免提取直接扩增的人PAH基因SNP分型快速试纸条检测方法及
试剂盒
技术领域
[0001] 本
发明属于SNP检测技术领域，特别涉及一种免提取直接扩增的人PAH基因SNP分型快速试纸条检测方法。
背景技术
[0002] 苯丙
酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常见的
氨基酸代谢异常
疾病，由苯丙氨酸代谢途径中的苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)
缺陷，导致苯丙氨酸转
化成酪氨酸的途径受阻，从而造成苯丙氨酸和苯丙
酮酸的积累，并影响脑内神经递质的合成。PKU为常
染色体隐形遗传，主要引起新生儿神经系统发育异常，主要临床特征为智
力低下、精神神经症状、
脑电图异常、湿疹、
皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等。苯丙氨酸在各国的发病率不同，平均约为1/15000人，而在我国的发病率为1/11144人，高于世界平均
水平。目前，已经发现了PAH基因的560多种突变，涉及到PAH基因的13个外显子；在中国人群中发现的PAH致病突变也超过100种。针对PKU的13个外显子进行测序，可以寻找到95％的遗传病因，仍有5％的遗传病因尚不清楚。
[0003] PKU
患儿出生时大多表现正常，新生儿期多无明显临床症状，或出现湿疹、吐奶等非特异性症状。若不及时
治疗，会逐渐出现典型症状：毛发
颜色由黑变黄，皮肤白，顽固的湿疹，汗液和尿液有特殊的鼠尿味，并伴有智力、运
动能力发育落后。随着年龄增长，PKU患儿智力低下会越来越明显，呈现中到重度的智力残疾，说话、走路均较同龄儿童晚，年长儿出现学习困难，严重者甚至生活不能自理，终生需要他人护理。除智力障碍外，还会出现一些精神行为方面的异常，如：烦躁易怒、攻击行为等。部分患儿合并
癫痫，常在18个月以前出现，可表现为婴儿痉挛性发作，点头样发作或其他形式，常规的抗癫痫治疗难以控制。PKU患儿通过早期诊断并采用饮食控制或药物治疗方法可有效阻断病程发展，有希望像正常孩子一样成长，因此对于PKU患儿的早期检出和治疗是非常必要的。
[0004] SNP分型检测技术是一种重要的基因检测技术，已有技术包括
荧光定量PCR法、
基因芯片杂交法、PCR结合凝胶
电泳法、PCR结合毛细管电泳法、PCR结合酶切方法、DNA直接测序法等。这些方法普遍存在操作复杂、检测时间长，或需要价格昂贵的大型仪器设备等方面的限制，且这些方法都需要从样本中纯化得到DNA，复杂繁琐的纯化步骤不但损耗大量时间，而且增加了造成样本间交叉污染的
风险，因此并不适合于大多数临床医院在常规的临床检验中推广使用。所以，研究并开发免提取直接扩增且简便省时，无需大型仪器设备的SNP分型检测方法无论是对于PKU患儿还是对于该疾病机理的实验室研究，都具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明提供一种免提取直接扩增的人PAH基因SNP分型快速试纸条检测方法，包括以下步骤：
[0006] (1)样本处理：取少量样本，加入样本处理液10μL，静置5分钟后直接作为模板进行下一步反应；
[0007] (2)针对待检测PAH基因R111X、IVS4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个位点，每一个位点分别设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记
生物素；
[0008] (3)针对每一个样本的每一个位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物；
[0009] (4)利用地高辛单抗修饰的金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以地高辛和地高辛单抗作用、生物素和链亲和素作用，对步骤(3)得到的扩增产物进行试纸条分型检测，判读基因型，滴加含有野生型特异性引物的扩增产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。
[0010] 步骤(1)中的样本类型可以是DNA样本、
全血样本或
口腔拭子样本。
[0011] 步骤(1)中的样本处理液为50mM-150mM的无机
碱性溶液，优选KOH溶液，NaOH溶液或CaOH溶液。
[0012] 优选的，步骤(2)中R111X位点野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-TACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTAG-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-digoxin-TACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTAA-3'；共用引物核苷酸序列为：5'-Biotin-TCTTTGGCCTGCGTTAGTTC-3'。
