CSFV、PCV2与PRV多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR引物及其检测方法
阅读：1013发布：2020-10-14
专利汇可以提供CSFV、PCV2与PRV多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR引物及其检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时 荧光 PCR引物及其检测方法，CSFV引物的序列如下：上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′PRV引物的序列如下：上游引物P3：5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′；下游引物P4：5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′；PCV2引物的序列如下：上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。本发明通过 猪瘟 病毒、猪 圆环病毒 2型、猪伪狂犬病毒三重SYBR Green Ⅰ定量PCR检测方法，能够同时检测CSFV、PRV和PCV2 3种DNA病毒，能最少检测183拷贝 猪瘟病毒 、231拷贝猪伪狂犬病毒和203拷贝 猪圆环病毒 2型；本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的 稳定性 ，为有效检测和 鉴别 混合感染提供了一种成本低、快速、灵敏、特异、准确的新方法，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。，下面是CSFV、PCV2与PRV多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR引物及其检测方法专利的具体信息内容。
1.CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR引物，其特征在于：CSFV引物的序列如下：
上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；
下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；
PRV引物的序列如下：
上游引物P3：5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′；
下游引物P4：5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′；
PCV2引物的序列如下：
上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；
下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
2.利用权利要求1所述引物检测CSFV、PCV2与PRV的多重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBRGreen I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：
所述SYBR Green I实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
所述反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸
15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及
其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种猪病毒的检测方法，具体涉及CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及检测方法。
背景技术
[0002] 猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育，即公猪睾丸肿胀，精液质量下降，失去种用能力；母猪表现为不发情，返情，不孕；妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等，给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。
[0003] 目前，国内外对以上三种病毒已经有大量的相关研究，建立了病毒分离、ELISA检测方法、免疫组化法、免疫荧光法等方法，以及以分子生物学为基础的检测方法，如PCR、套式PCR和竞争PCR等。但这些方法都存在这样那样的缺点：病毒分离耗时、原位杂交操作繁琐等，PCR虽然有较高的特异性和敏感性，但容易出现假阴性结果，而且不能定量，往往漏检隐性感染的动物，造成疾病的蔓延。TaqMan探针方法能够定量，但成本较高，不利于推广。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是CSFV、PCV2与PRV的PCR检测方法易出现假阴性结果，而且不能定量，提供一种CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及检测方法。
[0005] 本发明的技术方案是：CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物：
[0006] CSFV引物的序列如下：
[0007] 上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；
[0008] 下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；
[0009] PRV引物的序列如下：
[0010] 上游引物P3：5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′；
[0011] 下游引物P4：5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′；
