一种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光PCR检测方法及其试剂盒专利检索-猪瘟兽医学专利检索查询-专利查询网

一种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光PCR检测方法及其 试剂盒

阅读：1014发布：2020-10-09

专利汇可以提供一种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光PCR检测方法及其试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光 PCR检测方法及其试剂盒，该检测方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的存在，并能对每种病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒三色荧光定量PCR 联合检测的试剂盒。本发明的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果敏感、可靠，最低检测浓度为1×102拷贝/μl。，下面是一种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光PCR检测方法及其试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）提取待测样品中的病毒RNA；
2）以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒（CSFV）的
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-3’（SEQ ID NO.3）和猪蓝耳病病毒通用型：
上游引物：PRRSV-UF：5’- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-UR：5’- TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3’（SEQ ID NO.5）；
荧光探针：PRRSV-UP：5’-VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’（SEQ ID NO.6）；
和高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）的
上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.8），荧光探针：PRRSV-MP：5’-CY5-AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC-BHQ2-3’（SEQ ID NO.9）；
进行三色荧光定量PCR检测，其中，猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型、高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团不相同；
3）结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为CSFV、PRRSV-U、PRRSV-M阳性。
2.根据权利要求1所述的联合检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应的反应体系总体积为25μl，组成如下：多色荧光定量PCR MIX 20µl、反转录酶系0.5µl、Taq酶系
0.5µl以及提取的猪瘟和猪蓝耳病病毒RNA或者阳性质控品或者阴性质控品4µl；其中三色荧光定量PCR MIX中含有10×多色荧光定量PCR buffer、dNTPs。
3.根据权利要求2所述的联合检测方法，其特征在于：所述10×多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分：500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、10U的RNaseOut(U)。
4.根据权利要求2所述的联合检测方法，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX的组成为：
10×多色荧光定量PCR buffer 2.5µl
CSFV-F（10µM） 1µl
CSFV-R（10µM） 1µl
PRRSV-UF（10µM） 1µl
PRRSV-UR（10µM） 1µl
PRRSV-MF（10µM） 1µl
PRRSV-MR（10µM） 1µl
CSFV-P（10µM） 0.5µl
PRRSV-UP（10µM） 0.5µl
PRRSV-MP（10µM） 0.5µl
dNTPS (10mM) 1µl
ddH2O 1.5µl
Total 20.0μl。
5.根据权利要求1所述的联合检测方法，其特征在于：多色荧光定量PCR反应条件为：
93℃ 2分钟，然后93℃30秒，55～58℃45秒，采集荧光信号，40个循环。
6.一种同时检测猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B、反转录酶系、Taq酶系、多色荧光定量PCR MIX、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，所述多色荧光定量PCRMIX中含有10×多色荧光定量PCR buffer、dNTPS、及猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型、高致病性猪蓝耳病病毒的特异性引物及多色探针，序列分别为：
猪瘟病毒：
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’6-Fam-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQ1-3’（SEQ ID NO.3）；
猪蓝耳病病毒通用型：
上游引物：PRRSV-UF：5’- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-UR：5’- TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3’（SEQ ID NO.5）；
荧光探针：PRRSV-UP：5’-VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’（SEQ ID NO.6）；
高致病性猪蓝耳病病毒
上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.8），荧光探针：PRRSV-MP：5’-CY5- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC -BHQ2-3’（SEQ ID NO.9）；
其中，猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；猪蓝耳病病毒通用型的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。
7.根据权利要求6 所述的检测试剂盒，其特征在于：10×多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分：500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、
10U的RNaseOut(U)。
8.根据权利要求6 所述的检测试剂盒，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX的组成如下：
10×多色荧光定量PCR buffer 2.5µl
CSFV-F（10µM） 1µl
CSFV-R（10µM） 1µl
PRRSV-UF（10µM） 1µl
PRRSV-UR（10µM） 1µl
PRRSV-MF（10µM） 1µl
PRRSV-MR（10µM） 1µl
CSFV-P（10µM） 0.5µl
PRRSV-UP（10µM） 0.5µl
PRRSV-MP（10µM） 0.5µl
dNTPS (10mM) 1µl
ddH2O 1.5µl
Total 20.0μl。
9.根据权利要求6 所述的检测试剂盒，其特征在于：所述病毒提取液A每1000ml中含有：异硫氰酸胍480g，0.1M Tris-HCl（pH 6.4）500ml， 0.2M EDTA（pH8.0）120ml，余量为水。
10.根据权利要求6 所述的检测试剂盒，其特征在于：所述病毒提取液B的组成为异丙醇。

