用于鉴定与ZAP-70相互作用的分子和纯化ZAP-70的方法
阅读：376发布：2020-12-09
专利汇可以提供用于鉴定与ZAP-70相互作用的分子和纯化ZAP-70的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 在第一方面提供了用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：a)提供包含磷 酸化 的ZAP-70的 蛋白质 制剂，b)在允许 氨 基吡啶并嘧啶配体24- 磷酸 化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24 接触 ，c)将氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物与给定的化合物一起温育，和d)确定化合物是否能够将磷酸化的ZAP-70与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24分离；在第二方面，本发明涉及用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：a)提供包含磷酸化ZAP-70的蛋白质制剂，b)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的配体氨基吡啶并嘧啶配体24和与给定的化合物接触，和c)检测在步骤b)中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物。在第三方面，本发明提供了用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：a)提供两等份的包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，b)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使一个等份与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24接触，c)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使另一等份与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24和与给定的化合物接触，和d)确定步骤b)和c)中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量；在第四方面，本发明涉及用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：a)提供两个各自包含至少一个含有磷酸化的ZAP-70的细胞的等份，b)将一个等份与给定的化合物一起温育，c) 收获 各等份的细胞，d)裂解细胞以获得蛋白质制剂，e)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24接触，和f)确定步骤e)中各等份中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量。，下面是用于鉴定与ZAP-70相互作用的分子和纯化ZAP-70的方法专利的具体信息内容。
1.用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
b)在允许7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的
7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮接触，c)将7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物与给定的化合物一起温育，和
d)确定化合物是否能够将磷酸化的ZAP-70与固定的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，
6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮分离，
其中所述ZAP-70如图4中的序列所示。
2.权利要求1的方法，其中步骤d)包括检测分离的磷酸化的ZAP-70或确定分离的磷酸化的ZAP-70的量。
3.权利要求2的方法，其中通过质谱法或免疫检测法检测分离的磷酸化的ZAP-70或确定分离的磷酸化的ZAP-70的量。
4.权利要求3的方法，其中通过用抗磷酸化的ZAP-70的抗体检测分离的磷酸化的ZAP-70。
5.权利要求4的方法，其中通过用识别磷酸化的ZAP-70的位点493上的磷酸化的抗体检测分离的磷酸化的ZAP-70。
6.用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
b)在允许7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的
7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮和与给定的化合物接触，和
c)检测步骤b)中形成的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物，
其中所述ZAP-70如图4中的序列所示。
7.权利要求6的方法，其中在步骤c)中通过确定7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物的量来进行所述检测。
8.权利要求6的方法，其中用几种蛋白质制剂进行步骤a)至c)以检测不同的化合物。
9.用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
a)提供两等份的包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
b)在允许7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使一个等份与固定在固体支持物上的
7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮接触，c)在允许7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使另一等份与固定在固体支持物上的
7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮和与给定的化合物接触，和
d)确定步骤b)和c)中形成的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物的量，
其中所述ZAP-70如图4中的序列所示。
10.用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
a)提供两个各自包含至少一个含有磷酸化的ZAP-70的细胞的等份，
b)将一个等份与给定的化合物一起温育，
c)收获各等份的细胞，
d)裂解细胞以获得蛋白质制剂，
e)在允许7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的
7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮接触，和f)确定步骤e)中各等份中形成的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物的量，
其中所述ZAP-70如图4中的序列所示。
11..权利要求9或10中任一项的方法，其中和不与化合物一起温育的等分相比，与化合物一起温育的等分中形成的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物的减少的量表明ZAP-70是该化合物的靶。
12.权利要求9或10的方法，其中通过将磷酸化的ZAP-70与固定的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮分离，随后检测分离的磷酸化的ZAP-70或随后确定分离的磷酸化的ZAP-70的量来确定7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，
6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物的量。
13.权利要求12的方法，其中通过质谱法或免疫检测法检测磷酸化的ZAP-70或确定ZAP-70的量。
14.权利要求13的方法，其中通过用抗磷酸化的ZAP-70的抗体检测磷酸化的ZAP-70。
15.权利要求14的方法，其中通过用识别磷酸化的ZAP-70的位点493上的磷酸化的抗体检测磷酸化的ZAP-70。
16.权利要求1的方法，以高通量筛选的形式进行。
17.权利要求1的方法，其中所述化合物选自合成的化合物和天然小分子化合物。
18.权利要求1的方法，其中与ZAP-70相互作用的化合物是ZAP-70抑制剂。
19.权利要求1的方法，其中固体支持物选自琼脂糖、胶乳、纤维素和亚铁化合物颗粒或铁磁性颗粒。
20.权利要求19的方法，其中琼脂糖是修饰的琼脂糖、sepharose珠粒或NHS激活的sepharose的形式。
21.权利要求1的方法，其中将7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮共价偶联至固体支持物。
22.权利要求1的方法，其中所述化合物是有机合成药物。
23.用于纯化磷酸化的ZAP-70的方法，其包括步骤：
a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
b)在允许7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的
7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮接触，和c)将磷酸化的ZAP-70与固定的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮分离，
其中所述ZAP-70如图4中的序列所示。
24.权利要求23的方法，该方法还包括在步骤c)之后鉴定能够结合磷酸化的ZAP-70的蛋白质。
25.权利要求23的方法，该方法还包括在步骤c)之后确定磷酸化的ZAP-70的翻译后修饰。
26.权利要求23的方法，其中在步骤c)之后通过质谱法或免疫检测法表征磷酸化的ZAP-70和/或能够结合磷酸化的ZAP-70的蛋白质。
27.权利要求1的方法，其中蛋白质制剂的提供包括收获至少一个包含磷酸化的ZAP-70的细胞和裂解细胞的步骤。
28.7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮用于纯化磷酸化的ZAP-70的用途，其中所述ZAP-70如图4中的序列所示。
用于鉴定与ZAP-70相互作用的分子和纯化ZAP-70的方法
[0001] 本发明涉及使用氨基吡啶并嘧啶(aminopyrido-pyrimidine)配体24作为ZAP-70的配体来鉴定与ZAP-70相互作用的分子和纯化ZAP-70的方法。此外，本发明涉及包含所述相互作用分子的药物组合物，例如用于治疗T细胞介导的疾病例如自身免疫性疾病、炎症和移植排斥。
[0002] 蛋白质激酶参与控制响应细胞外介导物(mediator)或刺激物例如生长因子、细胞因子或趋化因子的细胞的激活、生长和分化的信号转导事件。一般说来，这些激酶分成两组，优先磷酸化酪氨酸残基的激酶和优先磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸残基的激酶。酪氨酸激酶包括跨膜生长因子受体例如表皮生长因子受体(EGFR)和细胞质非受体激酶例如Src、Syk或ZAP-70。
[0003] 不适当的高蛋白激酶活性涉及许多疾病包括癌症和炎症。这可由因酶的突变、过表达或不适当的激活而导致的控制机制的失效直接或间接引起。在所有这些情况下，预期激酶的选择性抑制具有有益的效果。
[0004] 蛋白质酪氨酸激酶-受体酪氨酸激酶和非受体激酶二者-对于免疫系统的细胞的激活和增殖是必需的。在肥大细胞、T细胞和B细胞中免疫受体激活后最早可检测的事件是非受体酪氨酸激酶的刺激。免疫受体例如高亲和力IgE受体(FcεRI)、T细胞抗原受体(TCR)和B细胞受体由抗原结合亚基和信号转导亚基组成。信号转导链包含一个或多个拷贝的免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif)(ITAMS)。对于TCR的激活，通过Lck和Fyn(两个Src家族酪氨酸激酶)磷酸化位于CD3分子中的ITAMS，然后募集和激活ZAP-70(酪氨酸激酶Syk家族的成员)。然后这些被激活的酪氨酸激酶磷酸化下游衔接分子(adaptor molecule)例如LAT(用于T细胞激活的连接体(linker))和SLP-76(76KDa的包含SH2结构域的白细胞蛋白)。该步骤导致多个下游信号转导分子例如可诱导T细胞激酶(ITK)、PLCγ1和PI3激酶的激活(Wong，2005，Current Opinion in Pharmacology 5，1-8)。
[0005] ZAP-70(70kDa的ζ-相关蛋白)属于酪氨酸激酶的Syk家族，其与T细胞受体的ζ亚基相关(Chan等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9166-9170；Weiss，1993，Cell73，209-212)。ZAP-70主要在T细胞和天然杀伤(NK)细胞中表达，并通过TCR在信号转导中起着重要的作用。T细胞的TCR介导的激活对于免疫反应是至关重要的。不能充分地调控T细胞的激活可导致变应性疾病和自身免疫性疾病。因此ZAP-70被认为是开发用于T细胞介导的疾病的免疫抑制剂的极具吸引力的靶。
