本发明涉及磁性聚合物颗粒，该磁性聚合物颗粒包含铁磁性、亚铁磁 性和/或超顺磁性颗粒，这些颗粒嵌埋在交联的聚丙烯酸酯或聚[(烷基丙烯 酸酯)]基质中，所述基质包含通式(I)的官能团

-C(＝O)-M-R    (I)

其中

M可以是-O-，-NH-或-N(C1-C6-烷基)-；

R可以是氢或YX基团，其中

Y可以是：亚烷基-(CH2)1-，1可以是整数1，2，3，4，5或6；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]g-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]h-

其中g和h可互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

-CH2-CH2CH(OH)]-和/或

-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-

-[CH2-CH(OH)]m-和/或-[CH(OH)-CH2]n-

其中m和n可互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(＝O)-[环-C6H10]-CH2-，

其中A和B可互相独立地为-NH-，-N(C1-C6-烷基)-或-O-，a可 以是整数1，2，3，4，5或6，b可以是整数1，2，3，4，5，6，7或8；

X可以是：氢，-OH，-O-C1-C6-烷基，-O-C6-C12-芳基，-O-C7-C14-亚烷基芳 基，其具有由1，2，3，4，5或6个碳原子组成的亚烷基链以及 C6-C12-芳基基团；

-C1-C6-烷基，-C6-C12-芳基，杂芳基，咪唑基，所述咪唑基任选 地通过C1-C6-亚烷基连接；

C7-C14-烷基芳基，其具有由1，2，3，4，5或6个碳原子组成的亚 烷基链和C6-C12-芳基基团；

以下通式所示的取代基

其中：

R1，R2和R3可互相独立地为氢，C1-C6-烷基和/或C6-C12-芳基；

-CN，-NC，-N3；

-C(＝O)-R4，R4可以是氢，OH，C1-C6-烷基，-O-C1-C6-烷基，

C6-C10-芳基或-O-C6-C12-芳基；

-NH2，-NHR5，R5可以是氢，C1-C6-烷基和/或C6-C12-芳基；

F，Cl，Br或I；

-SH或-S-S-H；

2-硫代吡啶基(thiopyridyl)或4-硫代吡啶基；

-S(＝O)-CH2-CF3；

酰基咪唑，马来酰亚氨基(maleimido)或二氢唑酮基团；

或者

R可以是Y’X’L基团，其中

Y’可以是：单键；

亚烷基-(CH2)q-，q可以是整数1，2，3，4，5或6；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]i-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]o-

其中i和o可互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

-CH2-CH2CH(OH)-和/或-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-

-[CH2-CH(OH)]r-和/或-[CH(OH)-CH2]s-

其中r和s可互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(＝O)-[环-C6H10]-CH2-，

其中A和B可互相独立地为-NH-，-N(C1-C6-烷基)-或-O-，a可 以是整数1，2，3，4，5或6，b可以是整数1，2，3，4，5，6，7或8；

-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(＝O)-[环-C6H10]-CH2-，

其中A和B可以是-NH-，a可以是整数1或2，b可以是6；

X’可以是：单键；

-CH(OH)-CH2-O-，-CH(OH)-CH2-S-，-CH(OH)-CH2-NH-， -CH(OH)-CH2-N(C1-C6-烷基)-，-O-，-C(＝O)O-，-C(＝O)NH-， -C(＝O)N(C1-C6-烷基)-；

-CR1R2-R3CH-O-，-O-CR1R2-CHR3-，其中R1，R2和R3的含义如 上文所述；

-NH-或-N(C1-C6-烷基)-；

L可以是：-C(＝O)-NH-(CH2)u-[NH-(CH2)2]v-NH2，在各种情况下，u和v 可以互相独立地为整数1，2，3或4；

-(CH2)w-C(＝O)OH，w可以是整数1，2，3，4，5或6；

三配位、四配位或五配位螯合剂，例如通过其ε-N连接的氨三 乙酸残基，所谓的低分子量、高分子量、或者分子量约为 500-200000Da的线性聚乙烯亚胺残基，氨基团，优选多胺残基， 亚精胺，尸胺，二亚乙基三胺，精胺，1，4-二(3-氨基丙基)哌嗪， 1-(2-氨基乙基)哌嗪，1-(2-氨基乙基)哌啶，1，4，10，13-四氧杂 -7，16-二氮杂环十八烷，羧酸残基，或结合抗体，优选第二抗体， 蛋白质，生物素，寡核苷酸或抗生蛋白链菌素，IDA，DEO或 TED(三羧酸甲基乙二胺)或

-CH2-CH2-N-(CH2COO-)[CH(COO-)CH2COO-)]。

优选的磁性聚合物包含通式(I)的官能团，其中

M可为：-O-，-NH-或-N(C1-C6-烷基)-；

R可为：氢；或者

-YX基团，其中

Y可以是：亚烷基-(CH2)1-，1可以是整数1，2，3，4，5或6；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]g-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]h-

其中g和h可互相独立地为整数1，2，3或4；

-CH2-CH2CH(OH)]-和/或

-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-

-[CH2-CH(OH)]m-和/或-[CH(OH)-CH2]n-

其中m和n可互相独立地为整数1，2，3或4；

-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(＝O)-[环-C6H10]-CH2-，

其中A和B可互相独立地为-NH-，a可以是整数1或2，b可以是 6；

X可以是：氢，-OH，-O-C1-C4-烷基，-O-C6-C10-芳基，-O-C7-C14-烷基芳 基，其具有由1，2，3，4，5或6个碳原子组成的亚烷基链以及 C6-C10-芳基基团；

-C1-C6-烷基，-C6-C12-芳基，杂芳基，咪唑基，所述咪唑基任选 地通过C1-C6-亚烷基连接；

以下通式所示的取代基

其中：

R1，R2和R3可互相独立地为氢，C1-C3-烷基；

-NH2，-NHR5，R5可以是氢，C1-C4-烷基；

F，Cl或Br；

-CN，-NC；

-SH或-S-S-H；

2-硫代吡啶基或4-硫代吡啶基；

-S(＝O)-CH2-CF3(特雷索基(tresyl))；

酰基咪唑，马来酰亚氨基或二氢唑酮基团；

或者

R可以是Y’X’L基团，其中

Y’可以是：单键；

亚烷基-(CH2)q-，q可以是整数1，2，3，4，5或6；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]i-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]o-

其中i和o可互相独立地为整数1，2，3或4；

-CH2-CH2CH(OH)-和/或-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-

-[CH2-CH(OH)]r-和/或-[CH(OH)-CH2]s-

其中r和s可互相独立地为整数1，2，3或4；

-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(＝O)-[环-C6H10]-CH2-，

其中A和B可互相独立地为-NH-，a可以是整数1或2，b可以是 整数6；

X’可以是：单键；

-CH(OH)-CH2-O-，-CH(OH)-CH2-S-，-CH(OH)-CH2-NH-， -CH(OH)-CH2-，-N(C1-C3-烷基)-，-O-，-C(＝O)O-，-C(＝O)NH-， -C(＝O)N(C1-C3-烷基)-；

-CR1R2-R3CH-O-，-O-CR1R2-CHR3-，其中R1，R2和R3的含义如 上文所述；

-NH-或-N(C1-C3-烷基)-；

L可以是：-C(＝O)-NH-(CH2)u-[NH-(CH2)2]v-NH2，在各种情况下，u和v 可以互相独立地为整数1，2，3或4；

-(CH2)w-C(＝O)OH，w可以是整数1，2，3或4；

三配位、四配位或五配位螯合剂，例如通过其ε-N连接的氨三 乙酸残基，所谓的低分子量、高分子量、或者分子量约为 500-200000Da的线性聚乙烯亚胺残基，多胺残基，亚精胺，尸 胺，二亚乙基三胺，精胺，1，4-二(3-氨基丙基)哌嗪，1-(2-氨基 乙基)哌嗪，1-(2-氨基乙基)哌啶，1，4，10，13-四氧杂-7，16-二氮 杂环十八烷，羧酸残基，或结合抗体，优选第二抗体，蛋白质， 生物素，寡核苷酸或抗生蛋白链菌素，IDA，DEO或TED(三羧 酸甲基乙二胺)，

-CH2-CH2-N-(CH2COO-)[CH(COO-)CH2COO-)]。

特别优选的磁性聚合物包含通式(I)的官能团，其中

M可为：-O-或-NH；

R可为：氢；或者

-YX基团，其中

Y可以是：亚烷基-(CH2)1-，1可以是整数1，2，3，4，5或6；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]g-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]h-