[0013] 优选的，步骤(2)中IVS4-1位点野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-AAATCAGGTGTCTCTTTTCTCCTTG-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-digoxin-AAATCAGGTGTCTCTTTTCTCCTTA-3'；共用引物核苷酸序列为：5'-Biotin-CTGGTATTTTCCATCCTCAACTG-3'。
[0014] 优选的，步骤(2)中Y204C位点野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-TGTATAAAACCCATGCTTGCGA-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-digoxin-TGTATAAAACCCATGCTTGCGG-3'；共用引物核苷酸序列为：5 '-Biotin-TCAATCCTCCCCCAACTTTC-3'。
[0015] 优选的，步骤(2)中R243Q位点野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-CACTGGTTTCCGCCTCAG-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-digoxin-CACTGGTTTCCGCCTCAA-3'；共用引物核苷酸序列为：5'-Biotin-AGCCAGCAATGAACCCAAAC-3'。
[0016] 优选的，步骤(2)中W326X位点野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-AGCCCAAACTCCACAGTAAATC-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-digoxin-AGCCCAAACTCCACAGTAAAAT-3'；共用引物核苷酸序列为：5 '-Biotin-CACTGACTCACATGCCAATCC-3'。
[0017] 优选的，步骤(2)中Y356X位点野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-GCTTTGGCTTCTCTGATAAGCTG-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-digoxin-GCTTTGGCTTCTCTGATAAGCTT-3'；共用引物核苷酸序列为：5'-Biotin-TTTCTCCCTTGGCTGTAGGTTTT-3'。
[0018] 优选的，步骤(2)中R413P位点野生型特异性引物的核苷酸序列为：5'-digoxin-TTGGGTGTATGGGTCGTAAC-3'；突变型特异性引物核苷酸序列为：5'-digoxin-TTGGGTGTATGGGTCGTAAG-3'；共用引物核苷酸序列为：5'-Biotin-TAGGGAGGTGTCCGTGTTC-
3'。
[0019] 优选的，步骤(4)中所述试纸条的质控线
喷涂有质控用羊抗兔IgG；试纸条的检测线喷涂有捕获用链霉亲和素；试纸条的结合垫喷涂有地高辛单抗修饰的金磁微粒。
[0020] 优选的，步骤(4)所述试纸条分型检测的步骤包括：将步骤(3)完成的两管扩增产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，由于获得的扩增产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至样品垫上后，一端的地高辛与地高辛单抗金磁微粒特异性结合，层析上移至检测线处，另一端的生物素与检测线上的链霉亲和素特异结合显色，依此判断其基因型。
[0021] 优选的，步骤(4)中所述地高辛单抗修饰的金磁微粒为
核壳结构的超顺
磁性复合微粒，其核为纳米Fe3O4磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗，形成地高辛单抗修饰的金磁微粒。
[0022] 本发明还提供了一种用于人PAH基因SNP快速分型检测的试剂盒，该试剂盒包括如下组分：本发明所述的针对待检测的R111X、IVS4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个突变位点设计的野生型特异性引物、突变型特异性引物和共用引物，以及用于快速检测的试纸条，所述试纸条的质控线喷涂有质控用羊抗兔IgG、检测线喷涂有捕获用链霉亲和素、结合垫喷涂有地高辛单抗修饰的金磁微粒。
[0023] 本发明的有益效果体现在以下方面：
[0024] (1)提高检测效率，减少交叉污染
