释Cy3标记的HA进行直接的结合测定来建立相对结合强度。对于压印在玻璃载玻片上的24种唾液酸苷中的每一种，通过用HA浓度对荧光强度作图来确定表面解离常数。基于朗缪尔等温线计算解离常数KD，surf值(参见图2B)。单价HA-唾液酸苷结合是弱的，表现出微摩尔范-3围的解离常数(KD＝2.5×10 M)(Sauter NK，et al.(1989)Biochemistry 28：8388-8396)；
但是，HA参与与宿主细胞表面上的唾液酸苷发生多价相互作用，这可以在定量阵列谱型中看到(表2)。KD，surf值整体和基本上随着HA上N-聚糖的长度降低而减小(图2B)。
但是，HA参与与宿主细胞表面上的唾液酸苷发生多价相互作用，这可以在定量阵列谱型中看到(表2)。KD，surf值整体和基本上随着HA上N-聚糖的长度降低而减小(图2B)。
[0113] 所有的HA糖型均表现出与具有硫酸盐基团的受体聚糖的强烈结合，该硫酸盐基团位于非还原末端第三GlcNAc残基的6位处(聚糖4和7)。该硫酸盐基团对于与H5HA的结合至关重要(Chandrasekaran A，et al.(2008)Nat Biotechnol 26：107-113；Stevens J，et al.(2008)J Mol Biol381：1382-1394)。此外，观察到，聚糖4是HAfg的最佳配体，而对于HAmg，聚糖13-15是优于聚糖6的配体，这表明配体结合位点内可能有多价相互作用，或者更多的受体结合结构域暴露于更大的二天线唾液酸苷(聚糖13和14)。有趣的是，当HA的N-聚糖结构的复杂性变低时，HA结合基本增加(图2B)。然而，尽管HAmg的KD，surf值表现出与少数SA聚糖更强且相似的结合，但是其他HA变体表现出与聚糖配体更弱且更特异的结合(图2B和10)。因此，结合特异性和结合亲和力可具有反比关系，这种关系受聚糖结构调节。该调节具有重要的生物学意义，因为HA上的碳水化合物可以调整其对肺上皮细胞上的聚糖受体的识别。
[0114] 受体唾液酸苷的结合能贡献
[0115] 动力学参数可应用热力学参数来阐明分子详情中的相互作用事件。HA-聚糖相互作用的解离常数(KD，surf)可用于计算结合的吉布斯自由能改变(ΔGmulti)。ΔGmulti值代表来自HA-聚糖相互作用的稳定能的定量测定结果。ΔGmulti的连续减小与HA上的N-聚糖结构的复杂性/截断的系统性降低相关(表2)。
[0116] 表2.当与α2，3唾液酸苷1-15结合时，HA糖基化变体的解离常数(KD，surf)和自由能改变(ΔG)
[0117]
[0118]
[0119] 表2显示对应于α2，3唾液酸苷1-15的具有不同糖基化的HA的热力学参数。显示对应于α2，3唾液酸苷1-15的HA-聚糖相互作用的自由能改变(ΔG)和KD，surf。通过使-1用方程ΔGmulti＝-RT ln(KD，surf )，ΔG值来源于KD，surf值。ΔG值是按照KD，surf值计算得出的，用于获得HA-聚糖结合中的自由能改变。聚糖5和9的ΔG(HAfg)未被测出，ND表示未测出(*来自15组鉴定的HA结合唾液酸苷，通过单向方差分析显示四种HA糖型的KD，surf值在统计学上差异显著(P＜0.05被认为显著的))。
[0120] HA变体之间自由能改变的差异(ΔΔG)是由独特的聚糖结构导致的(图10)，并且最大差异在HAfg和HAmg之间(ΔΔG HAfg→HAmg；参见图10)，这与将大多数N-聚糖修剪成单GlcNAc的所产生的结合能的最大差异一致。注意，除了聚糖4和7之外，ΔΔG值是相似的(图10)，这表明HA上的聚糖不会显著影响与硫酸化的α2，3三糖的结合亲和力(Chandrasekaran A，et al.(2008)Nat Biotechnol 26：107-113)。
[0121] HA-受体结合
[0122] 可以通过比较不同受体唾液酸苷之间的自由能改变(ΔΔG值)的差异来论述HA-受体结合的分子详情(即来自包含聚糖受体的每个结构组分的贡献)(图4和11)。解析负责HA结合的受体唾液酸苷的能量贡献揭示特异性的关键点，这可用来设计新的HA抑制剂。用β1，4(Galβ1-4)键连接于半乳糖残基的唾液酸苷α2，3比用Galβ1-3键连接的那些唾液酸苷α2，3具有更好的结合亲和力(Stevens J，et al.(2008)J Mol Biol381：1382-1394)。这在Neu5Ac-α2，3-半乳糖(Neu5Acα2，3Gal)二糖主链的比较中得到反映(图4A，聚糖1，红框突出)，其中三糖3和6仅在Gal和GlcNAc之间的键中不同。此处，所有HA变体的ΔΔG(1→3)都是负的(稳定HA-受体相互作用)，而所有HA变体的ΔΔG(1→6)都是正的(使HA-受体相互作用不稳定；图4A和11)。这个观察结果表明，Neu5Ac-α2，3Galβ1-4Glc/GlcNAc是与HA-结合口袋相互作用的核心聚糖组分。而且，所有HA变体的ΔΔG(1→9)都是正的，这表明负扰动是由第三位的β6-连接的甘露糖导致(图4A和11)。因此，结合能受内部糖残基和它们与远端Neu5Ac-α2，3Gal二糖配体的连接模式的影响(图4A)。该分析表明第三位的GlcNAc残基对所有HA变体都是有利的。但是，在比较聚糖13和14(图4E和11)与聚糖6的ΔΔG值时，在结合位点中与二天线唾液酸苷的多价相互作用明显，并且对于HAmg，该分子内部的亲和力对于驱动结合比第三个糖所贡献的结构效应更加显著。
[0123] 然后，比较受体聚糖10、11、12和15。这些具有相同的基本核心结构(聚糖8三糖)，但是在第三位的α2，6唾液酸的延长(聚糖11和12)或添加上不同(聚糖15；图4B)。有趣的是，具有分支α2，6唾液酸的唾液酸苷很好地增加HA亲和力，而从聚糖8延伸的更长的α2，3唾液酸苷导致与HA的结合更弱(ΔΔG(8→15)＞ΔΔG(8→11)～ΔΔG(8→10)＞ΔΔG(8→12)；图4B和11)。
[0124] 聚糖3-5和6-7共享相同的三糖主链，但是由于在从非还原末端的第三个GlcNAc上添加硫酸盐基团(聚糖4)或海藻糖残基(聚糖5)而不同。硫酸盐基团能使HA-受体聚糖相互作用稳定高达2.044kcal/mol(ΔΔG(6→7))，这是两个受体唾液酸苷间的最大能量间隔。在所有的HA变体中，完全糖基化的变体在自由能改变上呈现出最显著的差异，值为ΔΔG(3→4)HAfg(-1.653kcal/mol)和ΔΔG(6→7)HAfg(-2.044kcal/mol)，并且随着聚糖结构更加简化时，自由能增益的大小减小；即HAfg＞HAds＞HAhm＞HAmg。因此，硫酸盐化的聚糖显著增强HA结合，并且完全糖基化的HA使得该效应最大化(图4C和D)，这对于H5N1发病机理至关重要。另一方面，岩藻糖化的受体类似物极大地稳定HA结合，所有糖基化的HA变体都显示为正的ΔΔG(3→5)(图4C)。在ΔΔG(3→4)和ΔΔG(3→5)中的这些大的差异可能是由受体-结合口袋中的重要结合相互作用引起的，其中硫酸盐基团使其最大化，且海藻糖在空间上阻碍。HAfg的弱结合不可能是由于其唾液酸化聚糖的竞争，因为去除唾液酸对结合的影响较小，并且HAfg对某些唾液酸化聚糖仍表现出强的亲和力。
[0125] 利用单糖基化的HA的疫苗设计
[0126] 单糖基化的血凝素HAmg与其完全糖基化的对应物相比，表现出相似的二级结构和对宿主受体更好的结合亲和力。最近的研究还表明，Asn的单个GlcNAc残基是糖蛋白折叠和稳定所需的最小的N-聚糖组分(Hanson SR，et al.(2009)Proc Natl Acad Sci USA106：3131-3136)。因为伴随聚糖的蛋白是较好的免疫原，所以将单糖基化的HA作为抗流感病毒的蛋白疫苗来检验。将来自HAfg和HAmg免疫的抗血清就其结合天然HA和中和H5病毒的能力进行比较(图5)。的确，与HAfg相反，来自HAmg的抗血清表现出更强的病毒中和能力。除了H5亚型越南/1194、H5(安徽)和H5(ID5/2005)之外，HAmg抗血清还与H1(新喀里多尼亚株/1999)结合(图5D)。显然，在激发研究中，HAmg疫苗比HAfg疫苗更具保护性(图5C)。
[0127] 图3中对从人类分离得到的H1、H3和H5的氨基酸序列进行比较。当将H1与H3以及H3与H5进行比较时，观察到总氨基酸序列以及N-糖基化位点附近的那些氨基酸序列中的差异。H1和H5表现出更高的总氨基酸序列相似性，并且N-糖基化位点附近的序列更保守。季节性(A/布里斯班株/59/2007)和流行性(A/加利福尼亚株/07/2009)H1菌株显示大约79％的序列同一性。H1和H5之间的总序列同一性大约为63％，H3和H5之间以及H1和H3大约为40％。此外，N-糖基化位点(在图3的红框中显示)和有下划线的肽序列在H1和H5之间比在H1/H3和H5之间更保守。
[0128] 本发明显示，HA上N-聚糖的系统性简化导致与α2，3唾液酸苷的结合连续增加，但是不与α2，6唾液酸苷结合。本发明人第一次表明，HA外部和内部的聚糖对受体结合的影响，和定量解析HA-受体相互作用的结合亲和力和能量贡献。
[0129] HA糖基化影响流感HA的功能(Wagner R，et al.(2002)J Gen Virol83：601-609)。有趣的是，自从1968年以来，随着流感H3N2的糖基化水平的增高，发病率、死亡率和肺病毒滴度降低(Vigerust DJ，et al.(2007)J Virol 81：8593-8600)。
[0130] 不希望受到理论的束缚，发现以单个GlcNAc连接于糖基化位点的HA显示出不严格的特异性，但是与α2，3唾液酸苷的亲和力的增强提示HA上的N-聚糖可以在HA-受体结合结构域附近产生空间位阻。对受体唾液酸苷的高特异性可以防止病毒与人类肺上皮细胞表面上的一些其他特定聚糖结合。另一方面，具有截短的聚糖的HA可以以更高的结合亲和力和更小的特异性识别α2，3受体唾液酸苷，这提示降低HA上聚糖的长度可以增加禽流感感染的风险。但是，还不清楚通过糖基化而发生的HA-受体相互作用的改变如何影响病毒的感染力和病毒生命周期中的NA活性。
[0131] 具有单个GlcNAc的HA是有前途的流感疫苗候选者，因为这种构建体保留了HA的完整结构，并且容易制备(例如通过酵母)。它还可以暴露由大聚糖掩盖的保守表位，从而激发以更高滴度识别HA变体的免疫反应。该策略为疫苗设计打开了新的方向，并且与其他不同的疫苗策略一起(Hoffmann E，et al.(2005)Proc Natl Acad Sci USA102：12915-12920；Huleatt JW，et al.(2008)Vaccine 26：201-214；Scanlan CN，et al.(2007)J Mol Biol 372：16-22；Yang ZY，et al.(2007)Science 317：825-828)以及HA中和抗体的最新发现(Ekiert DC，et al.(2009)Science 324：246-251；Kashyap AK，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：5986-5991；Scheid JF，et al.(2009)Nature
458：636-640；Stevens J，et al.(2006)Science 312：404-410；Sui JH，et al.(2009)Nat Struct Mol Biol 16：265-273)一定会促进抗病毒疫苗的发展，所述病毒例如流感病毒、丙型肝炎病毒和HIV。
458：636-640；Stevens J，et al.(2006)Science 312：404-410；Sui JH，et al.(2009)Nat Struct Mol Biol 16：265-273)一定会促进抗病毒疫苗的发展，所述病毒例如流感病毒、丙型肝炎病毒和HIV。
