一种核酸提取磁珠的制备方法及应用
专利汇可以提供一种核酸提取磁珠的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种核酸提取 磁珠 的制备方法，是将 磁性 纳米Fe3O4颗粒的表面包被一层 硅 羟基再分散到万分之二的NaN3 水 溶液中；制得的硅基磁珠为 核壳结构 ，包括Fe3O4纳米颗粒 内核 ，SiO2 外壳 层，SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面；硅基磁珠经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm~1μm，饱和磁化强度为43.0～74.5emu/g；制得的硅基磁珠应用于新鲜动物组织、动物组织 石蜡 切片、 植物 叶片 、 种子 、 全血 、血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌或病毒等 生物 检材中的核酸提取及纯化。本发明的工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产。，下面是一种核酸提取磁珠的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种核酸提取磁珠的制备方法，其特征是:其包括以下步骤: SUFe3O4纳米颗粒的制备 分别配制浓度为0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5~2.0混合；上述混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10-ΐ/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系温度60~70°C，再向混合液中滴加质量浓度为25%氨水至体系PH值为10~11，在温度为70~80°C条件下反应3~6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1%氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10~-20°C冷冻干燥24~48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒； 其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理Ih后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100~300nm，饱和磁化强度较高为57.4~79.4 emu/g ； S2、纳米硅基磁珠的制备 将步骤SI中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2~500g分散到0.1~3L无水乙醇中超声波处理30~60min后，加入20~1000ml浓度为10~50g/L的分散剂,搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25%氨水至体系PH值为10，再滴加0.25~500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴加速度为0.1~0.5ml/min，体系温度为30~50°C，滴加完毕后反应3~5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6~7，超声分散15~30min，分散在万分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
2.根据权利要求1所述的核酸提取磁珠的制备方法，其特征是:步骤S2中采用的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种组入口 ο
3.—种权利要求1所述的制备方法制得的核酸提取磁珠，其特征是:其为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒内核，SiO2外壳层，SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面；娃基磁珠经超声分散处理Ih后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm μ m,饱和磁化强度为 43.0 ~74.5emu/g ο
4.根据权利要求3所述的核酸提取磁珠，其特征是:无外加磁场时，呈黑色悬浮液状态，放置有永磁铁时，核酸提取磁珠能够与水快速分离。
5.一种权利要求3所述的核酸提取磁珠的应用，其特征是:其应用于新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、种子、全血、血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。
6.根据权利要求5所述的核酸提取磁珠的应用，其特征是:其应用于生物检材中核酸提取，包括以下步骤: (1)、裂解 取适量生物检材样本于EP管中，加入样本体积f 3倍的细胞裂解液、5~20 μ I蛋白酶K，混合均匀，再把EP管置于恒温水箱中65~80°C温育10~30min ； (2)、结合 将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的样本体积1/15~1/10的核酸提取磁珠、样本体积2倍的异丙醇，上下颠倒混匀，结合5~10 min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液； (3 )、洗漆 a、加入样本体积3飞倍的洗涤液I，点振5~10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液； b、加入样本体积2~3倍的洗涤液II，点振5~10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液； C、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min ； (4)、洗脱 加入50~300 μ I的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65°C温浴lOmin，每隔2~3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验； (5)、电泳检测 制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
7.根据权利要求5所述的核酸提取磁珠的应用，其特征是:步骤(1)裂解中，对于动植物组织之类的固体样本,先研磨,离心取上清。
—种核酸提取磁珠的制备方法及应用
技术领域
背景技术
SUFe3O4纳米颗粒的制备
分别配制浓度为0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为