说明书全文

一种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光PCR检测方法及

其试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的检测方法，具体涉及一种同时检测猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

[0002] 猪瘟是由猪瘟病毒（Classical Swine Feine Virus, CSFV）引起的一种高度接触性热性传染病，该病传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主。感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业带来了重大的经济损失。病猪是本病最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染和隐形感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰爆发的猪瘟也表明，猪瘟的流行形式在发生改变，这给全世界的养猪业带来了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒（Bivine viral disease virus，BVDV）和羊边界病毒（border disease virus，BDV）同属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（pestivirus），在进行抗原检测的时候，能发生交叉免疫反应，而针对基因设计特异的引物、探针，则可以有效地避免交叉检出。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3KB，含一个大的开放阅读框（ORF），病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。

[0003] 猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是：眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏呈间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。

[0004] 高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductive and Respiratory Syndrom，PRRS)病毒变异株引起的急性高致死性疫病，是目前流行广、危害非常严重的传染病，目前被我国定为二类传染病，由于其可造成母猪繁殖障碍、仔猪及育肥猪的高死亡率，尤其是可引起发病猪免疫抑制机能障碍，因此可给养猪业造成巨大的经济损失。目前。检测PRRSV感染的方法已有多种，包括病毒分离、抗原检测和抗体检测等，这些方法有的操作比较繁琐，有的带有一定的主观性，准确度不高。

[0005] PRRSV分为2个基因型，即基因1型和基因2型，前者是以Lelystad virus（LV株）为代表的欧洲型毒株，后者是以ATCC VR-2332毒株为代表的北美型毒株。PRRSV具有广泛地变异性和毒株的多样性，欧洲和北美分离毒株之间存在显著的抗原差异性，两者只有很弱的交叉反应，不同毒株毒力和致病性也有明显的差异。我国的PRRSV分离毒株大多属于基因2型，即北美型，最近已有报道从临床标本中分离出了欧洲型毒株。我国的分离毒株也存在广泛的变异现象和毒株的多样性。2002年在国际上首次分离到非结构蛋白2（Nsp2）编码区连续缺失12个氨基酸的毒株，2006年出现的高致病性毒株是以Nsp2编码区不连续缺失30个氨基酸（481缺失1个氨基酸，533-561连续缺失29个氨基酸）为特征的，并对猪呈现致死性。

[0006] 概括来说猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存猪瘟和猪蓝耳病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。

[0007] 荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。CN101058830A公开了“猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒”，CN101328506A公开了“一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法”。两篇文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒感染的联合检测方法还未完善。

[0008] 多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。

发明内容

[0009] 本发明提供了一种猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法，该方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV-U）以及高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）的存在，并能对所检测病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒（经典型和高致病型通用）、高致病性猪蓝耳病病毒三色荧光定量PCR联合检测的试剂盒。

[0010] 本发明所采取的技术方案是：本发明所采用的猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（经典型和高致病型通用）（PRRSV-U）、高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）三色荧光定量PCR，包括如下步骤：
1）提取待测样品中的病毒RNA；
2）以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒（CSFV）的
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-3’（SEQ ID NO.3）
和猪蓝耳病病毒通用型：
上游引物：PRRSV-UF：5’- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-UR：5’- TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3’（SEQ ID NO.5）；
荧光探针：PRRSV-UP：5’-VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’（SEQ ID NO.6）。

[0011] 和高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）的上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.8），荧光探针：PRRSV-MP：5’-CY5- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC -BHQ2-3’（SEQ ID NO.9）
进行三色荧光定量PCR检测，其中，猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型、高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团不相同；
3）结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为CSFV、PRRSV-U、PRRSV-M阳性。

[0012] 所述荧光定量PCR反应的反应体系总体积为25μl，组成如下：多色荧光定量PCR MIX 20µl、反转录酶系0.5µl、Taq酶系0.5µl以及提取的猪瘟和猪蓝耳病病毒RNA或者阳性质控品或者阴性质控品4µl；其中三色荧光定量PCR MIX中含有10×多色荧光定量PCR buffer、dNTPs。

[0013] 所述10×多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分：500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、10U的RNaseOut(U)。