[0132] 因此，检验具有单个GlcNAc的HA是否有前途的流感疫苗候选者。为了其与0.2-3的唾液酸苷的强烈结合的目的，具有单个GlcNAc的HA可以激发以更高滴度识别RBD附近区域的免疫反应，这表明通过修饰或掩盖病毒上的抗原表位而添加的寡糖可以是免疫逃避的有效方法。因此，去除大多数聚糖，但保留至少一个GluNAc的策略为将来的疫苗设计打开新的方向，并且该概念对诸如HCV、HBV和HIV的其他抗病毒疫苗设计提供了见解。其他重复保留了原始聚糖链的两个、三个或更多个聚糖。
[0133] 作为疫苗的部分糖基化的细胞表面糖蛋白
[0134] 病毒的细胞表面糖蛋白是疫苗开发的良好靶标。但是，这类表面蛋白通过宿主而被高度糖基化，从而保护病毒逃避宿主的免疫系统。此外，糖基化位点附近的病毒蛋白序列通常是高度保守的，并因此是疫苗设计的良好抗原，然而，这些高度保守的区域至少在一定程度上不容易为宿主的免疫系统捕获，因为糖基化的数量覆盖或封闭了这些区域。例如，在制备抗完整HIV疫苗中受限地成功的一个原因是由于病毒表面的gp120是高度糖基化的。
[0135] 新的疫苗是更具有免疫原性的，并且所诱导的抗体预计具有抗完整糖蛋白的更好的中和活性，该完整糖蛋白由病毒和宿主产生。抗体既能攻击更可能发生突变的较少糖基化或非糖基化的区域，又能攻击高度保守的糖基化区域，该糖基化区域很少可能会突变和/或对突变敏感。由此产生的抗体将会与靶标的蛋白部分发生强烈的相互作用，因为这类抗体对蛋白的亲和力高于对碳水化合物的亲和力，并且因此，其在热力学上将推开聚糖链，从而与糖基化位点周围高度保守的区域结合。
[0136] 在O-连接的和N-连接的糖蛋白中，第一个糖(N-糖蛋白的N-乙酰葡糖胺和O-糖蛋白的N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)是维持糖蛋白的三级结构所必需的，而余下的糖是不重要的。用糖苷内切酶(endoH)处理N-糖蛋白将会去除糖链，并保持N-乙酰葡糖胺与蛋白连接。甘露糖苷酶也可以用来将N-糖蛋白切割成二聚糖或三聚糖，本文特别将所述二聚糖或三聚糖考虑为可能的疫苗，因为免疫系统能接近蛋白上的保守的糖基化位点，即便其为二、三或更大去糖基化的蛋白。还可以利用其他糖苷酶，以从O-糖蛋白去除糖链，并保持第一个糖与所述蛋白连接。
[0137] 当在人类细胞中表达的来源于禽流感(H5)的完全糖基化的血凝素(HA)用endoH处理，以将糖基化降低至单糖基化状态，并用于免疫兔子时，产生的抗血清的滴度比从完全糖基化的血凝素所产生的抗血清的滴度高(图13A-13B)。它还能中和来源于其他禽流感菌株的血凝素和来源于人流感的血凝素H1，而来源完全糖基化的HA的抗血清不能中和H1，并且对禽流感菌株的特异性更高。
[0138] H1和H5之间糖基化模式和蛋白结构的相似性提供了为什么单糖基化的H5抗血清与H1发生杂交反应的可能的原因。用兔抗血清获自数据(图13)。如图12-14所示，H3的血凝素不具有与H5HA和H1HA相同程度的同源性。因此，从H1和H5产生的抗血清不中和H3。然而，由于H3与H1和H5在保守区中分享其他同源性，从去糖基化的血凝素H3产生的抗血清除了中和血凝素H3之外还中和血凝素H1和血凝素H5。
[0139] 为了制备单糖基化的血凝素，没有必要从人类细胞培养物产生糖蛋白，因为具有前三种糖(甘露糖—N-乙酰葡糖胺—N-乙酰葡糖胺)的糖蛋白或仅与单糖(N-乙酰葡糖胺)连接的蛋白(即N-乙酰葡糖胺—蛋白)在真核生物中是高度保守的。因此，可以在酵母、杆状病毒或其他真核生物宿主中产生糖蛋白，并用N-连接的糖蛋白的诸如endoH或甘露糖苷酶的合适的糖苷酶处理糖蛋白混合物，以制备可用作疫苗的同源的单糖基化的蛋白。
[0140] 不希望受到理论的束缚，假定N-连接的聚糖远长于O-连接的聚糖，并且是N-连接的聚糖需要被修剪以去除其他糖链。因此，O-连接的聚糖不会产生问题，即便其是完整的。
[0141] 暴露于免疫系统的天然的糖蛋白具有N-连接的支链糖蛋白。由于糖基化，高度保守的区域难以接近免疫系统。免疫系统只可以靶向高度可变区，进而由于可变区会发生突变而降低个体对多种病毒感染的敏感性。如果免疫系统能接近高度保守的区域，那么针对不会随时间而改变的这些序列的抗体提供用于抗病毒接种免疫的途径，所述病毒或者具有可突变并进而使现存的抗糖蛋白的抗体无效的可变区，或者是被浓密地糖基化，以致基本上无法接近免疫系统。
[0142] 因此，为了通过疫苗使蛋白可接近免疫系统，去除糖基化，从而将天然的病毒蛋白暴露于免疫系统。重要的是，从蛋白完全去除糖被证实会导致蛋白变性；在多数病毒糖蛋白中，糖基化是糖蛋白三级结构的重要组分。
[0143] 通过将分离的天然糖基化的蛋白暴露于诸如endoH或甘露糖苷酶的N-糖苷酶来去除糖，所述N-糖苷酶会从糖蛋白切割除了前一个、两个或三个糖之外的所有糖，而不会导致蛋白丧失其三级结构。然后将去糖基化的蛋白与合适的药物载体配制成疫苗，并给予个体。因为高度保守的糖基化区域现在被去糖基化，并进而暴露于免疫系统，产生抗高度保守区域的抗体。
[0144] 当用病毒感染被免疫的个体，且病毒糖蛋白暴露于免疫系统时，针对蛋白高度保守区域的抗体存在于个体系统中。因此，可变区中的突变变得不相关，因为仍有针对糖蛋白非突变的保守区域的抗体。
[0145] 此外，糖基化不会妨碍抗体与高度保守区域的结合，因为抗体在热力学上倾向于结合蛋白，并将糖“推出”至不挡道的位置，用于抗体与高度保守区域的结合。重要的是，在诸如HIV的gp120的病毒蛋白中，该策略提供了接种免疫的方法和组合物，其中免疫系统会毫无疑问地产生大到足以有效战胜感染的抗体滴度。
[0146] 按照体现这些原理的实施过程，考虑包含至少一种去糖基化的血凝素和药物可接受的载体的疫苗。可以利用能表达糖基化蛋白的任何系统，例如酵母和杆状病毒，来制备疫苗。一旦产生了蛋白，就利用合适的方法分离它们，例如凝胶电泳、色谱法或能分离蛋白的其它方法。
[0147] 糖基化位点的糖基化模式几乎在所有的真核生物中都是保守的(GlcNAc-GlcNAc-Man)。因此，下游糖基化模式是什么无所谓，只要保留有前1-3个(可能更多地取决于被接种的有机体和产蛋白的有机体)糖就可以。因此，对于人类疫苗而言，酵母可用于产生人类疫苗接种中所用的蛋白，因为一旦将除了前一到三个糖之外的所有糖均切割了，则所得模式就与人类版本的糖蛋白的前一到三个糖一致。因此，本公开提供了用于高通量、高输出地产生抗病毒疫苗的特有平台，所述病毒诸如流感病毒、HIV和黄病毒属。
[0148] 为了产生疫苗，分离糖基化的蛋白，然后用糖苷酶或另一种酶或选择性消化形成糖基化的碳水化合物的方法将其(部分)去糖基化。但是，无论用什么方法切割糖链，一定不能影响基础蛋白的三级结构。
[0149] 还可以通过合成制备部分糖基化的糖蛋白或其片段。有两种策略用于合成糖肽。(i)逐步法：糖基氨基酸被用作固相合成的构建模块。该方法的优点是“广泛地用于”制备各种糖肽。该方法允许制备具有一些寡糖部分的糖肽。(ii)会合法：分别制备寡糖部分和肽部分，然后彼此连接。通常，该方法用于制备N-糖肽。该方法需要肽部分中的“糖基化点”具有特殊的正交的侧链保护基。
[0150] 在一实施方案中，可以利用建立多肽节段的硫酯方法(Merrifield RB.J.Am.Chem.Soc.85：2149(1983)和用于并入糖肽部分的二甲基硫代磷酰混合酐(Mpt-MA)方法(Guo，ZW，et al.(1997)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36，1464-1466)来合成连接于肽的天冬酰胺残基的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。
[0151] 由单糖基化的HA蛋白产生的可发生交叉反应的流感疫苗
[0152] (A)用季节性H1(布里斯班株)单糖基化的HA蛋白的疫苗接种
[0153] 血细胞凝集抑制测定用于检测来自H1(布里斯班株)疫苗接种的抗血清是否可以抑制NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒凝集红细胞的能力。如图15A所示，来自用H1(布里斯班株)单糖基化的HA(HAmg)疫苗接种的抗血清比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地抑制NIBRG-121(H1N1/2009)病毒凝集红细胞的能力。
[0154] 微量中和测定用于检测来自H1(布里斯班株)疫苗接种的抗血清是否能中和NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒感染MDCK细胞的能力。如图15B所示，来自H1(布里斯班株)的单糖基化的HA(HAmg)比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地中和NIBRG-121(H1N1/2009)病毒感染MDCK细胞的能力。
[0155] 进行病毒激发实验以显示用来自H1(布里斯班株)单糖基化的HA的疫苗接种可以保护免受NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒激发。如图15C所示，单糖基化的HA(布里斯班株)作为疫苗保护BALB/c小鼠免受NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒激发。相反，存在于由非活化病毒产生的传统流感疫苗中的完全糖基化的HA显示出没有抗H1N1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)病毒感染的交叉反应能力。
[0156] 图16A-16C显示WSN(H1N1)1933受单糖基化的H1(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清的抑制。图16A显示对WSN(H1N1)1933病毒凝集红细胞能力的抑制。图16B显示对WSN(H1N1)1933病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图16C显示保护BALB/c小鼠免受WSN(H1N1)1933流感病毒的感染。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5μg)免疫小鼠的抗血清，并且用于攻击的病毒是WSN(H1N1)1933(100×LD50)。
[0157] 如图16A所示，来自H1(布里斯班株)的单糖基化的HA(HAmg)疫苗接种的抗血清比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地抑制WSN(H1N1)1933病毒凝集红细胞的能力。如图16B所示，来自H1(布里斯班株)的单糖基化的HA(HAmg)比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地中和WSN(H1N1)1933病毒感染MDCK细胞的能力。如图16C所示，单糖基化的HA(布里斯班株)作为疫苗保护BALB/c小鼠免受WSN(H1N1)1933病毒攻击。相反，存在于由非活化病毒产生的传统流感疫苗中的完全糖基化的HA显示出没有抗WSN(H1N1)1933病毒感染的交叉反应能力。
[0158] 图17A-17C显示A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8受单糖基化的H1(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清的抑制。图17A显示对PR8病毒凝集红细胞能力的抑制。图17B显示对PR8病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图17C显示保护BALB/c小鼠免受PR8流感病毒的感染。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5μg)免疫小鼠免疫小鼠的抗血清，并且用于攻击的病毒是PR8(100×LD50)。
