猪瘟分支肽及其应用
阅读：557发布：2020-05-13
专利汇可以提供猪瘟分支肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 猪瘟 分支肽，该分支肽将辅助性T细胞表位和 猪瘟病毒 E2蛋白B细胞表位用分支骨架结构进行连接。本发明还公开了上述猪瘟分支肽作为猪瘟 疫苗 及作为检测猪瘟病毒 抗体 的检测 抗原 的应用。本发明猪瘟分支肽，作为猪瘟疫苗，不仅避免 机体 产生针对载体的免疫应答，而且提高了合成肽疫苗的免疫原性，其成份单纯，没有毒 副作用 和 生物 安全方面的担忧，具有产业化优势。本发明猪瘟分支肽，作为检测抗原，不仅制备简单，且能快速检测猪瘟病毒抗体，具有很好的应用前景。，下面是猪瘟分支肽及其应用专利的具体信息内容。
1.一种猪瘟分支肽，其特征在于，所述分支肽具有B-L-T结构，其中， T为通用型辅助性T细胞表位，该通用型辅助性T细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； B为猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位，该B细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； L为连接T与B的连接肽，该连接肽具有下述结构式:
其中，K代表赖氨酸，C代表半胱氨酸，所述B细胞表位连接在该连接肽的分支结构上。
2.一种疫苗组合物，其特征在于，用于免疫动物以对抗猪瘟病毒的感染，所述疫苗组合物包含:权利要求1所述的猪瘟分支肽、以及佐剂。
3.权利要求1所述的猪瘟分支肽在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物包括猪瘟疫苗。
5.—种检测猪瘟病毒抗体的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的猪瘟分支肽。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包含猪瘟病毒阳性对照血清、猪瘟病毒阴性对照血清。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包含ELISA酶标板、酶标二抗、显色液。
8.权利要求1所述的猪瘟分支肽在制备检测猪瘟病毒抗体的生物制品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物制品为检测猪瘟病毒抗体的检测抗原。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过ELISA的方法检测猪瘟病毒抗体。
猪瘟分支肽及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 猪瘟病毒E2蛋白可以诱导产生中和抗体，是猪瘟病毒最主要的保护性抗原(Konig等，J Virol，1995，69:479-86)。关于E2蛋白抗原表位的鉴定已经取得了一定的进展。其中，E2蛋白的829-837位氨基酸是一个主要的抗原表位，而且是保守的猪瘟特异性的线性表位(Lin等，J Virol, 2000, 74:11619-25)。大肠杆菌表达的该表位与GST的融合产物诱导了保护性免疫应答(Liu等，J Virol Meth，2006，134:125-9)，并且串联了 4个拷贝后，表达的融合蛋白能抵抗猪瘟病毒的攻击(Liu等，Vaccine，2006，24:7175-7180)。把该表位人工合成的肽链与BSA偶联后，免疫猪，仅仅显示了微弱的保护效力(Dong等，Vaccine, 2006, 24:1906-1913)。利用合成重叠肽的方法，已经鉴定出了一系列的猪瘟E2蛋白的线性中和表位，把上述表位分别与BSA偶联后，免疫猪，能诱导产生中和抗体，但并不能对猪提供完全的保护(Dong 等，Vaccine，2006，24:1906-1913 ;Dong 等，Vaccine，2006，24:426-434)。上述研究无论是表位与GST融合表达还是合成的肽链与BSA偶联，免疫动物后都不可避免地产生针对载体的免疫应答，这可能会给免疫动物带来一定的风险。而且，短肽链与巨大的载体偶联会更多地诱导机体产生针对载体的免疫应答(cease等，Proc NatlAcad Sci U S A, 1987,84(12):4249-53)。因此，需要研制一种包含上述E2蛋白抗原表位的免疫原分子，能为猪提供安全、高效的免疫保护。