[0012] PCV2引物的序列如下：
[0013] 上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；
[0014] 下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
[0015] 所述引物检测CSFV、PCV2与PRV的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
[0016]
[0017] 所述反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明分别设计扩增CSFV、PCV2和PRV的特异性引物，建立了能够同时检测CSFV、PCV2和PRV的三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法。本发明利用TM值来区分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要与GC含量、序列长度和结构有关。CSFV的扩增片段基因序列长252bp，其TM值较高，达到了89℃以上；PCV2扩增片段长171bp，TM值比CSFV的低，在85℃左右；PRV的扩增片段为187bp，GC含量相对最高，TM值比CSFV、PCV2的TM值都高，达到92℃以上，CSFV、PCV2和PRV的TM值可以很好的区分。
[0019] 在本发明中，CSFV扩增片段的TM值、PCV2扩增片段的TM值和PRV扩增片段的TM值会在一定的温度范围变动，CSFV的TM值变化范围为89.6-90.0℃，PCV2的TM值变化范围为85.2-85.7℃，PRV的TM值变化范围为92.6-93.0℃，3种病毒的TM值相差较大，借此可以利用熔解曲线的三个特异性的峰对这3种病毒进行鉴别。
[0020] 本发明通过猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒三重SYBR Green Ⅰ定量PCR检测方法，能够同时检测CSFV、PRV和PCV23种DNA病毒，能最少检测183拷贝猪瘟病毒、231拷贝猪伪狂犬病毒和203拷贝猪圆环病毒2型；本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性，为有效检测和鉴别混合感染提供了一种成本低、快速、灵敏、特异、准确的新方法，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。
[0021] 本发明可作为规模化猪场CSFV、PCV2和PRV的净化检测方法，建立无CSFV、PCV2和PRV的猪群，同时也为CSFV、PCV2和PRV感染的分子流行病学调查，研究CSFV、PCV2和PRV分子发病机理，CSFV、PCV2和PRV的诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。附图说明
[0022] 图1是CSFV部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段；
[0023] 图2是PCV2部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段；
[0024] 图3是PRV部分基因质粒PCR鉴定结果，M.DL 2000Marker，1.阴性对照，2.目的片段；
[0025] 图4是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应熔解曲线分析；
[0026] 图5是多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应特异性试验熔解曲线分析；
[0027] 图6是复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应同浓度重复性试验熔解曲线分析；
[0028] 图7是不同浓度重复性试验熔解曲线分析；
[0029] 图8是不同浓度重复性试验熔解曲线分析；
[0030] 图9是不同浓度重复性试验熔解曲线分析。
具体实施方式
[0031] CSFV、PCV2与PRV多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物，
[0032] CSFV引物的序列如下：
[0033] 上游引物P1：5′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；
[0034] 下游引物P2：5′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；
[0035] PRV引物的序列如下：
[0036] 上游引物P3：5′-CTCGCCATCGTCAGCAA-3′；
[0037] 下游引物P4：5′-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3′；
[0038] PCV2引物的序列如下：
[0039] 上游引物P5：5′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；
[0040] 下游引物P6：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。
[0041] 所述引物检测CSFV、PCV2与PRV的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：
[0042]
[0043]
[0044] 所述反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
[0045] 具体实验操作如下：
[0046] 1材料与方法
[0047] 1.1材料
[0048] 1.1.1毒株、细胞株和菌株
[0050] 1.1.2常用溶液及培养基
[0051] LB液体培养基，4℃保存；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液，100mg/mL；X-gal，浓度为20mg/mL，用棕色瓶或用铝箔包裹的瓶保存，IPTG液，浓度为100mg/mL；贮存于-20℃备用。