其中g和h可互相独立地为整数1或2；

-CH2-CH2CH(OH)-和/或

-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-

-[CH2-CH(OH)]m-和/或-[CH(OH)-CH2]n-

其中m和n可互相独立地为整数1或2；

X可以是：氢，-OH，-O-C1-C4-烷基，-O-C6-C10-芳基；

以下通式所示的取代基

其中：

R1，R2和R3可互相独立地为氢或C1-C2-烷基；

-NH2；

Cl或Br；

-S(＝O)-CH2-CF3；

或者

R可以是Y’X’L基团，其中

Y’可以是：单键；

亚烷基-(CH2)q-，q可以是整数1，2或3；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]i-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]o-

其中i和o可互相独立地为整数1或2；

-[CH2-CH2CH(OH)]-，-[CH2-CH(OH)]r-和/或-[CH(OH)-CH2]s-

其中r和s可互相独立地为整数1或2；

X’可以是：单键；

-CH(OH)-CH2-O-，-CH(OH)-CH2-S-，-CH(OH)-CH2-NH-， -CH(OH)-CH2-N(C1-C3-烷基)-，-O-，-C(＝O)O-，-C(＝O)NH-， -C(＝O)N(C1-C3-烷基)-；

-CR1R2-R3CH-O-，-O-CR1R2-CHR3-，其中R1，R2和R3的含义如 上文所述；

-NH-；

L可以是：-C(＝O)-NH-(CH2)2-[NH-(CH2)u]v-NH2，在各种情况下，u可 以为1或2，v可以是2；

-(CH2)w-C(＝O)OH，w可以是整数1或2；

三配位、四配位或五配位螯合剂，例如通过其ε-N连接的氨三 乙酸残基，所谓的低分子量、高分子量、或者分子量优选为 500-200000Da的线性聚乙烯亚胺残基，多胺残基，亚精胺，尸 胺，二亚乙基三胺，精胺，1，4-二(3-氨基丙基)哌嗪，1-(2-氨基 乙基)哌嗪，1-(2-氨基乙基)哌啶，1，4，10，13-四氧杂-7，16-二氮 杂环十八烷，羧酸残基，或结合抗体，优选第二抗体，蛋白质， 生物素，寡核苷酸或抗生蛋白链菌素，IDA，DEO或TED(三羧 酸甲基乙二胺)，

-CH2-CH2-N-(CH2COO-)[CH(COO-)CH2COO-)]。

极其优选的磁性聚合物包含通式(I)的官能团，其中

M可为：-O-或-NH-；

R可为：氢；或者

-YX基团，其中

Y可以是：单键；

亚烷基-(CH2)1-，1可以是整数1，2，3，4，5或6；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]g-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]h-

其中g和h可互相独立地为整数1或2；

-[CH2-CH2CH(OH)]-

-[CH2-CH(OH)]m-和/或-[CH(OH)-CH2]n-

其中m和n可互相独立地为整数1或2；

X可以是：氢；

以下通式所示的取代基

其中：

R1，R2和R3可以为氢；

-NH2；

或者

R可以是Y’X’L基团，其中

Y’可以是：单键；

亚烷基-(CH2)q-，q可以是整数1，2，3，4，5或6；

以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]i-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]o-

其中i和o可互相独立地为整数1或2；

-CH2-CH2CH(OH)-，-[CH2-CH(OH)]r-和/或-[CH(OH)-CH2]s-

其中r和s可互相独立地为整数1或2；

X’可以是：单键；

-CH(OH)-CH2-O-，-CH2-CH(OH)-O-；

-CR1R2-R3CH-O-，-O-CR1R2-CHR3-，其中R1，R2和R3的含义如 上文所述；

-NH-；

L可以是：-C(＝O)-NH-(CH2)2-[NH-(CH2)u]v-NH2，其中u可为1或2，v 可为2；

-(CH2)w-C(＝O)OH，w可以是整数1或2；

通过其ε-N连接的氨三乙酸残基，

NTA，IDA/DEO，TED，精胺或第二抗体，

-CH2-CH2-N-(CH2COO-)[CH(COO-)CH2COO-)]。

另外本发明还涉及用来制备所述磁性聚合物的方法，以及用来从样品 中分离至少一种生物分子物质(biomolecular species)和/或对其进行分析的 方法。

近年来，磁性颗粒被越来越多地应用于对各种生物分子进行纯化、分 离和分析的方法中。这些磁性颗粒通常包含结合在玻璃状或聚合的基质内 的磁性的或可磁化的无机材料。在此情况下，所述磁性颗粒的表面具有一 定的结构，使得来自样品的特定生物分子(例如细胞溶胞产物)可以选择性地 结合到该表面。所述结合了生物分子的磁性颗粒可以通过对样品施加外部 磁场而很容易地从样品中分离出来。然后可通过合适地处理所述磁性颗粒， 将生物分子洗脱出来从而以纯的形式或富集的形式得到所述生物分子。

美国专利申请第2001/0014468 A1号描述了基于聚乙烯醇的磁性聚合 物颗粒。这些颗粒通过一种方法制得，在此方法中，使用有机溶液悬浮包 含胶状分散的磁性颗粒的聚乙烯醇水溶液，所述有机溶液包含至少两种无 法与聚合物相相混溶的乳化剂。所述有机溶液还包含水溶性交联剂，在悬 浮所述聚乙烯醇液滴的时候，通过所述交联剂使得所述液滴交联。通过该 方法制得的磁性聚合物颗粒可随后根据它们预期的用途进行活化，或者用具 有合适的官能团的聚合物侧链进行官能化。

法国专利申请第FR 2531452 A1号描述了一种磁性载体基质，该基质包 含多孔的耐火金属氧化物，其内部分散有铁磁性颗粒。所述氧化物用具有 过量的双官能侧基的交联的聚酰胺浸渍。所述基质用来固定酶。

美国专利第4,795,698号描述了一种磁性聚合物颗粒，这种颗粒是通过 在聚合物的存在下，将至少两种过渡金属离子共沉淀而制得的。所述聚合 物包含合适的配位位点，以结合所述磁性聚合物沉淀物。通过这种方式制 得的颗粒可以通过选择适当地官能化的聚合物而用于免疫测定。

美国专利第4,358,388号描述了磁性聚合物颗粒，其通过一种均一乳液 的乳液聚合反应制得，所述均一乳液由以下组分组成：磁性颗粒在有机可 聚合相中的分散体，以及包含至少一种乳化剂的水相。所述有机相包含以 下组分作为可聚合单体：至少一种芳族乙烯基化合物，或者至少一种芳族 乙烯基化合物与可共聚单体(例如丙烯酸烷基酯或甲基丙烯酸烷基酯)的混 合物。

在磁性聚合物颗粒的表面上特定地结合一种或多种生物分子的能力很 大程度上是由所用聚合物的性质以及该聚合物上的官能团来决定的。而且， 固定反应(immobilizing reaction)的选择性所要满足的要求取决于固定的生 物分子预期的进一步应用。经常仅通过所述固定足以完成所需的生物分子 物质的富集；在其它的应用中，必须或至少需要更高的选择性，以便能够直 接或通过少数进一步纯化的步骤，得到尽可能纯的状态的所需生物分子物 质。所述磁性聚合物颗粒应另外包含尽可能高的与待固定生物分子物质的 结合能力，以便能够有效而低成本地使用所述磁性聚合物颗粒。但是，在 原则上，通常仅采用小粒度或高孔隙率便可得到高结合能力。但是，小的 粒度使得聚合物颗粒难以具有足够的可磁化性。

但是，本领域已知的磁性聚合物最多仅仅是具有极低的孔隙率，或者 根本没有孔隙，因此会对可供固定的表面造成不利影响。

另一个问题是将磁性颗粒结合入合适的聚合物基质中。具体来说，常 见的问题是磁性颗粒和有机相的偏析，聚合之前或过程中的磁性颗粒的聚 集，以及如何使得聚合物基质和磁性颗粒之间具有足够的粘着性。

因此人们需要能够以足够高的选择性固定生物分子的磁性聚合物颗 粒。人们特别需要一种具有以下性质的磁性聚合物颗粒：该磁性聚合物颗 粒能够以不同的方式被官能化，可以使用能够以足够的选择性将生物分子 从样品中固定出来的配体(优选通过常规的化学方法)简单地改性。人们还预 期所述改性的聚合物颗粒对相应的生物分子具有最高的结合能力，同时具 有最大的可磁化性。

因此本发明的目标是消除或至少减轻上述现有技术的缺点。

该目标通过所附权利要求书中独立权利要求1所述的磁性聚合物颗粒 和独立权利要求21所述的方法完成。通过从属权利要求和以下的说明可以 很清楚地了解本发明的进一步的实施方式、方面、细节和优点。

在第一方面，本发明涉及磁性聚合物颗粒，所述磁性聚合物颗粒选自 铁磁性颗粒、亚铁磁性颗粒和/或超顺磁性颗粒。所述磁性颗粒嵌埋在交联 的聚丙烯酸酯或聚[烷基丙烯酸酯]基质中。所述聚合物基质包含羧基 -C(＝O)OH或羧酸酯基或羧酰胺基(carboxamide group)或其它合适的通式I 所述的衍生羧基结构，它们各自之中可具有间隔基团Y和活性基团X。所述 磁性聚合物颗粒的平均粒度优选为5-25微米，特别优选为6-20μm，极其优 选为10-15μm，孔的最大孔半径优选为20-500nm，特别优选为30-400nm， 极其优选为80-250nm。