[0006] 已报导了几种鉴定选择性ZAP-70抑制剂的方法。Vu提出基于结构设计和合成ZAP-70的串联Src-同源性2(SH2)结构域的拮抗剂(Vu，2000，Curr.Med.Chem.7(10)，1081-1100)。Nishikawa就结合ZAP-70的能力筛选肽文库并通过与蛋白质底物竞争鉴定了抑制ZAP激酶活性的肽(Nishikawa等人，2000，Molecular Cell 6，969-974)。Moffat使用利用非生理学底物polyGluTyr进行的ZAP-70激酶测定法来鉴定ZAP-70抑制剂(Moffat等人，1999，Bioorg.Med.Chem.Letters 9，3351-3356)。此外，报导了与星形孢菌素(Staurosporine)形成的复合物中的ZAP-70激酶结构域的三维结构，该结构被认为是基于结构设计抑制剂的基础(Jin等人，2004，J.Biol.Chem.279(41)，42818-42825)。
[0007] 尽管已于1991年(Chan等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，9166-9170)发现了ZAP-70及其在TCR信号转导中的作用并在之后不久其被公认为T细胞介导的疾病的逻辑药物靶，但至今仍然没有批准ZAP-70的抑制剂作为药物。对于未能鉴定和开发选择性ZAP-70抑制剂的一个原因是缺乏有效测定方法来鉴定与ZAP-70(当其存在于激活的T细胞中时)的生理形式相互作用的化合物。
[0008] 鉴于上述内容，存在对提供用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的有效方法以及用于纯化ZAP-70的方法的需要。
[0009] 为了满足该需要，本发明在第一方面提供了用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
[0010] a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
[0011] b)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24接触，
[0012] c)将氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物与给定的化合物一起温育，和
[0013] d)确定化合物是否能够将磷酸化的ZAP-70与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24分离。
[0014] 在第二方面，本发明涉及用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
[0015] a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
[0016] b)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24和与给定的化合物接触，和[0017] c)检测步骤b)中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物。
[0018] 在第三方面，本发明提供了用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
[0019] a)提供两等份的包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
[0020] b)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使一个等份与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24接触，
[0021] c)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使另一等份与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24和与给定的化合物接触，和[0022] d)确定步骤b)和c)中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量。
[0023] 在第四方面，本发明涉及用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤：
[0024] a)提供两个各自包含至少一个含有磷酸化的ZAP-70的细胞的等份，
[0025] b)将一个等份与给定的化合物一起温育，
[0026] c)收获各等份的细胞，
[0027] d)裂解细胞以获得蛋白质制剂，
[0028] e)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24接触，和
[0029] f)确定步骤e)中各等份中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量。
[0030] 在本发明的上下文中，已令人吃惊地发现氨基吡啶并嘧啶配体24是优先识别磷酸化的ZAP-70的ZAP-70配体(参见图2)。这使得氨基吡啶并嘧啶配体24能够用于筛选测定，例如用于竞争性筛选测定法以及用于纯化磷酸化的ZAP-70的方法。
[0031] 在图1中给出了氨基吡啶并嘧啶配体24的结构。该化合物(7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮)是取代的氨基吡啶并嘧啶化合物。可通过伯氨基将氨基吡啶并嘧啶配体24共价偶联至合适的固体支持材料并将其用于分离结合的蛋白。在实施例1中描述了氨基吡啶并嘧啶配体24的合成。根据本发明，表述“氨基吡啶并嘧啶配体24”还包括包含核心例如由Klutchko和同事(Klutchko等人，1998，J.Med.Chem.41(17)：3276-3292)描述的相同的吡啶并[2，3]嘧啶核心结构的化合物，但该核心具有优选偶联至氨基(而非成为环状结构的部分)的另一种连接体，以与固体支持物连接。连接体通常具有8、9或10个原子的主链。连接体可包含羧基、羟基或氨基活性基团。
[0032] 因此，优选地，表述“氨基吡啶并嘧啶配体24”还包括具有相同((7-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮)核心的化合物，所述核心可以任选地例如用具有例如1-15个碳原子的烷基在7-苯氨基的4位上进行取代，所述化合物可用氨基、羟基或羧基进行取代，并且可以额外地用具有例如1-15个碳原子的烷基在1H-[1，6]萘啶-2-酮的N原子的1H位上进行取代。更优选地，表述“氨基吡啶并嘧啶配体24”还包括具有相同((7-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮)核心的化合物，所述核心只在7-苯氨基的4位上用具有例如1-15个碳原子的烷基进行取代，所述化合物可用氨基、羟基或羧基进行取代并且在1H-[1，6]萘啶-2-酮的1H位上可用具有例如1-15个碳原子的烷基进行取代。
[0033] 最优选，称为“氨基吡啶并嘧啶配体24”的化合物选自(7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮)和具有相同的((7-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮)核心的化合物，所述核心只在7-苯氨基的4位上用具有例如1-15个碳原子的烷基进行取代，所述化合物可用氨基、羟基或羧基进行取代并且在1H-[1，6]萘啶-2-酮的1H位上可用具有例如1-15个碳原子的烷基进行取代。
[0034] 吡啶并[2，3]嘧啶衍生物最初被描述为受体酪氨酸激酶(血小板衍生的生长因子受体，PDGFR；成纤维细胞生长因子受体，FGFR；表皮生长因子受体，EGFR)和非受体酪氨酸激酶c-Src的ATP竞争性抑制剂(Klutchko等人，1998，J.Med.Chem.41(17)：3276-3292)。后来，报导了PD173955化合物有效地抑制Bcr-Abl融合蛋白和c-Kit受体酪氨酸激酶(Wisniewski等人，2002，Cancer Research 62，4244-4255)以及间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase)(ALK)(Gunby等人，2006，J.Med.Chem.49(19)：
5759-5768)。
5759-5768)。
[0035] 在化学蛋白组学研究中，发现被固定的吡啶并[2，3-d]嘧啶配体与超过30种的人蛋白激酶相互作用并有效地抑制p38和RICK激酶(Wissing等人，2004，Mol.Cell.Proteomics 3(12)：1181-1193)。在独立的蛋白组学研究中，观察到固定的PD173955化合物与几种肝配蛋白(ephrin)受体酪氨酸激酶相互作用(WO2006/056467A1)。而另一个出版物显示该化合物有效地抑制肝配蛋白受体的激酶活性(Caligiuri等人，2006，Chemistry & Biology 13，711-722)。
[0036] 根据本发明，表述“ZAP-70”不仅是指图4中显示的人蛋白质而且还指其功能活性衍生物、或其功能活性片段、或其同源物或由在低严格条件下与编码所述蛋白质的核酸杂交的核酸编码的变体。优选地，这些低严格条件包括在40℃下在包含35％甲酰胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％BSA、100ug/ml变性鲑精DNA和10％(重量/体积)硫酸葡聚糖的缓冲液中进行18-20小时的杂交，在55℃下在由2×SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中进行1-5小时的洗涤，和在60℃下在由2×SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中进行1.5小时的洗涤。
[0037] 在本发明的一些方面，首先提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂。可使用任何蛋白质制剂作为起始材料来进行本发明的方法，只要磷酸化的ZAP-70溶解在该制剂中。实例包括几种蛋白质的液体混合物、细胞裂解物、不包含存在于原始细胞中的所有蛋白质的部分细胞裂解物或几种细胞裂解物的组合。
[0038] 可在用特异性抗ZAP-70磷酸化位点例如位点126、292、319、492或493上的磷酸化的酪氨酸残基的抗体探测的蛋白质印迹上检测目的蛋白质制剂中磷酸化的ZAP-70蛋白质种类的存在(Watts等人，1994，The Journal of Biological Chemistry 269(4)，29520-29529)。还可使用抗磷酸化的丝氨酸或苏氨酸的抗体。可从商业供应商(例如Upstate或Cell Signaling)获得此类磷酸特异性抗ZAP-70抗体。已描述了此类抗磷酸抗体与蛋白质印迹分析结合用于检测磷酸化的ZAP-70的用途(Houtman等人，2005，The Journal of Immunology175(4)，2449-2458)。
[0039] 可以首先通过分离细胞器(例如，细胞核、线粒体、核糖体、高尔基体等)，然后制备来源于这些细胞器的蛋白质制剂来获得细胞裂解物或部分细胞裂解物。用于分离细胞器的方法在本领域内是已知的(Chapter 4.2Purification of Organelles from Mammalian Cellsin“Current Protocols in Protein Science”，Editors：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，PaulT.Wingfield；Wiley，ISBN：0-471-14098-8)。
[0040] 此外，可通过分级分离细胞提取物从而富集特定类型的蛋白质例如细胞质蛋白或膜蛋白来制备蛋白质制剂(Chapter 4.3 SubcellularFractionation of Tissue Culture Cells in”Current Protocolsin Protein Science”，Editors：John.E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，ISBN：0-471-14098-8)。
[0041] 此外可使用来自体液(例如，血液、脑脊液、腹膜液和尿)的蛋白质制剂。
[0042] 例如可使用来源于模式生物例如线虫的确定的发育阶段或成年阶段的完全胚胎裂解物。此外，完整的器官例如从小鼠切取的心脏可以是蛋白质制剂的来源。还可在体外灌注这些器官以获得蛋白质制剂。
[0043] 此外，蛋白质制剂可以是包含重组产生的磷酸化的ZAP-70的制剂。已广泛地建立了用于在原核和真核细胞中产生重组蛋白质的方法(Chapter 5 Production of Recombinant Proteins in”CurrentProtocols in Protein Science”，Editors：John.E.Coligan，BenM.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；Wiley，1995，ISBN：0-471-14098-8)。
[0044] 在本发明的方法的优选实施方案中，蛋白质制剂的提供包括收获至少一个包含磷酸化的ZAP-70的细胞和裂解细胞的步骤。
[0045] ZAP-70蛋白优选在T淋巴细胞和天然杀伤(NK)细胞中表达。因此从外周血分离的细胞代表了合适的生物学材料。用于制备和培养获自外周血(PBL)的人淋巴细胞和淋巴细胞亚群的方法是众所周知的(W.E Biddison，Chapter 2.2“Preparation and culture of humanlymphocytes”in Current Protocols in Cell Biology，1998，JohnWiley & Sons，Inc.)。例如，密度梯度离心是用于将淋巴细胞与其他血液细胞群体(例如红细胞和粒细胞)分离的一种方法。可通过它们的特异的细胞表面受体(所述受体可被单克隆抗体识别)分离人淋巴细胞亚群。物理分离方法包括将这些抗体试剂偶联至允许富集被这些抗体结合(阳性选择)的细胞的磁珠。可进一步培养分离的淋巴细胞，并通过加入抗T细胞受体或共受体例如CD-3的抗体刺激所述淋巴细胞，从而起始T细胞受体信号转导和随后ZAP-70的磷酸化(Houtman等人，2005，The Journal of Immunology 175(4)，2449-2458)。