[0025] 已有的SNP检测方法需对样本中的DNA进行提取。使用常规提取方法约需2小时，使用商品化试剂盒提取约需1小时。使用本发明进行样本扩增时，不再进行DNA提取，提高了检测效率，同时避免了样本在提取过程中可能造成的交叉污染。结合地高辛单抗修饰的金磁微粒层析试纸条，整个检测过程可控制在1小时30分钟内，极大的提高了检测效率。
[0026] (2)降低检测成本，便于推广使用
[0027] 已有的SNP检测技术，如荧光定量PCR法、基因芯片杂交法、PCR结合凝胶电泳法、PCR结合毛细管电泳法、PCR结合酶切方法、DNA直接测序法等，通常需要配备一些特殊仪器，如基因测序仪，芯片点样仪，荧光定量PCR仪，电泳及成像设备等，或者需要复杂的扩增产物酶处理过程，需要耗费高额成本以完成检测。本发明不仅节省了DNA纯化试剂成本，还无需特殊仪器设备，仅通过试纸条目视化判读结果，大大降低了整个检测的成本，便于在各级医疗机构推广使用。
[0028] (3)提高检测灵敏度和准确性
[0029] 相对已有的PAH基因突变位点的AS－PCR检测方法，本发明通过优化引物、优化PCR反应体系等条件在保证准确性、操作简便性的同时获得了高灵敏度，突变等位基因在总检测模板中的比例为0.01％时仍然可检测到。
附图说明
[0030] 图1为本发明位点为纯合突变时的试纸显色结果示意图。
[0031] 图2为本发明位点为野生型时的试纸显色结果示意图。
[0032] 图3为本发明位点为杂合突变时的试纸显色结果示意图。
具体实施方式
[0033] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照
说明书文字能够据以实施。
[0034] 本发明提供了一种免提取直接扩增的人PAH基因SNP分型快速试纸条检测方法，包括以下步骤：
[0035] 步骤一、样本处理：取少量样本，加入样本处理液10μL，静置5分钟后可直接作为模板进行下一步反应。
[0036] 步骤二、针对待检测PAH基因R111X、IVS4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个SNP位点，每一个位点分别设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条共用引物进行识别与扩增；在野生型特异性引物和突变型特异性引物的5′端均标记地高辛，共用引物的5′端标记生物素；
[0037] 步骤三、针对每一个样本的每一个位点，平行做两管PCR反应，其中一管加入共用引物与等量的突变型特异性引物，另一管中加入共用引物与等量的野生型特异性引物，两管的PCR反应体系和反应条件相同并同时置于PCR仪中反应，获得扩增产物，扩增反应体系为：
[0038]
[0039] 步骤四、利用地高辛单抗修饰的金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以地高辛和地高辛单抗作用、生物素和链亲和素作用，对步骤三得到的扩增产物进行试纸条分型检测，判读基因型，滴加含有野生型特异性引物的扩增产物在试纸条的检测线上显色，而含有突变型特异性引物的PCR产物在试纸条的检测线上不显色，则表明基因型为野生型；反之基因型为突变型；若两支试纸条的检测线均显色，则表明基因型为杂合型。
[0040] 其中，步骤一所述样本，样本类型可以是DNA样本、全血样本或口腔拭子样本。
[0041] 步骤一所述样本处理液为浓度为50-150mM的无机碱性溶液，其可以是KOH溶液，NaOH溶液或CaOH溶液。
[0042] 步骤四所述层析技术采用的试纸条满足以下条件：
[0043] a.试纸条的质控线喷涂有质控用羊抗兔IgG；
[0044] b.试纸条的检测线喷涂有捕获用链霉亲和素；
[0045] c.试纸条的结合垫喷涂有地高辛单抗修饰的金磁微粒；
[0046] 步骤四所述分型检测，是指将步骤三完成的两管扩增产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测。获得的扩增产物一端标记有生物素，另一端标记有地高辛，滴加至样品垫上后，一端的地高辛与地高辛单抗金磁微粒特异性结合后，层析上移至检测线处，另一端的生物素与检测线上的链霉亲和素特异结合显色，依此判断其基因型。
[0047] 步骤四所述的地高辛单抗修饰的金磁微粒，是指一种核壳结构的超
顺磁性复合微粒，其核为纳米Fe3O4磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗，形成地高辛单抗修饰的金磁微粒。
[0048] 下面以
实施例阐述本发明提供的免提取直接扩增的人PAH基因7个热点突变位点基因分型快速试纸条检测方法的实施过程。
[0049] 实施例1引物的设计与优化
[0050] 针对PAH基因的七个突变位点设计引物：通过NCBI的dbSNP
数据库确认其SNP位点侧翼序列,据此设计合成引物。每一个SNP位点均设计一条野生型特异性引物,其3’末端与SNP位点野生型碱基互补,一条突变型特异性引物,其3’末端与SNP位点突变型碱基互补和一条共用引物进行识别与扩增。为了利于后续层析检测技术,针对设计的引物进行标记,其中对共用引物进行生物素标记,对特异性引物进行地高辛标记。为增加扩增特异性和检测