[0003] 对于猪瘟病毒抗体的检测，目前公认的方法是用中和试验来检测，但是该方法操作复杂，费时，而且需要高质量的猪瘟单克隆抗体来检测，普通的实验室很难达到上述要求。因此， 猪瘟抗体的检测需要一种制备简单、可实现快速检测的检测抗原。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种猪瘟分支肽，该分支肽含有辅助性T细胞表位和具有中和活性的猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位，该分支肽既可以作为免疫原诱导机体产生中和抗体，又可以作为检测抗原来检测猪瘟病毒抗体，其作为免疫原时，不仅可避免载体蛋白诱导不期望的免疫应答，而且能提高肽疫苗的免疫原性，增强免疫保护作用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0007] 在本发明的一个方面，提供了一种猪瘟分支肽，该分支肽具有B-L-T结构，其中，
[0008] T为通用型辅助性T细胞表位，该通用型辅助性T细胞表位的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；
[0009] B为猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位，该B细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；[0010] L为连接T与B的连接肽，该连接肽具有下述结构式:[0011]
[0012] 其中，K代表赖氨酸，C代表半胱氨酸，所述B细胞表位连接在该连接肽的分支结构上。[0013] 本发明的猪瘟分支肽，通过提高B细胞表位的密度以及模拟表位的空间构象从而提高合成肽的免疫原性。通用型辅助性T细胞表位克服了不同种类动物和不同个体的MHC限制，能诱导更有效的免疫应答。[0014] 为了增加本发明猪瘟分支肽的结构稳定性，在肽链的氨基端(即B细胞表位的游离末端)可以进行乙酰化修饰，在肽链的羧基端(即通用型辅助性T细胞表位的游离末端)可以进行酰胺化修饰。[0015] 本发明的另一方面，提供了一种疫苗组合物，用于免疫动物以对抗猪瘟病毒的感染，所述疫苗组合物包含:上述猪瘟分支肽、以及佐剂。[0016] 用本领域已知的常规方法人工合成上述猪瘟分支肽疫苗，纯度在90%以上，将猪瘟分支肽用无菌的PBS稀释成浓度为I微克每微升的肽溶液，以等量的蛋白质佐剂(如弗氏佐剂等)与肽溶液混合，乳化成疫苗组合物，既可作为免疫原用于免疫动物。[0017] 在本发明的另一方面，还提供了上述猪瘟分支肽在制备预防或治疗猪瘟病的药物中的应用。所述药物包括猪瘟疫苗。[0018] 本发明的另一方面，还提供了一种检测猪瘟病毒抗体的试剂盒，包含上述猪瘟分支肽。[0019] 所述试剂盒还包含猪瘟病毒阳性对照血清、猪瘟病毒阴性对照血清。[0020] 所述试剂盒还包含ELISA酶标板、酶标二抗、显色液。[0021] 在本发明的另一方面，还提供了上述猪瘟分支肽在制备检测猪瘟病毒抗体的生物制品中的应用。所述生物制品为检测猪瘟病毒抗体的检测抗原。[0022] 优选的，利用本发明猪瘟分支肽检测抗原，通过ELISA的方法检测猪瘟病毒抗体[0023] 本发明的猪瘟分支肽，与传统的原核表达或载体偶联方法制得的免疫原相比，不仅避免机体产生针对载体的免疫应答，而且提高了合成肽疫苗的免疫原性。由本发明猪瘟分支肽制成的疫苗质量稳定，生产品质易于控制，成份单纯，没有毒副作用和生物安全方面的担忧，具有产业化优势。由本发明猪瘟分支肽制成的检测抗原可用于快速检测猪瘟病毒抗体，具有很好的应用前景。附图说明[0024] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。[0025] 图1是本发明实施例1的IDEXX试剂盒检测免疫兔血清抗体阻断率柱状图；[0026] 图2是本发明实施例1攻毒后试验兔体温曲线图；[0027] 图3是本发明实施例2的IDEXX试剂盒检测免疫猪血清抗体阻断率柱状图；[0028] 图4是本发明实施例3线性肽E26作为间接ELISA的检测抗原的检测结果图；[0029] 图5是本发明实施例3分支肽E29作为间接ELISA的检测抗原的检测结果图。具体实施方式[0030] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京:科学出版社，2002)中所述的方法进行。[0031]目前，猪瘟病毒线性中和性表位无论是与GST融合表达还是以合成的肽链与BSA偶联，免疫动物后都不可避免地产生针对载体的免疫应答，这可能会给免疫动物带来一定的风险。而且，短肽链与巨大的载体偶联会更多地诱导机体产生针对载体的免疫应答。为了克服上述问题，本发明用辅助性T细胞表位替代了载体蛋白，从而有效避免机体产生针对载体蛋白的免疫应答。而且，本发明采用通用型辅助性T细胞表位，可以克服不同种类动物和不同个体的MHC限制，诱导更有效的免疫应答。此外，本发明用分支骨架结构将辅助性T细胞表位和猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位进行连接，猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位连接在分支结构上，可以通过提高B细胞表位的密度以及模拟表位的空间构象从而提高合成肽的免疫原性。[0032] 本发明的猪瘟分支肽，具有下述结构式:[0033]