在使用聚丙烯酸酯或聚[(烷基)丙烯酸酯]基质的时候，它们的可官能化 的羧基或取代的和可官能化的羧基使得它们能够制备较大的聚合物颗粒， 该颗粒能够确保足够的可磁化性，与此同时，使得能够以简单的方式，用大 量适于固定生物分子的配体进行进一步的官能化。

如果游离的丙烯酸或(烷基)丙烯酸(例如甲基丙烯酸)已被用作聚合用 的单体，则所述聚合物基质初始时包含未酯化的羧基。如果需要聚合物基 质包含其它可官能化的基团，可使用合适地衍生的丙烯酸酯或(烷基)丙烯酸 酯——特别是甲基丙烯酸酯——作为单体，所述酯残基可以在至少一个进 一步的步骤中转化成活性基团，使得在合适的时候可以通过进一步官能化， 具体来说是通过共价键合来结合能够固定生物分子的特定配体，或者共价 键合最终连接配体的间隔基团。

因此，所述磁性聚合物颗粒的聚合物基质可包含通式结构为-Y-X的官 能团，其中Y是间隔基团，X优选是活性基团。

可以使用任何允许发生用来将所需配体连接到间隔基团的化学反应的 基团作为官能团的活性基团X。例如，可以使用一种基团作为活性基团X， 所述基团能够在间隔基团上发生取代反应，使得配体能够与所述间隔基团 (spacer)共价连接。这些反应的例子是醚化、酯化、酰胺形成、亚氨键形成 等。

官能团的活性基团X优选选自氢，羟基，环氧基，芳基，杂芳基，芳烷 基，咪唑基——其通过C1-C6亚烷基键合适地连接，C(O)H，C(O)R，-C(O)OH， C(O)R，-NH2，-NHR，叠氮基，氰基，异氰基，-SH，-SSH，硫代吡啶基(2-或4- 硫代吡啶基)，芳基，卤素(卤(hal))，特雷索基(2，2，2-三氟乙烷磺酰基)，酰 基咪唑基和马来酰亚氨基或偶氮乙酰基(azlactyl group)。

在环氧基中，优选的是环氧乙烷-2-基，但是还可使用以下结构式所示 的取代环氧基：

其中，基团R1，R2和R3可互相独立地选自氢，C1-C6-烷基，C6-C12-芳基- -优选的是C1-C3-烷基。

在本发明的全文中，C1-C6-烷基具体表示以下基团：C1：甲基；C2：乙基； C3：丙基，异丙基，C4：丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，C5： 正戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基 丙基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，C6：己基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲 基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2- 二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基， 1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基和/或1-乙基-2-甲基 丙基。所述烷基可任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基是例如硝 基、氨基和/或一个或多个卤素原子，其可以是相同的或不同的。低级的基 团，例如-C1-C3-烷基具有相应的含义。

环氮杂烷基(cycloazaalkyl)在本发明的全文中表示5元至16元饱和环体 系，该体系包含1-15个、优选1-12个碳原子以及1-15个、优选1-6个、特别 优选3个和4个氮原子，其可任选地被选自以下的一个或多个取代基取代： 包含1-6个碳原子的低级烷基(C1-C6-烷基)，包含1-6个碳原子的烷氧基 (C1-C6-烷氧基)，硝基，氨基，这些取代基任选地可通过包含一个、两个或 三个碳原子的亚烷基与所述环状部分结构相连，而且/或者所述取代基可以 是一个或多个相同或不同的卤原子。在这些环状体系中，吡咯烷，哌啶和哌 嗪是优选的。所述环氮杂烷基体系除了氮原子以外，还可包含1，2，3或4个 氧原子作为环成员，例如该体系为吗啉的情况。

包含6-12个碳原子的芳基(C6-C12-芳基)表示芳族取代基，其可任选地被 选自以下的一个或多个取代基取代：包含1-6个碳原子的低级烷基(C1-C6-烷 基)，包含1-6个碳原子的烷氧基(C1-C6-烷氧基)，硝基，氨基和/或可以相同 或不同的一一个或多个卤素原子。优选的芳基的例子是例如苯基，或稠合 的芳族体系，例如萘基，或芴基，或其它体系，例如联苯基。较小的芳基(例 如C6-C10-芳基)也是类似的。

根据本发明的杂芳基主要为五元或六元的环体系，其包含至少一个杂 原子。实施方式的例子一方面是吡咯基和呋喃基或异噻唑基，另一方面是 吡啶基、吡嗪基或三嗪基。

包含7-14个碳原子的芳烷基表示通过亚烷基键连接的芳基。还可能是 芳族部分结构和任选地被选自以下的取代基取代的芳族部分结构：包含1-6 个碳原子的低级烷基(C1-C6-烷基)，包含1-6个碳原子的烷氧基(C1-C6-烷氧 基)，硝基，氨基和/或可能相同或不同的一个或多个卤原子。在芳族基团内 包含6-10个碳原子、在脂族部分结构中包含1-3个碳原子的芳烷基，例如苄 基或苯乙基是本发明优选的；苄基是特别优选的。

合适的活性卤素取代基是F，Cl，Br和I，特别是Cl和Br。

合适的间隔基Y可基于以下因素进行选择：合成的考虑，以提供合适的 可聚合单体；或其市售可得性；或者根据随后要用固定配体进行的官能化 反应来选择间隔基。在本发明的全文中，“间隔基”或“间隔基团”表示所有具 有以下性质的化学基团：其能够与聚合物基质的羧基连接，从而将与所述 间隔基连接并且能够与配体反应成键的活性基团置于与基质的聚合物结构 相隔的一定距离。可以使用这些“间隔基”提高用于配体的活性基团的可达 性。

在本发明的一个实施方式中，所述官能团的间隔基Y选自以下基团：

1.-(CH2)1-，1可以是整数1，2，3，4，5或6；

2.以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]g-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]h-

其中g和h可以互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

-CH2-CH2CH(OH)-和/或-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-

-[CH2-CH(OH)]m-和/或-[CH(OH)-CH2]n-

其中m和n可以互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

3.亚烷基二醇——例如聚乙二醇，聚丙二醇；

1.单糖、二糖或多糖；

2.聚乙烯亚胺；

3.聚丙烯酸；

4.-CH2-CH(OH)-CH2或-CH2-C(CH2OH)H-

5.-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(＝O)-[环-C6H10]-CH2-，其中 A和B可互相独立地为-NH-，-N(C1-C6-烷基)-或-O-基团，优选-NH-，a可以 为整数1，2，3，4，5或6——优选为1或2，b可以为整数1，2，3，4，5，6，7或8， 优选为6。

6.双官能和/或三官能交联剂(例如具有以下官能团的双官能间隔 基：亚氨酸酯R-C(＝NH)-OR’，酰肼，马来酰亚胺，醛，环氧化物，碘代乙酸 酯基，碘代乙酰胺，酰基咪唑，重氮芳基(diazoniumaryl)，卤化物，以及光活 性双官能间隔基，例如BASED(二硫化{二[b-(4-叠氮基水杨基酰氨基)乙 基]})；

7.肽间隔基。

使用与环氧官能化的(X)聚合物基质相连的-CH2-间隔基团(Y)是特别 有益的，这是因为丙烯酸的羧基可以通过特别简单的方式与表氯醇或表溴 醇反应。以类似的方式，如果在第一步，丙烯酸单体的羧基用表氯醇或表 溴醇酯化，然后通过所述环氧基引入活性基团X或包含活性基团X的基团， 则优选使用上面定义7)所述的间隔基。

在另一个方面，本发明涉及磁性聚合物颗粒，其包括铁磁性颗粒、亚 铁磁性颗粒或超顺磁性颗粒，这些颗粒嵌埋在交联的聚丙烯酸酯或聚(烷基) 丙烯酸酯基质中。在此情况下，所述聚丙烯酸酯或聚[(烷基)丙烯酸酯]基质 包含R＝Y’X’L类的基团。

根据该方面的磁性聚合物颗粒可通过简单的方式，通过对根据本发明 上述第一方面的磁性聚合物颗粒进行官能化而制得。因此，根据第一方面对 磁性聚合物颗粒进行的说明也可类似地适用于根据本发明第二方面的磁性 聚合物颗粒。在第二方面中描述的关于磁性聚合物颗粒的不同是用合适的 配体进行了另外的官能化，即通式中表示R的结构特征-Y’-X’-L。