1.5~2.0混合；上述混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10-ΐ/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系温度60~70°C，再向混合液中滴加质量浓度为25%氨水至体系PH值为10~11，在温度为70~80°C条件下反应3~6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为I %氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10~-20°C冷冻干燥24~48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理Ih后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100~300nm，饱和磁化强度较高为57.4~79.4 emu/g ；
S2、纳米硅基磁珠的制备
将步骤SI中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2~500g分散到0.1~3L无水乙醇中超声波处理30〜60min后，加入20〜IOOOml浓度为10〜50g/L的分散剂,搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25%氨水至体系PH值为10，再滴加0.25〜500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴加速度为0.1〜0.5ml/min，体系温度为30〜50°C，滴加完毕后反应3〜5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6〜7，超声分散15〜30min，分散在万分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
取适量生物检材样本于EP管中，加入样本体积f 3倍的细胞裂解液、5〜20 μ I蛋白酶K，混合均匀，再把EP管置于恒温水箱中65〜80°C温育10〜30min ；
(2)、结合
将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的样本体积1/15〜1/10的核酸提取磁珠、样本体积2倍的异丙醇，上下颠倒混匀，结合5〜10 min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液；
(3 )、洗漆
a、加入样本体积3飞倍的洗涤液I，点振5〜10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残
液；
b、加入样本体积2〜3倍的洗涤液II，点振5〜10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残
液；
C、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min ；
(4)、洗脱
加入50〜300 μ I的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65°C温浴lOmin，每隔2〜3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
图3是本发明实施例1中制备的硅基磁珠在外加磁场中放置后的分离效果图；
图4是本发明实施例1中制备的硅基磁珠的磁滞回线；
图5是本发明实施例1中制备的娃基磁珠的放大200倍光学显微镜照片；
图6是本发明实施例1中制备的硅基磁珠的TEM照片；
图7是本发明实施例4中硅基磁珠应用于全血中核酸提取后基因组的琼脂糖凝胶电泳图像；
图8是本发明实施例5中硅基磁珠应用于三叶草叶片中核酸提取后基因组的琼脂糖凝胶电泳图像；
图9是本发明实施例6中硅基磁珠应用于人血清游离DNA提取后荧光定量PCR扩增曲线图。
具体实施方式
SUFe3O4纳米颗粒的制备
称取无水三氯化铁300g溶解于IL超纯水中，称取六水硫酸亚铁铵392g溶解于IL超纯水中，把两种溶液转入5L反应釜中200r/min搅拌30min后，称取45g聚乙二醇-8000溶解于400ml超纯水中转入反应釜；通氩气除氧30min，调整反应温度为60°C，调整转速为500r/min，向溶液中滴加25%氨水至体系pH值为11，升温至80°C，调整转速为IOOr/min条件下反应3h;反应完毕后冷却至室温，停止搅拌关闭氩气，取出反应物，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为I %氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物3次至洗涤液为中性，-10°C冷冻干燥48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
S2、纳米硅基磁珠的制备
称取上述步骤SI中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒IOOg分散到3L无水乙醇中，超声处理30min后，加入IL浓度为50 g/L乙二胺四乙酸钠的水溶液；200r/min搅拌30min后，向体系中加入质量浓度为25%氨水至体系pH值为10 ;再滴加体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液30ml，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为50°C，滴加完毕后反应3h ；取出反应物，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用无水乙醇清洗3遍后，超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7，超声分散30min，分散在万分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，将其固含量调整为100mg/ml。
SUFe3O4纳米颗粒的制备 与实施例一中步骤SI相同；
S2、纳米硅基磁珠的制备
称取上述步骤SI中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒100 g分散到3L无水乙醇中，超声处理30min后，加入IL浓度为50 g/L柠檬酸三钠的水溶液；200r/min搅拌30min后，向体系中加入质量浓度为25%氨水至体系pH值为10 ;再滴加体积比为50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液100ml，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为30°C，滴加完毕后反应4h ;取出反应物，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用无水乙醇清洗3遍后，超纯水反复洗涤数次至洗涤液PH值为7，超声分散30min，分散在万分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，将其固含量调整为100mg/ml。