[0034] 其中，ISISEIKGVIVHKIEGILF(SEQ ID NO:1)是通用型辅助性T细胞表位序列；[0035] CTAVSPTTLRTEVVK (SEQ ID NO:2)是猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位序列； [0036]是连接T细胞表位与B细胞表位的分支骨架。
[0037] 本发明的猪瘟分支肽，将通用型辅助性T细胞表位和猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位用连接肽进行连接，该连接肽是以3个K(赖氨酸)为核心构成的分支骨架结构，一个赖氨酸有α、ε两个氨基，可以接两个赖氨酸，这两个赖氨酸的氨基可以再接四个肽链，即连接四个猪瘟病毒Ε2蛋白B细胞表位序列。四个猪瘟病毒Ε2蛋白B细胞表位与分支骨架上的赖氨酸之间都有一个C (半胱氨酸)，该半胱氨酸的羧基与赖氨酸的氨基通过反应形成酰胺键连接，该半胱氨酸的氨基与猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位的羧基端通过酰胺键连接。通用型辅助性T细胞表位与3个赖氨酸的核心结构之间还设有两个赖氨酸(KK)组成的连接接头。上述分支骨架结构本身没有抗原性，不会产生相应的抗体，但是由于其分子量小，呈树枝状，位于整个猪瘟分支肽的核心内，所以不会掩盖或封闭猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位。[0038] 可以用化学合成领域的常规方法人工合成本发明的猪瘟分支肽，合成方法通常有两种，一种是直接合成法，另一种是间接偶联法。直接合成法是先合成分支骨架结构(三聚赖氨酸)，然后直接从三聚赖氨酸的四个氨基末端，依次同时合成出猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位的氨基酸序列。间接偶联法是先合成分支骨架结构(三聚赖氨酸)，然后合成带半胱氨酸的猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位的氨基酸序列，再通过偶联剂将带有半胱氨酸的猪瘟病毒E2蛋白B细胞表位的氨基酸序列连接到三聚赖氨酸最末端的四个氨基端上。[0039] 实施例1[0040] 用化学合成领域的常规方法人工合成如下所示的分支肽E29以及线性肽E26。合成肽的纯度都在70%以上，以无菌的PBS把合成肽稀释成浓度为I微克每微升，然后以等量的弗氏佐剂与肽溶液混合，充分乳化后，作为免疫原用于免疫动物。 κ[0041] 分支肽-Ε29
[0042]线性肽-E26 ISISEIKGVIVHKIEGILFKKCTAVSPTTLRTEVVK[0043] 选择2公斤左右的健康家兔15只,分为3组,每组5只,第一组(1、2、3、4、5号兔)免疫线性肽E26，第二组(6、7、8、9、10号兔)免疫分支肽E29，第三组(11、12、13、14、15号兔)免疫PBS作为阴性对照。肽免疫原免疫剂量为每次50微克，总体积500微升，皮内多点注射，免疫2次，间隔2 周。第一次用弗氏完全佐剂乳化，第二次用弗氏不完全佐剂乳化。免疫前及免疫后每周采血分离血清，用IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒检测血清抗体滴度。第二次免疫2周后，静脉注射100个兔体反应量的猪瘟弱毒，攻毒后，每天测量体温2次。如果产生的抗体能够完全中和猪瘟弱毒，则免疫兔体温正常，如果不能中和猪瘟弱毒，兔子会呈现定型热反应，以此来验证合成肽的免疫效力。[0044] 结果显示，2次免疫后第2周，E29分支肽诱导的抗体阻断率可达74.8%，远远高于线性肽E26的抗体阻断率44.3% (图1)。IDEXX猪瘟抗体试剂盒检测的抗体水平与血清中和试验检测的抗体水平具有相关性，以上试验说明分支肽具有很好的免疫原性，其诱导产生的抗体也具有中和活性。猪瘟弱毒攻击后，分支肽E29免疫兔体温正常，而线性肽E26只是延迟但并没有完全阻止定型热反应，PBS对照组兔体温呈现明显的定型热反应(图2)。以上结果说明，分支肽E29免疫诱导的抗体完全中和了猪瘟病毒，没有引起免疫兔发生定型热反应。[0045] 实施例2[0046] 如实施例1中的方法制备肽免疫原，用于免疫动物。选择30日龄的猪瘟抗体阴性的健康仔猪20头，分为4组，每组5头，第一组免疫线性肽E26，第二组免疫分支肽E29，其余2组分别免疫猪瘟弱毒疫苗(HCLV)以及PBS，作为阳性对照与阴性对照。肽免疫原免疫剂量为每次200微克，总体积为I毫升，肌肉多点注射，免疫2次，间隔2周。第一次用弗氏完全佐剂乳化，第二次用弗氏不完全佐剂乳化。