[0014] 所述的检测方法的一个优选方案是，多色荧光定量PCR MIX的组成为：10×多色荧光定量PCR buffer 2.5µl
CSFV-F（10µM） 1µl
CSFV-R（10µM） 1µl
PRRSV-UF（10µM） 1µl
PRRSV-UR（10µM） 1µl
PRRSV-MF（10µM） 1µl
PRRSV-MR（10µM） 1µl
CSFV-P（10µM） 0.5µl
PRRSV-UP（10µM） 0.5µl
PRRSV-MP（10µM） 0.5µl
dNTPS (10mM) 1µl
ddH2O 1.5µl
Total 20.0μl。

[0015] 所述检测方法的一个优选方案是，多色荧光定量PCR反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃30秒，55～58℃45秒，采集荧光信号，40个循环。

[0016] 一种同时检测猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B、反转录酶系、Taq酶系、多色荧光定量PCR MIX、阳性质控品、阴性质控品，所述多色荧光定量PCRMIX中含有10×多色荧光定量PCR buffer、dNTPS、及猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型、高致病性猪蓝耳病病毒的特异性引物及多色探针，序列分别为：猪瘟病毒：
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’6-Fam-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQ1-3’（SEQ ID NO.3）猪蓝耳病病毒通用型：
上游引物：PRRSV-UF：5’- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-UR：5’- TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3’（SEQ ID NO.5）；
荧光探针：PRRSV-UP：5’-VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’（SEQ ID NO.6）。

[0017] 高致病性猪蓝耳病病毒上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.8），荧光探针：PRRSV-MP：5’-CY5- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC -BHQ2-3’（SEQ ID NO.9）
其中，猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；猪蓝耳病病毒通用型的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。

[0018] 所述检测试剂盒的一个优选方案是，10×多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分：500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、10U的RNaseOut(U)。

[0019] 所述检测试剂盒的一个优选方案是，多色荧光定量PCR MIX的组成如下：10×多色荧光定量PCR buffer 2.5µl
CSFV-F（10µM） 1µl
CSFV-R（10µM） 1µl
PRRSV-UF（10µM） 1µl
PRRSV-UR（10µM） 1µl
PRRSV-MF（10µM） 1µl
PRRSV-MR（10µM） 1µl
CSFV-P（10µM） 0.5µl
PRRSV-UP（10µM） 0.5µl
PRRSV-MP（10µM） 0.5µl
dNTPS (10mM) 1µl
ddH2O 1.5µl
Total 20.0μl。

[0020] 所述检测试剂盒的一个优选方案是，病毒提取液A每1000ml中含有：异硫氰酸胍480g， 0.1M Tris-HCl（pH 6.4）500ml， 0.2M EDTA（pH8.0）120ml，余量为水，病毒提取液B的组成为异丙醇。

[0021] 本发明的有益效果是：本发明方法能够同时检测出待测标本中猪瘟病毒和猪蓝耳病毒（通用型PRRSV-U适用于所有猪蓝耳病毒，高致病型PRRSV-M适用于检测高致病性猪蓝耳病病毒）两大类病原体，并能够实时精确检测并对病毒进行定量，应用极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级动物卫生监督所、动物疫病预防控制中心动物医院和各种动物疾病研究机构等大规模筛查的推广应用。

[0022] 根据本方法原理制得的试剂盒，可方便地同时检测出猪瘟病毒和猪蓝耳病毒以及高致病性猪蓝耳病毒，准确率高，具有广泛的应用前景；且操作简便，特异性强，对临床样品的快速诊断及流行病学调查具有很强的实用价值。附图说明

[0023] 图1为多色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为1×108、7 6 5 4 3 2
1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10拷贝/μl的标准品的扩增结果；
8
图2 为多色荧光PCR体系中PRRSV-U检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10 、
7 6 5 4 3 2
1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10拷贝/μl的标准品的扩增结果；
8
图3 为多色荧光PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10 、
7 6 5 4 3 2
1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10拷贝/μl的标准品的扩增结果；
图4为多色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，CSFV为阳性，PRRSV-CH1R株、PRRSV-JXA1株、PRRSV-HuN4株、BVDV、SIV-H1N1、FMDV-O Mya98、JEV及阴性质控品均为阴性；
图5 PRRSV-CH-1R株为阳性、PRRSV-HuN4株为阳性、PRRSV-JXA1株为阳性，BVDV、SIV-H1N1、FMDV-O Mya98、JEV及阴性质控品均为阴性；
图6 PRRSV-HuN4株为阳性、PRRSV-JXA1株为阳性，其余样品及阴性质控品均为阴性。