在本发明这个方面的一个实施方式中，用来将配体与聚丙烯酸酯或聚 烷基丙烯酸酯基质相连的连接基团X’选自以下基团：-CH(OH)-CH2-O-， -CH(OH)-CH2-S-，-CH(OH)-CH2-NH-，-CH(OH)-CH2-NR-，-O-，-NH-，-NR-， -C(＝O)O-，-C(＝O)NH-，-C(＝O)NR，其中R是C1-C3-烷基。这样所述配体通过 亚氨基(-NH-)，酰氨基(-C(＝O)NH-)，羧基(-C(＝O)O-)，氧基(-O-)或硫基(-S-) 与聚合物基质相连。当配体直接与聚丙烯酸酯或聚(烷基)丙烯酸酯基质的游 离羧基相连的时候，通过以下反应形成共价键合：酯化反应、酰胺形成或现 有技术已知的其它羧基的衍生化反应。相对于与羧基的直接连接，通过使 用间隔基-Y和可以共价连接配体的活性基团-X，进一步扩展了可用的键的 类型的范围，这可提高活性基团对配体的可达性(例如通过消除位阻效应)。

因此，在本发明的一个实施方式中，能够固定生物分子的配体直接与 聚合物基质的羧基连接。或者它们间接地通过间隔基与聚合物基质的羧基 连接，所述间隔基包含至少一种上述的活性基团。

在本发明这个方面的另一个实施方式中，用作间隔基Y(配体可通过合 适的活性基团X与所述间隔基Y相连)的基团选自：

a)-(CH2)1-，1可以是整数1，2，3，4，5或6；

b)以下种类的羟基取代的亚烷基：

-[CH2-CH(OH)-CH2]g-和/或-[CH2-CH(CH2OH)-]h-

其中g和h可以互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

-CH2-CH2CH(OH)-和/或-CH2-CH2-CH(OH)-CH2-CH2CH(OH)-

-[CH2-CH(OH)]m-和/或-[CH(OH)-CH2]n-

其中m和n可以互相独立地为整数1，2，3，4，5或6；

c)亚烷基二醇——例如聚乙二醇，聚丙二醇；

d)单糖、二糖或多糖；

e)聚乙烯亚胺；

f)聚丙烯酸；

g)-(CH2)a-CH(OH)-CH2-A-(CH2)b-B-C(＝O)-[环-C6H10]-CH2-，其中A和B 互相独立地为-NH-，-N(C1-C6-烷基)-或-O-基团，优选-NH-，n是1-6，优选为 1或2，m为1-8，优选为6。

h)双官能和/或三官能交联剂(例如具有以下官能团的双官能间隔基： 亚氨酸酯R-C(＝NH)-OR’，酰肼，马来酰亚胺，醛，环氧化物，碘代乙酸酯基， 碘代乙酰胺，酰基咪唑，重氮芳基，卤化物，以及光活性双官能间隔基，例 如BASED(二硫化{二[b-(4-叠氮基水杨基酰氨基)乙基]})；

i)肽间隔基。

这些间隔基可直接与基质的羧基相连，或者通过其它的间隔基(特别是 上面本发明第一方面所述的间隔基)，通过与间隔基相连的活性基团，与羧 基相连。

所述能够优选固定生物分子的配体具体来说可以是能够固定蛋白质， 核酸，寡核苷酸或第一抗体(primary antibody)或第二抗体(secondary antibody)的配体。特别适合用作配体的是三配位、四配位或五配位的螯合 剂，优选是氨三乙酸残基。也可使用聚乙烯亚胺残基。它们可以是支化的 或非支化的。另一种可能性是使用包含氨基的基团，例如-(CH2)n-NR10R20 类的烷基氨基，其中n除了为0以外，还可为优选1，2，3，4，5或6的整数，具体 来说是2，3，4，5或6，R10和R20互相独立地选自-H和C1-C6-烷基，特别是 C1-C3-烷基，胺和/或多胺残基。另一种可能性是使用羧酸残基，蛋白质，生 物素，寡核苷酸，抗生蛋白链菌素或结合抗体(bound antibody)。所述多胺优 选选自包含2，3，4，5或6个氨基的开链和环状多胺。所述多胺可优选选自： 乙二胺，三亚甲基二胺，四亚甲基二胺，亚精胺，尸胺，二亚乙基三胺，精 胺，三亚乙基四胺，四亚乙五胺，五亚乙基六胺，1，4-二(3-氨基丙基)哌嗪， 1-(2-氨基乙基)哌嗪，1-(2-氨基乙基)哌啶，1，4，10，13-四氧杂-7，16-二氮杂环 十八烷和三(2-氨基乙基)胺等。

可使用的羧酸残基具体来说是羧酸基团(-C(＝O)OH)本身，亚烷基羧基 (-亚烷基-C(＝O)OH)，其中所述烷基桥键可以是支化的或非支化的C1-C12-烷 基，优选是任选支化或未支化的C2-C6-烷基；其还可使用与芳基部分结构连 接的羧基(芳基-C(＝O)OH)，例如为苯基羧基，即在此情况下，上述亚烷基 桥键被苯基体系代替。

本发明的内容中优选使用铁磁性或亚铁磁性颗粒，优选选自以下物质： γ-Fe2O3(磁赤铁矿)，Cr2O3，和铁氧体，特别是(M2+O)Fe2O3，其中M2+是二价 过渡金属阳离子，优选是Fe3O4(磁铁矿)。但是，类似地可以使用其它铁磁性 或亚铁磁性颗粒。这些颗粒的平均粒径小于5μm，优选小于1微米，特别优 选为0.05-0.8μm，极其优选为0.1-0.4μm。

合适的可以在市场上购得的铁磁性或亚铁磁性颗粒的例子是基于 γ-Fe2O3的铁磁性颗粒，例如Bayoxide E AB 21(德国勒沃库森的兰克瑟斯AG 公司(Lanxess AG，Leverkusen，Germany))，购自德国勒沃库森的兰克瑟斯 AG公司亚铁磁性磁铁矿，例如Bayoxide E 8706，E 8707，E 8710和E 8713H， 以及购自德国路德维希的BASF AG公司(BASF AG，Ludwigshafen， Germany)，的磁性颜料(magnetic pigment)340和磁性颜料345。

另外还可使用超顺磁性颗粒。合适的超顺磁性材料是Fe，Fe3O4，Fe2O3， 超顺磁性铁氧体，Co，N和二元和/或三元化合物(合金)。其例子为直径约等 于或小于300的氧化铁晶体。

在本发明内容中，所述聚合物基质优选使用二丙烯酸酯或聚丙烯酸酯 或二(烷基)丙烯酸酯或聚(烷基)丙烯酸酯进行交联。它们优选选自乙二醇丙 烯酸酯，乙二醇(烷基)丙烯酸酯，特别是乙二醇甲基丙烯酸酯，聚乙二醇丙 烯酸酯，聚乙二醇(烷基)丙烯酸酯，特别是聚乙二醇甲基丙烯酸酯，季戊四 醇四丙烯酸酯和季戊四醇三丙烯酸酯，甘油三丙烯酸酯，甘油三甲基丙烯 酸酯，甘油丙氧基化物三丙烯酸酯(glycerol propylate triacrylate)，甘油丙氧 基化物三甲基丙烯酸酯(glycerol propylate trimethacrylate)或二乙烯基苯及 其有机改性的衍生物，例如2-羟基-1，4-二乙烯基苯。这些交联剂已被证明特 别适于所用的丙烯酸酯和(烷基)丙烯酸酯单体。

在另一个方面，本发明涉及用来制备磁性聚合物颗粒的方法。该方法 包括以下步骤：

a)在第一有机相中制备磁性颗粒的分散体，所述磁性颗粒选自铁磁性 颗粒、亚铁磁性颗粒或超顺磁性颗粒，所述第一有机相包含

a.1.)选自以下的一种或多种丙烯酸酯单体：丙烯酸、(烷基)丙烯酸或 丙烯酸酯和(烷基)丙烯酸酯，其包括-C(＝O)-O-Y-X类的取代羧基，其中Y是 间隔基，X是活性基团，

a.2.)至少一种包含两个或更多个丙烯酸酯或(烷基)丙烯酸酯基的交 联剂，

a.3.)至少一种亲脂性自由基引发剂，

a.4.)至少一种有机成孔剂，

b)在第二有机相中混合分散体并使得分散体均一化，以形成乳液，所 述第二有机相包含：

b1)至少一种液态疏水性化合物

b2)至少一种表面活性物质，

以及

c)乳液的自由基聚合，

通过这种方式制得的磁性聚合物颗粒的平均粒度优选为5-25μm，特别 优选为6-20μm，极其优选为10-15μm，孔的最大孔半径为20-500纳米，特 别优选为30-400nm，极其优选为80-250纳米。

磁性聚合物颗粒(像上文所述的那些)可通过该方法制得。

优选在自由基聚合反应之前用惰性气体吹扫所述乳液，以除去混合物 中存在的任意氧气。因此，后续的聚合反应优选在保护气氛之下进行。特别 适合作为保护气体或惰性气体的是氮气或氩气，由于氮气成本较低，因此优 选氮气。但是也可使用其它的保护气体，特别是氦气或氪气之类的稀有气 体。