免疫前及免疫后每周采血分离血清，用IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒检测血清抗体水平。[0047] 结果显示，2次免疫后2周，分支肽E29免疫诱导的抗体，其阻断率可达39.2%,远远高于线性肽E26的抗体阻断率10.9%，稍低于猪瘟弱毒疫苗(HCLV)的阻断率46.7%(图3)。从以上结果可以看出，线性肽E26与分支肽E29免疫所诱导的抗体趋势与兔体实验是一致的，只是诱导的抗体滴度低于兔体实验，这可能与合成肽的免疫剂量、免疫方式有关。总之，与线性肽E26相比，分支肽E29诱导了更有效的抗体。[0048] 实施例3[0049] 用包被液分别稀释合成肽E26和E29，终浓度为0.5ug/100ul，用两种合成肽分别作为间接ELISA的检测抗原，检测5份猪瘟病毒阳性血清，I份猪瘟病毒阴性血清以及猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清，猪蓝耳病病毒(PRRSV)阳性血清，猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清，猪细小病毒(PPV)阳性血清，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清，猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性血清各I份，检测合成肽E26和E29作为猪瘟抗体检测抗原的特异性。[0050] 间接ELISA实验操作程序如下:[0051] 1、包被:用包被液稀释合成肽(0.5ug/100ul)，加入酶标板，每孔100ul，4°C包被过夜。[0052] 2、洗涤:用 PBST (0.5%。tween20)洗涤(200ul/ 孔)3 次。每次 2 分钟。[0053] 3、封闭:5%脱脂乳(200ul/孔)，37°C孵育2小时。[0054] 4、洗涤:用 PBST (0.5%。tween20)洗涤(200ul/ 孔)3 次。每次 2 分钟。[0055] 5、加血清样品:血清样品用PBS200倍稀释后，加入酶标板，每孔100ul，37°C孵育I小时。[0056] 6、洗涤:用 PBST (0.5%。tween20)洗涤(200ul/ 孔)3 次。每次 2 分钟。[0057] 7、加入第二抗体:10000稀释后，加入酶标板，每孔100ul，37°C孵育50分钟。[0058] 8、洗涤:用 PBST (0.5%。tween20)洗涤(200ul/ 孔)3 次。每次 2 分钟。[0059] 9、显色:每 孔加入IOOul TMB，避光室温显色5分钟。[0060] 10、终止:加入 2M H2S04 每孔 50ul。[0061] 11、检测OD值:酶标仪测定0D450值。[0062] 结果显示，线性肽E26作为间接ELISA的检测抗原与猪瘟阳性血清没有反应，对其他血清也没有反应(图4)。但是分支肽E29作为间接ELISA的检测抗原与5份猪瘟阳性血清都发生了反应，而与猪瘟阴性血清和其他病毒的阳性血清没有反应(图5)。上述结果说明，分支肽E29与猪瘟阳性血清具有特异性反应，可以作为检测猪瘟抗体的检测抗原。[0063] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。[0064] 序列表[0065] 〈110〉中国农业科学院上海兽医研究所[0066] 〈120〉猪瘟分支肽及其应用[0067] <160>2[0068] <170>PatentIn version 3.3[0069] <210>1[0070] <211>19[0071] <212>PRT[0072] 〈213〉人工序列[0073] 〈220〉[0074] <221>MISC_FEATURE[0075] 〈222〉(I)..(19)[0076] <223>T细胞表位[0077] <400>1[0078] He Ser He Ser Glu He Lys Gly Val He Val His Lys He Glu Gly[0079] 15 10 15[0080] He Leu Phe[0081] <210>2[0082] 〈211〉15[0083] <212>PRT [0084] <213>Classical swine fever virus[0085] 〈220〉[0086] <221>MISC_FEATURE[0087] 〈222〉(I)..(15)[0088] <223>E2蛋白B细胞表位[0089] <400>2[0090] Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys[0091] 15 10 15
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