技术领域
[0001] 本
发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种免提取直接扩增的人MTHFR基因SNP分型快速试纸条检测方法。
背景技术
[0002] 亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸在人体内代谢的关键酶，主要功能是将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸是同型半胱
氨酸再次甲基化为蛋氨酸的甲基供体。研究表明，亚甲基四氢叶酸还原酶活性与MTHFR基因C677T位点单核苷酸多态性(SNP)相关。MTHFR基因C677T位点单核苷酸多态性即野生型(CC型)、杂合突变型(CT型)及纯合突变型(TT型)。C677T位点的突变使酶对热不耐受而活性降低，与野生型个体相比，杂合突变型个体酶活性只有65％，而纯合突变型个体酶活性仅有30％，造成叶酸
代谢能力降低并可能诱发高同型半胱氨酸血症(Hhcy)。因此，针对MTHFR C677T基因的分型检测在用患者服用叶酸药物时具有重要的指导意义。
[0003] SNP分型检测技术是一种重要的基因检测技术，已有技术包括
荧光定量PCR法、
基因芯片杂交法、PCR结合凝胶
电泳法、PCR结合毛细管电泳法、PCR结合酶切方法、DNA直接测序法等。这些方法普遍存在操作复杂、检测时间长，或需要价格昂贵的大型仪器设备等方面的限制，且这些方法都需要从样本中纯化得到DNA，复杂繁琐的纯化步骤不但损耗大量时间，而且增加了造成样本间交叉污染的
风险，因此并不适合于大多数临床医院在常规的临床检验中推广使用。所以，研究并开发免提取直接扩增且简便省时，无需大型仪器设备的SNP分型检测方法有重要意义。
发明内容
[0004] 本发明的一个目的是
[0005] 本发明提供的技术方案为：
[0006] 一种免提取直接扩增的人MTHFR基因SNP分型快速试纸条检测方法，包括如下步骤：
[0007] 步骤一、将样本与样本处理液混合并静置5分钟，作为
模版使用；
[0008] 步骤二、针对待检测MTHFR基因C677T SNP位点，分别设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记
生物素；
[0009] 步骤三、针对每一个样本，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物；
[0010] 步骤四、采用层析技术并以地高辛和地高辛单抗作用、生物素和链亲和素作用，对步骤三得到的扩增产物进行试纸条分型检测，判读基因型，滴加含有野生型特异性引物的扩增产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。
[0011] 作为优选的是，步骤一中，样本为
全血样本、
口腔拭子和指尖血血斑样本中的一种。
[0012] 作为优选的是，步骤一中，样本处理液为浓度为50-150mM的无机
碱性溶液。
[0013] 作为优选的是，所述无机碱性溶液为KOH溶液或NaOH溶液或CaOH溶液。
[0014] 作为优选的是，步骤二中，所述野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-地高辛-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAAC-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-地高辛-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAAT-3'；共用引物核苷酸序列为：5'-生物素-AGCGAACTCAGCACTCCACC-3'。
[0015] 作为优选的是，步骤四中，试纸条的质控线
喷涂有质控用羊抗兔IgG，试纸条的检测线喷涂有捕获用链霉亲和素，试纸条的结合垫喷涂有地高辛单抗修饰的金磁微粒。
[0016] 作为优选的是，步骤四中，所述分型检测的步骤包括：
[0017] 将步骤三中完成的两管扩增产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，获得的扩增产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至样品垫上后，一端的地高辛与地高辛单抗金磁微粒特异性结合后，层析上移至检测线处，另一端的生物素与检测线上的链霉亲和素特异结合显色，判断基因型。
[0018] 作为优选的是，步骤四中，所述地高辛单抗修饰的金磁微粒，为
核壳结构的超顺
磁性复合微粒，其核为纳米Fe3O4磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗，形成地高辛单抗修饰的金磁微粒。
[0019] 本发明的有益效果体现在以下方面：
