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一种基于 H-NMR的甘松药材质量评价方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种药材质量评价方法，具体涉及
一种基于1H-NMR的甘松药材质量评价方法。
背景技术
[0002] 甘松为败酱科
植物甘松Nardostachys jatamansi Dc.的干燥根及根茎，味辛、甘，性温，具有理气止痛，开郁醒脾，外用祛湿消肿的功效，常用于
治疗脘腹胀满、食欲不振、呕吐等症。现代药理学研究表明，甘松药材具有抗
心律失常、
镇静、抗
癫痫、抗惊厥、抗抑郁、抗心肌缺血、降血压、解痉、抗菌等诸多作用。除药用外，在食品、
化妆品等领域也被广泛应用，具有较高的经济价值和开发前景。
[0003] 目前，已从甘松药材中分离得到多种化合物，按化学结构可分为萜类、黄
酮类、香豆素和木脂素类，此外还有糖类、无机元素等，其中萜类化合物是甘松药材的主要活性成分。目前，已有文献分别测定了甘松药材中的挥发油、
绿原酸、甘松新酮、无机元素等成分的含量，但这些方法大多仅测定了一种、二种或一类成分，而没有多类成分同时检测分析的报道，这显然不符合中药多成分、多靶点的整体性作用特征。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种基于1H-NMR的甘松药材质量评价方法，该方法解决了目前没有多类成分同时检测分析的方法，能够同时对多种甘松药材进行检测分析。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供了一种基于1H-NMR的甘松药材质量评价方法，该方法包含：
[0006] 以氘代甲醇为
频率内
锁，对不同产地的甘松药材进行1H-NMR检测，测定条件为：观察频率400.13MHz，测定
温度25℃，谱宽6393.9Hz，
采样时间2.56s，脉冲延迟时间2.0s，采样次数64次，脉冲宽度8.04μs，采用标准的预饱和脉冲序列压制残留的
水峰
信号；
[0007] 将测得的1H-NMR
自由感应衰减信号进行傅立叶转换，校正化学位移，对0.70～8.50ppm范围的图谱以0.002ppm为化学位移值单位进行分段积分并以总峰面积进行归一化处理，得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值；
[0008] 将各化学位移段中扣除甲醇
溶剂的信号和残留水峰信号，对扣除后的数据进行多变量统计分析：以扣除后的数据组成矩阵，该矩阵为甘松药材产地数*扣除后的化学位移段数，将该矩阵进行尺度同一化处理，进行主成分分析，根据第一主成分和第二主成分的得分图对不同产地的甘松药材进行分类。
[0009] 优选地，所述不同产地的甘松药材进行1H-NMR检测时，将药材粉末于氘代甲醇和氘代水中，密封，超声，过微孔滤膜，再进行1H-NMR测定。
[0010] 优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
[0011] 优选地，所述氘代水中含有12.32mg/mLKH2PO4和质量分数为0.04％的3-(三甲基
硅基)-2,2,3,3-四氘代丙酸钠盐。
[0012] 优选地，所述傅立叶转换采用MestReNova
软件。
[0013] 优选地，所述甲醇溶剂的信号在3.280～3.326ppm，所述残留水峰信号在4.69～5.03ppm。
[0014] 优选地，所述矩阵导入SIMCA-P软件进行主成分分析。
[0015] 优选地，所述矩阵采用中心化方法进行尺度同一化处理。
[0016] 本发明的基于1H-NMR的甘松药材质量评价方法，解决了目前没有多类成分同时检测分析的方法，具有以下优点：
[0017] (1)本发明的方法采用代谢组学技术，首次建立了甘松药材的1H-NMR指纹图谱，同时检测分析了甘松药材的整体化学成分，并且借助化学计量学方法对代谢组学产生的复杂数据进行
降维处理，简化变量，找出海量数据背后隐藏的特征性规律，最终达到对样本进行分类或判别并发现起关键作用的代谢标志物的目的；
[0018] (2)本发明的方法采用主成分分析，能将原始的多变量数据进行降维处理，重新组合成一组新的相互无关的变量来代替原来的变量，并从中取几个主要变量(主成分)尽可能充分地反映原来变量的信息。主成分分析在最大程度保留原数据信息的前提下，能简化数据结构，有利于观察不同样本数据的分布特征及变化规律；
[0019] (3)通过本发明的方法发现特征代谢标志物，对于甘松药材的质量评价和控制具有重要的意义。例如，甘松新酮今后可以作为甘松不同产地药材质量评价的指标。
附图说明
[0020] 图1为本发明的不同产地甘松药材代表性的一维1H-NMR谱图。
[0021] 图2为本发明的NJ-1甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0022] 图3为本发明的NJ-2甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0023] 图4为本发明的NJ-3甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0024] 图5为本发明的NJ-4甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0025] 图6为本发明的NJ-5甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0026] 图7为本发明的NJ-6甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0027] 图8为本发明的NJ-7甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0028] 图9为本发明的NJ-8甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0029] 图10为本发明的NJ-9甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0030] 图11为本发明的NJ-10甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0031] 图12为本发明的NJ-11甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0032] 图13为本发明的NJ-12甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0033] 图14为本发明的NJ-13甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0034] 图15为本发明的NJ-14甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0035] 图16为本发明的NJ-15甘松药材的一维1H-NMR谱图。