[0046] 作为原代人细胞的另一选择，可以使用培养的细胞系(例如Jurkat细胞)，并以类似的方式使用抗CD3抗体刺激所述细胞系，从而获得磷酸化的ZAP-70(Kim和White，2006，The Journal ofImmunology 176(5)：2833-2843)。
[0047] 可选择地，还可以将所述淋巴细胞或细胞系与磷酸酶抑制剂一起温育以使ZAP-70保持其磷酸化状态。此类方法在本领域内是已知的(D.C.Weiser和S.Shenolikar，Chapter18.10 in CurrentProtocols in Molecular Biology，2003，John Wiley & Sons，Inc.)。
[0048] 在优选实施方案中，细胞是细胞培养系统的部分，用于从细胞培养系统收获细胞的方法在本领域内是已知的(文献同上)。
[0049] 细胞的选择将主要取决于ZAP-70的表达，因为必须确保该蛋白质主要存在于所选择的细胞中。为了确定给定的细胞是否适用于本发明的方法的合适的起始系统，为了确定给定的目的蛋白是否存在于该细胞中，方法如蛋白质印迹法、基于PCR的核酸检测法、RNA印迹法和DNA微阵列法(“DNA芯片”)可以是合适的。
[0050] 细胞的选择还受研究目的影响。如果需要分析给定药物的体内功效，那么可选择其中发生希望的疗效的细胞或组织(例如T细胞、NK细胞或ZAP-70阳性CLL细胞)。相反地，为了阐明蛋白质靶介导不想要的副作用，可分析其中观察到所述副作用的细胞或组织(例如骨髓、胸腺)。
[0051] 此外，预想在本发明内，可例如通过活组织检查从生物体获得包含磷酸化的ZAP-70的细胞。相应的方法在本领域内是已知的。例如，活组织检查是用于获得少量组织之后可通过显微镜或使用生物化学方法检查的组织的诊断方法。活组织检查不仅对于疾病的诊断、分类和分期而且对于药物治疗的评估和监测是非常重要的。
[0052] 在收获至少一个细胞的同时进行裂解包括在本发明中。然而，同样优选首先收获细胞，然后分开裂解。
[0053] 用于裂解细胞的方法在本领域内是已知的(Karwa和Mitra：Sample preparation for the extraction，isolation，andpurification of Nuclei Acids；chapter 8 in“Sample PreparationTechniques in Analytical Chemistry”，Wiley 2003，编辑：Somenath Mitra，印刷 ISBN：0471328456；在线ISBN：0471457817)。可通过匀浆器(例如Potter-homogenizer)、超声粉碎机、酶促裂解、去污剂(例如NP-40、Triton X-100、CHAPS、SDS)、渗透压休克(osmoticshock)、反复冻融或这些方法的组合实现不同细胞类型和组织的裂解。
[0054] 根据本发明的方法，在允许氨基吡啶并嘧啶配体24磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24接触。
[0055] 在本发明中，术语“氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物”表示其中氨基吡啶并嘧啶配体24通过例如共价键或最优选通过非共价结合与ZAP-70相互作用的复合物。
[0056] 本领域技术人将知道可应用什么条件以使氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物能够形成。
[0057] 在本发明的上下文中，术语“在允许复合物形成的条件下”包括在其下此类形成，优选此类结合是可能的所有条件。这包括使固体支持物在固定相上和使裂解物流至其上的可能性。在另一个优选实施方案中，还包括，固体支持物以微粒的形式存在且与细胞裂解物混合。
[0058] 在非共价结合的背景中，氨基吡啶并嘧啶配体24和磷酸化的ZAP-70之间的结合是例如通过盐桥、氢键、疏水相互作用或其组合进行的。
[0059] 在优选实施方案中，在大体上生理条件下进行形成氨基吡啶并嘧啶配体24-磷1
酸化的ZAP-70复合物的步骤。在Petty，1998(HowardR.Petty，Chapter1，Unit 1.5 in：
Juan S.Bonifacino，Mary Dasso，Joe B.Harford，Jennifer Lippincott-Schwartz，和KennethM.Yamada(eds.)Current Protocols in Cell Biology Copyright 2003 John Wiley & Sons，Inc.保留所有权利。DOI：10.1002/0471143030.cb0101s00在线公布日期：
2001年5月，印刷出版日期：1998年10月)中描述了细胞内蛋白质的物理状态。
酸化的ZAP-70复合物的步骤。在Petty，1998(HowardR.Petty，Chapter1，Unit 1.5 in：
Juan S.Bonifacino，Mary Dasso，Joe B.Harford，Jennifer Lippincott-Schwartz，和KennethM.Yamada(eds.)Current Protocols in Cell Biology Copyright 2003 John Wiley & Sons，Inc.保留所有权利。DOI：10.1002/0471143030.cb0101s00在线公布日期：
2001年5月，印刷出版日期：1998年10月)中描述了细胞内蛋白质的物理状态。
[0060] 在大体上生理条件下的接触具有以下优点，即配体、细胞制剂(即待表征的酶)和任选地化合物之间的相互作用尽可能地反映天然条件。除其他以外，“大体上生理条件”尤其是那些存在于原始的、未处理的样品材料中的条件。它们包括生理蛋白质浓度、pH、盐浓度、缓冲能力和所涉及的蛋白质的翻译后修饰。术语“大体上生理条件”不需要与样品所来源的原始活生物体中的条件完全相同的条件，但需要大体上类细胞(cell-like)的条件或与细胞条件相近的条件。当然本领域技术人员将认识到，由于实验设置的原因可产生某些限制，这最终将导致与类细胞条件少许不同。例如，当从活生物体取样和处理样品时细胞壁或细胞膜的最终必需的破裂可能需要与生物体中所见的生理条件不同的条件。实施本发明的方法的生理条件的合适的变化对于本领域技术人员来说是很显然的，所述变化包括在本文所使用的术语“大体上生理条件”内。概而言之，应理解，术语“大体上生理条件”涉及接近于例如在天然细胞中发现的生理条件的条件，但不需要要求这些条件完全一致。
[0061] 例如，“大体上生理条件”可包含50-200mM NaCl或KCl、pH6.5-8.5、20-45℃和0.001-10mM二价阳离子(例如Mg++、Ca++，)；更优选大约150m NaCl或KCl、pH7.2至7.6、
5mM二价阳离子和通常包括0.01-1.0％的非特异性蛋白质(例如BSA)。非离子型去污剂(Tween、NP-40、Triton-X100)通常可以以通常大约0.001至2％，典型地0.05-0.2％(体积/体积)的浓度存在。对于一般指导，可使用下列缓冲水性条件：10-250mM NaCl、5-50mM Tris HCl、pH5-8，任选地加入二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子去污剂。
5mM二价阳离子和通常包括0.01-1.0％的非特异性蛋白质(例如BSA)。非离子型去污剂(Tween、NP-40、Triton-X100)通常可以以通常大约0.001至2％，典型地0.05-0.2％(体积/体积)的浓度存在。对于一般指导，可使用下列缓冲水性条件：10-250mM NaCl、5-50mM Tris HCl、pH5-8，任选地加入二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子去污剂。
[0062] 优选，“大体上生理条件”是指6.5至7.5，优选7.0至7.5的pH，和/或10至50mM，优选25至50mM的缓冲液浓度，和/或120至170mM，优选150mM的一价盐(例如Na或K)浓度。二价盐(例如Mg或Ca)还可以以1至5mM，优选1至2mM的浓度存在，其中更优选地缓冲液选自Tris-HCl或HEPES。
[0063] 在本发明的上下文中，氨基吡啶并嘧啶配体24被固定在固体支持物上。在整个发明中，术语“固体支持物”涉及每一种能够将小分子配体固定在其表面上的不溶性支持物。
[0065] 可共价地或非共价地将氨基吡啶并嘧啶配体24偶联至固体支持物。非共价结合包括通过生物素亲和配体与链霉抗生物素蛋白基质(steptavidin matrice)结合的结合。
[0066] 优选，将氨基吡啶并嘧啶配体24与固体支持物共价偶联。
[0067] 在偶联前，基质可包含活性基团例如NHS、碳二亚胺等以使能够与氨基吡啶并嘧啶配体24产生偶联反应。可通过直接偶联(例如使用官能团例如氨基、巯基、羧基、羟基、醛基和酮基)和通过间接偶联(例如通过生物素、共价连接至氨基吡啶并嘧啶配体24的生物素以及生物素与直接结合至固体支持物的链霉抗生物素的非共价结合)将氨基吡啶并嘧啶配体24偶联至固体支持物。
[0068] 与固体支持物材料的连接可包括可切割的和不可切割的连接体。可通过酶促切割或用合适的化学方法处理来实现切割。
[0069] 将氨基吡啶并嘧啶配体24与固体支持物材料结合的优选结合界面是具有碳原子主链的连接体。连接体通常具有8、9或10个原子的主链。连接体包含羧基或氨基活性基团。
[0070] 本领域技术人员将认识到，在本发明的方法的单个步骤之间，可能需要洗涤步骤。这样的洗涤是本领域技术人员的知识的一部分。洗涤用于从固体支持物除去未结合的细胞裂解物的组分。可通过加入低水平的去污剂或通过对洗涤缓冲液中的盐浓度进行适度的调整来使非特异性(例如单纯的离子)结合相互作用减少至最低程度。
[0071] 根据本发明的鉴定方法，读出系统是磷酸化的ZAP-70的检测或确定(本发明的第一方面)、氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的检测(本发明的第二方面)或氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量的确定(本发明的第二、第三和第四方面)。
[0072] 在根据本发明的第一方面的方法中，分离的磷酸化的ZAP-70的检测或确定优选表明化合物能够将磷酸化的ZAP-70从固定的aminopyrimidin配体24分离的事实。该能力表明各个化合物与ZAP-70相互作用，优选与之结合，这表明了其治疗潜能。
[0073] 在根据本发明的第二方面的方法的一个实施方案中，检测在本发明方法的过程中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物。形成此类复合物的事实优选表明化合物不完全抑制复合物的形成。另一方面，如果没有形成复合物，则化合物是假定的与ZAP-70的强相互作用子(interactor)，这表明了其治疗潜能。
[0074] 根据本发明的第二、第三和第四方面，确定在方法过程中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量。一般说来，在各个化合物存在的情况下形成的复合物越少，各个化合物与磷酸化的ZAP-70的相互作用越强，这表明了其治疗潜能。
[0075] 可通过使用标记的抗磷酸化的ZAP-70的抗体和合适的读出系统进行根据本发明的第二方面的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的检测。
[0076] 根据本发明的第二方面的优选实施方案，通过确定其量来检测氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物。
[0077] 在本发明的第二、第三和第四方面的过程中，优选将磷酸化的ZAP-70与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24分离以确定氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量。
[0078] 根据本发明，分离表示破坏氨基吡啶并嘧啶配体24和磷酸化的ZAP-70之间的相互作用的每一个操作。这包括在优选实施方案中将磷酸化的ZAP-70从固定的氨基吡啶并嘧啶配体24洗脱。
[0079] 通过使用下面详细描述的非特异性试剂(离子强度、pH值、去污剂)实现洗脱。此外，可检测目的化合物是否可特异性地将磷酸化的ZAP-70从氨基吡啶并嘧啶配体24洗脱。在下面部分进一步描述此类与ZAP-70相互作用的化合物。
[0080] 用于破坏相互作用的此类非特异性方法在本领域基本上是已知的，其取决于配体酶的相互作用的性质。原则上，离子强度、pH值、温度的改变或与去污剂的温育是将靶酶与固定的配体分离的合适方法。洗脱缓冲液的应用可通过极端pH值(高或低pH；例如通过使用0.1M柠檬酸盐(pH2-3)降低pH)、离子强度的改变(例如使用NaI、KI、MgCl2或KCl的高盐浓度)、破坏疏水相互作用的极性还原剂(例如二噁烷或乙二醇)或变性剂(离液盐或去污剂例如十二烷基硫酸钠，SDS；Review：Subramanian A.，2002，Immunoaffinty chromatography)来分离结合伴侣。
[0081] 在一些情况下，优选必须将固体支持物与释放的材料分离。用于该目的的单独的方法取决于固体支持物的性质，所述方法在本领域内是已知的。如果支持物材料包含在柱中，则可将释放的材料收集为柱流出液(column flowthrough)。在将支持物材料与裂解物组分混合(所谓的分批方法)的情况下，可能需要额外的分离步骤例如温和的离心，且释放的材料收集为上清液。可选择地，磁珠可用作固体支持物，以便可通过使用磁性装置将珠粒从样品中除去。
[0082] 在根据本发明的第一方面的方法的步骤d)中，确定是否已将磷酸化的ZAP-70与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24分离。这可以包括磷酸化的ZAP-70的检测或磷酸化的ZAP-70的量的确定。
[0083] 因此，至少在本发明的所有鉴定方法的优选实施方案中，使用用于检测分离的磷酸化的ZAP-70或用于确定其量的方法。此类方法在本领域内是已知的且包括物理化学方法例如蛋白质测序(例如Edmann降解)、通过质谱法进行的分析或使用抗磷酸化的ZAP-70的抗体的免疫检测方法。