[0159] 如图17A所示，来自H1(布里斯班株)的单糖基化的HA(HAmg)疫苗接种的抗血清比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地抑制PR8病毒凝集红细胞的能力。如图17B所示，来自H1(布里斯班株)的单糖基化的HA(HAmg)比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地中和PR8病毒感染MDCK细胞的能力。如图17C所示，单糖基化的HA(布里斯班株)作为疫苗保护BALB/c小鼠免受PR8病毒攻击。相反，存在于由非活化病毒产生的传统流感疫苗中的完全糖基化的HA显示出没有抗PR8病毒感染的交叉反应能力。
[0160] (B)用新的H1(流行性2009A(H1N1)疫苗品系)单糖基化的HA蛋白的疫苗接种[0161] 分离流感病毒H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)HA编码序列，并按实施例1所述进行修饰用于表达。表3显示修饰的流行性2009A(H1N1)疫苗菌株H1/HA del-TM-FH6的序列，其中信号肽序列有下划线，并为粗体，凝血酶切割位点为斜体，噬菌体T4 fibritin折叠子三聚序列和组氨酸标签有下划线，并且连接物序列为粗体并有下划线。
[0162] 表3.流感H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)血凝素序列
[0163]
[0164]
[0165] 血细胞凝集抑制测定用于检测来自H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)疫苗接种的抗血清是否可以抑制WSN(H1N1)病毒凝集红细胞的能力。如图18A所示，来自用H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)单糖基化的HA(HAmg)疫苗接种的抗血清比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地抑制WSN(H1N1)病毒凝集红细胞的能力。
[0166] 微量中和测定用于检测来自H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)疫苗接种的抗血清是否能中和WSN(H1N1)病毒感染MDCK细胞的能力。如图18B所示，来自H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)的单糖基化的HA(HAmg)比完全糖基化的HA(HAfg)和非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地中和WSN(H1N1)病毒感染MDCK细胞的能力。
[0167] 利用病毒激发实验以显示用来自H1(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)单糖基化的HA的疫苗接种可以保护免受WSN(H1N1)1933或A/波多黎各/8/34(H1N1)：PR8病毒激发。单糖基化的HA(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)作为疫苗保护BALB/c小鼠免受WSN(H1N1)或PR8病毒激发。相反，存在于由非活化病毒产生的传统流感疫苗中的完全糖基化的HA显示出没有抗WSN(H1N1)或PR8病毒感染的交叉反应能力。
[0168] 来自其他流感病毒菌株的部分糖基化的(例如单糖基化的)HA也可以用来配制在预防或降低由一种或多种流感病毒菌株或亚型引起的感染中有活性的有效疫苗。可以从任意数量的病毒分离流感病毒HA编码序列，并按实施例1所述进行修饰用于表达。然后克隆HA并在真核表达系统中表达，然后进行去糖基化，从而在糖基化位点保留一到三个糖基化(优选单糖基化)。
[0169] 表4显示修饰的H1A del-TM-FH6的共有序列，其中信号肽序列有下划线并为粗体，凝血酶切割位点为斜体，噬菌体T4 fibritin这笛子三聚序列和组氨酸标签有下划线，并且连接物序列为粗体并有下划线。
[0170] 表4.共有H1 A del-TM-FH6血凝素序列
[0171]
[0172]
[0173]
[0174] 表5显示修饰的H1-C del-TM-FH6的共有序列，其中信号肽序列有下划线并为粗体，凝血酶切割位点为斜体，噬菌体T4 fibritin折叠子三聚序列和组氨酸标签有下划线，并且连接物序列为粗体并有下划线。
[0175] 表5.共有H1-C del-TM-FH6血凝素序列
[0176]
[0177]
[0178] 由本公开的去糖基化的HA肽产生的疫苗表现出抗呼吸道病毒的抗病毒活性，所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞体病毒(RSV)和各种类型的流感病毒，例如甲型流感病毒和乙型流感病毒。有利的是，本公开的抗病毒肽表现出抗多种流感菌株的抗病毒活性，包括季节性的、禽(例如H5N1菌株)和猪流感。按照所公开的一些方法，还可以预防或治疗由这些病毒感染所引发的疾病。
[0179] (C)H1/HA蛋白上的糖基化位点
[0180] 流感H1HA分子有四个不同的抗原位点：Sa、Sb、Ca和Cb(Luoh SM，et al.(1992)J Virol 66：1066-1073)。这些位点由季节性人类H1N1病毒的HA分子中的最可变的氨基酸组成，这类病毒自从1918年出现以来，就遭受抗体介导的免疫压力。
[0181] 利用血细胞凝集抑制(HI)测定和疫苗接种/激发研究，已经表明，2009年流行性H1N1病毒在抗原性上与1918-1943年传播的人类H1N1病毒和经典的猪H1N1病毒相似。发现抗1918年-样或经典猪H1N1疫苗的抗体能完全保护C57B/6小鼠免受甲型流感/荷兰株/602/2009病毒分离体的致死激发。发现用抗1918或A/加利福尼亚株/04/2009HA蛋白所引发的可交叉反应的单克隆抗体(mAbs)的被动免疫能提供完全的保护免于死亡。对用这些mAbs选择2009年H1N1病毒所产生的mAb抗体逃离突变体的分析表明，抗原位点Sa是保守的交叉保护性表位中的一个(Manicassamy B.，et al.PLoS Pathogens January2010|Volume 6|Issue 1|e1000745)。
[0182] 通过HA结构的同源建模，显示2009年H1N1的HA和1918年流行性病毒在已知的抗原位点中共享大量的氨基酸残基，这提示存在用于中和可与两种HA发生交叉反应的抗体的共有表位(Igarashi M.et al.，PLoSONE January 2010，Volume 5，Issue 1，e8553)。可能的糖基化位点存在于HA的Asn177残基上，该残基位于抗原保守的Sa区内(参见图
19)。在布里斯班株H1的HA中的Asn177糖基化位点处携带突变的蛋白用于免疫小鼠。检测抗NIBRG-121的交叉保护。
19)。在布里斯班株H1的HA中的Asn177糖基化位点处携带突变的蛋白用于免疫小鼠。检测抗NIBRG-121的交叉保护。
[0183] 用在H1(布里斯班株)的Asn177处携带突变的单糖基化的HA(HAmg)疫苗接种所产生的抗血清比在Asn177处携带突变的完全糖基化的HA(HAfg)和在Asn177处携带突变的非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地抑制NIBRG-121病毒凝集红细胞的能力。来自H1(布里斯班株)的在Asn177处携带突变的单糖基化的HA(HAmg)比在Asn177处携带突变的完全糖基化的HA(HAfg)和在Asn177处携带突变的非糖基化的HA(HAug)显示出能更好地中和NIBRG-121病毒感染MDCK细胞的能力。单糖基化的HA(布里斯班株)作为疫苗保护BALB/c小鼠免受NIBRG-121病毒攻击。相反，在Asn177处携带突变的完全糖基化的HA表现出较少或没有抗NIBRG-121病毒感染的交叉保护能力。
[0184] 如本文所用，“治疗活性”或“活性”可以指效应与人类所期望的治疗结果一致的活性，或者是指在非人哺乳动物或在其他物种或有机体中所期望的效应。可以在体内或体外检测治疗活性。例如，可以在细胞培养物中测定所期望的效应。
[0185] 按照本公开，疫苗的“抗病毒活性”是指疫苗在给予该疫苗的个体中产生免疫应答的能力，其中所述免疫应答足以预防或治疗或改善完全肿胀的病毒感染和/或与诸如流感病毒的病毒感染相关的症状。有利的是，本公开的去糖基化的HA肽所产生的疫苗可以显示出抗流感病毒的显著的抗病毒活性。如本文所用，与病毒的模拟治疗样品相比，“显著的抗病毒活性”可以测定为疫苗将病毒血细胞凝集抑制至少约50％的能力。在某些实施方案中，与病毒的模拟治疗样品相比，抗病毒肽将血细胞凝集抑制至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，且更优选至少约95％。
[0186] 证实抗病毒组合物对病毒复制的抑制性效应的方法是本领域内公知的。本发明疫苗作为抗病毒药剂的治疗功效可以在实验室动物中证实，例如使用鼠模型(参见例如Jones，et al.，J.Virol，2006，Vol.80，No.24，pp.11960-11967)。此外，本发明药物活性肽的治疗效应可以通过本领域内已知的技术在人类中显示。
[0187] 本发明的中和抗体还可以用作绘制甲型流感病毒抗原决定簇的表位图谱的工具，并用在疫苗开发中。事实上，如以下的实施例所示。本发明人已鉴定出了数种可用作疫苗设计指导的广泛反应性的中和抗体。
[0188] 因此，本发明的中和抗体可用于选择在功能上模拟该抗体所结合的中和表位的肽或多肽，该肽或多肽转而可被开发成抗甲型流感病毒感染的疫苗。在一实施方案中，本发明提供了有效抗甲型流感病毒的疫苗，所述疫苗包含在功能上模拟本文所述抗体所结合的中和表位的肽或多肽。在一实施方案中，疫苗包含在功能上模拟抗体所结合的中和表位的肽或多肽，所述抗体与血凝素(HA)抗原结合。在另一实施方案中，疫苗可以是合成的。在其他实施方案中，疫苗可以包含(i)减毒甲型流感病毒或其一部分；或(ii)被杀死的甲型流感病毒或其一部分。在一另外的实施方案中，疫苗包含在功能上模拟抗体所结合的中和表位的肽或多肽，所述抗体与血凝素(HA)抗原结合。HA抗原可以是H5亚型或H1亚型。在一些实施方案中，HA抗原被展示在甲型流感病毒的表面上。
[0189] 流感病毒疫苗
[0190] 流感H5HA的N-糖基化位点序列是高度保守的。H5HA总共具有15个参照序列为N-X-(S/T)的N-糖基化位点。每个单体在N27、N39、N170、N181和N500位具有5个N-糖基化位点。宿主受体结合受到HA结构上的聚糖的影响。H5HA在39、127、170、181和500位具有糖基化位点位。
[0191] 可以利用流感病毒的任何表面蛋白的部分糖基化版本产生本发明的疫苗，所述表面蛋白包括HA、NA和M2。甲型流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白展示在它们的表面上。甲型流感病毒M2蛋白是在受感染细胞的表面表达的97个氨基酸的整合膜蛋白，其具有18-23个氨基酸残基的胞外N-末端结构域、约19个残基的内部疏水性结构域和54个残基的C-末端胞质结构域(Zebedee SL，et al.J.Virol.1988 Aug；62(8)：2762-2772)。