具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

[0025] 实施例11、特异性引物及探针的设计
根据从Genbank上检索到的猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)和猪蓝耳病病毒（Reproductive and Respiratory Syndrome Virus）的核酸序列，设计用于检测猪瘟病毒和猪蓝耳病毒的引物和探针，其序列如下：
猪瘟病毒（CSFV）的
上游引物：CSFV-F：5’-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物：CSFV-R：5’-CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’（SEQ ID NO.2）；
荧光探针：CSFV-P：5’-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-3’（SEQ ID NO.3），扩增片段长度
81bp；
猪蓝耳病病毒通用型：
上游引物：PRRSV-UF：5’- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3’（SEQ ID NO.4）；
下游引物：PRRSV-UR：5’- TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3’（SEQ ID NO.5）；
荧光探针：PRRSV-UP：5’-VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’（SEQ ID NO.6），扩增片段长度76bp。

[0026] 高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）的上游引物：PRRSV-MF：5’- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.7）；
下游引物：PRRSV-MR：5’- GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’（SEQ ID NO.8），荧光探针：PRRSV-MP：5’-CY5- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC -BHQ2-3’（SEQ ID NO.9），扩增片段长度为97bp。

[0027] 用于检测猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；用于检测猪蓝耳病病毒（通用型）的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；用于检测高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ2；2、标本采集和预处理
本方法及试剂盒适用标本类型包括猪的组织、血清、分泌排泄物等。组织标本：无菌条件下取组织约100～200mg左右，置入1.5ml洁净EP管中，保存待检。血清：用一次性无菌注射器抽取受检猪静脉血3-5ml，留取血清，保存待检。分泌排泄物：无菌条件下采集，保存待检。采集的标本应该尽快送检，或者保存于-20℃。

[0028] 3、阳性质控品的制备分别以猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒通用型（PRRSV-U）RNA以及高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV-M）RNA标准品为模板，进行PCR扩增，步骤如下：
反转录体系：
Oligo dT Primer (50 μM)1 μl、dNTP Mixture (10 mM ) 1 μl以及总RNA 2μg，
65℃ 5min，激冷，然后加入5×PrimeScript Buffer 4μl（TAKARA公司）、RNase Inhibitor (40 U/μl)0.5μl、PrimeScript RTase (200 U/μl)1μl和RNase free H2O 4.5μl反转录条件：
30℃ 10min，然后42℃，30min，进行逆转录和成cDNA。

[0029] PCR体系：10×多色荧光定量PCR Buffer 5μl、TaKaRa Taq（5 U/μl）1μl 、dNTP Mixture（各2.5 mM）4μl、上述CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M上下游引物（10μM）各0.5μl、上述cDNA0.5μl和RNase free H2O39.25μl，
PCR条件：
按照94℃ 3分钟预变性，94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 45秒，共35个循环，72℃延伸
10分钟。

[0030] 反应后取5μl PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行检测，将切胶纯化的PCR产物与pMD-18T载体连接，重组质粒pMD-18T-CSFV、pMD-18T-PRRSV-U及pMD-18T-PRRSV-M涂布于培养皿上，转化感受态DH5α细胞，挑取阳性菌落抽提质粒，取品5μl稀释测其A260nm7
和A280nm吸光度值，计算其浓度并换算成绝对拷贝数，稀释成1.0×10拷贝/μl，作为多色荧光定量PCR的阳性质控品。

[0031] 上述所有10×多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分：500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2、250mM KCl以及15%(v/v)的DMSO、10U的RNaseOut(U)。

[0032] 4、病毒RNA的提取1）固体组织：取0.5g左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml的EP管中，10000rpm离心2min，取上清100μl于1.5ml的EP管中，加入200μl RNA提取液A充分震荡，静置3min；
2）血清或病毒液：取100μl血清加入200μl RNA提取液A充分震荡，静置3min，然后加入200μl RNA提取液B，用力震荡15s，4℃ 13,000rpm离心5min；
3）弃上清，加入1ml 75%乙醇，充分混匀，13,000rpm离心5min，小心吸去大部分残留液体；
4）将提取管敞口在室温空气中干燥10min，使液体挥发干净，用20μl DEPC水溶解沉淀即为待检测的病毒RNA。