[0084] 优选地，通过质谱法或免疫检测法检测磷酸化的ZAP-70或确定磷酸化的ZAP-70的量。
[0085] 使用质谱分析(质谱法)进行的蛋白质的鉴定在本领域内是已知的(Shevchenko等人，1996，Analytical Chemistry 68：850-858，(Mann等人，2001，Analysis of proteins and proteomes by massspectrometry，Annual Review of Biochemistry 70，437-473)且在实施例部分进行了进一步的举例说明。
[0086] 优选地，以定量的方式例如通过使用iTRAQ技术(同位素标记相对和绝对定量(isobarictags for relative and absolutequatification))或cICAT(可切割的同位素亲合标签(cleavableisotope-coded affinity tag))(Wu等人，2006.J.Proteome Res.5，651-658)进行质谱分析。
[0087] 根据本发明的其他优选实施方案，通过鉴定磷酸化的ZAP-70的原生肽(proteotypic peptides)来进行通过质谱(MS)的表征。设想是，用蛋白酶消化磷酸化的ZAP-70，并通过MS确定所得的肽。因此，来自相同来源蛋白质的肽的肽频率存在很大程度的不同，最常见的“通常”帮助鉴定该蛋白质的肽称为“原生肽”。因此，本发明中使用的原生肽是在实验上可容易观察到的独特地鉴定特定蛋白质或蛋白质同种型(protein isoform)的肽。
[0088] 根据优选实施方案，通过将在实施本发明的方法的过程中获得的原生肽与已知的原生肽比较来进行表征。由于当使用通过蛋白酶消化制备的片段来鉴定MS中的蛋白质时，通常对给定的酶观察到相同的原生肽，因此可以就给定的酶种类的酶比较对于给定的样品获得的原生肽与已知的原生肽，从而鉴定存在于样品中的酶。
[0089] 作为质谱分析的另一选择，可通过使用抗磷酸化的ZAP-70的特异性抗体，优选用识别磷酸化的ZAP-70的位点493上的酪氨酸磷酸化的抗体检测洗脱的磷酸化的ZAP-70(包括共洗脱的结合伴侣或支架蛋白)或确定其量。此类抗体在本领域内是已知的(Cell SignalingTechnologies，#2704)。
[0090] 由于氨基吡啶并嘧啶配体24优先识别磷酸化的ZAP-70，因此也可以使用识别ZAP-70上的非磷酸化表位的抗ZAP-70抗体。
[0091] 此外，在另一个优选实施方案中，一旦已通过质谱分析建立共洗脱的结合伴侣的鉴定，使用抗该蛋白的特异性抗体检测各结合伴侣。
[0092] 合适的基于抗体的检测包括但不限于蛋白质印迹、ELISA测定、夹心ELISA测定和抗体阵列或其组合。此类测定的建立在本领域内是已知的(Chapter 11，Immunology，pages11-1 to 11-30 in：ShortProtocols in Molecular Biology.第4版，由F.M.Ausubel等人编著，Wiley，New York，1999)。
[0093] 不仅可以以检测和定量与ZAP-70相互作用的目的蛋白(例如另一种激酶例如其为ZAP-70的底物的LAT)的方式而且还可以以分析翻译后修饰模式例如泛素修饰的方式设计此类测定。
[0094] 此外，本发明的鉴定方法包括就它们作为与ZAP-70相互作用的化合物的能力对其进行检测的化合物的用途。
[0095] 原则上，根据本发明，此类化合物可以是能够例如通过抑制ZAP-70与氨基吡啶并嘧啶配体24结合而与ZAP-70相互作用的每一种分子。优选地，化合物对ZAP-70具有影响，例如刺激或抑制效应。
[0096] 优选地，所述化合物选自合成的或天然存在的化合物或有机合成的药物，更优选小分子、有机药物或天然小分子化合物。优选地，所述化合物从包含此类化合物的文库开始进行鉴定。然后，在本发明的过程中，筛选此类文库。
[0097] 此类小分子优选地不是蛋白质或核酸。优选地，小分子展示低于1000Da，更优选低于750Da，最优选低于500Da的分子量。
[0098] 根据本发明的“文库”涉及以分类方式提供的(许多)不同化学实体的集合体(通常很大)，所述分类方式使得能够对不同的个体实体进行快速功能分析(筛选)，并同时提供对形成文库的个体实体的快速鉴定。实例是在表面上包含化合物的管或孔或斑的集合体，所述化合物可以高通量的方式加入至与一种或多种确定的潜在相互作用伴侣的反应。在鉴定两个伴侣的希望的“阳性”相互作用后，归因于文库构建，可快速鉴定各个化合物。可由本领域技术人员购买或设计合成的和天然来源的文库。
[0099] 在例如Breinbauer R，Manger M，Scheck M，Waldmann H.Naturalproduct guided compound library development.Curr Med Chem.2002Dec；9(23)：2129-45中提供了文库构建的实例，其中描述了在生物学上被证明为组合文库的设计起点的天然产物，因为它们具有已证明的生物学相关性的记录。根据通过结构生物学和生物信息学获得的关于蛋白质的结构域结构的新见解，可以解释天然产物在药物化学和化学生物学中的该特殊作用。为了满足结构域家族中个体结合袋的特定要求，可能需要通过化学变化来最优化天然产物的结构。固相化学被认为是该最优化过程的有效工具，在这一综述论文中突出强调了该领域内的最新进展。其他相关参考文献包括Edwards PJ，Morrell AI.Solid-phase compound library synthesis in drug design anddevelopment.Curr Opin Drug Discov Devel.2002Jul；5(4)：594-605.；Merlot C，Domine D，Church DJ.Fragmentanalysis in small molecule discovery.Curr Opin Drug DiscovDevel.2002May；5(3)：391-9. 综述；Goodnow RA Jr.Currentpractices in generation of small molecule new leads.J CellBiochem Suppl.2001；Suppl 37：13-21；其描述了在许多制药公司中目前的药物发现过程需要大量和不断增加的高质量引导物结构(leadstructure)的集合体以用于高通量筛选测定。过去，通过几种方法：通过之前内部引导物最优化成就的档案、通过从化合物卖家购卖和通过在公司合并后结合各自的集合体来获得具有不同结构和“类药”(drug-like)性质的小分子的集合体。尽管高通量/组合化学被描述为新引导物产生过程中的重要组成部分，但用于合成的文库设计和随后文库成员的设计的选择已演化至新的挑战和重要性水平。筛选多个针对多个生物学靶的小分子化合物文库设计的潜在益处提供了大量发现新引导物结构的机会。
[0100] 在本发明的第二方面的优选实施方案中，首先将磷酸化的ZAP-70与化合物一起温育，然后再与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24一起温育。
[0101] 优选地，首先将磷酸化的ZAP-70与化合物在4℃至37℃，更优选4℃至25℃，最优选4℃下温育10至60分钟，更优选30至45分钟。优选地，以1μM至1mM，优选10至100μM的浓度使用化合物。第二步骤，接触固定的配体，优选地在4℃下进行10至60分钟。
[0102] 此外，可使用几种蛋白质制剂进行本发明的第二方面的步骤a)至c)以检测不同的化合物。该实施方案在中等或高通量筛选中特别吸引人(参见下文)。
[0103] 在根据第三或第四方面的本发明的方法的优选实施方案中，将步骤c)中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的量与步骤b)中形成的量相比较。
[0104] 在根据第三或第四方面的本发明的方法的优选实施方案中，与步骤b)相比，步骤c)中形成的氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物的减少的量表明磷酸化的ZAP-70是化合物的靶。该结果是由这样的事实引起的，即在本发明的该方法的步骤c)中，化合物与配体竞争结合磷酸化的ZAP-70。如果在与化合物一起温育的等分中存在更少的磷酸化的ZAP-70，则这优选表示化合物已与抑制剂竞争与酶的相互作用，因此是酶的直接的靶，反之亦然。
[0105] 优选地，以中等或高通量筛选的形式进行本发明的鉴定方法。
[0106] 通过确定其是否对ZAP-70活性(例如对其激酶活性)具有影响来进一步表征根据本发明鉴定的相互作用的化合物(Isakov等人，TheJournal of Biological Chemistry271(26)，15753-15761)。
[0107] 还可通过在基于细胞的测定中使用T细胞系或原代T细胞测量其是否影响T细胞受体(TCR)信号转导来表征根据本发明鉴定的相互作用化合物。通过TCR信号转导起始的细胞激活作为一系列分子事件的结果发生，所述分子事件包括CD3ζ(CD3ζ)链的酪氨酸磷酸化、ZAP-70的募集、磷脂酶γ(PLCγ)的磷酸化、肌醇1，4，5-三磷酸的产生和钙贮备从内质网至细胞质的释放。已描述了用于在TCR刺激后使用针对胞质钙的荧光指示剂测量细胞内钙释放的方法(Meinl等人，2000，J.Immunol.165(7)：3578-3583)。
[0108] 根据经典TCR信号转导模型，CD3ζ链和ZAP-70是Lck激酶的底物，而SLP76、LAT和PLCγ是ZAP-70的下游(Schwartzberg等人2005，Nat.Rev.Immunology 5，284-295)。通过用特异性抗磷酸酪氨酸抗体检测下游靶的特异性磷酸化事件来评估ZAP-70的活性。
例如，ZAP-70在位点191的酪氨酸残基上磷酸化“用于T细胞激活的连接体”(LAT)蛋白，这可通过抗pTyr191抗体检测(Houtman等人，2005，J.Immunol.175(4)：2449-2458)。该测定可用作ZAP-70活性的读出或用于测量与ZAP-70相互作用的化合物对激酶ZAP-70的活性的影响。
例如，ZAP-70在位点191的酪氨酸残基上磷酸化“用于T细胞激活的连接体”(LAT)蛋白，这可通过抗pTyr191抗体检测(Houtman等人，2005，J.Immunol.175(4)：2449-2458)。该测定可用作ZAP-70活性的读出或用于测量与ZAP-70相互作用的化合物对激酶ZAP-70的活性的影响。
[0109] 可进一步最优化(引导物最优化)根据本发明鉴定的化合物。由于这些引导物产生文库(lead generation library)中编码的结构-活性关系(SAR)信息，通常加速此类化合物的该随后最优化。归因于用于追踪合成(follow-up synthesis)的高通量化学(HTC)方法的即时可应用性，通常促进引导物最优化。
[0110] 在Wakeling AE，Barker AJ，Davies DH，Brown DS，Green LR，Cartlidge SA，Woodburn JR.Specific inhibition of epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase by4-anilinoquinazolines.Breast Cancer Res Treat.1996；38(1)：67-73中描述了此类文库和引导物最优化的一个实例。
[0111] 本发明还涉及用于制备药物组合物的方法，该方法包括步骤：
[0112] a)如上所述鉴定与ZAP-70相互作用的化合物，和
[0113] b)将相互作用化合物配制成药物组合物。
[0114] 因此，本发明提供了用于制备可以以有效量施用给受试者的药物组合物的方法。在一个优选方面，基本上纯化治疗剂。待治疗的受试者优选是动物，包括但不限于动物例如牛、猪、马、鸡、猫、狗等，优选是哺乳动物，最优选是人。在特定的实施方案中，非人哺乳动物是受试者。
[0115] 根据本发明鉴定的化合物用于预防或治疗其中ZAP-70起作用的疾病，例如免疫性或自身免疫性疾病或由T淋巴细胞介导的病症。此类疾病或病症包括哮喘、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)、多发性硬化症和器官或组织同种异体移植物或异种移植物的急性或慢性排斥。
[0116] 此外，本发明的化合物可用于治疗ZAP-70阳性B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)。
[0117] 一般而言，本发明的药物组合物包含治疗有效量的治疗剂和药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的或美国药典或其他公认的药典中所列的用于动物，更特别地用于人的。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当口服施用药物组合物时，水是优选载体。当静脉内施用药物组合物时生理盐水和水性葡萄糖是优选载体。生理盐水溶液和水性葡萄糖以及甘油溶液优选用作用于注射液的液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶，麦芽，米，面粉，白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果想要，组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以以溶液、悬浮液、乳剂、片剂、药丸、胶囊、粉剂、持续释放制剂等形式存在。可将组合物与常规的粘合剂和载体例如甘油三酯一起配制为栓剂。口服制剂可包含标准载体例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酯镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在由E.W.Martin编著的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中描述了合适的药物载体的实例。此类组合物包含治疗有效量的治疗剂，优选以纯化的形式存在，与合适量的载体一起，以提供用于患者的恰当施用的形式。制剂应当适合施用的模式。