[0036] 图17为本发明的不同产地甘松药材的主成分分析的得分图。
[0037] 图18为本发明的不同产地甘松药材的主成分分析的
载荷图。
具体实施方式
[0038] 下面将对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039] 实施例1
[0040] 对不同产地甘松药材进行成分检测，不同产地甘松药材的来源具体如下表1，主要来自于四川省甘孜州，经鉴定为败酱科植物甘松Nardostachys jatamansi Dc.的干燥根及根茎。
[0041] 表1不同产地甘松药材的来源
[0042]
[0043] 该检测方法基于1H-NMR，具体检测方法包含：
[0044] 取干燥的药材粉末0.20g，精密称定，置于锥形瓶中，分别加入1mL CD3OD和0.3mL D2O溶液(内含12.32mg/mLKH2PO4和0.04％TSP)，密封，超声提取30min，取出，放冷，过0.45μm微孔滤膜，取0.60mL滤液至标准的5mm核磁管中，进行1H-NMR测定。
[0045] 以氘代甲醇为频率内锁，采用布鲁克Bruker400MHz
核磁共振波谱仪，测定条件为：观察频率400.13MHz；测定温度T＝25℃；谱宽Spectral Width＝6393.9Hz；采样时间Acquisition Time＝2.56s；脉冲延迟时间Relaxation Delay＝2.0s；采样次数Number of Scans＝64；脉冲宽度Pulse Width＝8.04μs；采用标准的预饱和脉冲序列(ZGPR)压制残留的水峰信号。
[0046] 将测得的1H-NMR自由感应衰减(free induction decay,FID)信号导入MestReNova(version 7.0,Mestrelabs Research SL,Santiago de Compostela,Spain)软件进行傅立叶转换，并手动调整
相位和基线，以TSP(3-(三甲基硅基)-2,2,3,3-四氘代丙酸钠盐，0ppm)为基准校正化学位移。对0.70～8.50ppm范围的图谱以0.002ppm为化学位移值单位进行分段积分(binning)，并以总峰面积进行归一化处理，然后以ASCII格式输出数据，即得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值。
[0047] 本试验共得到3900段积分，扣除23段属于甲醇溶剂的信号(3.280～3.326ppm)及170段残留水峰信号(4.69～5.03ppm)，最终得3707段数据，代表3707个变量进行多变量统计分析，15批甘松药材样本产生的3707段信号积分值，组成一个15×3707的数据矩阵，将获得的数据矩阵导入SIMCA-P软件(version 11.5)进行主成分分析，首先将数据采用Center方法进行尺度同一化处理，从而消除不同
代谢物尺度差异的影响，预处理后的数据再进行主成分分析。
[0048] 甘松不同产地药材代表性的一维1H-NMR谱见图1，采用加标准品定性试验及对比文献数据进行信号归属，最终从甘松药材提取物中共鉴定出8个化合物，包括绿原酸、甘松新酮、α-
葡萄糖、β-葡萄糖、
蔗糖、
醋酸、丁二酸、
甲酸，图1中信号归属为：1为绿原酸；2为甘松新酮；3为α-葡萄糖；4为β-葡萄糖；5为蔗糖；6为醋酸；7为丁二酸；8为甲酸。
[0049] 前述15批药材的1H-NMR代谢指纹图谱见图2-图16，依次为NJ-1至NJ-15的指纹图谱。
[0050] 前述主成分分析的得分图见图17(横坐标t[1]表示第一主成分，纵坐标t[2]表示第二主成分)，结果表明，前2个主成分的累积贡献率为60％(PC1＝42.5％，PC2＝17.5％)，由第一主成分(PC1，即第一维度)与第二主成分(PC2，即第二维度)的得分图可知，不同产地的甘松药材主要沿着PC1轴分为两大类，NJ-1、NJ-6、NJ-9、NJ-10、NJ-12、NJ-13聚为一类，NJ-2、NJ-3、NJ-4、NJ-5、NJ-7、NJ-8、NJ-11、NJ-14、NJ-15聚为另外一类。
[0051] 采用《中国药典》2015年版挥发油测定法测定了15批甘松药材的挥发油，结果见表1。挥发油测定结果表明，共有10批药材的挥发油含量符合《中国药典》标准(≥2.0％)，而其它批次药材的挥发油含量较低。基于1H-NMR代谢组学的PCA分类结果与挥发油测定结果基本一致，表明NJ-1、NJ-6、NJ-9、NJ-10、NJ-12、NJ-13批次的药材质量较差，而NJ-2、NJ-3、NJ-
4、NJ-5、NJ-7、NJ-8、NJ-11、NJ-14、NJ-15批次的甘松药材质量更好。
[0052] 为了找出引起差异的原因，发现关键的代谢标志物，进一步观察主成分分析的载荷图。从图18(横坐标p[1]表示第一主成分，纵坐标p[2]表示第二主成分)可知，甘松新酮和蔗糖成分是造成不同产地甘松药材分类的差异代谢物。同时，一些糖类成分也被发现贡献于分类，然而由于糖区信号高度重叠，很难明确
鉴别这些代谢物。
[0053] 本发明的方法采用代谢组学技术，首次建立了甘松药材的1H-NMR指纹图谱，同时检测分析了甘松药材的整体化学成分，并且借助化学计量学方法对代谢组学产生的复杂数据进行降维处理，简化变量，找出海量数据背后隐藏的特征性规律，最终达到对样本进行分类或判别并发现起关键作用的代谢标志物的目的。发现的这些特征代谢标志物对于甘松药材的质量评价和控制具有重要的意义。例如，甘松新酮今后可以作为甘松不同产地药材质量评价的指标。
[0054] 尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种
修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的
权利要求来限定。
