技术领域
[0001] 本方面属于
磁性材料制备技术领域，特别是涉及一种核酸提取磁珠的制备方法及应用。
背景技术
[0002] 磁珠是一种包被有
生物活性基团的功能化载体，可分散于基液中形成磁性液体材料，生物活性基团可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点。磁珠在外
磁场的作用下可以定向移动和集中，撤去外磁场后，又可以恢复原来的结构与状态，从而使复杂的液固分离技术变得快捷简便。通过简单的洗脱即可得到纯度很高的靶向物质。目前，磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。对于核酸提取技术而言，磁珠法具有常规提取方法无法比拟的独特优势，诸如提取和纯化一步完成，定量提取，实现提取自动化，对于初学者而言操作简便。
[0003] 纳米Fe3O4由于其制备简单、
稳定性高、较强的超
顺磁性、
生物相容性和表面易于修饰等特点，成为目前应用最广泛的磁珠材料之一。但是，由于纳米Fe3O4的小尺寸效应、磁偶极子引
力等作用，磁性
纳米粒子易于团聚，且化学稳定性不高易受
氧化，表面羟基不足，导致其难以直接应用到生物领域。
发明内容
[0004] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种核酸提取磁珠的制备方法，其工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产；制得的核酸提取磁珠，其为
核壳结构磁珠，具有良好的生物相容性，并能与核酸特异性结合；而且还提供上述核酸提取磁珠在核酸提取中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种核酸提取磁珠的制备方法，其包括以下步骤：
[0007] S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
[0008] 分别配制浓度为0.1～1mol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5～2.0混合；上述
混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000
水溶液，聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10~1/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系
温度60～70℃，再向混合液中滴加
质量浓度为25％
氨水至体系PH值为10～11，在温度为70～80℃条件下反应3～6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10～-20℃
冷冻干燥24～
48h，得到
超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
[0009] 其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100～300nm，饱和磁化强度较高为57.4～79.4 emu/g；
[0011] 将步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2～500g分散到0.1～3L无水
乙醇中
超声波处理30～60min后，加入20～1000ml浓度为10～50g/L的分散剂，搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25％氨水至体系PH值为10，再滴加0.25～500ml体积比为1:1的正
硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴
加速度为0.1～0.5ml/min，体系温度为30～50℃，滴加完毕后反应3～5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6～7，超声分散15～30min，分散在万分之二NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
[0012] 进一步地，上述步骤S2中采用的分散剂为
乙二胺四乙酸二钠、
柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷
酮中的一种或几种混合。
[0013] 上述方法制得的硅基磁珠，其为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒
内核，SiO2
外壳层，SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面；硅基磁珠经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm ~1μm，饱和磁化强度为43.0～74.5emu/g。
[0014] 上述方法制得的核酸提取磁珠，无外加磁场时，呈黑色悬浮液状态，放置有永磁
铁时，核酸提取磁珠能够与水快速分离。
[0015] 上述方法制得的核酸提取磁珠，其应用于新鲜动物组织、动物组织
石蜡切片、
植物叶片、
种子、
全血、血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。
[0016] 上述方法制得的核酸提取磁珠，其应用于生物检材中核酸提取，包括以下步骤：
[0017] （1）、裂解
[0018] 取适量生物检材样本于EP管中，加入样本体积1~3倍的细胞裂解液、5~20μl蛋白酶K，混合均匀，再把EP管置于恒温水箱中65~80℃温育10～30min；
[0019] （2）、结合
[0020] 将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的样本体积1/15~1/10的核酸提取磁珠、样本体积2倍的异丙醇，上下颠倒混匀，结合5～10 min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液；
[0021] （3）、洗涤
[0022] a、加入样本体积3~5倍的洗涤液Ⅰ，点振5～10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0023] b、加入样本体积2~3倍的洗涤液Ⅱ，点振5～10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0024] c、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min；
[0025] （4）、洗脱
[0026] 加入50~300μl的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65℃温浴10min，每隔2～3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
[0028] 制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
[0029] 进一步地，上述的步骤（1）裂解中，对于动植物组织之类的固体样本，先