[0118] 在优选实施方案中，按照常规方法将组合物配制为适合用于人静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。当必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因以在注射部位减轻疼痛。一般而言，分开地提供组分或将其混合以单位剂型(例如作为标明活性剂的量的密封容器例如安瓿或sachette中冻干的粉剂或无水浓缩剂)提供。当通过输注施用组合物时，可将其分散至装有无菌药物级水或生理盐水的输注瓶。当通过注射施用组合物时，可提供用于注射的无菌水或生理盐水的安瓿以便在施用之前可将组分混合。
[0119] 本发明的治疗剂可配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离羧基例如来源于盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的羧基形成的盐，与游离胺基例如来源于异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的胺基形成的盐和来源于氢氧化钠、钾、铵、钙和铁等的盐。
[0120] 在治疗特定病症或病况中有效的本发明的治疗剂的量将取决于病症或病况的性质，其可通过标准临床技术来确定。此外，体外测定可任选地用于帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重性，应当按照医生的判断和各患者的情况来确定。然而，用于静脉内施用的合适的剂量范围通常为大约20-500毫克活性剂/千克体重。用于鼻内施用的合适的剂量范围通常为大约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。可从来源于体外或动物模型试验系统的剂量响应曲线推断出有效剂量。通常，栓剂可包含按重量计算0.5％至10％的范围内的活性组分；口服制剂优选包含10％至95％的活性组分。
[0121] 各种递送系统是已知的且可用于施用本发明的治疗剂，例如脂质体、微粒和微胶囊中的封装：能够表达治疗剂的重组细胞的使用、受体介导的内吞作用的使用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)；作为逆转录病毒或其他载体的部分的治疗性核酸的构建等。导入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可通过任何方便的途径例如通过输注，快速浓注(bolus injection)、通过经由上皮或粘膜衬(例如，口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)的吸收施用化合物，且可将所述化合物与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部性的。此外，可能希望通过任何合适的途径(包括脑室内和鞘内注射)将本发明的药物组合物导入中枢神经系统；可通过例如附着至贮器例如奥马耶贮器的脑室内导管帮助脑室内注射。还可例如通过使用吸入器或喷雾器和具有雾化剂的制剂进行肺部给药(Pulmonary administration)。
[0122] 在特定的实施方案中，可能希望将本发明的药物组合物局部施用至需要治疗的区域。这可以通过例如(但不限于)手术期间的局部输注、手术后例如与伤口敷剂(wound dressing)结合的局部敷用、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜例如硅橡膜(sialasticmembranes)或纤维。在一个实施方案中，可通过在恶性肿瘤或瘤(neoplastic)组织或肿瘤前组织(pre-neoplastictissue)的位置(或之前的位置(former site))上的直接注射来进行施用。
[0123] 在其他实施方案中，可在媒介物特别地在脂质体中递送治疗剂(Langer，1990，Science 249：1527-1533)。
[0124] 在另一个实施方案中，可通过控释系统递送治疗剂。在一个实施方案中，可使用泵(Langer，supra)。在另一个实施方案中，可将控释系统置于治疗靶即脑的附近，从而只需要全身性剂量的一部分。
[0125] 本发明还涉及用于纯化磷酸化的ZAP-70的方法，该方法包括步骤：
[0126] a)提供包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂，
[0127] b)在允许氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物形成的条件下使蛋白质制剂与固定在固体支持物上的氨基吡啶并嘧啶配体24接触，和
[0128] c)将磷酸化的ZAP-70与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24分离。
[0129] 如上所述，令人吃惊地发现氨基吡啶并嘧啶配体24是识别磷酸化的ZAP-70的配体。这使得能够产生磷酸化的ZAP-70的有效纯化方法。
[0130] 对于磷酸化的ZAP-70，包含磷酸化的ZAP-70的蛋白质制剂、用于与氨基吡啶并嘧啶配体24接触的条件、固定的氨基吡啶并嘧啶配体24、氨基吡啶并嘧啶配体24-磷酸化的ZAP-70复合物、磷酸化的ZAP-70与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24的分离以及磷酸化的ZAP-70的检测或其量的确定、上述用于本发明的鉴定方法的实施方案也用于本发明的纯化方法。
[0131] 在一个优选实施方案中，本发明的纯化方法还包括在步骤c)后鉴定能够结合磷酸化的ZAP-70的蛋白质。当在大体上生理条件下进行复合物的形成时这特别吸引人，因为之后其可以保持酶的天然状况(包括结合伴侣、酶亚基的存在或翻译后修饰的存在)，所述状况之后可借助质谱(MS)来鉴定。
[0132] 因此，在一个优选实施方案中，本发明的纯化方法还包括在步骤c)后，确定磷酸化的ZAP-70是否还例如通过泛素修饰来进行进一步的翻译后修饰。
[0133] 本发明还涉及氨基吡啶并嘧啶配体24用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物和纯化磷酸化的ZAP-70的用途。上面定义的实施方案也用于本发明的这些用途。
[0134] 已描述了ZAP-70是代表B细胞恶性肿瘤的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的诊断标记(Hamblin和Hamblin，2005，Expert Opinion inTherapeutic Targets 9(6)：1165-1178)。最初通过免疫球蛋白可变区基因的突变状态来区分CLL亚型，但现在已确立，可通过ZAP-70的表达来鉴定CLL亚型。ZAP-70激酶通常在T细胞而非B细胞中表达。因此，氨基吡啶并嘧啶配体24是诊断CLL的亚型或通过确定CLL患者将遭受晚期疾病的可能性来预后疾病进程的重要工具。
[0135] 因此，在其他方面，本发明还涉及氨基吡啶并嘧啶配体24用于制备用于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的诊断剂的用途。
[0136] 本发明还涉及用于CLL的诊断/预后的方法，该方法包括确定磷酸化的ZAP-70在样品中的存在/与ZAP-70的总量相比磷酸化的ZAP-70的量的步骤，其中与来自CLL患者的样品中的ZAP-70的总量(非磷酸化的+磷酸化的ZAP-70)相比磷酸化的ZAP-70的增加的量表示就CLL的侵袭形式而言具有更高的可能性。
[0138] 在本发明的诊断方法的一个优选实施方案中，通过上述方法例如通过MS或借助于特异性抗体确定磷酸化的ZAP-70和总ZAP-70的存在或量。然后，比较各个量。
[0139] 根据本发明，“受试者”是指任何哺乳动物，优选人。
[0140] 可如上所述确定磷酸化的ZAP-70的量。
[0141] 在本发明的说明书中，“诊断”指现存疾病的诊断以及给定的受试者具有超过50％的可能性发展各个疾病的预后。
[0144] 图1：氨基吡啶并嘧啶配体24的结构。
[0145] 游离的氨基可用于共价偶联至固体支持物材料。
[0146] 图2：用固定的氨基吡啶并嘧啶配体24和蛋白质印迹分析的药物下拉(pulldown)实验。
[0147] 使用从未处理或过钒酸盐处理的Jurkat细胞制备的细胞裂解物作为生物材料。如实施例2中所述用包含50mg蛋白质的裂解物样品进行药物下拉实验。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离加入裂解物，流出物(非结合级分)和SDS-洗脱物(结合级分)，并且转移至膜。首先用普通抗ZAP-70抗体(2A)探测印迹，然后用抗磷酸ZAP-70抗体(2B)探测印迹。
用荧光染料标记第二检测抗体以使用Odyssey红外成像系统进行检测。
用荧光染料标记第二检测抗体以使用Odyssey红外成像系统进行检测。
[0148] 来自未处理的Jurkat细胞的裂解物(泳道1至3)：
[0149] 泳道1：裂解物对照，未经历药物下拉实验
[0150] 泳道2：流出物(未结合级分)
[0151] 泳道3：洗脱物(SDS-洗脱的结合级分)
[0152] 来自过钒酸盐处理的Jurkat细胞的裂解物(泳道4至6)：
[0153] 泳道4：裂解物对照，未经历药物下拉实验
[0154] 泳道5：流出物(未结合级分)
[0155] 泳道6：洗脱物(SDS-洗脱的结合级分)
[0156] 2A：用普通ZAP-70抗体(L1E5，抗围绕人ZAP-70的氨基末端部分的残基的小鼠单克隆抗体，Cell Signaling#2709)探测的上方印迹。
[0157] 2B：用磷酸-ZAP-70抗体(磷酸-ZAP-70 Tyr493，Cell Signaling#2704)探测的下方印迹。
[0158] 图3：用固定的氨基吡啶并嘧啶配体24的药物下拉实验以用于蛋白质和磷酸肽的质谱分析。
[0159] 用SDS样品缓冲液洗脱与固定的氨基吡啶并嘧啶配体24结合的蛋白质，然后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。显示用考马斯蓝染色后的蛋白质凝胶。切取标示的凝胶区域作为凝胶切片，然后使蛋白经历通过质谱进行的分析。ZAP-70的位置在凝胶切片10和10a中。
[0160] 图4：鉴定的ZAP-70的肽。
[0161] 以粗体类型和下划线展示由人ZAP-70序列(IPI00329789.5，628个氨基酸)的质谱分析鉴定的肽。
[0162] 图5：用于与ZAP-70相互作用的化合物的鉴定的测定法。
[0163] 如实施例3中所述进行实验。通过固定的氨基吡啶并嘧啶配体24从Jurkat细胞裂解物(过矾酸盐处理的Jurkat细胞)捕获ZAP-70蛋白，然后通过标示的化合物洗脱。将洗脱物转移至硝酸纤维素膜，用Odyssey红外成像系统检测ZAP-70。一抗：抗磷酸ZAP-70(Tyr493)。二抗：山羊抗兔Irdye800CW。显示相对Odyssey单位。用于洗脱的化合物：SDS，最大洗脱的阳性对照；DMSO，溶剂对照；配体24，氨基吡啶并嘧啶配体24；星形孢菌素；JNK抑制剂SP600125；p38抑制剂SB 202190。
[0164] 图6：通过向细胞裂解物加入化合物进行的化合物谱的表征(compound profiling)(实施例4)。
[0165] 以不同的浓度向Jurkat细胞加入受试化合物，然后与亲和基质一起温育，并分析捕获的蛋白质。A：使用特异性抗体和Odyssey成像系统检测和定量ZAP-70和Lck蛋白质。25μg细胞裂解物用作对照。B：受试化合物CZC15497的剂量响应曲线。
[0166] 图7：通过将化合物与活细胞一起温育进行的化合物谱的表征(实施例4)。
[0167] 将Jurkat细胞与不同浓度的受试化合物一起温育30分钟，然后使用过钒酸盐处理细胞30分钟。制备细胞裂解物，与亲和基质混合，并分析捕获的蛋白质。A：使用特异性抗体和Odyssey成像系统检测和定量ZAP-70和Lck蛋白质。25μg细胞用作对照。B：受试化合物CZC15497的剂量响应曲线。
[0168] 图8：在基于细胞的钙释放测定中进行的化合物CZC15497的检测。
[0169] 使用用抗CD3抗体激活的Jurkat细胞(密度1.5×106个细胞/ml)通过流式细胞测定法实时测量钙的释放。将钙释放的抑制对化合物浓度作图。获得0.24μM的IC50值。如实施例5中所述进行该实验。
[0170] 实施例1：亲和基质的制备
[0171] 本实施例举例说明用于亲和捕获来自细胞裂解物的激酶的亲和基质的制备。使用氨基官能团通过共价连接将捕获配体共价固定在固体支持物上。该亲和基质用于实施例2和实施例3。
[0172] 氨基吡啶并嘧啶配体24：7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮的合成
[0173] 如Klutchko，S.R.等人，1998，Journal of MedicinalChemistry 41，3276-3292中所述进行合成的前七个步骤。如下所述进行剩下的步骤。
[0174] 步骤1-7：按照J.Med.Chem.1998，41，3276-3292中的方法从4-氯-2-甲磺酰基(methylsulfanyl)-5-嘧啶羧酸乙酯合成6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺酰基-8-甲基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。
[0175] 步骤8：{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-2-氧-1，2-二氢-[1，6]萘啶-7基氨基]苯基}-氨基甲酸叔丁酯
[0176] 将6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺酰基-8-甲基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(0.100g，0.2mmol)和3-(N-Boc-甲氨基)苯胺(0.421g，2.0mmol)以固体形式混合，加热至140℃进行30分钟。将粗反应混合物溶解于二氯甲烷中，用2N HCl(水性)洗涤2次。用无水硫酸镁干燥有机层，进行过滤和浓缩。从热的乙酸乙酯再结晶粗产物以提供作为黄色固体的{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-2-氧-1，2-二氢-[1，6]萘啶-7-基氨