所述磁性颗粒优选在制备分散体之前或过程中进行研磨和/或解附聚 (deagglomerate)。从而防止了初级磁性颗粒的聚集，促进和提高了乳液的分 散和随后的均一化。可通过超声技术、搅拌方法和/或研磨方法，例如在球 磨机中进行研磨，以进行所述研磨或解附聚。

所述自由基聚合优选在等于或高于50℃、优选50-120℃、优选60-90℃ 的温度下进行。

在本发明方法的一个实施方式中，所述第一有机相中的单体是通式(II) 所示的化合物：

H2C＝CR’-C(＝O)-OZ(II)

其中R’是H-或C1-C3-烷基，Z是氢(-H)或通式-Y-X的基团，Y是间隔基， X如上所述，例如选自以下基团：-OH，-NH2，-C(＝O)OH，卤素(hal)，特雷索 基，马来酰亚氨基和环氧基团。所述间隔基可以是例如-(CH2)1-基团，其中1 是整数1，2，3，4，5或6，或-CH2-CH(OH)-CH2-基团。该连接中的合适的间隔 基是类似的，除了开头所列的所有基团以外，还包括前面的方面(特别是本 发明的第一个方面)关于磁性聚合物颗粒所述的那些基团。

在一个优选的实施方式中，第一有机相中的单体选自：甲基丙烯酸缩 水甘油酯，甲基丙烯酸-2-羟基乙酯，甲基丙烯酸和丙烯酸，以及通式(III)所 示的丙烯酸衍生物：

H2C＝CR’C(＝O)O-(CH2)cZ  (III)

其中R’可以是H或甲基，c是整数1，2，3，4，5，或6，Z选自例如-OH，-NH2， -C(＝O)OH，卤素，特雷索基，马来酰亚氨基和环氧基。

可用于本发明的方法的交联剂可以是通式(III)所示的一种或多种亚烷 基二醇二丙烯酸酯或亚烷基二醇(烷基)丙烯酸酯：

H2C＝CR”C(＝O)O-[(CdH2dO)]e(C＝O)CR’”＝CH2(IV)

在式(IV)中，R”和R’”互相独立地为H或C1-C3-烷基，优选R”和R’”均为H 或甲基，d是整数1，2，3或4，优选为1或2，e是1-100之间的整数，优选为整 数1，2，3，4，5，6，7，8，9或10，特别优选为整数1，2，3，或4。

具体来说可以使用乙二醇二丙烯酸酯，乙二醇二甲基丙烯酸酯或a，ω- 二[甲基(丙烯酸酯)]-官能化的聚乙二醇或聚丙二醇，例如丙二醇丙烯酸酯， 丙二醇(烷基)丙烯酸酯，特别是丙二醇甲基丙烯酸酯，聚丙二醇丙烯酸酯， 聚丙二醇(烷基)丙烯酸酯，特别是聚丙二醇甲基丙烯酸酯或丙二醇丙烯酸 酯，丙二醇(烷基)丙烯酸酯，特别是丙二醇甲基丙烯酸酯，聚丙二醇丙烯酸 酯，聚丙二醇(烷基)丙烯酸酯，特别是聚丙二醇甲基丙烯酸酯或它们的混合 物作为交联剂。另一种可能是使用包含至少两个、优选三个或四个丙烯酸 酯或(烷基)丙烯酸酯基的聚丙烯酸酯或聚(烷基)丙烯酸酯，其中所述烷基优 选选自C1-C3-烷基，特别优选为甲基。例如，可使用季戊四醇四丙烯酸酯， 季戊四醇四甲基丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，季戊四醇三甲基丙烯酸 酯，甘油三丙烯酸酯，甘油三甲基丙烯酸酯，甘油丙氧基化物三丙烯酸酯， 甘油丙氧基化物三甲基丙烯酸酯或二乙烯基苯及其有机改性的衍生物，例 如2-羟基-1，4-二乙烯基苯或其混合物，或这些化合物与上述其它交联剂的混 合物。

具体可以用作有机成孔剂的的化合物选自：

a)包含4-20个碳原子、优选4-16个碳原子、特别优选4-8个碳原子、 包含一个或多个羟基、优选1-3个羟基的脂族、支化或未支化的醇，

b)亚烷基二醇，特别是乙二醇，甘油等。

c)碳水化合物，例如葡萄糖，

d)聚合物，其质量平均分子量Mw为200-100000克/摩尔，选自聚亚烷 基二醇衍生物，聚乙烯亚胺，聚乙烯基吡咯烷酮和聚苯乙烯，或上面关于a)， b)和c)所述的化合物的混合物。

具体来说可以使用的成孔剂选自乙二醇，聚乙二醇(Mw：200-20000克/ 摩尔)，聚丙二醇(Mw：200-10000克/摩尔)，聚乙二醇单烷基醚(Mw： 200-5000克/摩尔)，聚乙二醇二烷基醚(Mw：200-5000克/摩尔)，聚乙二醇单 烷基酯(Mw：200-20000克/摩尔)，聚乙二醇二烷基酯(Mw：200-5000克/摩尔)， 聚乙二醇二酸(Mw：1000-20000克/摩尔)，聚乙烯亚胺(Mw：200-100000克/摩 尔)，聚乙烯基吡咯烷酮(Mw：10000-40000克/摩尔)和/或聚苯乙烯(Mw： 200-5000克/摩尔)。具体可用于本发明的成孔剂是乙二醇和聚乙二醇(Mw： 1000-6000克/摩尔)。其它合适的为氨基-官能化的聚乙二醇，其是现有技术 众所周知的，被称为聚醚胺(jeffamine)。

可用的亲油性自由基引发剂具体为偶氮异丁腈(AIBN)，二盐酸-2，2’-偶 氮二(2-脒基丙烷)，2，2’-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)，以及1，1’-偶氮二(环己烷 -1-腈)。但是还可使用其它自由基引发剂，例如过氧化二苯甲酰，前提是它 们要具有足够的亲油性，以便能够结合入分散体中。

用来制备乳液的疏水性液体应具有足够的化学惰性，使其不会对自由 基聚合造成负面影响。所述液体优选应基本上不与第一有机相混溶，使得第 一有机相中的分散体的乳液可以在第二有机相中制得。对体系的选择很关 键的一点是，在聚合过程中，聚合物不溶于所述体系。

在合适的时候，所述疏水性液体可以选自脂族或环状烷烃，特别是通 式为C2H2n+2的脂族烷烃，其中n＞6，脂族和环状烯烃，特别是通式为C2H2n 的脂族烯烃，其中n＞6，芳族化合物，特别是单环、二环或三环化合物，其 可被烷基或烯基取代，特别是甲苯、二甲苯、矿物油、硅油、植物油或石 蜡油，基于脂肪酸和醇的化合物的物质，以及上述物质的混合物，特别是脂 族烷烃和芳族化合物的混合物。

第二有机相中的表面活性物质优选是选自以下的乳化剂：阳离子性乳 化剂、阴离子性乳化剂和非离子性乳化剂。其可以用作表面活性物质，例 如脱水山梨糖醇酯，乙氧基化的脱水山梨糖醇酯，聚氧乙烯烷基苯酚醚和 其它可在市场上购得的表面活性化合物或化合物混合物。合适的表面活性 物质的例子是市售可得的物质，例如Tween20(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐 单月桂酸酯)，TritonX 100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，Span 85(山梨糖 醇酐三油酸酯)(均可购自德国陶弗克臣的西格马-艾尔德里奇公司 (Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany))，Hypermer 2296(可购自荷兰高达的 由尼克马公司(Uniqema，Gouda，Holland))以及类似的物质。

可用于所述方法的磁性颗粒是与上面关于本发明的磁性颗粒所述相同 的颗粒。

上述组分根据本发明通过以下比例混合(重量％)(以反应混合物的重量 为基准计：

所述交联剂优选以0.1-20重量％的比例加入，优选0.5-5重量％，特别优 选1-4重量％。

官能化的单体以0.1-20重量％的比例加入，优选0.5-5重量％，特别优选 1-4重量％。

所述磁性材料或磁铁矿以0.1-20重量％的比例加入，优选0.5-5重量％， 特别优选1-4重量％。

所述引发剂或自由基引发剂以0-5重量％的比例加入，优选0.01-3重量 ％，特别优选0.05-0.5重量％。

洗涤剂(表面活性剂)以0-20重量％的比例加入，优选0.1-10重量％，特 别优选0.1-3重量％。

成孔剂(porogen)以0.1-20重量％的比例加入，优选0.5-5重量％，特别优 选1-4重量％。

所得的适于本发明的聚合物优选具有以下组成：

交联剂含量为1-95重量％，优选为10-80重量％，特别优选为20-70重量 ％，极其优选为15-40重量％。

根据本发明由官能化的单体形成的聚合物在本发明的磁性颗粒中的含 量为1-99重量％，优选为10-80重量％，特别优选为20-70重量％，极其优选 为30-60重量％。