[0192] 此外，用作抗原的部分糖基化的流感蛋白可以通过改变该蛋白的N-或O-糖基化位点的糖基化模式来产生。
[0193] 在另一实施方案中，疫苗的肽或多肽包含引发甲型流感病毒中和抗体的抗原决定簇。
[0194] 在更通常的方面中，中和分子，包括但不限于抗体，可用于预防或治疗病毒感染。因此本发明的中和分子可用于免疫疗法和针对病毒抗原靶标的疫苗开发中，所述免疫疗法例如使用一种或多种这类分子的被动免疫。
[0195] 本发明提供了用于预防和治疗由禽流感中和病毒所引起的感染的疫苗组合物。尽管对免疫血清的被动给药可以预防感染已经了解超过80年了(Luke，T.C.et al.，Kilbane E M，Jackson J L，&Hoffman S L(2006)Ann Intern Med 145，599-609)，但是利用单克隆抗体的更新的研究还提供了促进作用(Hanson，B.J.et al.(2006)Respir Res 7，126；Huang，C.C.et al.(2004)Proc.Nat.Acad.Sci.101，2706-2711；Simmons C.P.et al.(2007)PLoS Med 4，e178)。例如，Hanson et al.表明，H5N1病毒的单克隆抗体保护免受致死感染，甚至是当在小鼠中给出接种免疫三天之后(Hanson，B.J.et al.(2006)Respir Res 7，126)。
[0196] 考虑到灾难性流行性的可能性，建议政府应当维持中和抗体的储备，例如本文所报道的那些。抗体完全是人的，并且是从成功战胜病毒感染的个体分离得到的事实可以提供优势。然而，即便大量储备这类抗体，但如果编码该抗体所结合的表位的基因发生突变，则所述抗体的效率可能会较低。同样，有一些证据表明细胞免疫增强病毒的清除。尽管如此，如果被动免疫的唯一效应是减轻感染的严重性，进而给出其他免疫效应物进行操作所必需的时间，那么多于具有弱化的免疫系统、心血管系统和呼吸系统的患者和老年人来说，降低死亡率可能是非常关键的。被动免疫可以防止抗快速增殖病毒的细胞因子风暴，其在1918年流感爆发期间即使是在健康的年轻成年人中都发生过。
[0197] 呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗
[0198] 人类呼吸道合胞体病毒(RSV)是能引起呼吸道感染的病毒。它是婴儿和儿童期下呼吸道感染和医院就医的主要原因。RSV是副粘病毒家族和肺炎病毒属的有包膜的RNA病毒。没有疫苗。
[0199] RSV病毒体包含三种表面糖蛋白，即表面糖蛋白F、G和SH(小疏水性的)。病毒表面的F蛋白引起附近细胞的细胞膜融合，形成合胞体。F(融合)和G(附着)糖蛋白是病毒进入细胞中所必需的，并且它们还决定抗体应答。RSV的结构和组成已经阐明，并在教科书″Fields Virology(费氏病毒学)″，ed.Knipe，D.M.et al.，Lippincott Williams&Wilkins，NY(2001)中，尤其是在第45章，1443-1485页的Collins，P.，Chanock，R.M.and Murphy，B.R的″Respiratory Syncytial Virus(呼吸合胞体病毒)″中详细描述。
[0200] 33kDa的非糖基化的RSV G蛋白当其为完全糖基化时(N-和O-连接的糖基化)，延伸到大约90kDa。F和G蛋白在RSV-感染的细胞表面上作为蛋白复合体而存在(Low K-W et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.366(2)2008，308-313)。
[0201] 表6显示RSV糖蛋白G的序列，可能的N-糖基化位点以下划线表示。
[0202] 表6.RSV糖蛋白G多肽序列.
[0203]
[0204] 部分去糖基化的RSV糖蛋白F和G可能可用作更有效的RSV疫苗。
[0205] 黄病毒属疫苗
[0206] 黄病毒属是黄病毒属家族属。黄病毒属是小的、有包膜的RNA病毒，其利用诸如蚊子的节肢动物来在它们的脊椎动物宿主中传播，其包括黄热病病毒(YFV)、西尼罗河病毒(WNV)、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒(JE)和登革病毒的2种病毒(Weaver SC，Barrett AD Nat.Rev.Microbiol.2789-801 2004)。黄病毒属由三种结构蛋白组成：核心核壳蛋白C和包膜糖蛋白M和E。糖蛋白E是既介导受体结合又介导融合的II类病毒融合蛋白。II类病毒融合蛋在黄病毒属和甲病毒属中发现。
[0207] 糖蛋白E由三个结构域组成：I结构域(二聚结构域)是8条折叠的β桶、II结构域(中央结构域)是由12条β折叠和两条α螺旋组成的条形结构域，以及III结构域(免疫球蛋白样结构域)是具有10条β折叠的IgC样单元。I结构域和II结构域缠在一起。
[0208] 如同在核内体的酸性环境中所发现的，一旦暴露于低pH，病毒表面的495AA糖蛋白E二聚体会不可逆转的重新聚簇成可融合的三聚体。三聚体的形成导致构象改变，该构象改变导致II结构域末端的融合肽环的暴露，这是融合步骤中所必需的，用于通过插入膜中来驱动细胞和病毒膜融合在一起(Modis Y et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1006986-912003)。
[0209] 登革病毒包膜蛋白(E)包含位于Asn-67和Asn-153处的两个主要的N-连接的糖基化位点。153位的糖基化位点在大多数黄病毒属中是保守的，而67位的位点被认为是登革病毒所特有的。黄病毒属E蛋白上的N-连接的寡糖侧链与病毒的形态发生、感染力和嗜性相关。缺少67位的N-糖基化的登革病毒表现出感染人细胞的能力降低(Mondotte JA，et al.，J.Virol.81(3)：7136-7148(2007)。
[0210] 表7显示登革病毒糖蛋白E的序列，在N-67和N-153处的可能的N-糖基化位点以下划线表示。
[0211] 表7.登革病毒糖蛋白E多肽序列.
[0212]
[0213]
[0214] 因此，部分去糖基化的登革病毒糖蛋白E可用于产生抗黄病毒属的更有效且广泛的疫苗。3型登革病毒E蛋白二聚体部分去糖基化的结果显示在图21A-B所描绘的模型中。图21B显示单糖基化的登革E蛋白。
[0215] 丙型肝炎病毒(HCV)是人输血后感染和社区获得性非甲型、非乙型肝炎的主要病原，在世界范围内感染大概1％的人群。HCV是包括黄病毒属和瘟病毒属的黄病毒属家族的成员(Miller RH&Purcell RH，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 87，2057-2061 1990)。
[0216] 丙型肝炎病毒(HCV)基因组编码两种膜结合的包膜糖蛋白(E1和E2)，它们相互作用形成非共价的异二聚复合体。HCV糖蛋白E1和E2被N-连接的糖基化大量修饰。E1蛋白由192个氨基酸组成且包含5-6个N-糖基化位点，这取决于HCV基因型。E2蛋白由363-370个氨基酸组成且包含9-11个N-糖基化位点，这取决于HCV基因型。(Maertens G.and Stuyver L.Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus(丙型肝炎病毒的基因型和遗传变异).In：The molecular medicine of viral hepatitis(病毒性肝炎的分子医药).Ed：Harrison T.J.and Zuckerman A.J.1997)。
[0217] 最近的研究显示，当用糖苷内切酶H进行部分去糖基化时，仅利用了HCV糖蛋白E1的5个可能的糖基化位点中的4个，所述5个可能的糖基化位点分别位于196、209、234、305和325位。在N2位(196)和N3位(234)的突变对E1E2复合体的组装具有较小的影响，而在N1位(196)和占主导的N4位(305)的突变显著降低非共价E1E2复合体形成的效率(Meunier JC.et al.，J.Gen.Virol.(1999)，80，887-896.)。
[0218] 表8显示丙型肝炎病毒分离体HC-J6包膜糖蛋白E1的序列(Okamoto，H.，et al.，J.Gen.Virol.72(11)，2697-2704(1991))，196、209、234、305和325位的可能的N-糖基化位点以下划线表示。
[0219] 表8.丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E1的多肽序列
[0220]
[0221] 因此，部分去糖基化的HCV糖蛋白E1和E2可用于产生抗HCV的更有效且广泛的疫苗。
[0222] 人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗
[0223] 人类免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2和相关的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)导致其各自+宿主中CD4 淋巴细胞的破坏，导致发展成为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。HIV进入宿主细胞由病毒包膜糖蛋白介导，该糖蛋白组织成展示在病毒体表面上的寡聚体、可能是三聚体刺突。这些包膜复合体通过gp41跨膜包膜糖蛋白锚定于病毒膜中。刺突的表面主要由外部包膜糖蛋白gp120组成，gp120通过非共价相互作用与三聚gp41糖蛋白复合体的每个亚基连接。
[0224] 天冬酰胺(N)-连接的多糖链(即聚糖)向人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜的gp120和gp41糖蛋白上的添加不仅是正确的蛋白折叠所必需的，而且可以作为“聚糖盾牌”提供抗中和抗体的保护(Wei X et al.，Nature 422：307-312，2003)。代表病毒和宿主环境之间的主要界面的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜的表面糖蛋白(gp120)是迄今为止已知的糖基化程度最高的蛋白，其分子量的接近一半是由于N-连接的聚糖的添加(Allan JS，et al.Science 228：1091-1094，1985)。HIV-1包膜的跨膜糖蛋白(gp41)也被糖基化，但是为较小的程度。N-连接的聚糖的添加是HIV-1 gp120折叠成与CD4受体结合的合适的构象所必需的，并影响与备选共受体CXCR4和CCR5的结合，以上的联合效应介导HIV-1融合并进入宿主细胞。
[0225] 因为多数N-连接的聚糖是HIV-1包膜高度保守的成分，所以它们自身为中和抗体提供有前景的靶标。广泛中和人类单克隆抗体2G12与包含连接于gp120糖蛋白的N-连接的聚糖的表位结合(Trloka A et al.，J Virol 70：1100-1108，1996)。其中N-连接的糖基化位点已被通过实验删除或经修饰的HIV-1菌株可以变得对中和更加敏感(Koch et al.，2003 Virology 313：387-400)。
[0226] 成熟的gp120含有24个可能的N-糖基化位点，这是通过序列Asn-Xaa-Ser/Thr来识别出的(Kornfeld and Kornfeld，Ann Rev.Biochem.54：631-664，1985)。表9显示HIV-1HXB2序列中的24个位点。可能的N-糖基化位点以下划线表示。
[0227] 表9.HIV gp120的多肽序列.