[0052] 1.1.3主要仪器及试剂
[0053] 紫外凝胶成像系统购自美国ALPHA INNOTECH公司；Agilent Mx3005P型实时定量PCR扩增仪购自美国安捷伦Stratagene公司、PTC-200型PCR仪购自美国MJ公司等。
[0054] SYBR Premix Ex TaqTM II、EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000均购自大连宝生物工程有限公司；Protein K购自华美生物工程公司；T4DNA连接酶、PGEM-T Easy质粒载体均购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司；RNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司；反转录试剂盒购自美国MBI公司。
[0055] 1.2方法
[0056] 1.2.1引物的设计和合成
[0057] 以CSFV 5′端保守序列、猪伪狂犬病毒gH基因序列和Gene Bank公布的PCV2 ORF2基因为参照序列(AF027217)，用Primer Premier 6.0生物软件分别设计一对特异性引物，引物的序列如表1所示。
[0058] 表1 荧光PCR引物序列
[0059]
[0060]
[0061] 1.2.2PCV2、PRV、PPV DNA的提取
[0062] 传统的蛋白酶K提取方法：取已经检测过的含有这三种病毒的组织，剪碎、加适量的PBS研磨，取450μL研磨后的组织液，加入等体积样品裂解缓冲液[0.02mol/L Tris HCl(PH 7.5)，0.03mol/L EDTA，1％SDS]，混匀，再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/m L)，55℃水浴1h，然后加入等体积的平衡酚，混匀，12000r/min离心5min。取上清，经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，-20℃放置30min，12000r/min离心5min，70％乙醇洗涤2次，干燥，加入25μL超纯水溶解，贮存于-20℃备用。
[0063] 1.2.3CSFV、PRRSV、SIV H9亚型cDNA的制备
[0064] 取已经检测过的含有这三种病毒的组织，剪碎、加适量的PBS研磨，取450μL研磨后的组织液，然后按试剂盒说明提取和反转录。
[0065] 1.2.4质粒模板标准品的制备
[0066] 以提取的PCV2DNA、PRV DNA和CSFV cDNA为模板，用优化的条件扩增基因片段。在50μL反应体系中分别依次加入：EX TaqDNA聚合酶28μL，引物浓度P1/P3/P5、P2/P4/P6为0.5μm/L，模板2μL，最后用双蒸水补至50μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：
95℃预变性5min后，进入循环95℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环后，72℃延伸10min，
4℃结束反应。2.0％琼脂糖凝胶电泳。
95℃预变性5min后，进入循环95℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环后，72℃延伸10min，
4℃结束反应。2.0％琼脂糖凝胶电泳。
[0067] 将扩增出目的片段按DNA凝胶回收试剂盒回收，按照载体连接试剂盒说明书将目的片段与pGEM-T Easy载体相连接，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，进行菌液PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒说明提取质粒DNA，送宝生物工程有限公司进行测序。经测序验证的阳性质粒作为模板标准品，并分别命名为pGEM-CSFV、pGEM-PRV和pGEM-PCV2。
[0068] 1.2.5CSFV、PCV2与PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系条件的优化[0069] SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系如下：
[0070] 在25μL体系中加入以下成份：
[0071]
[0072]
[0073] 反应条件为：95℃预变性1min；进入循环，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环，循环结束后升温至95℃15s，再降至65℃15s，开始从65℃递增至94℃，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95℃15s结束反应。
[0074] 1.2.5.1引物浓度的优化
[0075] 分别以50pmol/μL的引物浓度0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9μL进行荧光定量PCR反应，选取最佳引物浓度扩增病毒。
[0076] 1.2.5.2退火温度的优化
[0077] 三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR分别以54℃、55℃、56℃、57℃、58℃的退火温度进行反应，选择最佳的退火温度。
[0078] 1.2.5.3 SYBR Premix Ex TaqTM II浓度的优化
[0079] 本发明中SYBR Premix Ex TaqTM II的浓度是5U/μL，反应体系SYBR Green ⅠTM荧光定量PCR总体积是固定，通过改变SYBR Premix Ex Taq II的添加量来筛选荧光定量PCR反应体系中SYBR Premix Ex Taq的最佳浓度。分别以10μL、11.5μL、13μL、
14.5μL、16μL、17.5μL的量进行筛选。
14.5μL、16μL、17.5μL的量进行筛选。
[0080] 1.2.6特异性检验