[0033] 5、多色荧光定量PCR扩增每个测试反应体系配制如下，多色PCR MIX 20μl、反转录酶系0.5µl、Taq酶系0.5µl，瞬时离心，然后加入待检测的RNA 4µl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl进行扩增。

[0034] 其中，PCR MIX的配方为：10×多色荧光定量PCR buffer 2.5µl
CSFV-F（10µM） 1µl
CSFV-R（10µM） 1µl
PRRSV-UF（10µM） 1µl
PRRSV-UR（10µM） 1µl
PRRSV-MF（10µM） 1µl
PRRSV-MR（10µM） 1µl
CSFV-P（10µM） 0.5µl
PRRSV-UP（10µM） 0.5µl
PRRSV-MP（10µM） 0.5µl
dNTPS (10mM) 1µl
ddH2O (不含核酸酶) 1.5µl
Total 20.0μl。

[0035] 将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类（检测CSFV的报告基团选择FAM，淬灭基团选择BHQ1；检测PRRSV-U的报告基团选择VIC，淬灭基团选择BHQ1；检测PRRSV-M的报告基团选择CY5，淬灭基团选择BHQ2)，设定循环条件：ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等仪器循环条件为93℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒，40个循环。LightCycler等使用毛细管的仪器循环条件为93℃→2分钟，后93℃ 5秒→58℃ 45秒，共40个循环。

[0036] 6、结果分析和判定反应结束后，调整阈值使阴性质控品无Ct 值或Ct值为40，FAM荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为CSFV阳性，VIC荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PRRSV-U阳性，CY5荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PRRSV-M阳性。多个通道荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线，则为对应通道的检测项目呈共阳型。

[0037] 当CY5荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线，VIC荧光Ct值大于等于35个循环或没有呈S型扩增曲线，需复检。

[0038] 7、灵敏度实验7 6 5 4 3
上述阳性质控品（10拷贝/μl），依次稀释为1.0×10 、1.0×10、1.0×10、1.0×10、
2 1 0
1.0×10、1.0×10、1.0×10拷贝/μl，进行灵敏度实验。

[0039] 多色荧光定量PCR体系中CSFV检测的敏感性实验见图1，多色荧光定量PCR体系中PRRSV-U检测的敏感性见图2，多色荧光定量PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性见图3。图8 7 6
1为多色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10、1×10、1×10、
5 4 3 2
1×10、1×10、1×10、1×10拷贝/μl的标准品的扩增结果。图2 为多色荧光PCR体
8 7 6 5 4
系中PRRSV-U检测的敏感性实验，从左到右依次为1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、
3 2
1×10、1×10拷贝/μl的标准品的扩增结果。图3 为多色荧光PCR体系中PRRSV-M检测
8 7 6 5 4 3 2
的敏感性实验，从左到右依次为1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10拷贝/μl的标准品的扩增结果。

[0040] 结果证实本试剂盒检测灵敏度为：1.0×102μl-1，该多色荧光定量PCR的方法敏感度为普通PCR的200倍，精确性优于普通PCR方法。

[0041] 8、特异性实验根据上述的多色荧光定量PCR检测方法，用猪瘟病毒野毒株（CSFV）、猪蓝耳病病毒美洲型疫苗株（PRRSV-CH1R）、高致病猪蓝耳病病毒疫苗株PRRSV-HuN4和PRRSV-JXA1、以及其它病毒如牛病毒性腹泻（BVDV）、猪流感H1N1(SIV-H1N1)、口蹄疫病毒O型缅甸98株（FMDV-O Mya98）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、阴性对照进行验证实验并对产物进行测序验证，结果证实，本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性或假阳性，吻合度为100%，实验结果见图4、图5、图6。

[0042] 图4为多色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，由图可以看出，CSFV为阳性， PRRSV-CH1R株、PRRSV-JXA1株、PRRSV-HuN4株、BVDV、SIV-H1N1、FMDV-O Mya98、JEV及阴性质控品均为阴性。

[0043] 图5为多色荧光PCR方法中PRRSV-U的特异性实验，由图可以看出，PRRSV-CH-1R株为阳性、PRRSV-HuN4株为阳性、PRRSV-JXA1株为阳性，BVDV、SIV-H1N1、FMDV-O Mya98、JEV及阴性质控品均为阴性。

[0044] 图6为多色荧光PCR方法中PRRSV-M的特异性实验，由图可以看出， PRRSV-HuN4株为阳性、PRRSV-JXA1株为阳性、，其余样品及阴性质控品均为阴性。

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