研磨，离心取上清。
[0030] 由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
[0031] 本发明核酸提取磁珠的制备方法，其采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，利用超声辅助溶胶–凝胶法制备核酸提取磁珠，工艺流程简单，操作简便，适于批量化生产；制得的核酸提取磁珠，饱和磁化强度较高为43.0～74.5emu/g，剩磁和
矫顽力接近于零，能够在较小的磁场作用下达到快速彻底的固液分离效果，当撤去外加磁场后又能很快到分散到溶液中；制得的核酸提取磁珠，通过在Fe3O4纳米颗粒外表面包覆SiO2壳层，能很大程度地降低粒子的零电点和屏蔽磁偶极子的互相作用，使粒子具有良好的
水溶性、化学稳定性及生物相容性，且SiO2表面存在丰富的羟基，可使复合粒子容易进一步生物功能化，能够有效
吸附核酸，可用于提取含有常规量核酸（动植物、血液、细菌、质粒等）的生物检材，同时也能对含有痕量核酸（血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌、病毒等）的样本进行提取与纯化。
附图说明
[0032] 图1是本发明
实施例1中制备的纳米Fe3O4粒子的
磁滞回线；
[0033] 图2是本发明实施例1中制备的硅基磁珠在无磁场时在水中的悬浮状态图；
[0034] 图3是本发明实施例1中制备的硅基磁珠在外加磁场中放置后的分离效果图；
[0035] 图4是本发明实施例1中制备的硅基磁珠的磁滞回线；
[0036] 图5是本发明实施例1中制备的硅基磁珠的放大200倍光学
显微镜照片；
[0037] 图6是本发明实施例1中制备的硅基磁珠的TEM照片；
[0038] 图7是本发明实施例4中硅基磁珠应用于全血中核酸提取后基因组的琼脂糖凝胶电泳图像；
[0039] 图8是本发明实施例5中硅基磁珠应用于三叶草叶片中核酸提取后基因组的琼脂糖凝胶电泳图像；
[0040] 图9是本发明实施例6中硅基磁珠应用于人血清游离DNA提取后
荧光定量PCR扩增曲线图。
具体实施方式
[0041] 参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
[0042] 实施例一
[0043] 一种核酸提取磁珠的制备方法，包括以下具体步骤：
[0044] S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
[0045] 称取无水三氯化铁300g溶解于1L超纯水中，称取六水
硫酸亚铁铵392g溶解于1L超纯水中，把两种溶液转入5L反应釜中200r/min搅拌30min后，称取45g聚乙二醇-8000溶解于400ml超纯水中转入反应釜；通氩气除氧30min，调整反应温度为60℃，调整转速为500r/min，向溶液中滴加25％氨水至体系pH值为11,升温至80℃，调整转速为100r/min条件下反应3h；反应完毕后冷却至室温，停止搅拌关闭氩气，取出反应物，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物3次至洗涤液为中性，-10℃冷冻干燥48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
[0046] S2、纳米硅基磁珠的制备
[0047] 称取上述步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒100g分散到3L无水乙醇中，超声处理30min后，加入1L浓度为50 g/L乙二胺四乙酸钠的水溶液；200r/min搅拌30min后，向体系中加入质量浓度为25％氨水至体系pH值为10；再滴加体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液30ml，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为50℃，滴加完毕后反应3h；取出反应物，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用无水乙醇清洗3遍后，超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7，超声分散30min，分散在万分之二NaN3水中即得到硅基包被磁珠，将其固含量调整为100mg/ml。
[0048] 由图1中纳米Fe3O4粒子的磁滞回线可以看出，Fe3O4粒子饱和磁化强度M高为79.4emu/g，剩磁和矫顽力接近于0，为超顺磁性。
[0049] 图2是步骤S2制备的纳米硅基磁珠在无外加磁场时在水中的黑色悬浮状态；图3是步骤S2制备的纳米硅基磁珠在外加磁场时，纳米硅基磁珠与水快速分离，放置后的分离状态。
[0050] 由图4中纳米硅基磁珠的磁滞回线可以看出，纳米硅基磁珠饱和磁化强度M高为73.2emu/g，剩磁和矫顽力接近于0，为超顺磁性。
[0051] 由图5可以看出，纳米硅基磁珠在放大200倍的
光学显微镜下，呈现较好的分散性。
[0052] 由图6可以看出，纳米硅基磁珠在透射电镜下观察呈多分散状态。
[0053] 实施例二
[0054] 一种核酸提取磁珠的制备方法，包括以下具体步骤：
[0055] S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
[0056] 与实施例一中步骤S1相同；
[0057] S2、纳米硅基磁珠的制备
[0058] 称取上述步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒100 g分散到3L无水乙醇中，超声处理30min后，加入1L浓度为50 g/L柠檬酸三钠的水溶液；200r/min搅拌30min后，向体系中加入质量浓度为25％氨水至体系pH值为10；再滴加体积比为50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液100ml，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为30℃，滴加完毕后反应4h；取出反应物，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用无水乙醇清洗3遍后，超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7，超声分散30min，分散在万分之二NaN3水中即得到硅基包被磁珠，将其固含量调整为100mg/ml。
[0059] 实施例三
[0060] 一种核酸提取磁珠的制备方法，包括以下具体步骤：
[0061] S1、Fe3O4纳米颗粒的制备
[0062] 与实施例一中步骤S1相同；
[0063] S2、纳米硅基磁珠的制备