[0081] 按照SYBR Green Ⅰ荧光定量反应体系，分别加入CSFV cDNA、PCV2DNA、PRV DNA(约20ng)，PPV DNA 1μL(约20ng)，PRRSV cDNA 1μL(约20ng)，同时设阴性对照，验证其特异性。
[0082] 1.2.7重复性检验
[0083] 选取CSFV、PCV2、PRV同一浓度的质粒标准品进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验，重复反应三次；将不同浓度的质粒标准品进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应重复性试验，重复反应三次；通过每种病毒的TM值与溶解曲线分析，验证CSFV、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的稳定性。
[0084] 1.2.8荧光定量PCR敏感性测定
[0085] 分别将CSFV、PCV2、PRV的重组质粒测OD260值，计算出每微升的拷贝数，然后进行10倍梯度稀释，作为模板进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应，确定复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应检测每种病毒的敏感性。
[0086] 1.2.9疑似CSFV、PCV2、PRV病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较[0087] 取采自河南省内多个地市猪场的疑似CSFV、PCV2、PRV感染的病料进行复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR和检测，以验证该方法的实用性。
[0088] 2结果
[0089] 2.1常规质粒PCR扩增
[0090] CSFV、PCV2、PRV部分基因质粒PCR鉴定结果如图1-3所示，分别扩增出了与预计大小相一致的252bp、171bp和187bp的片段。pGEM-CSFV、pGEM-PCV2和pGEM-PRV经EcoR Ⅰ酶切鉴定，得到产物与预期的条带一致。测序与国内流行的毒株相比，核苷酸同源性在100％、100％、99.6％以上。
[0091] 2.2质粒浓度的计算
[0092]
[0093] 测得提取的CSFV、PCV2、PRV质粒DNA浓度分别为：pGEM-CSFV质量浓度＝18.8μg/mL，pGEM-PCV2质量浓度＝19.9μg/mL，pGEM-PRV质量浓度＝20.8μg/mL。经计算，pGEM-CSFV质粒浓度为1.38×1011拷贝/mL，pGEM-PCV2质粒浓度为2.19×1011拷贝/mL，pGEM-PRV质粒浓度为1.27×1011拷贝/mL。
[0094] 2.3CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化结果[0095] 2.3.1引物浓度优化结果
[0096] CSFV、PCV2、PRV引物均采用50pmoL/μL 0.5μL的量反应体系为25μL，产生特异性的单一峰值，阴性对照无特异性峰值产生。CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的最佳引物浓度是0.5μL50pmoL/μL。
[0097] 2.3.2退火温度优化结果
[0098] CSFV、PCV2、PRV在退火温度57℃时，均产生了特异性的峰值。CSFV TM值分别为89.8℃，89.8℃，89.9℃；PCV2TM值分别为85.2℃，85.3℃，85.3℃；PRV TM值分别为92.7℃，
92.6℃，92.7℃。阴性对照没有产生特异性峰值。CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的退火温度优化结果为57℃。
92.6℃，92.7℃。阴性对照没有产生特异性峰值。CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应的退火温度优化结果为57℃。
[0099] 2.3.3 SYBR Premix Ex TaqTM II浓度的优化结果CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应中SYBR Premix Ex TaqTM II添加量在14.5μL时，三者均可产生特异性的峰值，阴性对照则不产生特异性峰值。
[0100] 2.4复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系的确定
[0101] 通过优化各个反应条件，最终确定了CSFV、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系，在25μL体系中加入以下成份：
[0102]
[0103]
[0104] 该反应最终确定的反应参数为：95℃预变性1min，95℃10s，58℃15s，72℃15s，40个循环。反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0.5℃/sec递增至94℃检测荧光信号，进而得出扩增产物的熔解曲线。
[0105] SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在进行复合SYBR Green Ⅰ PCR试验时，它并非均一的和所有的双螺旋结合，而是会优先和某些片段结合，这就需要优化反应体系，以确保体系中有足够的染料以及各种引物TM的比例适中。试验中，对三者的引物浓度、退火温度及SYBR Premix Ex Taq II的浓度进行了优化，结果发现CSFV、PCV2、PRV的引物以50pmoL/μL 0.4μL、0.5μL、0.6μL的量添加，退火温度57℃，SYBR Green Ⅰ预混酶13μL、14.5μL、16μL时，均有特异性峰值产生。从确保试验结果的准确度、特异性以及经济成本来考虑，最终确定采用50pmoL/μL
0.5μL，SYBR Green Ⅰ预混酶14.5μL的条件进行反应。本试验结果的特异性和重复性较好。试验的敏感性，为了避免核酸提取过程中杂质核酸片段对试验的影响，通过以重组质粒为模板，测定重组质粒的浓度，从而获得了相对纯度较高的每微升所含的重组质粒拷贝数。