所述磁铁矿或磁性材料的含量为1-95重量％，优选为10-80重量％，特 别优选为20-70重量％，极其优选为30-60重量％。

在本发明方法的另一个实施方式中，对通过所述方法制得的磁性聚合 物颗粒实施另外的步骤d)官能化，其中至少一种能够固定生物分子的配体 与聚合物基质连接。所述磁性颗粒优选在聚合反应之后、进一步反应(例如 官能化)之前，进行分离和洗涤。所述颗粒可通过简单的过滤进行分离，然 后通过用溶剂洗涤进行纯化。适合用于洗涤的溶剂是有机溶剂和无机溶剂， 例如甲苯、丙酮或水。

在本发明方法的一种变体中，配体直接与磁性聚合物颗粒官能团的活 性基团连接。在另一种情况下，配体可以以下方式连接：在第一步d1)中， 将包含至少两个活性基团的间隔化合物与磁性聚合物颗粒的官能团连接， 然后在第二步骤d2)中，使所述配体与所述磁性聚合物颗粒共价连接，所述 配体优选能够固定生物分子。

合适的配体和间隔基是例如上面关于本发明的磁性颗粒所述的基团。 这些基团可通过包含至少两个活性基团的合适的化合物与聚合物颗粒相 连。

上面在本发明的第一个方面和第二个方面中所述的磁性聚合物颗粒可 通过上面本发明所述的方法制得。

在另一个方面中，本发明涉及用来从样品分离至少一种生物分子物质 并且/或者对其进行分析的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含至少一种生物分子物质的样品，

b)在一定条件下使得所述样品与本发明的磁性聚合物颗粒接触，使得 至少一种生物分子物质与所述磁性聚合物颗粒相结合，

c)使用至少一个磁场将结合有生物分子的磁性聚合物颗粒分离。

在此方法的一个实施方式中，还进行另外的步骤d)：从所述磁性聚合物 颗粒洗脱所述至少一种生物分子。

通过本发明方法制得的磁性聚合物颗粒可优选用来固定或结合生物分 子。关于这一点，与磁性颗粒相连的生物物质可选自核酸、寡核苷酸、蛋 白质、多肽、肽、碳水化合物、类脂、以及它们的组合。具体来说可以使 得以下物质与磁性颗粒结合：核酸和寡核苷酸，优选质粒DNA，基因组DNA， cDNA，PCR DNA，线状DNA，RNA，核糖酶，适体，以及化学合成的或改性 的核酸或寡核苷酸。其中，“结合”通常表示生物分子产生与磁性聚合物颗 粒的强相互作用，使得可以在磁场的影响下，将其一起从样品中除去。这 些相互作用的性质是可变的。例如，所述相互作用可以基于共价键和/或氢 键和/或范德华力的形成。

用作为配体的螯合剂、例如Ni-NTA官能化的磁性聚合物颗粒可具体可 用于蛋白质纯化。

用含氨基的配体(例如聚乙烯亚胺)或含羧酸的配体改性的磁性聚合物 颗粒具体可用于核酸的分离和纯化。如果第二抗体作为配体与磁性聚合物 颗粒结合，它们可用于第一抗体的分离和纯化。

包含至少一种生物分子物质的样品可以是较为复杂的样品，例如血液、 组织、细胞、植物材料等。其它样品是在纯化、扩增或分析方法过程中得 到的溶液，例如PCR溶液。

可使用本发明的磁性颗粒的其它方法是通过杂交进行的核酸检测，结 合抗体或有机大分子，生物分子或细胞的结合和检测。所述磁性颗粒通常 可用于生物分子或细胞的结合、检测和纯化。

下面将通过各种实施例进一步描述本发明。这些实施例仅仅是用来进 一步说明本发明，而不是限制性的。

实施例1：多孔、羟基官能化的磁性聚合物颗粒的合成

在第一步中，将8毫升Tween 20(购自德国陶弗克臣的西格马-艾尔德里 奇公司，Aldrich编号27，4348)溶解在400ml毫升石蜡油(德国陶弗克臣的西 格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号33，076-0)。然后使用移液管将基本不含 引发剂的2毫升乙二醇二甲基丙烯酸酯(德国陶弗克臣的西格马-艾尔德里奇 公司，Aldrich编号33，568-1)和9毫升甲基丙烯酸羟乙酯(德国陶弗克臣的西 格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号47，702-8)加入塑料容器中，优选该容器 是50毫升的猎鹰牌(Falcon)管子(BD生物科学公司(BD Biosciences))，加入 10毫升聚乙二醇，3400，(德国陶弗克臣的西格马-艾尔德里奇公司，Aldrich 编号20，244-4)，0.3克偶氮二-2-甲基丙腈(德国陶弗克臣的西格马-艾尔德里 奇公司，Fluka编号11630)和7.5克BASF磁铁矿345(德国路德维希的BASF AG公司)。然后该混合物在泊利卓(Polytron)均化器中，在最高设定下均化1 分钟。将一半的石蜡油溶液置于500毫升的奈尔津(Nalgene)瓶中。然后加入 磁铁矿悬浮液，在冰冷却的同时对该混合物均一化120秒。在保护气的气氛 下将另一半石蜡油溶液置于装有回流冷凝器和KPG搅拌器的1000毫升三颈 烧瓶中。初始搅拌速度为500rpm，然后提速到600rpm。然后加入氧化铁悬 浮液。然后通过使得保护气体通过所述烧瓶，使得反应混合物不含氧气。 反应温度升高到70℃1小时，然后在80℃下保持过夜。第二天，过滤混合物， 用甲苯、丙酮和水洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥。通过这种方式得到的 颗粒是羟基官能化的，大孔的，粒径为10-15微米。

实施例2：多孔、环氧基官能化的磁性聚合物颗粒的合成

在第一步中，将8毫升Span 60(购自德国陶弗克臣的西格马-艾尔德里奇 公司，Aldrich编号31，822-1)溶解在400ml毫升石蜡油(德国陶弗克臣的西格 马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号33，076-0)。然后使用移液管将基本不含引 发剂的5毫升乙二醇二甲基丙烯酸酯和5毫升甲基丙烯酸缩水甘油酯(西格 马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号15-123-8)加入猎鹰牌管子，加入10毫升聚 乙二醇，(Mw4600)，(西格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号37，300-1)，0.3克 偶氮二-2-甲基丙腈和7.5克Bayer Bayoxide E 8710(德国勒沃库森的兰克瑟 斯AG公司)。然后该混合物在泊利卓(Polytron)均化器中，在最高设定下均 化1分钟。

将一半的石蜡油溶液置于500毫升的奈尔津(Nalgene)瓶中。然后加入磁 铁矿悬浮液，在冰冷却的同时对该混合物均一化120秒。在保护气的气氛下 将另一半石蜡油溶液置于装有回流冷凝器和KPG搅拌器的1000毫升三颈烧 瓶中。初始搅拌速度为500rpm，然后提速到600rpm。然后加入氧化铁悬浮 液。然后通过使得保护气体通过所述烧瓶，使得反应混合物不含氧气。反 应温度升高到60℃1小时，然后在70℃下保持过夜。第二天，过滤混合物， 用甲苯、丙酮和水洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥。通过这种方式得到的 颗粒是环氧基官能化的，大孔的，粒径为10-15微米。

实施例3：多孔的羧酸官能化的磁性聚合物颗粒的合成

在第一步中，将8毫升Span 60溶解在400ml毫升石蜡油(西格马-艾尔德 里奇公司，Aldrich编号33，076-0)。然后使用移液管将基本不含引发剂的3毫 升乙二醇二甲基丙烯酸酯和7毫升甲基丙烯酸(西格马-艾尔德里奇公司， Aldrich编号39，537-4)加入猎鹰牌管子，加入10毫升聚乙二醇，(Mw2000)， (西格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号29，590-6)，0.3克偶氮二-2-甲基丙腈和 7.5克Bayer Bayoxide E 8713H。然后该混合物在泊利卓均化器中，在最高设 定下均化1分钟。

将一半的石蜡油溶液置于500毫升的奈尔津瓶中。然后加入磁铁矿悬浮 液，在冰冷却的同时对该混合物均一化120秒。在保护气的气氛下将另一半 石蜡油溶液置于装有回流冷凝器和KPG搅拌器的1000毫升三颈烧瓶中。初 始搅拌速度为500rpm，然后提速到600rpm。然后加入氧化铁悬浮液。然后 通过使得保护气体通过所述烧瓶，使得反应混合物不含氧气。反应温度升 高到70℃1小时，然后在80℃下保持过夜。第二天，过滤混合物，用甲苯、 丙酮和水洗涤，在50℃的真空烘箱中干燥。通过这种方式得到的颗粒是羧 基官能化的，大孔的，粒径为10-15微米。