分辨率,每个位点均设计多组引物进行试验筛选。
[0051] 根据以下目标筛选最优引物：(1)扩增特异性高：野生型、突变型特异性引物均能扩增出特异性单一的目的条带。(2)扩增灵敏度高，能在样本中存在低至0.01％突变比例的情况下仍然有效扩增出突变。(3)对样本类型的适应度高，不仅适用于常见的DNA样本，而且对免提取的全血样本、口腔拭子样本也能有效特异的扩增。
[0052] 其中，对于扩增准确性和灵敏度，按照下述步骤进行筛选：用已知确定的各个位点纯合突变和野生型的人的DNA作为模板,进行梯度稀释，使得纯合突变的模板占总模板中的比例为:50％、25％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％，0.01％。利用设计的多套备选引物、通过AS-PCR方法对上述各个比例的模板进行扩增，同时设置阳性质控和阴性质控。将扩增后的产物分为2部分，分别进行琼脂糖凝胶电泳检测和本
申请的试纸条层析系统检测,确定所设计的引物准确性与灵敏度。
[0053] 根据上述原则获得下表所述具体的引物组合：
[0054]
[0055]
[0056] 实验结果表明，优化后的引物对样品进行AS-PCR后，使用琼脂糖凝胶电泳和试纸条层析系统均能检测出比例低至0.01％的突变。另外，用肉眼判
断层析试纸条对于0.01％模板的检测显度明显高于琼脂糖凝胶电泳的显度,且没有
假阳性的出现与预期的结果相吻合。
[0057] 实施例2、全血样本的检测
[0058] 各取10个人的全血样本，分别针对本发明涉及的七个突变位点，进行突变类型的检测，具体操作步骤如下：取少量全血样本加入到PCR离心管中，用移液器吸取样本处理液10μL，加入到离心管中，静置5min备用；取A、B两支PCR离心管中分别加入以下物质(A管中加入突变型引物，B管中加入野生型引物)：
[0059]
[0060] 将A、B两管放入PCR仪，按如下优化后的扩增程序进行：
[0061] 50℃UNG酶作用2min，95℃预变性5min，94℃变性30s，在比Tm值低5℃的
温度进行
退火30s，65℃延伸30s，进行30个循环，65℃终延伸10min。总时间：1h20min。
[0062] 将A、B两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，按照如下原则进行突变与否的判断：如果结果如图1所示，A管突变型引物对应的试纸条的T线显色、而B管野生型引物对应的试纸条的T线不显色则表明位点为纯合突变。结果如图2所示A管突变型引物对应的试纸条的T线不显色、而B管野生型引物对应的试纸条的T线显色则表明位点为野生型，结果如图3所示两个管对应的试纸条的T线均显色则表明位点为杂合突变。
[0063] 针对7个突变位点，10个样本的检测结果与对应的测序验证结果相同，如下表所示。表明该方法应用于全血样本是可靠的。
[0064]
[0065]
[0066] 实施例3：口腔拭子样本的检测
[0067] 采用与实施例2相同的样本来源个体，分别针对本发明涉及的七个突变位点，进行突变类型的检测，具体操作步骤如下：取少量口腔拭子样本加入到PCR离心管中，用移液器吸取样本处理液10μL，加入到离心管中，静置5min备用；取A、B两支PCR离心管中分别加入以下物质：
[0068]
[0069]
[0070] 将A、B两管放入PCR仪，按与实施例2相同的程序进行扩增反应和试纸条检测及判断。结果与实施例2相同，均与测序结果吻合。表明该方法应用于口腔拭子样本也是可靠的。
[0071] 实施例4：DNA样本的检测
[0072] 采用与实施例2相同的样本来源个体，分别针对本发明涉及的七个突变位点，进行突变类型的检测。具体步骤如下：取少量人基因组DNA样本加入到PCR离心管中；取A、B两支PCR离心管中分别加入以下物质，静置5min备用；
[0073]
[0074]
[0075] 将A、B两管放入PCR仪，按与实施例2相同的程序进行扩增反应和试纸条检测及判断。结果与实施例2相同，均与测序结果吻合。表明该方法应用于基因组DNA样本是可靠的。
[0076] 对比例
[0077] 另外，并非任何一个基因的SNP位点均适合采用KOH处理的样本进行检测。本对比例进行了证实：
[0078] 不同SNP位点使用该方法检测结果如下表所示
[0079]
[0080] 通过本对比例实验，证明通常的SNP的检测并不能直接使用KOH处理的样本。本发明发现了在本发明的方法中位于PAH基因的七个SNP位点的检测可以使用KOH处理的样本直接作为模板，使得检测过程大为简化。
[0081] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的
修改。因此在不背离
权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