在试验中，发现模板的量对反应体系有很大影响，加入的模板量过大，试验结果的背景荧光值就会很高，随之非特异性的杂峰很多，对判定特异性峰值造成严重影响，因此我们选用的模板量为1μL，以保证敏感性的前提下排除了杂峰的干扰。引物浓度是一个影响荧光定量PCR扩增的关键因素，若引物浓度太低，会使反应不完全；若引物浓度太高，则发生错配以及产生非特异性产物的可能性会大大增加；因此我们经过优化后采用0.5μL，以保证反应完全，避免产生非特异性产物。
0.5μL，SYBR Green Ⅰ预混酶14.5μL的条件进行反应。本试验结果的特异性和重复性较好。试验的敏感性，为了避免核酸提取过程中杂质核酸片段对试验的影响，通过以重组质粒为模板，测定重组质粒的浓度，从而获得了相对纯度较高的每微升所含的重组质粒拷贝数。
在试验中，发现模板的量对反应体系有很大影响，加入的模板量过大，试验结果的背景荧光值就会很高，随之非特异性的杂峰很多，对判定特异性峰值造成严重影响，因此我们选用的模板量为1μL，以保证敏感性的前提下排除了杂峰的干扰。引物浓度是一个影响荧光定量PCR扩增的关键因素，若引物浓度太低，会使反应不完全；若引物浓度太高，则发生错配以及产生非特异性产物的可能性会大大增加；因此我们经过优化后采用0.5μL，以保证反应完全，避免产生非特异性产物。
[0106] 2.5CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线及CSFV、PCV2、PRV TM值的确定
[0107] 按照CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件，以CSFV、PCV2、PRV的重组质粒为模板，进行荧光定量PCR反应，经软件Agilent Mx3005P分析后得到熔解曲线(图4)，从图中可以看出三个特异性的峰值所对应的温度为CSFV、PCV2、PRV的TM值。通过多个批次试验数据的收集整理后，最终确定了CSFV、PCV2、PRV 3种病毒的TM值，分别为：CSFV 88.6-89.9℃，PCV285.2-85.5℃，PRV 92.5-92.8℃；阴性对照无峰值产生。
[0108] 2.6多重复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性检验结果
[0109] 从CSFV、PCV2、PRV多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性试验结果(图5)可以看出，对照组中PRRSV、PPV及阴性对照均无特异性峰值产生。只有试验组中的CSFV、PCV2、PRV复合荧光PCR产生了特异性的三个峰值。CSFV TM值为89.8℃，PCV2TM值为85.2℃，PRV TM值为92.7℃。
[0110] 2.7多重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果
[0111] 2.7.1同一浓度的CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验结果
[0112] 三次重复性试验中，这3种病毒的TM值都较为稳定。对照组中PRRSV、PPV及阴性对照均无特异性峰值产生(如表2，图6)。同浓度的CSFV、PCV2、PRV三重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应具有很好的稳定性。
[0113] 表2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的同一浓度重复性试验分析
[0114]
[0115] 2.7.2不同浓度的CSFV、PCV2、PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验[0116] 在不同浓度重复性试验中，这几种病毒的TM值都较为稳定。对照组中PPV、PRRSV及阴性对照都没有特异性峰值产生(如表3，图7-9)。不同浓度的CSFV、PCV2、PRV复合SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR反应同样具有很好的稳定性。
[0117] 表3多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR的不同浓度重复性试验分析
[0118]
[0119] 2.8 CSFV、PCV2、PRV复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR敏感性试验验[0120] pGEM-CSFV、pGEM-PCV2和pGEM-PRV三种质粒的浓度分别为18.8μg/mL、19.9μg/mL、20.8μg/mL；取等体积的两种质粒混匀后，进行10倍梯度稀释，以此作为模板进行复合SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应。CSFV重组质粒的敏感性可以达到183拷贝/μL，PCV2重组质粒的敏感性可以达到203拷贝/μL，PRV重组质粒的敏感性可以达到231拷贝/μL。
[0121] 2.9三重荧光定量PCR与常规PCR检测比较
[0122] 将疑似患CSFV、PCV2、PRV仔猪组织病料24头份(编号为1-24)，阴性对照2头份(编号为25、26)，提取DNA或cDNA，分别进行PCR和real-time PCR检测，结果如表4所示，在24份病料中，常规PCR检出13份CSFV阳性病料，检出率为54.2％；11份PCV2阳性病料，检出率为45.8％；11份PRV阳性病料，检出率为45.8％；三重荧光定量PCR同样能够检测出常规PCR所检出的阳性病料，二者吻合率达100％；三重荧光定量PCR中，CSFV检出19份阳性病料，检出率为79.2％，比常规PCR的检出率高25％；PCV2检出15份阳性病料，检出率为62.5％，比常规PCR的检出率高16.7％，PRV检出15份阳性病料，检出率为62.5％，比常规PCR的检出率高16.7％，real-time PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。
[0123] 表4 CSFV、PCV2、PRV复合荧光定量PCR方法与常规PCR方法比较
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