1
基]苯基}-氨基甲酸叔丁酯(0.031g-25％)。H NMR(DMSO-d6)δ10.18(s，1H)；8.83(s，
1H)；7.76(d，2H)；7.58(d，2H)；7.46(dd，1H)；7.32(brt，1H)；7.23(d，2H)；4.10(d，2H)；
3.66(s，3H)；1.40(s，9H).LCMS：方法A，RT＝5.60分钟。
1
基]苯基}-氨基甲酸叔丁酯(0.031g-25％)。H NMR(DMSO-d6)δ10.18(s，1H)；8.83(s，
1H)；7.76(d，2H)；7.58(d，2H)；7.46(dd，1H)；7.32(brt，1H)；7.23(d，2H)；4.10(d，2H)；
3.66(s，3H)；1.40(s，9H).LCMS：方法A，RT＝5.60分钟。
[0177] 步骤9：7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮
[0178] 将{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-2-氧-1，2-二氢-[1，6]萘啶-7-基氨基]苯基}-氨甲酸叔丁酯(0.026g，0.05mmol)溶解于甲醇(3ml)中，并加入盐酸(4N于二噁烷中，1.2ml)。在室温下搅拌反应物进行1.5小时，此时HPLC显示无剩余起始材料。在真空中除去溶剂。将残留物溶解在水中，用碳酸钠(饱和的，水性)碱化溶液。收集所得的沉淀，并干燥以提供作为黄色固体的7-(4-氨甲基-苯氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲1
基-1H-[1，6]萘啶-2-酮(0.021g-100％)。H NMR(DMSO-d6)δ10.20(brd，1H)；8.83(d，
1H)；7.90(d，1H)；7.76(d，1H)；7.72(d，1H)；7.60(dd，2H)；7.47(ddd，1H)；7.33(d，1H)；
+
7.24(d，1H)；4.07(d，2H)；3.66(s，3H)。LCMS：方法A，RT＝4.44分钟，[MH ＝426]。
基-1H-[1，6]萘啶-2-酮(0.021g-100％)。H NMR(DMSO-d6)δ10.20(brd，1H)；8.83(d，
1H)；7.90(d，1H)；7.76(d，1H)；7.72(d，1H)；7.60(dd，2H)；7.47(ddd，1H)；7.33(d，1H)；
+
7.24(d，1H)；4.07(d，2H)；3.66(s，3H)。LCMS：方法A，RT＝4.44分钟，[MH ＝426]。
[0179] 在惰性气氛下进行所有反应。在Bruker dpx400上获得NMR光谱。使用zorbax SBC-18，4.6mm×150mm-5μ柱在Agilent 1100上进行LCMS。柱流为1ml/分钟，所使用的溶剂是水和乙腈(0.1％TFA)，注射体积为10μl。波长为254和210nm。下面描述方法。
[0180] 表1：分析方法
[0181]方法 快捷(Easy ChemStation方 流速 溶剂 运行时
Access)方法 法名称 间
名称
A 分析性阳性7 ANL_POS7.M 1ml/分钟 0-2.5分钟 7分钟
mn 5-95％MeCN
2.5-6分钟
95％MeCN
B 分析性阳性离 ANAL_POS.M 1ml/分钟 0-11分钟 15分
子 5-95％MeCN 钟
11-13分钟
95％MeCN
Access)方法 法名称 间
名称
A 分析性阳性7 ANL_POS7.M 1ml/分钟 0-2.5分钟 7分钟
mn 5-95％MeCN
2.5-6分钟
95％MeCN
B 分析性阳性离 ANAL_POS.M 1ml/分钟 0-11分钟 15分
子 5-95％MeCN 钟
11-13分钟
95％MeCN
[0182] 表2：用于化学方案的缩写
[0183]aq 水性的
d 双峰(doublet)
DMSO 二甲基亚砜
g 克
HCl 盐酸
HPLC 高压液相色谱
LCMS 液相色谱-质谱法
m 多重峰(multiplet)
mins 分钟
mmol 毫摩尔
N 正常
NMR 核磁共振
q 四重峰(quartet)
RT 保留时间
s 单峰(singlet)
sat 饱和的
t 三重峰(triplet)
d 双峰(doublet)
DMSO 二甲基亚砜
g 克
HCl 盐酸
HPLC 高压液相色谱
LCMS 液相色谱-质谱法
m 多重峰(multiplet)
mins 分钟
mmol 毫摩尔
N 正常
NMR 核磁共振
q 四重峰(quartet)
RT 保留时间
s 单峰(singlet)
sat 饱和的
t 三重峰(triplet)
[0184] 包含胺基的配体的固定
[0185] 用无水DMSO(二甲基亚砜，Fluka，41648，H2O＜＝0.005％)平衡NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，17-0906-01)。将1ml沉积的珠粒置于15ml Falcon管中，加入化合物原液(通常100mM于DMF或DMSO中)(终浓度0.2-2μmol/ml珠粒)和15μl三乙胺(Sigma，T-0886，99％的纯度)。在黑暗中在室温下于立式圆筒(end-over-end)振荡器(Roto Shake Genie，ScientificIndustries Inc.)上温育珠粒，进行16至20小时。通过HPLC确定偶联效率。通过在室温下于立式圆筒振荡器上与氨基乙醇一起温育过夜来封闭未反应的NHS基团。用10ml DMSO洗涤珠粒，在-20℃下将其贮存在异丙醇中。这些珠粒在实施例2和3中用作亲和基质。通过阻断NHS基团(通过如上所述与氨基乙醇一起温育来阻断)来产生对照珠粒(没有固定的配体)。
[0186] 实施例2：使用固定的氨基吡啶并嘧啶配体24进行的ZAP-70的磷酸化形式的药物下拉
[0187] 该实施例示范固定的氨基吡啶并嘧啶配体24用于鉴定来自人T细胞系(Jurkat细胞)的细胞裂解物的ZAP-70的用途。为此，将未处理的和处理的Jukat细胞的裂解物与实施例1中描述的亲和基质接触。通过蛋白质印迹和质谱(MS)分析鉴定结合氨基吡啶并嘧啶配体24的蛋白质。
[0188] 对于蛋白质印迹分析，从亲和基质洗脱结合的蛋白质，随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分离。用结合所述蛋白质的非磷酸化氨基末端部分的普通单克隆抗体和另外用磷酸-特异性抗体(phospho-specific antibody)检测ZAP-70(图2)。
[0189] 蛋白质印迹分析的结果显示固定的氨基吡啶并嘧啶配体24优先下拉ZAP-70的磷酸化形式。与未处理的裂解物相比只在已处理的Jurkat细胞裂解物中显著检测到磷酸化的ZAP-70。
[0190] 对于通过质谱分析鉴定蛋白质和磷酸肽，洗脱通过亲和基质捕获的蛋白质，随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分离。切取合适的凝胶条带，使其经历使用胰蛋白酶的凝胶内蛋白水解消化。然后通过固定的金属亲和层析(IMAC)富集磷酸化的肽。通过LC-MS/MS质谱法分别分析保留的磷酸肽和非结合肽。
[0191] ZAP-70的肽序列覆盖示于图4中。通过质谱法总共鉴定9个ZAP-70磷酸肽(表4)。
[0192] 1.细胞培养
[0193] 以0.15×106和1.2×106个细胞/ml之间的密度将Jurkat细胞(来自ATCC，编号TIB-152的克隆E6-1)在1升Spinner瓶(IntegraBiosciences，#182101)中悬浮培养在补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，#21875-034)中。6
对于刺激实验，用30μM过钒酸盐(终浓度)处理密度大约为1.0×10 个细胞/ml的细胞，进行1小时，然后通过离心收获细胞。在用1×PBS缓冲液(Invitrogen，#14190-094)充分洗涤后，将细胞沉淀冷冻在液氮中，然后于-80℃下保存。
对于刺激实验，用30μM过钒酸盐(终浓度)处理密度大约为1.0×10 个细胞/ml的细胞，进行1小时，然后通过离心收获细胞。在用1×PBS缓冲液(Invitrogen，#14190-094)充分洗涤后，将细胞沉淀冷冻在液氮中，然后于-80℃下保存。
[0194] 对于刺激实验，用H2O2处理的原钒酸钠处理细胞以抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶(D.C.Weiser 和 S.Shenolikar，Chapter 18.10 inCurrent Protocols in Molecular Biology，2003，John Wiley & Sons，Inc.)。对于细胞处理，向10升培养基中加入30ml混6
合物3，从而产生30μM过钒酸盐的终浓度。以0.8至1.2×10 个细胞/ml之间的密度保持Jurkat细胞，进行1小时，然后收获细胞。
合物3，从而产生30μM过钒酸盐的终浓度。以0.8至1.2×10 个细胞/ml之间的密度保持Jurkat细胞，进行1小时，然后收获细胞。
[0195] 过钒酸盐溶液的制备
[0196] 以100mM的终浓度将原钒酸钠(Sigma，#6508)溶解在无菌蒸馏水中，用0.1M NaOH将溶液的pH值调节至pH10.0。将溶液置于沸水浴中直至溶液澄清或变成半透明。如果必要，再次调节pH至10.0，在-20℃下贮存原液。避免原液反复冻融。
[0197] 将500μl 30％H2O2(Sigma，Cat.No.H1009)和375μl 1×PBS混合(混合物1)。
[0198] 将3.5ml 100mM钒酸盐溶液(pH10.0)和31.5ml 1×PBS混合(混合物2)。
[0199] 将650μl混合物1和32.5ml混合物2混合(混合物3)。在用于细胞培养前在室温下温育混合物3，进行10分钟。
[0200] 2.细胞裂解物的制备
[0201] 在Potter S匀浆器中将Jurkat细胞在裂解缓冲液(50mMTris-HCl、0.8％NP40、5％甘油、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、25mMNaF、1mM钒酸钠、1mM DTT、pH7.5)中匀浆。每25ml缓冲液加入一个完整的不含EDTA的片剂(蛋白酶抑制剂混合物，RocheDiagnostics，1 873
580)。使用机械化的POTTER S将材料匀浆(dounce)10次，然后将材料转移至50ml falcon管中，在冰上温育30分钟，然后在4℃下以20,000g(10,000rpm于预冷的SorvallSLA600中)离心10分钟。将上清液转移至超速离心机(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmann，355654)中，在4℃下以100.000g(33.500rpm于预冷的Ti50.2中)离心1小时。再次将上清液转移至新的50ml falcon管中，通过Bradford测定法(BioRad)确定蛋白质浓度，并制备每等分包含50mg蛋白质的样品。立即将样品用于实验或冷冻在液氮中，于-80℃下冷冻贮存。
580)。使用机械化的POTTER S将材料匀浆(dounce)10次，然后将材料转移至50ml falcon管中，在冰上温育30分钟，然后在4℃下以20,000g(10,000rpm于预冷的SorvallSLA600中)离心10分钟。将上清液转移至超速离心机(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmann，355654)中，在4℃下以100.000g(33.500rpm于预冷的Ti50.2中)离心1小时。再次将上清液转移至新的50ml falcon管中，通过Bradford测定法(BioRad)确定蛋白质浓度，并制备每等分包含50mg蛋白质的样品。立即将样品用于实验或冷冻在液氮中，于-80℃下冷冻贮存。
[0202] 3.化合物下拉实验
[0203] 在裂解缓冲液中平衡具有固定的化合物的Sepharose-珠粒(每个下拉实验100μl珠粒)，然后在立式圆筒振荡器(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上在4℃下与包含50mg蛋白质的细胞裂解物样品一起温育2小时。收集珠粒，将其转移至Mobicol-柱(MoBiTech 10055)，并用10ml包含0.5％NP40去污剂的裂解缓冲液洗涤，然后用5ml具有0.25％的去污剂的裂解缓冲液洗涤。为了洗脱结合的蛋白质，加入60μl
2×SDS样品缓冲液，在50℃下加热柱子进行30分钟，通过离心将洗脱物转移至微量离心管。然后通过SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。
2×SDS样品缓冲液，在50℃下加热柱子进行30分钟，通过离心将洗脱物转移至微量离心管。然后通过SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。
[0204] 4.通过蛋白质印迹分析法进行的蛋白质检测
[0205] 按照标准方法进行蛋白质印迹，按照厂商提供的说明书(Schutz-Geschwendener等 人，2004.Quantitative，two-colorWestern blot detection with infrared fluorescence.PublishedMay 2004 by LI-COR Biosciences，www.licor.com)通过使用特异性抗磷酸ZAP-70抗体(一抗)、荧光标记的二抗和来自LI-CORBiosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像系统来检测和定量ZAP-70蛋白。