[0020] (1)提高检测效率，减少交叉污染
[0021] 已有的SNP检测方法均需对样本中的DNA进行提取。使用常规提取方法约需2小时，使用商品化
试剂盒提取约需1小时。使用本发明进行样本扩增时，不再进行DNA提取，提高了检测效率，同时避免了样本在提取过程中可能造成的交叉污染。结合地高辛单抗修饰的金磁微粒层析试纸条，整个检测过程可控制在1小时30分钟内，极大的提高了检测效率。
[0022] (2)降低检测成本，便于推广使用
[0023] 已有的SNP检测技术，如荧光定量PCR法、基因芯片杂交法、PCR结合凝胶电泳法、PCR结合毛细管电泳法、PCR结合酶切方法、DNA直接测序法等，通常需要配备一些特殊仪器，如基因测序仪，芯片点样仪，荧光定量PCR仪，电泳及成像设备等，或者需要复杂的扩增产物酶处理过程，需要耗费高额成本以完成检测。本发明不仅节省了DNA纯化试剂成本，还无需特殊仪器设备，仅通过试纸条目视化判读结果，大大降低了整个检测的成本，便于在各级医疗机构推广使用。
附图说明
[0024] 图1为本发明所述的免提取直接扩增的人MTHFR基因SNP分型快速试纸条检测方法
流程图。
[0025] 图2为本发明
实施例一试纸显色结果示意图。
[0026] 图3为本发明实施例二试纸显色结果示意图。
[0027] 图4为本发明实施例三试纸显色结果示意图。
具体实施方式
[0028] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照
说明书文字能够据以实施。
[0029] 如图1所示，本发明提供了一种免提取直接扩增的人MTHFR基因SNP分型快速试纸条检测方法，包括以下步骤：
[0030] 步骤一S110、样本处理：取少量样本，加入样本处理液10μL，静置5分钟后可直接作为模板进行下一步反应。
[0031] 步骤二S120、针对待检测MTHFR基因C677T(rs1801133C>T)SNP位点，分别设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记生物素；
[0032] 步骤三S130、针对每一个样本，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物，扩增反应体系为：
[0033]
[0034] PCR反应条件为：50℃UNG酶作用2min，95℃预变性3min，94℃变性5s，60℃
退火10s，72℃延伸30s，进行31个循环，65℃终延伸10min。
[0035] 步骤四S140、利用地高辛单抗修饰的金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以地高辛和地高辛单抗作用、生物素和链亲和素作用，对步骤三S130得到的扩增产物进行试纸条分型检测，判读基因型，滴加含有野生型特异性引物的扩增产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。
[0036] 其中，步骤一S110所述样本，样本类型可以是全血样本、口腔拭子或指尖血血斑样本。
[0037] 步骤一S110所述样本处理液为浓度为50-150mM的无机碱性溶液，其可以是KOH溶液，NaOH溶液或CaOH溶液。
[0038] 步骤二S120所述野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-地高辛-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAAC-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-地高辛-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAAT-3'；共用引物核苷酸序列为：5'-生物素-AGCGAACTCAGCACTCCACC-3'。
[0039] 步骤四S140所述层析技术采用的试纸条满足以下条件：
[0040] a.试纸条的质控线喷涂有质控用羊抗兔IgG；
[0041] b.试纸条的检测线喷涂有捕获用链霉亲和素；
[0042] c.试纸条的结合垫喷涂有地高辛单抗修饰的金磁微粒；
[0043] 步骤四S140所述分型检测，是指将步骤三S130完成的两管扩增产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测。获得的扩增产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至样品垫上后，一端的地高辛与地高辛单抗金磁微粒特异性结合后，层析上移至检测线处，另一端的生物素与检测线上的链霉亲和素特异结合显色，依此判断其基因型。
[0044] 步骤四S140所述的地高辛单抗修饰的金磁微粒，是指一种核壳结构的超