SUFe3O4纳米颗粒的制备 与实施例一中步骤SI相同；
S2、纳米硅基磁珠的制备
称取上述步骤SI中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒500 g分散到4L无水乙醇中，超声处理30min后，加入IL浓度为50 g/L乙二胺四乙酸钠的水溶液；200r/min搅拌30min后，向体系中加入质量浓度为25%氨水至体系pH值为10 ;再滴加体积比为50%正硅酸四乙酯的乙醇溶液130ml，控制滴加速度为0.5ml/min，体系温度为50°C，滴加完毕后反应5h ;取出反应物，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用无水乙醇清洗3遍后，超纯水反复洗涤数次至洗涤液pH值为7，超声分散30min，分散在万分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，将其固含量调整为100mg/ml。
为:
(1)、裂解
取150μ1抗凝全血于EP管中，加入30μ1的细胞裂解液、10 μ I蛋白酶K，混合均匀(可用漩涡振荡器，1800rpm),再把EP管置于恒温水箱中70°C温育30min ；
(2)、结合
将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠10 μ 1、异丙醇300 μ I，上下颠倒混匀5 min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液(吸净管盖及管底残液)；
(3 )、 洗漆
a、加入800 μ I洗涤液I，点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度)，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
b、加入500 μ I洗涤液II，点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度)，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
C、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min ；
(4)、洗脱
加入100 μ I的洗脱液，缓慢抽吸混匀，70°C温浴5min，每隔3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果，由图7可以看出，电泳图中条带均为平行样，提取结果批间差异小，产量及纯度高。
(1)、裂解
取新鲜三叶草叶片IOOmg,于研钵中稍加研磨至无块状,加入400μ1细胞裂解液、5 μL蛋白酶κ、10 μι DTT,研磨均匀，然后转移至1.5ml EP管中，混合均匀(可用镟润振荡器，1200rpm),再把EP管置于恒温水箱中65°C温育30min ；
(2)、结合
将EP管从温浴设备中取出，12000r离心10min ;取200 μL上清，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠10 μ 1、结合液200 μ I (也可加入200μ1异丙醇，产量高于结合液，但是提取双子叶植物种子的核酸时,异丙醇的量为上清体积的0.6倍为宜)，上下颠倒混匀5 min,将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液(吸净管盖及管底残液)；
(3 )、洗漆
a、加入500 μ I洗涤液I，点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度)，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
b、加入500 μ I洗涤液II，点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度)，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；C、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min ；
(4)、洗脱
加入100 μ I的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65°C温浴lOmin，每隔3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果，由图7可以看出，电泳图中条带均为平行样，提取结果批间差异小，产量及纯度高。
(1)、裂解
a、对于易裂解样本，取200μ1血清到1.5mlEP管中，加入200μ1细胞裂解液、ΙΟμΙ蛋白酶K，混合均匀(可用漩涡振荡器，1800rpm)，然后把EP管置于恒温水箱中80°C温育lOmin，每隔3min，混匀一次；b、对于难裂解样本，取300μ1血清到1.5mlEP管中，加入200μ1细胞裂解液、ΙΟμΙ蛋白酶K，混合均匀(可用漩涡振荡器，ISOOrpm)，然后把EP管置于恒温水箱中80°C温育IOmin,每隔3min,混匀一次；
(2)、结合
a、对于易裂解样本，将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠20μ1、异丙醇100 μL ;b、对于难裂解样本，将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的纳米硅基磁珠20μ1、异丙醇150 μL ;室温下颠倒混匀，结合5min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液(吸净管盖及管底残液);
(3 )、洗漆
a、加入800 μ I洗涤液I，点振10次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度)，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；
b、加入800 μ I洗涤液II，点振10次(若磁珠有结块现象，加大震荡力度和洗涤时间，尽量使磁珠分散)，然后磁分尚，吸净管盖及管底的残液；
C、将EP管置于磁力架上，晾干若干分钟，至没有乙醇味道，一般为lOmin，根据室内温度和湿度可适当延长或缩短晾干时间；
(4)、洗脱
加入100 μ I的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65°C温浴lOmin，每隔3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验；
(5)、电泳检测
制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。
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