实施例4：用Ni-氨三乙酸对多孔磁性聚合物颗粒进行化学改性

在250毫升的圆底烧瓶中，将5克来自实施例1的多孔磁性聚合物颗粒悬 浮在100毫升0.5M的氢氧化钠溶液中。然后加入2毫升表溴醇，该混合物在 旋转蒸发器中，在40℃下反应4小时。然后该悬浮液通过玻璃抽滤设备过滤， 用去离子水洗六次。然后将残余物转移到250毫升的圆底烧瓶中，悬浮在100 毫升0.5M的a-N，N’-二(羧基甲基)赖氨酸(根据Doebeli等人在EP 0 253 303 中所述合成)溶液中，在旋转蒸发器上加热过夜。然后抽滤该混合物，用去 离子水洗涤四次。然后将磁性颗粒悬浮在50毫升2％强度的硫酸镍溶液中， 再搅拌3小时。然后进行磁性分离(magnetic removal)，该颗粒用水洗涤三次， 再重新悬浮并储存在50毫升100mM的乙酸盐缓冲剂中，其pH为6.0，包含 20％的乙醇。

实施例5：用Ni-氨三乙酸对多孔磁性聚合物颗粒进行化学改性

在250毫升的圆底烧瓶中，将4克来自实施例2的聚合物颗粒悬浮在50 毫升去离子水中。然后加入2克a-N，N’-二(羧基甲基)赖氨酸配体(按照 Doebeli等人在EP 0 253 303中的描述制备)溶液，然后该反应混合物在缓慢 搅拌的条件下在60℃加热10小时。然后该混合物用去离子水洗涤四次，进 行磁性分离。然后将磁性颗粒悬浮在50毫升2％强度的硫酸镍溶液中，再搅 拌3小时。然后，进行磁性分离，颗粒用水洗涤三次，再重新悬浮并储存在 50毫升100mM的乙酸盐缓冲剂中，其pH为6.0，包含20％的乙醇。

实施例6：用聚乙烯亚胺对多孔磁性聚合物颗粒进行化学改性

将4克实施例3的聚合物颗粒悬浮在50毫升10％强度的高分子量聚乙烯 亚胺(西格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号40，872-7)的pH＝10的水溶液中， 转移到圆底烧瓶中。然后加入200毫克N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(西格马- 艾尔德里奇公司，Fluka编号56485)和200毫克盐酸-N-3-二甲基氨基-N’-丙基 碳二亚胺(西格马-艾尔德里奇公司，Fluka编号03449)，该混合物在室温下， 在旋转蒸发器上搅拌3小时。然后该混合物用去离子水洗涤六次，磁性分离， 最后悬浮在50毫升去离子水中。

实施例7：用聚乙烯亚胺对多孔磁性聚合物颗粒进行化学改性

将4克实施例2的聚合物颗粒悬浮在50毫升10％强度的高分子量聚乙烯 亚胺(西格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号40，872-7)的pH＝10的水溶液中， 转移到圆底烧瓶中，在搅拌的条件下在60℃加热10小时。然后该混合物用 去离子水洗涤六次，磁性分离，最后悬浮在50毫升去离子水中。

实施例8：用胺对多孔磁性聚合物颗粒进行化学改性

将4克来自实施例3的聚合物颗粒悬浮在50毫升5％强度的pH＝10的精 胺溶液(西格马-艾尔德里奇公司，Fluka编号85590)中，转移入圆底烧瓶中。 然后加入200毫克N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(西格马-艾尔德里奇公司，见 上)和200毫克盐酸N-3-二甲基氨基-N’-丙基碳二亚胺(西格马-艾尔德里奇公 司，见上)，该混合物在室温下，在旋转蒸发器中搅拌3小时。然后该混合物 用去离子水洗涤六次，磁性分离，最后悬浮在50毫升的去离子水中。

实施例9：用胺对多孔磁性聚合物颗粒进行化学改性

将4克来自实施例2的聚合物颗粒悬浮在50毫升5％强度的pH＝10的精 胺溶液(西格马-艾尔德里奇公司，见上)中，转移入圆底烧瓶中，在60℃搅拌 10小时。然后该混合物用去离子水洗涤六次，磁性分离，最后悬浮在50毫 升的去离子水中。

实施例10：多孔羧基官能化的磁性聚合物颗粒的化学合成

将4克实施例2的聚合物颗粒悬浮在50毫升10％强度的pH＝9.5的6-氨基 己酸溶液(西格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号A4，460-6)中，转移到圆底烧 瓶中，在搅拌下于60℃加热10小时。然后该混合物用去离子水洗涤6次，磁 性分离，最后悬浮在50毫升的去离子水中。

实施例11：第二抗体与多孔磁性聚合物颗粒结合

将2克来自实施例2的磁性聚合物颗粒加入50毫升10％强度的1，6-二氨 基己烷(西格马-艾尔德里奇公司，Aldrich编号H1-1，169-6)在100mM的氯化 钠中的溶液，其pH值为9.5，将其转移入100毫升的圆底烧瓶中。在下一步中， 加入250毫克N-羟基磺基琥珀酰亚胺和250毫克盐酸N-3-二甲基氨基-N’-丙 基碳二胺。然后将该烧瓶转移到旋转蒸发器上，使得反应混合物在室温下 反应3小时。

冷却之后，聚合物悬浮体用去离子水洗涤三次，磁性分离。将珠粒悬 浮在4毫升磷酸盐缓冲盐水中，然后加入1毫升10毫克/毫升的磺基 (sulfo)-SMCC(购自美国伊利诺伊州，洛克福德的皮尔斯公司(Pierce， Rockford，IL，USA))在磷酸盐缓冲盐水中的溶液。该悬浮体立即进行涡旋处 理，然后使其在颠倒振荡机(end-over-end shaker)中反应2小时。通过磁性分 离将反应产物与上清液分离，用pH＝7.0的100mM的磷酸盐缓冲剂洗涤两 次。然后加入1毫升抗体溶液(1毫克/毫克山羊抗鼠(goat anti mouse)IgG；西 格马-艾尔德里奇公司，Sigma编号M 8642)和1毫升磷酸盐缓冲盐水，该反应 混合物在颠倒振荡机中反应2小时。然后通过磁性分离将上清液与产物分 离。该磁性颗粒用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，可以在-20℃下储存。

实施例12：将第二抗体与多孔磁性聚合物颗粒结合

将2克来自实施例3的磁性聚合物颗粒加入50毫升10％强度的1，6-二氨 基己烷(西格马-艾尔德里奇公司，见上)在100mM的氯化钠中的溶液，其pH 值为9.5，然后转移至100毫升的圆底烧瓶。然后将该烧瓶转移到旋转蒸发器 上，该反应混合物在70℃反应10小时。冷却之后，聚合物悬浮体用去离子水 洗涤三次，磁性分离。然后将珠粒悬浮在4毫升磷酸盐缓冲盐水中，加入1 毫升的10毫克/毫升的磺基-SMCC在磷酸盐缓冲盐水中的溶液。该悬浮液立 刻进行涡旋处理，然后在颠倒振荡机中反应2小时。所述反应产物通过磁性 分离与上清液分离，用100mM的磷酸盐缓冲剂(pH＝7.0)洗涤两次。然后加 入1毫升抗体溶液(1毫克/毫克，第二山羊抗鼠(sec.goat anti-mouse))和1毫升 缓冲盐水，然后使得该混合物在颠倒振荡机中反应2小时。然后通过磁性沉 淀将上清液与产物分离。磁性颗粒用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，可以在 -20℃储存。

实施例13：用Ni-NTA改性的、多孔磁性聚合物颗粒(变性条件)进行蛋 白质纯化。

通过在室温下上下移液运动(pipetting up and down)和震摇管子1小时， 将5毫升细胞培养团粒(大肠杆菌(E.coli)中的质粒pQE 16，依照“The Qiaexpressionist”，第三版，Qiagen GmbH，Hilden，1997所述转化和生产重组 蛋白质)重新悬浮在1毫升的溶菌缓冲剂(6M盐酸胍，0.1M NaH2PO4，0.01M 三羟甲基氨基甲烷×HCl，0.05％ Tween20，pH 8.0)中。然后通过在10000g 下离心30分钟使得溶菌产物澄清，将上清液转移到另一个管子。将5毫克来 自实施例4或5的多孔磁性聚合物珠粒置于第二管子中，加入500μl澄清的 溶菌产物溶液。悬浮液在颠倒振荡器上，在室温下培养30分钟。然后将该 管子置于合适的磁性分离器上，用移液管移走上清液。在下一步中，加入 500μl毫升洗涤缓冲剂(8M脲，0.1M NaH2PO4，0.01M三羟甲基氨基甲烷 ×HCl，0.05％Tween20，pH＝6.3)，将所述管子置于磁性分离器上处理1分 钟，用移液管移去上清液。用洗涤缓冲剂重复一次所述洗涤步骤。然后加 入100μl洗脱缓冲剂(8M脲，0.1M NaH2PO4，0.01M三羟甲基氨基甲烷×HCl， 0.05％Tween20，pH＝4.5)，悬浮液在颠倒振荡器上培养1分钟，该管子置于 磁性分离器上1分钟，收集洗脱液。重复洗脱步骤，收集洗脱液。通过 Bradford试验测定的蛋白质结合能力约为10微克/克磁性颗粒。