[0228]
[0229] 在HIV-1跨膜糖蛋白gp41中，保守的糖基化位点为Asn621、Asn630和Asn642。
[0230] 因此，部分去糖基化的HIV包膜蛋白gp120或跨膜蛋白gp41可产生抗黄病毒属的更有效且广泛的疫苗。HIV gp120蛋白三聚体的部分去糖基化的结果显示在图20A-B所描绘的模型中。图20B显示单糖基化的HIVgp120蛋白三聚体。
[0231] 制备部分糖基化的细胞表面糖蛋白的方法
[0232] 例如，通过化学方式直接合成片段可容易制备本发明的多核苷酸或其片段或变体，这通常使用自动寡核苷酸合成仪来实施。还有，通过以下技术来获得片段：应用诸如美TM国专利4,683,202的PCR 技术的核酸复制技术、通过将选择的序列导入重组载体用于重组产生、以及通过分子生物学领域技术人员所公知的其他重组DNA技术。
[0233] 本发明提供了包含本发明核酸的载体和宿主细胞，以及用于产生本发明多肽的重组技术。本发明的载体包括能在任何类型的细胞或有机体中复制的那些，例如质粒、噬菌体、黏粒和微染色体。在多个实施方案中，包含本发明多核苷酸的载体是适于多核苷酸增殖或复制的载体，或者是适于表达本发明多肽的载体。这类载体是本领域内已知的，而且是可商购的。
[0234] 可以合成本发明的多核苷酸，然后用常规分子和细胞生物学技术将其全部或一部分联合，插入载体中，所述技术包括例如，利用合适的限制性位点和限制性酶将多核苷酸亚克隆入线性载体。通过聚合酶链式反应利用与本发明多核苷酸的每条链互补的寡核苷酸引物来合成所述多核苷酸。引物还包含限制性酶切位点，用于促进亚克隆入载体中。复制型载体的成分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点和一个或多个标志物或选择基因。
[0235] 为了表达本发明的多肽，将编码所述多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的表达载体，即包含插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。用本领域技术人员公知的方法构建含有编码目的多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括：体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。这些技术描述于例如Sambrook，J.，et al.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验手册)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.和Ausubel，F.M.et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)，John Wiley&Sons，New York.N.Y中。
[0236] 多种表达载体/宿主系统用来包含和表达多核苷酸序列。这些表达载体/宿主系统包括但不限于，诸如用重组噬菌体、质粒、或粘粒DNA表达载体转化的细菌的微生物；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
[0237] 已知多种启动子序列可用于真核生物，并且任何启动子都可以按照本发明来使用。事实上，所有真核基因都具有富含AT的区域，该区域位于起始转录的位点的上游大约25-30个碱基处。见于多数基因转录起始上游70-80个碱基处的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3′末端是AATAAA序列，其可以是用于向编码序列的3′末端添加poly A尾的信号。所有这些序列均适于插入真核表达载体中。
[0238] 在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子通常是优选的。通过启动子哺乳动物宿主细胞中载体的多肽表达是受控的，所述启动子例如，获自病毒基因组、来自异源哺乳动物启动子和来自热休克启动子，只要这类启动子与宿主细胞系统兼容就可以，所述病毒例如多瘤病毒属、鸟痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)，所述哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子。如果需要产生包含多拷贝的编码多肽的序列的细胞系，则与合适的选择标志物一起使用的基于SV40或EBV的载体是有利的。合适的表达载体的一个实例是pcDNA-3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其包含CMV启动子。
[0239] 诸多病毒基础的表达系统可用于多肽的哺乳动物表达。例如，在用腺病毒作为表达载体的条件下，编码目的多肽的序列可被连接于由晚期启动子和三联前导序列所组成的腺病毒转录/翻译复合体。向病毒基因组非必需的E1或E3区中的插入可用于获得能在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan，J.and Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。此外，可以使用诸如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子的转录增强子，以增强在哺乳动物宿主细胞中的表达。
[0240] 在细菌系统中，根据表达的多肽的希望的用途，可以选择多种表达载体中任何一种。例如，当大量需要时，可以使用指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。这类载体包括但不限于，诸如BLUESCRIPT(Stratagene)的多功能大肠杆菌克隆和表达载体，其中将编码目的多肽的序列与载体连接，与氨基末端Met和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基在同一读码框中，以便产生杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke，G.and S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)等。pGEX载体(Promega，Madison，WI)也可以用来将外源多肽表达为具有谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白是可溶的，并且可以通过谷胱甘肽琼脂糖珠的吸附并随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱来容易地从裂解的细胞中纯化。这些系统中产生的蛋白被设计为包括肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点，以便任意地从GST部分释放克隆的目的多肽。
[0241] 在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用多种含有诸如α因子、醇氧化酶和PGH的组成型或诱导型启动子的载体。与酵母宿主一起使用的其他合适的启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶的启动子，例如烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。对于综述，参见Ausubel et al.(同上)and Grant et al.(1987)Methods Enzymol.153：516-544。诱导型的具有受生长条件控制转录的的额外优势的其他酵母启动子包括以下的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和负责利用麦芽糖和半乳糖的酶。用于在酵母表达中的合适的载体和启动子进一步在欧洲73,657中描述。酵母中糖基化的HCV表面蛋白的表达在WO96/04385中披露。将酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利的。
[0242] 如果使用植物表达载体，编码多肽的序列的表达可以由多种启动子中的任何一种所驱动。例如，诸如CaMV的35S和19S启动子的病毒启动子可以单独使用或与来自TMV的Ω前导序列联合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6：307-311)。可选择地，可以使用诸如RUBISCO的小亚基或热休克启动子的植物启动子(Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3：1671-1680；Broglie et al.(1984)Science 224：838-843；和Winter et al.(1991)Results Probl.Cell Differ.17：85-105)。可以通过直接的DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体导入植物细胞。这类技术描述于很多可普遍获得的综述中(参见，例如，Hobbs，S.or Murry，L.E.in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill，New York，N.Y.；pp.191-196)。
[0243] 还可以用昆虫系统来表达目的多肽。例如，在一种这类系统中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。可以将编码多肽的序列克隆入病毒的非必需区，例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。编码多肽的序列的成功插入会使多角体蛋白基因失活，并产生缺少衣壳蛋白的重组病毒。随后，可以将所述重组病毒用于感染例如草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，其中目的多肽可以表达(Engelhard，E.K.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：3224-3227)。
[0244] 可以通过多种糖苷酶的组合的受控使用来实现重组表面糖蛋白的部分去糖基化，例如用神经氨酸酶处理以去除唾液酸、用α-1-甘露糖苷酶(Sigma)处理以切割外部甘露糖残基、或用内F-N聚糖酶((Boehringer Mannheim Biochemicals，Mannheim，Germany)处理，该酶有效切割N-连接的高甘露糖和复合型聚糖。
[0245] 还可以通过以下过程来合成本发明的HA肽：肽合成中常用的并入方法，例如经典的氨基酸残基和/或肽片段的溶液偶联，以及必要时的固相合成技术。可以使用本领域内公知的任何肽合成方法，例如，Schroeder and Lubke，在″The Peptides″，Vol.1，Academic Press，New York，N.Y.，pp.2-128(1965) 中； ″ The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology ″，(E.Gross et al.，Eds.)，Academic Press，New York，N.Y.，Vol.1-8，(1979-1987)；Stewart and Young，在″Solid Phase peptide Synthesis″，2nd Ed.，Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.(1984)；Wild et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10537(1992)中；以及Rimsky et al.，J Virol，72：986(1998)；Chan&White在″Fmoc Solid Phase peptide Synthesis：A Practical Approach ″，Oxford University Press，(2000)中。在一些实施方案中，可以使用糖基化的氨基酸合成糖肽，使得诸如GlcNAc-Asn(V-Labs，Covington，LA)的糖基化的氨基酸在肽的合适的糖基化位点并入。
[0246] 通过局部、鼻内、或通过肠胃外给药将肽给予诸如人、马、其他哺乳动物等的温血动物，可以将本公开的疫苗用作抗病毒剂，所述肠胃外给药例如，通过皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射、腹膜内注射或皮内注射。抗病毒肽可以单独使用或联合使用。此外，抗病毒肽可以被单独给药，或作为还包含一种或多种药物可接受的载体的组合物的一部分被给药，所述药物可接受的载体的比例由该肽的可溶性和化学性质、所选的给药途径以及标准生物学给药决定。因为创造性的肽可以靶向病毒和/或细胞表面的蛋白，以确保功效，所以这类制剂中的载体应该不含或基本不含(例如优于90、95、98或99wt％)与该肽结合的蛋白。
[0247] 药物组合物