[0206] 只有当在酪氨酸残基493上磷酸化时，磷酸ZAP-70抗体(pTyr493，兔多克隆抗体，Cell Signaling#2704)检测ZAP-70。普通ZAP-70抗体(L1E5，小鼠单克隆抗体，Cell Signaling#2709)抗人ZAP-70的氨基末端。
[0207] 5.通过质谱法进行的蛋白质鉴定
[0208] 5.1在质谱分析之前进行的蛋白质消化
[0209] 基本按照Shevchenko等人，1996，Anal.Chem.68：850-858所描述的方法在凝胶中还原、烷基化和消化凝胶分离的蛋白质。简而言之，使用干净的解剖刀从凝胶切取凝胶分离的蛋白质，使用10mM DTT(于5mM碳酸氢铵中，54℃，45分钟)还原所述蛋白质，然后在室温下在黑暗中用55mM碘乙酰胺(于5mM碳酸氢铵中)进行烷化(30分钟)。以12.5ng/μl于5mM碳酸氢铵中的蛋白酶浓度用猪胰蛋白酶(Promega)在凝胶中消化经还原和烷化的蛋白质。让消化在37℃下进行4小时，随后使用5μl 5％甲酸终止反应。
[0210] 5.2通过质谱法分析之前的样品制备
[0211] 用20μl 1％TFA提取凝胶塞2次，将其与酸化的消化上清液混合。在真空离心机中干燥样品，然后重悬于10μl 0.1％甲酸中。将干燥的样品重悬于30μl包含250mM乙酸、30％乙腈和4μl PHOS-选择性铁亲和珠粒(Sigma，P9740；IMAC材料)的水中，在温和水平振荡的条件下在室下温育2小时。随后，将浆状物(slurry)装载在包含restriction的凝胶装料器尖端以防止IMAC材料流出。让珠粒沉淀1分钟，然后使用P10移液管使溶剂通过柱子，并在Eppendorf管中收集所述溶液。用20μl包含250mM乙酸、30％乙腈的水溶液洗涤IMAC柱两次。混合洗脱的级分，在真空离心机中进行干燥。该级分称为未结合级分(NBF)。使用20μl包含400mM氨和30％乙腈的水溶液从IMAC柱洗脱磷酸肽。重复洗脱两次，混合洗脱级分，并在真空离心机中干燥(结合级分，BF)。在进行LC-MS/MS分析(PoZuelo Rubio等人，2005，Biochemical Journal 392(Part 1)，163-172)之前将两种级分(NBF和BF)都重悬于10μl 0.1％甲酸中。
[0212] 5.3.质谱数据的获取
[0213] 将肽样品注射入直接与四极TOF(QTOF2，QTOF Ultima，QTOFMicro，Micromass)或离子阱(LCQ Deca XP)质谱仪偶联的的纳米LC系统(CapLC，Waters或Ultimate，Dionex)。使用水性和有机溶剂的梯度在LC系统上分离肽(参见下文)。溶剂A是于0.5％的甲酸中的5％乙腈，溶剂B是于0.5％的甲酸中的70％乙腈。
[0214] 表3：在质谱仪中对从LC系统洗脱出的肽进行部分测序。
[0215]时间(分钟) ％溶剂A ％溶剂B
0 95 5
5.33 92 8
35 50 50
36 20 80
40 20 80
41 95 5
50 95 5
0 95 5
5.33 92 8
35 50 50
36 20 80
40 20 80
41 95 5
50 95 5
[0216] 5.4.蛋白质的鉴定
[0217] 将LC-MS/MS实验中产生的肽质量和片段化数据用于查询NCBI(针对NCBInr、dbEST以及人和小鼠基因组)和欧洲生物信息研究所(EBI，针对人、小鼠、果蝇和线虫蛋白质组数据库)维护和定期更新的fasta格式的蛋白质和核苷酸序列数据库。通过使 用 软件 工 具Mascot(Matrix Science；Perkins等人，1999.Probability-based proteinidentification by searching sequence databases using massspectrometry data.Electrophoresis 20，3551-3567)使测量的肽质量和片段化数据与从数据库的条目(entries)计算的相同数据相关联来鉴定蛋白质。搜寻标准随用于分析的质谱仪变化而变化。
[0218] 5.5磷酸肽的鉴定
[0219] 通过允许在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上磷酸化(作为Mascot搜寻参数的可变修饰)，之后人工观察光谱与序列赋值(sequenceassignments)来完成磷酸化的肽的鉴定。
[0220] 表4：ZAP-70的磷酸肽
[0221] 标示通过人ZAP蛋白质序列(IPI00329789.5，628个氨基酸)的质谱分析鉴定的磷酸肽(观察的值：测量的质荷比；Mr(exp.)：‘观察的值’×电荷)。
[0222]终止 观察的
肽编号 起始位点 Mr(expt) Mr(calc) Δ 序列
位点 值
1 176 186 624.297 1246.579 1246.559 0.02 KLpYSGAQTDGK
2 241 251 687.349 1372.684 1372.683 0.002 LKADGLIpYCLK
3 283 298 628.966 1883.876 1883.841 0.034 RIDTLNSDGpYTPEPAR
4 284 298 864.899 1727.783 1727.74 0.043 IDTLNSDGpYTPEPAR
5 299 306 497.244 992.474 992.469 0.005 ITpSPDKPR
6 485 496 691.795 1381.575 1381.555 0.02 ALGADDS pYYTAR
7 485 496 691.8 1381.585 1381.555 0.03 ALGADDSYpYTAR
8 485 496 731.792 1461.569 1461.521 0.048 ALGADDSpYpYTAR
9 604 612 571.749 1141.483 1141.451 0.032 ACYpYSLASK
肽编号 起始位点 Mr(expt) Mr(calc) Δ 序列
位点 值
1 176 186 624.297 1246.579 1246.559 0.02 KLpYSGAQTDGK
2 241 251 687.349 1372.684 1372.683 0.002 LKADGLIpYCLK
3 283 298 628.966 1883.876 1883.841 0.034 RIDTLNSDGpYTPEPAR
4 284 298 864.899 1727.783 1727.74 0.043 IDTLNSDGpYTPEPAR
5 299 306 497.244 992.474 992.469 0.005 ITpSPDKPR
6 485 496 691.795 1381.575 1381.555 0.02 ALGADDS pYYTAR
7 485 496 691.8 1381.585 1381.555 0.03 ALGADDSYpYTAR
8 485 496 731.792 1461.569 1461.521 0.048 ALGADDSpYpYTAR
9 604 612 571.749 1141.483 1141.451 0.032 ACYpYSLASK
[0223] 实施例3：用于鉴定与ZAP-70相互作用的化合物的测定法
[0224] 如实施例1中所述进行氨基吡啶并嘧啶配体24亲和基质的制备。为了在96孔板中筛选最多80种化合物，如下所述进行洗脱实验。
[0225] 洗脱测定法
[0226] 用30ml 1×DP-缓冲液洗涤亲和基质(1600μl的珠粒)2次。在每一次洗涤步骤后，通过在Heraeus离心机中在4℃下以1300rpm离心4分钟来收集珠粒。弃去上清液。最后，在50ml结合缓冲液(1×DP缓冲液/0.4％NP40)中平衡珠粒，在4℃下于ROTO SHAKE GENIE(Scientific Industries，Inc.)上旋转30至45分钟。在该温育时间后，收获珠粒，将其与45ml过钒酸盐激活的澄清的、蛋白质浓度为5mg/ml的Jurkat细胞裂解物混合。如实施例2中所述制备裂解物。在4℃下温育珠粒和裂解物2小时。在与裂解物温育后，如所述通过离心收集珠粒，用25ml结合缓冲液洗涤珠粒3次。在每一次洗涤步骤过程中，在4℃下在ROTO SHAKE GENIE(Scientific Industries，Inc.)上温育珠粒8分钟。在第三次洗涤后，将珠粒转移至2ml柱子(MoBiTec，#S10129)，并用20ml 1×DP缓冲液/0.2％NP40进行洗涤。在洗涤缓冲液完全通过柱子后，计算留在柱子中的珠粒的体积(大约1000μl)。将珠粒重悬于4倍过量的1×DP-缓冲液/0.2％NP40(4ml)中以产生1∶4的浆状物。对于化合物洗脱试验，向96孔板(MilliporeMultiScreenHTS，MSBVN1210，具有盖子和1.2um亲水低蛋白结合Durapore膜)的各个孔加入50μl该悬浮液。为了除去残留缓冲液，将96孔板装配上装配滤器(Assemble filter)和收集板，并将该夹层装置在离心机中以800rpm离心10秒。然后向珠粒中加入40μl补充有受试化合物的洗脱缓冲液(1×DP-缓冲液/0.2％NP40)。通过将它们(始于40倍的DMSO中的浓缩原液)稀释在稀释缓冲液中来制备受试化合物。将板装配在收集板上，固定在Eppendorf保温箱上，在4℃下在以650rpm振荡的情况下温育30分钟。为了收获洗脱物，在4℃下在台式离心机(Heraeus)中以800rpm离心装配在96孔收集板上的96孔滤板1分钟。洗脱物的通常体积为大约35μl。在-80℃下贮存洗脱物。通过使用斑点印迹法就ZAP-70的存在检查洗脱物。
[0227] 使用氨基吡啶并嘧啶配体24(参见实施例1)，星形孢菌素(Sigma S4400)、JNK抑制剂SP600125(Calbiochem 420119)和p38抑制剂SB 202190(Tocris 1264)作为受试化合物。通常将所有化合物以100mM的浓度溶解在100％DMSO(Fluka，cat.no 41647)中。可选择地，100％DMF(Fluka，cat.no 40228)可用于不能溶解在DMSO中的那些化合物。在-20℃下贮存化合物。用于洗脱实验的受试化合物的稀释：通过用100％DMSO以1∶1稀释100mM的原液来制备50mM的原液。对于洗脱实验，进一步用洗脱缓冲液(1×DP-缓冲液，0.2％NP40)稀释化合物。
[0228] 缓冲液的制备
[0229] 表5：5×-DP缓冲液的制备
[0230]物质： 原液 1×裂解缓冲液 加入以获得115
中的终浓度 ×裂解缓冲液
Tris/HCl pH7.5 1M 50mM 250ml
甘油 87％ 5％ 288ml
MgCl2 1M 1.5mM 7.5ml
NaCl 5M 150mM 150ml
Na3VO4 100mM 1mM 50ml
中的终浓度 ×裂解缓冲液
Tris/HCl pH7.5 1M 50mM 250ml
甘油 87％ 5％ 288ml
MgCl2 1M 1.5mM 7.5ml
NaCl 5M 150mM 150ml
Na3VO4 100mM 1mM 50ml
[0231] 将5×-DP缓冲液通过0.22μm的滤器进行过滤，并将其在-80℃下以40ml的等分贮存。从下列提供商获得这些溶液：1.0M Tris/HClpH7.5(Sigma，T-2663)、87％甘油(Merck，目录号04091.2500)、1.0M MgCl2(Sigma，M-1028)、5.0M NaCl(Sigma，S-5150)。
[0232] 洗脱的ZAP-70的检测
[0233] 按照厂商提供的说明书(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-color Western blot detection with infraredfluorescence. 由 LI-COR Biosciences于2004年5月公布，www.licor.com)使用特异性抗磷酸ZAP-70抗体(一抗)、荧光标记的二抗和来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像系统，通过斑点印迹法检测和定量洗脱的ZAP-70蛋白。
[0234] 用20％的乙醇处理硝酸纤维素膜5秒，然后用1×PBS缓冲液洗涤。将洗脱物(如上所述的)与10μl 4×SDS上样缓冲液(200mMTris-HCl pH6.8，8％SDS、40％甘油、0.04％溴酚蓝)混合，用BioRad斑点印迹装置(BioRad，#170-6545)将其用于硝酸纤维素膜，并用1×PBS缓冲液洗涤一次。
[0235] 对于ZAP-70蛋白的检测，首先通过与Odyssey封闭缓冲液温育1小时来封闭膜。将经封闭的膜在4℃下与一抗，识别磷酸化的酪氨酸残基493的兔抗磷酸ZAP-70抗体(pTyr493，兔多克隆抗体，CellSignaling#2704)(在补充有0.1％Tween 20和0.02％SDS的Odyssey封闭缓冲液中以1∶1000稀释)一起温育16小时。
[0236] 在用包含0.01％Tween 20的1×PBS缓冲液洗涤膜4次(每次5分钟)后，将膜与检测抗体(来自LI-COR的山羊抗兔IRDye 800CW抗体，在补充有0.1％Tween 20和0.02％SDS的Odyssey封闭缓冲液中以1∶10000稀释)一起温育1小时。之后用1×PBS缓冲液/0.1％Tween 20洗涤膜4次(每次5分钟)并用1×PBS缓冲液洗涤膜1次(进行5分钟)。之后用Odyssey读数计扫描膜，并分析数据。
[0237] 实施例4：通过向细胞裂解物或活细胞加入化合物来进行的与ZAP-70相互作用的化合物的化合物谱的表征
[0238] 本实施例示范了其中将受试化合物直接加入细胞裂解物或与活细胞一起温育的竞争结合测定法。对于细胞裂解物竞争结合测定法，向裂解物样品加入不同浓度的受试化合物，让所述受试化合物与裂解物样品中包含的蛋白质结合。然后加入包含固定的氨基吡啶并嘧啶配体24的亲和基质以捕获不与受试化合物结合的蛋白质。在温育时间后，通过离心将具有捕获的蛋白的珠粒与裂解物分离。然后洗脱结合的蛋白质，并使用特异性抗体和Odyssey红外检测系统检测ZAP-70的存在和对其进行定量(图6A)。产生化合物CZC15497的剂量响应曲线，IC50值为1.72μM(图6B)。
[0239] 可选择地，首先将活Jurkat细胞的等分与各种化合物浓度温育30分钟，然后用30μM过钒酸盐处理另外30分钟。收获细胞，制备细胞裂解物，并加入亲和基质以捕获不与受试化合物结合的蛋白。在将细胞裂解物与亲和基质温育90分钟后，通过离心将具有捕获的蛋白的珠粒与裂解物分离。然后洗脱结合的蛋白，并如上所述，使用特异性抗体和Odyssey红外检测系统检测ZAP-70的存在和对其进行定量(图7A)。产生化合物CZC15497的剂量响应曲线，IC50值为0.65μM(图7B)。