实施例14：使用聚乙烯亚胺改性的多孔磁性聚合物珠粒浓缩病毒

将1毫升病毒血浆(virus plasma)置于2毫升的Eppendorff管内。然后将 200μl实施例5的聚乙烯亚胺改性的颗粒的悬浮液以10毫克/毫升的浓度加 入200μl不含RNase的水中。对该混合物进行涡旋处理，然后在室温下培养 15分钟，然后在2000rpm转速下离心2秒，以除去管子的上端的颗粒的残余 物。然后所述颗粒在5分钟的过程内通过磁力法分离。弃去上清液，同时不 除去颗粒。然后，将13.2毫升“AL”缓冲剂(德国希尔登乔根公司(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)，编号19075)、82.9μl定量标样(得自罗氏的古巴斯 泰克曼(Cobas TaqMan，Roche))和载体RNA(德国希尔登乔根公司的 QIAampMinElute真空试剂盒，编号57714)与75μl蛋白酶溶液(在QIAamp MinElute试剂盒中)和7毫升再悬浮缓冲剂(在QIAampMinElute试剂盒中) 混合。

加入15μl酶溶液(Smitest溶液I，日本茨城的JSR公司(JSR Corporation， Ibaraki，Japan))，380μl样品稀释剂(Smitest溶液II)和5μl沉淀剂(Smitest溶液 IV)。加入Smitest溶液之后，立刻通过漩涡混合所述样品。然后其在55℃下 培养30分钟，然后在2000rpm下进行简短的离心步骤。通过反复地上下移液 运动使得所述颗粒重新悬浮。将所述颗粒的悬浮体置于Ultrafree MC过滤器 (米利泊公司(Millipore Corporation))上，给管子盖上盖子，用剪刀切穿铰链 区。然后将过滤装置置于2毫升的Eppendorff管内。其在10000rpm下离心3 分钟。取出过滤装置并弃去。然后加入250μl包含来自RT和cRNA(载体RNA/ 罗氏诊断学(Roche Diagnostics))的质量标样的Smitest溶液III(用于蛋白质溶 液)。该混合物立刻进行漩涡处理，在55℃下培养15分钟。然后加入600μl 的异丙醇，通过颠倒管子20次而混合。然后其在冰上培养15分钟，然后在4 ℃下、以15000rpm的转速离心10分钟。小心地除去上清液而不使颗粒重新 悬浮。加入500μl的70％的乙醇，通过颠倒管子三次进行混合。其在4℃下 在12000rpm转速下离心三分钟，然后加入500μl的70％的乙醇，通过颠倒管 子三次而再次混合。在4℃下，以12000rpm的转速再次离心三分钟。分离上 清液并弃去。在15000rpm的转速下离心10秒后，分离上清液。这些颗粒在 室温下干燥10分钟。所述颗粒重新悬浮在60μl不含RNase的水中，用热混合 器(thermomixer)在室温下振荡10-15分钟。将50μl的洗脱液与50μl的科巴斯 泰克曼(Cobas TaqMan)的马斯特混合物(Master mix)(罗氏(Roche))混合，通 过实时PCR进行检测。能够通过该过程发现与已经使用MinElute纯化过的非 浓缩的血清相比，CT值的减小。

实施例15：用氨基改性的多孔磁性聚合物颗粒进行核酸纯化

在1.5升的Eppendorff管中，将10μl的1mg/ml的标准质粒pUC 21的溶液 加入300μl的100mM的乙酸铵溶液(pH＝5.5)，以及20μl的100mg/ml的来 自实施例7或8的氨基改性的多孔磁性聚合物颗粒的悬浮液中。该溶液通过 脉冲漩涡充分混合10秒，通过在Eppendorff热混合器中，以1100rpm的转速 震摇所述管子5分钟，促进DNA连接。通过在微管磁性分离器(例如12管磁 性分离器(德国希尔登乔根公司，编号36912))中磁性分离，将颗粒与上清液 分离，弃去上清液。然后加入500μl的重蒸馏水，然后对该管子进行脉冲漩 涡处理10秒钟。然后所述颗粒通过磁性分离与上清液分离，弃去上清液。重 复该清洗过程，在磁性分离之后再次弃去上清液。然后所述颗粒悬浮在含 有0.1％的SDS(十二烷基硫酸钠，西格马-艾尔德里奇公司，Fluka编号71725) 的50μl“TE”缓冲剂(10mM三羟甲基氨基甲烷/Cl；pH 8.0，1mM EDTA)中， 该悬浮液通过脉冲漩涡充分混合10秒。然后将该管子置于磁性分离器上， 将上清液转移到第二Eppendorff管内。在纯化之后，可通过OD320检测和聚丙 烯酰胺凝胶电泳测定洗脱液中的DNA含量。或者，DNA可用具有高盐含量的 缓冲剂(例如1.25ml的NaCl；50mM MOPS，pH＝8.5，15％异丙醇)洗脱，但 是其必须随后沉淀，使其可用于随后的生物化学反应。

实施例16：第一抗体与用第二抗体改性的多孔磁性聚合物颗粒结合

将3.4×105/毫升人CD3+和4.2×105/毫升CD3-悬浮细胞与包含10mM Na2HPO4，100mM NaCl(pH＝7.5)和10％胎牛血清(FCS)的溶液混合。然后每 次试验使用3.32×106个细胞。在不进行振荡的条件下，该混合物用CD3-特 异性单克隆抗体(鼠抗人CD3 PerCP/德国海德尔堡的贝克顿迪克森公司 (Becton Dickinson GmbH，Heidelberg，Germany)，编号555330)培养30分钟。 然后，加入1毫升磷酸盐缓冲盐水(10mM Na2HPO4，100mM NaCl/pH＝ 7.5)，然后该混合物在1000rpm的转速下离心。通过移液操作除去上清液，所 述颗粒重新悬浮在1ml磷酸盐缓冲盐水中。然后加入200μl的25mg/ml的实 施例11或12的用第二抗体(山羊抗鼠IgG)官能化的磁性颗粒的悬浮体。所述 颗粒进行培养以及通过偶尔的振荡混合20分钟。在下一步中，将所述管子置 于磁性分离器上，将上清液转移到第二管中。然后，在进一步的步骤中，加 入20μl鼠抗人CD3 PerCP，培养15分钟，洗涤并通过荧光活化细胞分选 (FACS)进行分析。对信号的分析显示

a)未染色的细胞，

b)CD3 PerCP染色的和未分离的细胞混合物，

c)用分离抗体培养、然后用染色抗体(CD3 PerCP)培养的细胞

d)磁性分离的用CD3 Per CP染色的细胞。

FACS结果显示表达CD3的Jurkat细胞减少至少85％，即从39.3％减少到 5.44％。

实施例17：用羧酸酯改性的多孔磁性聚合物颗粒纯化核酸(凝胶提取)

将包含1μg DNA的200mg凝胶碎片置于400μl的“QX1”缓冲剂(德国希 尔登乔根公司，编号20912)中，通过脉冲漩涡充分混合5秒。然后加入50μl 50mg/ml的根据实施例3或10的羧酸酯改性的多孔磁性聚合物颗粒的悬浮 液，该混合物通过重新脉冲漩涡而混合。然后该混合物在加热块(heating block)上，在50℃再加热5分钟，再通过脉冲漩涡混合10秒。然后通过磁性 分离将颗粒与上清液分离，弃去上清液。在下一步中，加入500μl的“QX1” 缓冲剂，该悬浮液通过脉冲漩涡处理充分混合5秒。然后重复所述分离步骤， 再次弃去上清液。然后用“PE”缓冲剂(德国希尔登乔根公司，编号19065)进 行两个洗涤步骤，弃去相应的上清液。然后通过旋转管子对所述颗粒进行10 分钟的干燥，在此过程中不移去磁分离器。在干燥步骤之后，加入100μl的 “EB”缓冲剂(德国希尔登乔根公司，编号19068)，悬浮液通过脉冲漩涡混合 15秒。用磁分离器将上清液与颗粒分离，并将上清液转移到另一个管内。 重复洗脱步骤，收集洗脱液，通过简短的脉冲漩涡进行均一化。纯化的DNA 的纯度和量可通过凝胶电泳和OD测量进行测定。