[0248] 按照另一方面，本公开的疫苗和去糖基化的蛋白可以包含在药物组合物或保健食品组合物中，或者可以与本领域技术人员在阅读本公开后可确认的其他活性剂、载体、介质、佐剂、赋形剂或辅助剂配制在一起。
[0249] 本公开的疫苗应有利地包含有效佐剂量的佐剂肽。本领域技术人员显而易见的是，佐剂肽或肽的最佳浓度必然取决于所用的特定肽、患者的特征、所用的免疫原和寻求治疗或预防的病毒感染的性质。医疗和药物领域的技术人员根据本公开可以确定这些因素。通常，佐剂肽最期望以通常能提供佐剂活性但不会引起任何有害或有毒副反应的浓度被给药。通常，需要有效的佐剂量。有效的佐剂量是指能刺激对所给予的免疫原免疫应答的佐剂肽的量。
[0250] 本公开的组合物中所含有的合适的佐剂包括本领域内公知的那些，例如并非用于人的弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷、明矾和各种油，所有的这些都是本领域内公知的，并可以从数种来源商购，例如Novartis(例如MF59佐剂)。
[0251] 药物组合物或保健食品组合物优选包含至少一种药物可接受的载体。在这类药物组合物中，疫苗或去糖基化的蛋白形成“活性化合物”，也被称为“活性剂”。如本文所用，词语“药物可接受的载体”包括于药物给药兼容的溶剂、分散介质、包被、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。补充性活性化合物也可以被并入组合物中。药物组合物被配制成与其预期的给药途径兼容。给药途径的实例包括肠胃外给药，例如静脉内给药、皮内给药、皮下给药、口服(例如吸入)给药、经皮给药(局部)、经粘膜给药和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下给药的溶液和悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释液，例如注射用水、盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯的抗细菌剂；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸的螯合剂；诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲液以及诸如氯化钠或右旋糖的用于调节渗透压的试剂。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂装进安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0252] 含有肽的组合物的合适的药物可接受的载体描述于标准药物教科书中。参见例如″Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)″，18th Ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1990)。合适的药物可接受的载体的具体非限制性实例包括水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及以上的组合。此外，如果需要，所述组合物还可以含有少量的辅助性物质，例如能增强所述组合物的抗病毒效力的润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂。
[0253] 本文所用的个体是指人和非人灵长类(例如大猩猩(guerilla)、弥猴、绒猴)、牲畜(例如绵羊、牛、马、鸭子和猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室测试动物(例如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、仓鼠)、捕获的野生动物(例如狐、鹿)和可以从本公开的试剂获利的任何其他有机体。对可能从本文所描述的试剂获利的动物类型没有限制。无论是人还是非人有机体的个体都可以称为患者、个体动物、宿主或接受者。
[0254] 对于肠胃外给药，本公开的肽或其疫苗都可以通过静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或皮内注射单独或在组合物中被给药，所述组合物还包含药物可接受的载体。对于注射给药，优选将抗病毒肽用在无菌水性媒介的溶液中，所述无菌水性媒介还含有其他诸如缓冲剂或防腐剂的溶质以及足量的药物可接受的盐或葡萄糖以促使溶液等渗。可以以本领域公知的药物可接受的盐的形式获得本公开的抗病毒肽。
[0255] 适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(如果是水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理TM盐水、抑菌水、Cremophor EL (BASF，Parsippany.N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在各种情况下，所述组合物应该是无菌的，并且流动性应达到易于注射的程度。在制备和保存的条件下，它应该是稳定的，并且应该针对诸如细菌和真菌的微生物的污染作用而进行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)和以上合适的混合物的溶剂或分散介质。
[0256] 通过以下可以保持合适的流动性：例如，使用诸如卵磷脂的包被、对于分散液保持所需的颗粒大小和使用表面活性剂。各种抗细菌剂和抗真菌剂可以促进预防微生物作用，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等。在多数情况下，所述组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨糖醇的多元醇或氯化钠。通过在组合物中包含诸如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的试剂可以实现注射组合物的延长吸收。
[0257] 可以通过以下制备无菌的可注射溶液：将合适的溶剂中的所需量的活性组合物与上面列举的成分中的一种或组合合并，如果需要，随后进行过滤灭菌。通常，通过将活性化合物合并入无菌媒介中来制备分散液，所述无菌媒介含有基本的分散介质和来自那些上文列举的所需的其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这可以从事先的无菌过滤溶液产生活性成分外加任何其他所需成分的粉末。
[0258] 还可以口服给予疫苗。口服组合物通常包含惰性稀释液或可食用的载体。为了口服治疗给药的目的，活性化合物可以与赋形剂合并，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用，例如明胶胶囊。还可以利用用作漱口剂的液体载体制备口服组合物。可以包含药物兼容的结合剂或佐剂材料作为所述组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有相似性质的以下组分或化合物中的任何一种：诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶的粘合剂；诸如淀粉或乳糖的赋形剂、诸如藻酸、Primogel或玉米淀粉的崩解剂；诸如硬脂酸镁或Sterote的润滑剂；诸如胶质二氧化硅的助流剂；诸如蔗糖或糖精的甜味剂；或诸如薄荷、甲基水杨酸盐或桔子香精的芳香剂。
[0259] 因为本公开的肽和疫苗显示出抗呼吸病毒的活性，所以它们可以被局部递送至呼吸系统，例如递送至鼻、鼻腔、鼻膜或肺。肽、疫苗或含有一种或多种肽或疫苗的药物组合物可以以任何合适的方式被递送至呼吸系统，例如通过经口或鼻的吸入。本组合物作为粉状或液体鼻喷雾剂、悬浮液、滴鼻液、凝胶或软膏，通过管或导管、通过注射器、通过packtail、通过拭子或通过粘膜下注入来发药。肽或疫苗可以使用加压包装或喷雾器或合适的推进剂以气雾喷雾剂的形式方便地递送，所述合适的推进剂例如但不限于，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送测定的量而受到控制。例如，用在吸入器或吹入器中的明胶胶囊或明胶盒可以被配制成包含肽和诸如乳糖或淀粉的合适的粉末基质的粉末混合物。鼻内制剂和给药方法的实例可见于PCT公开WO 01/41782、WO 00/33813和美国专利第6,180,603号、第6,313,093号和第5,624,898号。后面的引用的美国专利通过引用并入本文，用于各种目的。用作气雾剂制剂的推进剂可以包括压缩的空气、氮气、二氧化碳或基于烃的低沸点溶剂。本公开的肽或疫苗可以从喷雾器等提供的气雾喷雾剂的形式被方便地递送。在一些方面中，活性组分适于微粉化，以便一旦给予干粉制剂时，允许基本上所有的所述活性组分被吸入肺中，因此活性组分的微粒大小小于100微米，期望小于20微米，且优选范围为1-10微米。在一实施方案中，一种或多种肽或疫苗被包装进这样的装置中，所述装置可通过吸入递送预定、且通常有效量的肽，例如鼻喷雾剂或吸入器。
[0260] 可以经粘膜或经皮进行全身给药。对于经粘膜或经皮给药，适于用作渗透屏障的渗透剂可用在制剂中。这种渗透剂通常是本领域内已知的，并且包括例如，对于经粘膜给药，洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮给药，如本领域内通常已知的，将活性化合物配制成软膏、油膏、凝胶或乳膏。还可以将化合物配制成栓剂(例如，用诸如可可油和其他甘油酯的传统栓剂基质)或用于直肠递送的保留灌肠剂。
[0261] 按照实施，将活性化合物与保护所述化合物免于从身体快速消除的载体配制在一起，所述载体例如受控释放制剂，包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物兼容的多聚体，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。材料还可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc购买获得。脂质体悬浮液(包括用细胞特异抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药物可接受的载体。这些可以按照本领域技术人员已知的方法制备，例如，如在美国专利第4,522,811号中所描述的，通过引用将其并入本文。
[0262] 对于便于给药和剂量一致而言，以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物是有利的。本文所用的剂量单位形式是指适于待治疗个体的单一剂量的物理离散单位；每单位含有计算出与所需的药物载体一起产生期望的治疗效应的预定量活性化合物。
[0263] 本领域技术人员应当理解，本文所涉及的治疗延伸至预防以及治疗既定感染或症状。本公开的肽和疫苗可以治疗性或预防性给药。治疗优选在感染之前或感染时或在哺乳动物暴露于能引起病毒呼吸感染的病毒时开始，并且持续直到病毒在呼吸道中不再存在或不再有活性。然而，治疗也可以在感染后、在哺乳动物暴露于能引起病毒呼吸感染的病毒之后或者在建立的症状或感染出现之后开始。
[0264] 还应当理解，用于治疗或预防流感的本公开的抗病毒肽的量不仅可以随所选的特定肽而改变，而且可以随给药途径、待治疗疾病状态的特性和患者的年龄和状况，并最后可随护理医生或兽医的意见而改变。然而通常，合适剂量的范围可以为每天每千克体重约0.01-750mg，范围优选0.1-100mg/kg/天，范围最优选0.5-25mg/kg/天。
[0265] 肽或疫苗可以以单位剂量形式被方便地给予，例如，每单位剂量形式含有10-1500mg的活性组分，方便地为20-1000mg的活性组分，最方便为50-700mg的活性组分，例如每千克体重1mg/kg等于75mg/75kg。
[0266] 优选地，疫苗中所包含的每种流感病毒菌株的免疫原的浓度为诱导免疫应答，但不会引起显著的、不利的副反应的量。这种量随所用的免疫原和疫苗中所包含的佐剂肽的类型和量而改变。通常，如同通过SRD测定所测量的，疫苗包含免疫原的量为每ml约1-约1000μg，更优选每ml约3-约300μg，且最优选每ml约10μg-约15μg。最初的疫苗接种之后，被疫苗接种的个体在此后足够的间隔可以接受一次或数次加强免疫。
[0267] 这类组合物的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物步骤来测定，例如，对于测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中有效治疗的剂量)。毒性和治疗效应之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为LD50/ED50的比值。优选表现出高治疗指数的化合物。尽管可以使用表现出有毒负效应的化合物，但是应当考虑设计使这类化合物靶向受影响位置的位点，以使对未感染的细胞的可能损伤最小化，并进而降低副作用的递送系统。