[0064] 称取上述步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒500 g分散到4L无水乙醇中，超声处理30min后，加入1L浓度为50 g/L乙二胺四乙酸钠的水溶液；200r/min搅拌30min后，向体系中加入质量浓度为25％氨水至体系pH值为10；再滴加体积比为50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液130ml，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为50℃，滴加完毕后反应5h；取出反应物，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用无水乙醇清洗3遍后，超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7，超声分散30min，分散在万分之二NaN3水中即得到硅基包被磁珠，将其固含量调整为100mg/ml。
[0065] 实施例四
[0066] 将上述实施例一中制得的纳米硅基磁珠应用于人全血基因组DNA的提取，具体步骤为：
[0067] （1）、裂解
[0068] 取150µl抗凝全血于EP管中，加入30µl的细胞裂解液、10μl蛋白酶K，混合均匀（可用漩涡
振荡器，1800rpm），再把EP管置于恒温水箱中70℃温育30min；
[0069] （2）、结合
[0070] 将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠10μl、异丙醇300μl，上下颠倒混匀5 min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液（吸净管盖及管底残液）；
[0071] （3）、洗涤
[0072] a、加入800μl洗涤液Ⅰ，点振10次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0073] b、加入500μl洗涤液Ⅱ，点振10次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0074] c、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min；
[0075] （4）、洗脱
[0076] 加入100μl的洗脱液，缓慢抽吸混匀，70℃温浴5min，每隔3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
[0077] （5）、电泳检测
[0078] 制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果，由图7可以看出，电泳图中条带均为平行样，提取结果批间差异小，产量及纯度高。
[0079] 实施例五
[0080] 将上述实施例一中制得的纳米硅基磁珠应用于植物基因组DNA的提取，具体步骤为：
[0081] （1）、裂解
[0082] 取新鲜三叶草叶片100mg，于研钵中稍加研磨至无
块状，加入400µl 细胞裂解液、5 µl 蛋白酶K、10 µl DTT，研磨均匀，然后转移至1.5ml EP管中，混合均匀（可用漩涡振荡器，1200rpm），再把EP管置于恒温水箱中65℃温育30min；
[0083] （2）、结合
[0084] 将EP管从温浴设备中取出，12000r离心10min；取200 µl上清，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠10μl、结合液200μl(也可加入200µl异丙醇，产量高于结合液，但是提取双子叶植物种子的核酸时，异丙醇的量为上清体积的0.6倍为宜)，上下颠倒混匀5 min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液（吸净管盖及管底残液）；
[0085] （3）、洗涤
[0086] a、加入500μl洗涤液Ⅰ，点振10次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0087] b、加入500μl洗涤液Ⅱ，点振10次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0088] c、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min；
[0089] （4）、洗脱
[0090] 加入100μl的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65℃温浴10min，每隔3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
[0091] （5）、电泳检测
[0092] 制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果，由图7可以看出，电泳图中条带均为平行样，提取结果批间差异小，产量及纯度高。
[0093] 实施例六
[0094] 将上述实施例一中制得的纳米硅基磁珠应用于人血清游离DNA的提取，具体步骤为：
[0095] （1）、裂解
[0096] a、对于易裂解样本，取200µl血清到1.5mlEP管中，加入200µl 细胞裂解液、10µl 蛋白酶K，混合均匀（可用漩涡振荡器，1800rpm），然后把EP管置于恒温水箱中80℃温育10min，每隔3min，混匀一次；b、对于难裂解样本，取300µl血清到1.5mlEP管中，加入200µl 细胞裂解液、10µl蛋白酶K，混合均匀（可用漩涡振荡器，1800rpm），然后把EP管置于恒温水箱中80℃温育10min，每隔3min，混匀一次；
[0097] （2）、结合
[0098] a、对于易裂解样本，将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠20µl、异丙醇100 µl；b、对于难裂解样本，将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠20µl、异丙醇150 µl；室温下颠倒混匀，结合5min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液（吸净管盖及管底残液）；
[0099] （3）、洗涤
[0100] a、加入800μl洗涤液Ⅰ，点振10次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0101] b、加入800μl洗涤液Ⅱ，点振10次（若磁珠有结块现象，加大震荡力度和洗涤时间，尽量使磁珠分散），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
[0102] c、将EP管置于磁力架上，晾干若干分钟，至没有乙醇
味道，一般为10min，根据室内温度和湿度可适当延长或缩短晾干时间；
[0103] （4）、洗脱
[0104] 加入100μl的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65℃温浴10min，每隔3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
[0105] （5）、电泳检测
[0106] 制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
[0107] 纳米硅基磁珠应用于人血清游离DNA提取后荧光定量PCR扩增数据，如以下表1所示，与之对应的荧光定量PCR扩增曲线图如图9所示，可以看出PCR扩增的效率高、CT值差异小。
[0108]