顺磁性复合微粒，其核为纳米Fe3O4磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗，形成地高辛单抗修饰的金磁微粒。
[0045] 下面以实施例阐述本发明提供的免提取直接扩增的人MTHFR基因SNP分型快速试纸条检测方法的实施过程。
[0046] 实施例1
[0047] 1.取少量全血样本加入到PCR离心管中，用移液器吸取样本处理液10μL，加入到离心管中，静置5min备用；
[0048] 2.取A、B两支PCR离心管中分别加入以下物质：
[0049]
[0050] 3.将A、B两管放入PCR仪，按如下扩增程序进行：
[0051] 50℃UNG酶作用2min，95℃预变性3min，94℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸30s，进行31个循环，65℃终延伸10min。总时间：1h20min。
[0052] 4.将A、B两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，结果如图2所示。根据图2中T线显色判读，该样本为MTHFR C677T杂合突变型。
[0053] 实施例2：
[0054] 1.取少量口腔拭子样本加入到PCR离心管中，用移液器吸取样本处理液10μL，加入到离心管中，静置5min备用；
[0055] 2.取C、D两支PCR离心管中分别加入以下物质：
[0056]
[0057] 3.将C、D两管放入PCR仪，按如下扩增程序进行：
[0058] 50℃UNG酶作用2min，95℃预变性3min，94℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸30s，进行31个循环，65℃终延伸10min。总时间：1h20min。
[0059] 4.将C、D两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，结果如图3所示。根据图3中T线显色判读，该样本为MTHFR C677T野生型。
[0060] 实施例3：
[0061] 1.取少量指尖血血斑样本加入到PCR离心管中，用移液器吸取样本处理液10μL，加入到离心管中，静置5min备用；
[0062] 2.取A、B两支PCR离心管中分别加入以下物质：
[0063]
[0064] 3.将A、B两管放入PCR仪，按如下扩增程序进行：
[0065] 50℃UNG酶作用2min，95℃预变性3min，94℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸30s，进行31个循环，65℃终延伸10min。总时间：1h20min。
[0066] 4.将A、B两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，结果如图4所示。根据图4中T线显色判读，该样本为MTHFR C677T纯合突变型。
[0067] 对比例1
[0068] 不同SNP位点使用该方法检测结果如下表所示
[0069]
[0070]
[0071] 通过本对比例实验，证明通常的SNP的检测并不能直接使用KOH处理的样本。本发明发现了在本发明的方法中MTHFR(C677T)这个SNP位点的检测可以使用KOH处理的样本直接作为模板，使得检测过程大为简化。
[0072] 对比例2
[0073] 引物的优化如下表所示
[0074]
[0075] 通过本对比例实验，证明通过引物的优化，尤其是SNP前一个位点核苷酸的特定改变，使得野生型和突变型扩增的区分度大为提高。
[0076] 本发明具有以下优点：
[0077] (1)提高检测效率，减少交叉污染
[0078] 已有的SNP检测方法均需对样本中的DNA进行提取。使用常规提取方法约需2小时，使用商品化试剂盒提取约需1小时。使用本发明进行样本扩增时，不再进行DNA提取，提高了检测效率，同时避免了样本在提取过程中可能造成的交叉污染。结合地高辛单抗修饰的金磁微粒层析试纸条，整个检测过程可控制在1小时30分钟内，极大的提高了检测效率。
[0079] (2)降低检测成本，便于推广使用
[0080] 已有的SNP检测技术，如荧光定量PCR法、基因芯片杂交法、PCR结合凝胶电泳法、PCR结合毛细管电泳法、PCR结合酶切方法、DNA直接测序法等，通常需要配备一些特殊仪器，如基因测序仪，芯片点样仪，荧光定量PCR仪，电泳及成像设备等，或者需要复杂的扩增产物酶处理过程，需要耗费高额成本以完成检测。本发明不仅节省了DNA纯化试剂成本，还无需特殊仪器设备，仅通过试纸条目视化判读结果，大大降低了整个检测的成本，便于在各级医疗机构推广使用。
[0081] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的
修改。因此在不背离
权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