[0268] 从细胞培养物测定和动物研究所获得的数据可用于配制人类可使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选位于所计算的具有最小或无毒性的浓度范围内，包括ED50。剂量可以在该范围内依据所用的剂量形式和使用的给药途径而改变。对于本公开的方法中所用的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养物测定中估计。可以在动物模型中配制剂量，以获得包括如同在细胞培养物中所测定的IC50(即实现半数最大抑制症状的测试化合物的浓度)在内的循环血浆浓度范围。这些信息可以用于更精确地确定人类中可用的剂量。例如通过高效液相色谱法可以测量血浆中的水平。
[0269] 如本文所定义的，活性化合物的治疗有效量(即有效剂量)的范围可以为约0.001-100g/kg体重，或者是本领域技术人员无需过度实验就显而易见且应当理解的其他范围。本领域技术人员应当理解，某些因素可以影响有效治疗个体所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、之前的治疗、所述个体通常的健康状况或年龄以及现存的其他疾病。
实施例
实施例
[0270] 并非意图限制本发明的范围，下面提供了本发明实施方案的示例性仪器、装置、方法及其相关的结果。注意实施例中所用的标题或小标题是为了方便读者，并非解释为限制本发明的范围。此外，某些理论在文中提出和披露；然而，无论对错与否，它们都不应被解释为限制本发明的范围，只要本发明是按照本发明来实施，而不用考虑任何特定理论或行动方案。
[0271] 实施例1：用于HA表达的基因构建体
[0272] 流感H5N1HA序列来自共有H5，CHA5(Chen MW，et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105：13538-13543)。用人类密码子对CHA5的密码子进行表达优化。将最初的病毒蛋白酶切割位点PQRERRRKKRG突变成PQRERG，以防止蛋白由酶促切割形成HAI和HA2。在HA构建体的C末端，用另外的残基( GSGYIPEAPRDGOAYVRKDGEWVLLSTFLG)替代跨膜区(残基：533-555)，其中凝血酶切割位点为斜体，噬菌体T4 fibritin折叠子三聚序列有下划线，且组氨酸标签为粗体(Stevens J.et al.(2006)Science 312：404-410)。
将修饰过的HA序列克隆入pTT载体中，用于蛋白表达(Durocher Y，et al.(2002)Nucleic Acids Res30：E9)。
将修饰过的HA序列克隆入pTT载体中，用于蛋白表达(Durocher Y，et al.(2002)Nucleic Acids Res30：E9)。
[0273] 实施例2：蛋白表达和纯化
[0274] 使用聚乙烯亚胺将编码分泌型HA的质粒转染进人类胚胎肾细胞系HEK293EBNA(ATCC number CRL-10852)或GnTI-HEK293S细胞(Reeves PJ，et al.(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：13419-13424)中，并在 补充 有0.5％ 小牛 血清 的Freestyle293表达培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养。于转染后72小时收集上清液，并通过离心使之澄清。按之前所述(Wei CJ，et al.(2008)J Virol 82：6200-6208)用镍螯合色谱法纯化HA蛋白，以获得完全糖基化的HAfg和高甘露糖型HAhm。为了获得没有唾液酸化的HA蛋白，即去唾液酸的HAds，用20mM梭菌属(Clostridium)神经氨酸酶(NA；
Sigma)于37℃处理纯化的蛋白2小时。NA处理之后，再次纯化蛋白，使之与NA分离。用Endo H(NEB)于37℃处理纯化的HAhm2小时，从而产生在糖基化位点具有单个GlcNAc的HA蛋白，即单糖基化的HAmg。用SDS PAGE、聚糖阵列和质谱法(MS)分析所有纯化的HA蛋白。
Sigma)于37℃处理纯化的蛋白2小时。NA处理之后，再次纯化蛋白，使之与NA分离。用Endo H(NEB)于37℃处理纯化的HAhm2小时，从而产生在糖基化位点具有单个GlcNAc的HA蛋白，即单糖基化的HAmg。用SDS PAGE、聚糖阵列和质谱法(MS)分析所有纯化的HA蛋白。
[0275] 实施例3：将从糖蛋白释放的N-聚糖用于MS分析
[0276] 用10mM二硫苏糖醇(DTT，Sigma)于37℃使纯化的HA糖蛋白还原1小时。然后用50mM碘乙酰胺(IAA，Merck)在黑暗中使还原的样品烷基化1小时，随后用双蒸水(ddH2O)脱盐，并在高速真空中干燥。首先在37℃下以酶与蛋白大概为1∶20(w/w)的比用胰蛋白酶(Roche)将还原且烷基化的HA蛋白提取物在pH 8.3的50mM碳酸氢铵缓冲液中消化4小时，随后进行第二次胰蛋白酶(Roche)消化，然后加载至反相C18 Sep-Pak盒(Waters Corp)。
此外，将样品与N-糖苷酶F(Roche)一起在37℃下于pH 8.3的50mM碳酸氢铵中孵育16小时，并再进行两次N-糖苷酶F孵育。用C18 Sep-Pak盒方案从肽/糖肽分离释放的N-聚糖，将N-聚糖收集在5％乙酸(AcOH)中，即流入部分。用5％AcOH将肽洗脱入20％、40％和60％的1-丙醇中。
此外，将样品与N-糖苷酶F(Roche)一起在37℃下于pH 8.3的50mM碳酸氢铵中孵育16小时，并再进行两次N-糖苷酶F孵育。用C18 Sep-Pak盒方案从肽/糖肽分离释放的N-聚糖，将N-聚糖收集在5％乙酸(AcOH)中，即流入部分。用5％AcOH将肽洗脱入20％、40％和60％的1-丙醇中。
[0277] 实施例4：MALDI-MS和MS/MS分析
[0278] 所有的聚糖样品都用NaOH/二甲亚砜匀浆方法进行过甲基化。将NaOH/DMSO匀浆与干燥的聚糖样品在螺帽玻璃管中混合，并向管中添加300μL碘甲烷(Merck)，将管轻轻涡旋25分钟。逐滴添加大约1mlddH2O终止反应，然后添加等体积的氯仿。过甲基化的聚糖被萃取进入底部的有机层中，通过用ddH2O的重复萃取去除其余的NaOH以及其他亲水性污染物。通过氮气使氯仿蒸发。对于聚糖谱型，将乙腈中的过甲基化的聚糖与50％乙腈中的10mg/ml 2，5-二羟基苯甲酸(DHB)以1∶1混合，点在加热的目标平板上，并用乙腈对平板上进行再结晶。在反射模式操纵的ABI 4700Proteomics Analyzer(Applied Biosystems)上进行数据采集。当联合并平铺时，积累激光发射(5Hz；每段光谱10次发射)直到获得满意信噪比。在TOF/TOF装置上，手动获取高能CID MS/MS数据，并且在5000-5500的激光能设置时通常共包含125种激光发射的40种子光谱。
[0279] 实施例5：聚糖微阵列的制备
[0280] 化学制备为HA所设计的24种含有唾液酸的聚糖，并用于阵列制备。通过自动的针(SMP3；TeleChem International)从384孔平板将于印刷缓冲液(300mM磷酸缓冲液，pH 8.5，含有0.005％的Tween 20)中的约0.7nL不同浓度的含胺的聚糖沉淀在NHS包被的玻璃载玻片(Nexterion H slide；SCHOTT North America)上来印刷微阵列(BioDot；Cartesian Technologies)。对于一种聚糖，用每排100μM浓度的聚糖1-17和21-27溶液从底部向顶部点到唾液酸苷载玻片上，在每个子阵列中水平放置12个重复，并将每个载玻片设计成16个格子，用于进一步的孵育实验。允许印刷的载玻片在80％湿度的大气中反应
1小时，随后过夜脱水，并将它们于室温储存在干燥器中，直到使用。在结合测定之前，用乙醇胺(于醋酸盐缓冲液中的50mM乙醇胺，pH 9.2)封闭这些载玻片，然后用水和PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤两次。
1小时，随后过夜脱水，并将它们于室温储存在干燥器中，直到使用。在结合测定之前，用乙醇胺(于醋酸盐缓冲液中的50mM乙醇胺，pH 9.2)封闭这些载玻片，然后用水和PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤两次。
[0281] 实施例6：用Cy3-NHS酯标记血凝素
[0282] 用PBS(pH＝7.4)将每种HA蛋白样品稀释成I mg/mL的终浓度，然后用Cy3Mono NHS酯(5μL，0.2mg/ml)(GE Healthcare，UK)进行标记。当反应在冰上进行18小时以后，将20μL于PBS中的500mM的糖胶添加到每管以终止反应。然后将溶液在冰上再孵育30分钟。
使每种溶液通过30kDa分子量极限的分子排阻旋转过滤器(Microcon YM-30，Millipore，USA)来去除未反应的染料分子。为了获得染料/蛋白的比值，将每种标记蛋白的样品用PBS进行稀释，使用NanoDrop ND-IOO分光光度计(NanoDrop Technologies，USA)在280nm(对-1 -1
于蛋白)和552nm(对于Cy3；在该波长处的摩尔消光系数是150,000M cm )进行两次吸收值测量。在对280nm处CyDye的吸收值计算(大约为552nm处吸收值的8％)进行校正之后，染料/蛋白的比值从双吸收值测定结果得出。
使每种溶液通过30kDa分子量极限的分子排阻旋转过滤器(Microcon YM-30，Millipore，USA)来去除未反应的染料分子。为了获得染料/蛋白的比值，将每种标记蛋白的样品用PBS进行稀释，使用NanoDrop ND-IOO分光光度计(NanoDrop Technologies，USA)在280nm(对-1 -1
于蛋白)和552nm(对于Cy3；在该波长处的摩尔消光系数是150,000M cm )进行两次吸收值测量。在对280nm处CyDye的吸收值计算(大约为552nm处吸收值的8％)进行校正之后，染料/蛋白的比值从双吸收值测定结果得出。
[0283] 实施例7：间接的结合测定
[0284] 在pH 7.4，0.005％Tween 20/PBS缓冲液中制备HA糖基化的变体，并添加覆盖到施有盖玻片的聚糖阵列的格子上。在潮湿的室内震动孵育1小时之后，用pH 7.4，0.005％Tween 20/PBS缓冲液将载玻片洗涤三次。然后，向载玻片添加兔抗H5N1HA抗体，并在潮湿的室内孵育1小时。用0.005％Tween 20/PBS缓冲液将载玻片洗涤三次之后，向载玻片添加Cy3偶联的山羊抗兔IgG抗体，并在潮湿的室内再孵育1小时。用pH 7.4，0.05％Tween20/PBS缓冲液将载玻片洗涤三次；用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤三次；并用H2O洗涤三次，然后干燥。用微阵列荧光芯片读板机(GenePix Pro 6.0；Molecular Devices)在595nm(对于Cy3)对载玻片进行扫描。
[0285] 实施例8：直接的结合测定
[0286] 在0.005％Tween 20IPBS缓冲液(pH 7.4)中制备具有不同糖基化的Cy3标记的HA蛋白，并添加覆盖到施有盖玻片的聚糖阵列的格子上。在潮湿的室内震动孵育1小时之后，用0.005％Tween 20/PBS缓冲液(pH 7.4)将载玻片洗涤三次，用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤三次，用H2O洗涤三次，并干燥。用微阵列荧光芯片读板机(GenePix Pro 6.0；
Molecular Devices)在595nm(对于Cy3)对载玻片进行扫描。
Molecular Devices)在595nm(对于Cy3)对载玻片进行扫描。
[0287] 实施例9：微量中和测定
[0288] 用半数组织培养感染剂量(TCID50)对新鲜制备的H5N1(NIBRG-14)病毒(National Institute for Biological Standards and Control，Potters Bar，U.K.)进行定量。将100倍TCID50的病毒与血清原液的2倍系列稀释物等体积混合在96孔平板中，并于37℃
4
孵育1小时。将混合物添加到平板的MDCK细胞(每孔1.5×10 细胞)上，随后于37℃孵育16-20小时。用PBS将细胞洗涤三次，在丙酮/甲醇溶液(vol/vol 1∶1)中固定，并用
5％的脱脂乳封闭。使用抗甲型流感NP的mAb通过间接ELISA检测病毒抗原(Sui JH，et al.(2009)Nat Struct Mol Biol 16：265-273)。
4
孵育1小时。将混合物添加到平板的MDCK细胞(每孔1.5×10 细胞)上，随后于37℃孵育16-20小时。用PBS将细胞洗涤三次，在丙酮/甲醇溶液(vol/vol 1∶1)中固定，并用
5％的脱脂乳封闭。使用抗甲型流感NP的mAb通过间接ELISA检测病毒抗原(Sui JH，et al.(2009)Nat Struct Mol Biol 16：265-273)。
[0289] 实施例10：小鼠、疫苗接种和激发