[0240] 两种方法的结果的比较(图6和7；加入至裂解物的化合物对与细胞一起温育的化合物)对于CZC15497化合物和ZAP-70激酶产生相似的IC50值。此外，该化合物特异性地与ZAP-70激酶而非Lck相互作用。
[0241] 亲和基质的洗涤
[0242] 用15ml 1×DP缓冲液洗涤实施例1中描述的亲和基质(0.3ml干体积(dry volume))2次，然后用15ml包含0.4％NP40的1×DP缓冲液洗涤，最后重悬于0.3ml的包含0.4％NP40的1×DP缓冲液中(50％珠粒浆状物)。
[0243] 受试化合物的制备
[0244] 对于在裂解物竞争中，在DMSO中制备相应于比最终希望的试验浓度高200倍的浓度的受试化合物的原液(例如对于5μM的终试验浓度制备1mM的原液)。该稀释方案产生0.5％的终DMSO浓度。对于对照实验(无受试化合物)，使用包含0.5％DMSO的缓冲液，以便所有受试样品包含0.5％DMSO。
[0245] 细胞裂解物的稀释
[0246] 如实施例2中所述从过钒酸盐处理的Jurkat细胞制备细胞裂解物。对于通常实验，将一个包含50mg蛋白质的裂解物等分在37℃的水浴中解冻，然后保持在4℃。向裂解物中加入1体积的包含蛋白酶抑制剂的1×DP缓冲液(1片蛋白酶抑制剂溶解在25ml 1×DP缓冲液或25ml包含0.4％NP40的1×DP缓冲液中；不含EDTA的小片蛋白酶抑制剂混合物来自Roche Diagnostics，产品目录号41647)，以便获得0.4％的终NP40浓度。通过加入包含0.4％NP40和蛋白酶抑制剂的1×DP缓冲液来进一步稀释裂解物，以便获得5mg/ml的终蛋白质浓度。
[0247] 细胞裂解物与受试化合物和亲和基质的温育
[0248] 向1ml Jurkat裂解物(包含5mg蛋白质)加入5μl化合物CZC15497(稀释于DMSO中)，在4℃下温育45分钟。然后加入20μl具有固定的氨基吡啶并嘧啶配体24的亲和基质，在4℃下再温育1个小时。在通过离心将珠粒与裂解物分离后，用50μl 2×浓缩样品缓冲液(25μl 4×NuPAGE LDS样品缓冲液，Invitrogen，NP0007；2.5μ1 1M二硫苏糖醇(DTT)；22.5μl H2O)洗脱结合的蛋白质。
[0249] ZAP-70的检测和定量
[0250] 按照 标 准方 法进 行 蛋白 质 印迹 法，按 照 由厂 商提 供 的说 明 书(Schutz-Geschwendener等人，2004.Quantitative，two-colorWestern blot detection with infrared fluorescence. 由 LI-CORBiosciences 于 2004 年 5 月 公 布，www.licor.com)通过使用特异性抗ZAP-70抗体(一抗)、荧光标记的二抗和来自LI-COR Biosciences(Lincoln，Nebraska，USA)的Odyssey红外成像系统检测和定量ZAP-70蛋白。对于Lck的检测，使用抗Lck抗体(Upstate 3A5)。
[0251] 在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质洗脱物，然后转移至PVDF膜。在室温下将膜与Odyssey缓冲液一起温育1小时以阻断非特异性结合。在洗涤后，在4℃下将膜与抗ZAP-70抗体(获自Abcam的抗磷酸Tyr292的兔多克隆抗体；于具有0.2％Tween 20的Odyysey缓冲液中以1∶1000稀释)一起温育16小时。对于Lck的检测，使用抗Lck抗体(Upstate 3A5)。然后用补充有0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗涤膜4次，每次5分钟。将用荧光染料标记的第二检测抗体与Odyssey红外成像系统结合使用以显现和定量蛋白质条带(于具有0.2％Tween20、0.02％SDS的Odyssey缓冲液中以1∶10000稀释的IRDye800nm抗兔抗体(Licor)，在室温下温育1小时)。再一次，用补充有0.1％Tween 20的PBS缓冲液洗涤膜4次，每次5分钟，最后用PBS缓冲液短暂洗涤以除去Tween 20。
[0252] 使用XL拟合程序(fit program)(XLfit4 Excel Add-In Version4.2.0 Build13；IDBS，Guilford，UK)计算剂量响应曲线。
[0253] 细胞与受试化合物的温育，细胞裂解物的制备，与亲和基质的温育以及蛋白质的检测
[0254] 对于细胞处理，以比最终希望的试验浓度高5000倍的浓度制备受试化合物的原液。细胞培养基中的终DMSO浓度为0.02％DMSO。
[0255] 在37℃下用不同浓度(5.0μM、1.0μM、0.33μM、0.11μM、0.037μM和0.012μM)6
的化合物CZC15497处理Jurkat细胞培养物(1升体积，细胞密度1.15×10 个细胞/ml)30分钟，然后用30μM过钒酸盐再处理另外30分钟(关于过钒酸盐溶液的制备，参见实施例
2)。然后收获细胞，如上所述制备细胞裂解物，并加入亲和基质以捕获未与受试化合物结合的蛋白质。在细胞裂物与亲和基质在4℃下温育90分钟后，通过离心将具有捕获的蛋白质的珠粒与裂解物分离。用50μl 2×浓缩样品缓冲液(25μl 4×NuPAGE LDS样品缓冲液，Invitrogen，NP0007；2.5μl 1M二硫苏糖醇(DTT)；22.5μl H2O)洗脱珠粒结合的蛋白质。使用特异性抗体和Odyssey红外检测系统检测洗脱物中ZAP-70的存在和对其进行定量(图7A)。对于Lck的检测，使用抗Lck抗体(Upstate 3A5)。产生化合物CZC15497与ZAP-70相互作用的剂量响应曲线，得到0.65μM的IC50值(图7B)。
的化合物CZC15497处理Jurkat细胞培养物(1升体积，细胞密度1.15×10 个细胞/ml)30分钟，然后用30μM过钒酸盐再处理另外30分钟(关于过钒酸盐溶液的制备，参见实施例
2)。然后收获细胞，如上所述制备细胞裂解物，并加入亲和基质以捕获未与受试化合物结合的蛋白质。在细胞裂物与亲和基质在4℃下温育90分钟后，通过离心将具有捕获的蛋白质的珠粒与裂解物分离。用50μl 2×浓缩样品缓冲液(25μl 4×NuPAGE LDS样品缓冲液，Invitrogen，NP0007；2.5μl 1M二硫苏糖醇(DTT)；22.5μl H2O)洗脱珠粒结合的蛋白质。使用特异性抗体和Odyssey红外检测系统检测洗脱物中ZAP-70的存在和对其进行定量(图7A)。对于Lck的检测，使用抗Lck抗体(Upstate 3A5)。产生化合物CZC15497与ZAP-70相互作用的剂量响应曲线，得到0.65μM的IC50值(图7B)。
[0256] 实施例5：Jurkat细胞中的钙释放测定
[0257] 与CZC15497用作ZAP-70的抑制剂一致，我们发现该化合物抑制抗CD3刺激的Jurkat T细胞中的钙释放，IC50值为0.24μM(图8)。
[0258] 测定原理
[0259] 荧光探针的开发使得能够测量单个活细胞中细胞内游离钙离子的浓度。首先用2+
可渗透细胞的Ca -灵敏性染料装载细胞，然后加入受试化合物。最后，在即将于流式细
2+
胞仪上获取数据之前用抗CD3抗体通过T细胞受体激活细胞。Ca 的释放测量为细胞刺激后时间的函数。本方案描述了使用Fluo-3和Fluo-4染料(Minta等人，1989，J.Biol.
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Chem.264(14)：8171-8178)测量Jurkat细胞中细胞内Ca 的浓度的流式细胞术方法(也参见June等人，1997，Measurement ofintracellular calcium ions by flow cytometry.In：
CurrentProtocols in Cytometry(1997)Unit 9.8.1-9.8.19，John Wiley &Sons，Inc.)。
可渗透细胞的Ca -灵敏性染料装载细胞，然后加入受试化合物。最后，在即将于流式细
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胞仪上获取数据之前用抗CD3抗体通过T细胞受体激活细胞。Ca 的释放测量为细胞刺激后时间的函数。本方案描述了使用Fluo-3和Fluo-4染料(Minta等人，1989，J.Biol.
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Chem.264(14)：8171-8178)测量Jurkat细胞中细胞内Ca 的浓度的流式细胞术方法(也参见June等人，1997，Measurement ofintracellular calcium ions by flow cytometry.In：
CurrentProtocols in Cytometry(1997)Unit 9.8.1-9.8.19，John Wiley &Sons，Inc.)。
[0260] Ca2+释放的测定方案
[0261] 一般而言，应当在可能的最短时间内处理细胞以确保它们的稳定性。因此，高度推荐预先准备所有材料和利用任何温育或离心时间准备后面的步骤(例如制备化合物稀释物或启动流式细胞仪)。
[0262] 1)准备标明待分析的样品包括对照的数目的工作计划。
[0263] 2)细胞收获：以1100rpm离心50至100ml Jurkat细胞培养物，进行5分钟。弃去上清液，将重悬的细胞沉淀混合在单个50mlFalcon管中，用PBS-CaCl2(无FCS)补足至50ml。再次离心样品。
[0264] 3)用PBS-CaCl2(无FCS)重悬细胞沉淀以获得不低于10×106个细胞/ml的浓度。制备适当的稀释物以估计细胞浓度和计数细胞。
[0265] 4)在50ml Falcon管中分离需要装载的细胞的体积(例如用于20个样品的1077
个细胞)，对于10 个细胞用PBS-CaCl2补足至900μl。
个细胞)，对于10 个细胞用PBS-CaCl2补足至900μl。
[0266] 5)在黑暗中制备1∶1的FLUO-4(1mM)+Pluronic F-127(20％)的混合物。每107个细胞需要5μl的Fluo-4。
[0267] 6)用PBS-CaCl2制备该混合物的1/10稀释物(在黑暗中；例如将5μlFluo-4+5μl F-127配成100μl)。
[0268] 7)向细胞加入染料溶液。每管装载不超过30×106个细胞。
[0269] 8)在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中温育样品30分钟。不时进行混合。
[0270] 9)在此期间，于PBS-CaCl2(具有10％FCS)中制备足够的受试化合物稀释物。溶液浓度应当比希望的终浓度高10倍。涡旋各稀释物。也制备抗体稀释物：抗CD3(1/200)和GAM(1/25)。
[0271] 10)标记FACS管，将30μl化合物稀释物分配入相应的管中或只将缓冲液分配入对照管中。
[0272] 11)在30分钟的温育后，在PBS-CaCl2(具有10％FCS)中洗涤细胞两次。在洗涤步骤期间确保流式细胞仪已经打开以加热激光器。
[0273] 12)以1.5×106个细胞/ml的浓度在PBS-CaCl2(具有10％FCS)中重悬细胞沉淀。
[0274] 13)将300μl细胞悬浮液分配入FACS管，轻轻混合。开始化合物温育。在黑暗中使样品保持在室温。
[0275] 14)打开流式细胞仪的设置。建议将用于所有测量的模板准备好。机器的设置也应当在允许估计细胞制剂的重复性的实验间相同。
[0276] 15)在设置方法中，在细胞仪上控制细胞制剂。细胞应当置于预先确定的槽(gates)。
[0277] 16)在化合物温育期间，也检查细胞如预期响应抗CD3激活。将定时器定为8秒。加入6μl抗CD3稀释物(0.2μg/ml终浓度)，轻轻地混合。加入1μl GAM稀释物(0.75μg/ml终浓度)，轻轻地混合。在37℃下在水浴中温育样品，同时起动定时器。在8秒钟的温育后，以中等速度获得数据，进行200秒。荧光的明显增加应当在1分钟后出现。
[0278] 17)在获取FACS数据之前确保细胞在室温下静息和平衡15分钟。
[0279] 18)数据获取：应当连续测量待比较的样品。
[0280] 19)为了更好的重复性，确保在2小时内获得装载的细胞的数据。
[0281] 20)使用FlowJo 软件(Tree Star，Inc.)分析数据。
[0282] 细胞培养
[0283] 从美国典型培养物保藏中心(American Type Cell Collection)(ATCC)获得Jurkat细胞系J77。将Jurkat细胞维持在补充有热灭活的胎牛血清(Gibco，ref.10270-106。通过在56℃水浴中进行45分钟热灭活FCS)的RPMI 1640培养基(Gibco，ref.21875-034)中。
[0284] 试剂
[0285] Fluo-3，AM(Molecular Probes，F14218，以1ml现成的于DMSO中的1mM溶液的形式提供，在-20℃下以5μl或7.5μl的等分贮存)。
[0286] Fluo-4，AM(Molecular Probes，F14217，以1ml现成的于DMSO中的1mM溶液的形式提供，在-20℃下以5μl或7.5μl的等分贮存)。
[0287] Pluronic F-127(Molecular Probes，P3000MP，以1ml现成的于DMSO中的20％的溶液的形式提供)。
[0288] PBS-CaCl2-MgCl2(Gibco，14040-91)。
[0289] 抗CD3抗体(Calbiochem，217570，以1mg/ml提供)。
[0290] 山羊抗小鼠IgG抗体(GAM；Sigma，M8890，以6mg/ml提供)。
[0291] 设备
[0292] 流式细胞仪(Becton-Dickinson，FACSCalibur)和FlowJo 软件(Tree Star，Inc.)。
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