[0290] 将pH 7.4，50μL PBS中的20μg纯化的HAfg或HAmg蛋白，与50μL1mg/mL氢氧化铝(Alum；Sigma)混合，并于第0周和第2周时通过肌肉对雌性6至8周龄BALB/c小鼠(n＝15)进行免疫。在免疫后14天收集血液，并从每只小鼠收集血清样品。用遗传修饰的H5N1病毒，NIBRG-14通过鼻内对免疫小鼠进行激发，NIBRG-14具有致死剂量(对50％的小鼠的100倍致死剂量)。激发后，每天监测小鼠的存活，持续14天。所有的动物实验都经中央科学院机构动物照顾与使用小组(Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica)评估和认证。
[0291] 实施例11：血细胞凝集(HA)测定
[0292] 如在Jones，et al.，Journal of Virology，80(24)：11960-11967(2006)中所描述，通过制备于PBS中的病毒样品的2倍稀释物，在圆底PBS 96孔微滴定板中进行鸡红细胞(cRBCs，Lampire Biological Laboratories，Pipersville，Pa.)的血细胞凝集。将滴度报道为每50μL(HAU/50μL)样品的血细胞凝集单位。
[0293] 实施例12.病毒血凝素的纯化
[0294] 按Johansson，et al.，Journal of Virology，1989，Vol.63(3)，p.1239-1246中所述并有修改，从流感病毒颗粒纯化病毒粒子相关的血凝素(HA)。简单而言，从感染母鸡鸡蛋的尿囊液收集病毒，并按上述纯化蔗糖。细胞团重悬浮于0.5mL醋酸钠缓冲液(0.05M醋酸钠、2mM二水CaCl、0.2mM EDTA，pH至7.0)中，通过18口径的针混匀，并与等体积的于醋酸钠缓冲液中的15％辛基糖苷(辛基-β-d-葡糖硫酐；Fisher Scientific，Norcross，Ga.)混合，随后用力涡旋5分钟。在4℃下以18,400xg使该悬浮液离心60分钟，然后小心弃去上清液，并保留富含HA的部分。将2％水溶的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，Bio-World，Dublin，Ohio)添加到HA部分至0.1％CTAB的终浓度，并将样品施加到之前用含0.1％辛基糖苷的0.05M Tris-盐酸(pH 7.5)润胀并平衡的DEAE-Sephadex(A-50；GE Healthcare，Uppsala，Sweden)离子交换柱(床，0.7cm×6.0cm)上。用低盐HA洗脱缓冲液(0.05M TrisHCl、0.1M NaCl、0.1％Triton X-100，pH至7.5)通过重力收集20份0.5mL的馏分，再次用高盐HA洗脱缓冲液(0.05M TrisHCl、0.2M NaCl、0.1％Triton X-100，pH至7.5)通过重力收集20份0.5mL的馏分。测定各个馏分的HA活性，并通过非还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用胶态考马斯染色分析纯度。通过BCA测定按照厂商的说明书测定蛋白浓度(Pierce，Rockford，Ill.)。
[0295] 实施例13：阵列数据分析
[0296] 软件GenePix Pro(Axon Instruments)用于提取的数据的荧光分析。从信号去除每个点处的局部本底。从分析中去除具有明显缺陷的点，检测不到信号的点或净荧光小于100的点。重复点的“比值中间值”是在同一测定中求得的平均值。在同一阵列上的相同条件下进行与阵列结合的HA谱型(图2A)和缔合常数的确定(图2B)，以确保数据标准化。
[0297] 为了确定KD，surf值，通过使数据拟合朗缪尔等温线(方程1)来分析平衡结合数据，假设使用商业非线性回归程序GradPad PRISM(Graph-Pad)，使配体与一个或两个独立位点连接。
[0298] Fmax是最大荧光强度，表面活性碳水化合物的量的度量；(P)是总的HA蛋白浓度，且KD，surf是表面碳水化合物和蛋白之间的平衡解离常数。
[0299] 重复每种样品的KD，surf值，并计算至少4次，以得到KD，surf的平均值。通过使用KD，surf值，可以从方程(2)和(3)得到热力学参数。
[0300] Fobs＝Fmax(P)/(KD，surf+(P)){方程1}
[0301] KD，surf＝KA，surf-1 {方程2}
[0302] ΔGmulti＝RTln(KA，surf) {方程3}
[0303] KD，surf代表方程(1)中的缔合常数。在方程(2)中，R＝1.987cal mol-1K-1；T是绝对温度，并且实验在298K进行。通过Microsoft Excel计算每种样品的这些值。使用GraphPad PRISM(GraphPad)的单向ANOVA进行不同HA糖型中KD，surf的统计学分析。
[0304] 实施例14：通过ELISA测定血清中HA特异的抗体
[0305] 从HEK293纯化HA蛋白，并过夜包被在96孔平板上(5μg/mL)。将小鼠血清稀释100倍至用于检测HA结合的储备血清。将HA包被的平板用2倍系列稀释的血清孵育1小时。
用HRP偶联的抗小鼠抗体检测HA特异的IgG。通过选择大于免疫前血清的1∶50稀释物的读数的稀释物来计算终点稀释(Stevens J.et al.(2006)Science 312：404-410)。通过LTKBioLaboratories制备来自兔的抗血清。用混合有完全或不完全佐剂的约0.25-0.35mg的HA蛋白免疫兔。在时间表为每2周一次免疫的6次免疫之后，从兔收集血液。
用HRP偶联的抗小鼠抗体检测HA特异的IgG。通过选择大于免疫前血清的1∶50稀释物的读数的稀释物来计算终点稀释(Stevens J.et al.(2006)Science 312：404-410)。通过LTKBioLaboratories制备来自兔的抗血清。用混合有完全或不完全佐剂的约0.25-0.35mg的HA蛋白免疫兔。在时间表为每2周一次免疫的6次免疫之后，从兔收集血液。
[0306] 实施例15：HA的糖基化位点分析
[0307] 从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库共检索到来自H1、H3和H5流感病毒的297种全长HA序列，并通过EMBL-EBI的ClustalW2程序进行比对(Larkin MA，et al.(2007)Bioinformatics23：2947-2948)。序列数据来自1918年至2000年，并且是从人类分离得到。为了降低冗余性，一个国家的菌株仅选择一次用于分析。用于比对的序列包括：H1(AAX56530、AAY78939、ABA18037、ABB51962、ABC42750、ABD60867、ABD62061、ABE11690、ABF47869、ABF82830、ABF82852、ABG37362、ABI19015、ABI21211、ABI95294、ABI96103、ABK39995、ABK57092、ABK57093、ABK79970、ABO32948、ABO32970、ABR15885、ABS71664和ABS76427)；
H3(AAT08000、AAT12654、AAX11455、AAY58320、AAZ32943、AAZ43394、ABA26700、ABA26777、ABB51961、ABB71825、ABC42596、ABC42607、ABC42629、ABC43017、ABD15713、ABD59850、ABD61359、ABF17954、ABG37450 和 ABG37461)；H5(AAS65618、AAT39065、AAT73273、AAT73274、AAT73275、AAT84153、AAV32636、ABC72655、ABD28180、ABD28182、ABE97624、ABI16504、ABI36144、ABI36439、ABO10181、ABO36644和ABP51968)。HA序列的N-连接的糖基化由生物序列分析预测服务器中心(www.cbs.dtu.dk/services/)来预测。对于天冬酰胺(Asn)的糖基化，序列含有氨基酸模式Asn-Xaa-(Ser/Thr)，其中Xaa可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸(Gavel Y，et al.(1990)Protein Eng 3：433-442)，随后是丝氨酸或苏氨酸。用PRISM程序(GraphPad)和Jalview(Waterhouse AM，et al.(2009)Bioinformatics
25：1189-1191)准备数据分析的结果。
H3(AAT08000、AAT12654、AAX11455、AAY58320、AAZ32943、AAZ43394、ABA26700、ABA26777、ABB51961、ABB71825、ABC42596、ABC42607、ABC42629、ABC43017、ABD15713、ABD59850、ABD61359、ABF17954、ABG37450 和 ABG37461)；H5(AAS65618、AAT39065、AAT73273、AAT73274、AAT73275、AAT84153、AAV32636、ABC72655、ABD28180、ABD28182、ABE97624、ABI16504、ABI36144、ABI36439、ABO10181、ABO36644和ABP51968)。HA序列的N-连接的糖基化由生物序列分析预测服务器中心(www.cbs.dtu.dk/services/)来预测。对于天冬酰胺(Asn)的糖基化，序列含有氨基酸模式Asn-Xaa-(Ser/Thr)，其中Xaa可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸(Gavel Y，et al.(1990)Protein Eng 3：433-442)，随后是丝氨酸或苏氨酸。用PRISM程序(GraphPad)和Jalview(Waterhouse AM，et al.(2009)Bioinformatics
25：1189-1191)准备数据分析的结果。
[0308] 实施例16：合成HA糖肽的化学方法
[0309] 可以通过使用二甲基硫代磷酰混合酐(Mpt-MA)方法进行HA糖蛋白的逐步合成(Inazu，T.，et al.(1997)in Peptide Chemistry 1996(Kitada，C.ed.)pp.41-44，Proteoin Research Foundation，Osaka)。可以用N-糖基化的共有序列“Asn-X-Ser/Thr”但没有糖链的硫酯方法合成HA糖蛋白。通过应用Boc-strategy程序的自动合成仪制备肽片段。用DCC/HOBt作为激活试剂进行偶联反应。通过Mpt-MA方法用Boc-Asn(GlcNAc)-OH(3当量)偶联Asn(GlcNAc)残基。偶联反应进行1小时，并监测重复。用含有10％苯甲醚的无水HF处理和进行HPLC纯化之后，获得糖肽硫酯。将该糖肽硫酯节段与通过硫酯节段缩合方法单独制备的其他肽节段偶联。在去保护和二硫键形成之后，获得GlcNAc-HA类似物。
[0310] 可选地，HA糖蛋白的会合方法合成可以通过肽基Asn的β-羧基基团与葡糖胺的偶联反应进行(参见Cohen-Abisfeld，S.T.，and Lansbury，P.T.(1993)J.Am.Chem.Soc.115，10531-10537)。
[0311] 实施例17：合成HA糖肽的化学酶促方法
[0312] 可以通过使用酶促方法联合化学方法制备含有复合寡糖的糖肽。可以通过使用内-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(内-β-GlcNAc酶)的转糖基活性进行N-糖肽的合成(Takegawa，K.，et al.(1995)J.Biol.Chem.270，3094-3099)。内-β-GlcNAc酶使N-连接的寡糖的N，N’-二乙酰基壳二糖部分之间的糖苷键水解，并将释放的寡糖片段转移至羟基化合物。使用内-β-GlcNAc酶的N-糖肽的合成可以以两步进行。第一，通过化学途径制备含有GlcNAc的肽。然后通过内-β-GlcNAc酶的转糖基反应将糖基供体的寡糖片段转移至作为糖基受体的糖肽的GlcNAc部分。
[0314] 尽管结合详细描述对本发明进行了描述，但是前面的说明书意图示例，而并非限制本发明的范围，本发明的范围受所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改均在以下权利要求书的范围内。
[0315] 本文提到的专利和科学文献确立本领域技术人员可获得的知识。本文所引用的所有美国专利和公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入。本文所引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文所引用的通过登录号指出的Genbank和NCBI呈递物均通过引用并入本文。本文所引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用并入本文。
[0316] 尽管本发明已结合其优选的实施方案进行具体展示和描述，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离包括在所附的权利要求书中的本发明的范围的条件下，可以在其中进行形式和详情的多种改变。
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