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具有增强的光学信号的微流体传感器

阅读:299发布:2022-01-16

专利汇可以提供具有增强的光学信号的微流体传感器专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本公开提供,除其他事项之外,用于检测液体中的分析物的微 流体 装置,其包括:基片;在基片的表面上的流体通道;和位于该通道的某一 位置 的纳米 传感器 ,该纳米传感器包括:纳米结构,该纳米结构包括至少一个纳米结构元件,每个元件包括至少两个由间隔分开的金属结构;和沉积在纳米结构的表面上的捕捉剂,其中该捕捉剂特异性结合分析物。当分析物结合于或接近捕捉剂时,纳米传感器放大照向和/或来自分析物的光 信号 、或照向和/或来自附接于分析物的 光标 记物的 光信号 。,下面是具有增强的光学信号的微流体传感器专利的具体信息内容。

1.一种用于检测液体中的分析物的微流体装置,其包括:
基片;
位于基片的表面上的流体通道;和
位于所述通道的某一位置的纳米传感器,该纳米传感器包括:
i.纳米结构,该纳米结构包括至少一个纳米结构元件,每个元件包括至少两个由间隙分开的金属结构,和
ii.沉积于该纳米结构的表面上的捕捉剂,其中该捕捉剂特异性地结合分析物;且其中当分析物结合于或接近于捕捉剂时,该纳米传感器放大照向和/或来自分析物的光信号,或放大照向和/或来自附接于分析物的光标记物的光信号
2.权利要求1的微流体装置,其中所述纳米结构元件包括:
i.自所述流体通道的壁的表面延伸出的电介质半导体或混合物突出部;
ii.在所述突出部顶上的金属帽;和
iii.位于所述突出部的底部的金属底板,该金属底板覆盖突出部底部附近的流体通道壁表面的至少一部分,且与所述金属帽隔开一定间隙。
3.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述纳米结构元件包括:
i.位于所述流体通道的壁上的平坦表面;
ii.覆盖该平坦表面的一部分的金属底板;
iii.在该金属底板顶上的电介质或半导体突出部,其占据金属底板表面的一部分;和iv.在该突出部顶上的金属帽,该金属帽与所述金属帽隔开一定间隙。
4.任一前述权利要求的微流体装置,其中每个纳米结构元件进一步包括至少一个所述突出部的侧壁上面的金属点结构,该金属点与所述金属帽或金属底板隔开一定间隙。
5.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述突出部的顶面具有选自下述形状组的形状:圆形,三形,多边形,椭圆形,长条形,或其任何组合。
6.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述金属帽具有与所述突出部基本上相同的横向几何特征。
7.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述突出部具有比所述光的波长小的横向尺寸和/或高度。
8.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述金属帽的横向尺寸在5nm至150nm的范围。
9.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述金属帽与所述金属底板之间的间隙在
0.1nm至60nm的范围。
10.任一前述权利要求的微流体装置,其中至少一个所述金属点结构具有在1nm至
25nm的范围的尺寸。
11.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述多个元件中最接近的两个突出部之间的间隔在2nm至200nm的范围。
12.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述金属帽和所述金属底板的厚度介于
5nm和80nm之间。
13.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述微流体通道的尺寸使得所述纳米传感器的顶面上的流体的总深度在2nm至50nm的范围。
14.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述微流体通道具有这样的横截面,使得所述纳米传感器的顶面上的总流体厚度在不到500μm的范围。
15.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述金属选自下述者构成的组:金、、铂、它们的合金,展现等离激元特性的半导体,及其组合。
16.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述微流体装置具有多于一个微流体通道。
17.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述流体通道在
(a)流体通道的同一或不同壁的不同位置处,和/或
(b)不同流体通道的不同位置处
具有多于一个纳米传感器。
18.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述微流体装置通过在一个微流体装置上设有并使用多于一个纳米传感器和/或多于一个微流体通道来同时和/或顺序检测和/或定量液体样品中的多于一种分析物。
19.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述微流体装置还包括所述纳米结构的表面上的粘附/间隔层,该粘附/间隔层连接该表面与捕捉剂。
20.权利要求19的微流体装置,其中所述粘附/间隔层具有0.5nm至50nm的厚度,且被选择以优化光信号的放大。
21.权利要求19的微流体装置,其中所述粘附/间隔层具有0.1nm至10nm的厚度,且被选择以优化光信号的放大。
22.权利要求19的微流体装置,其中所述分子粘附层的外表面包含捕捉剂反应性基团,其选自胺反应性基团、硫醇反应性基团、羟基反应性基团、咪唑基反应性基团和胍基反应性基团。
23.权利要求22的微流体装置,其中所述捕捉剂反应性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤素取代的苯酚酯、五氟苯酚酯、硝基取代的苯酚酯、酸酐、异氰酸盐或酯、异硫氰酸盐或酯、亚酸酯、来酰亚胺、碘乙酰基、酰肼、、或环化物。
24.权利要求19-23中任一项的微流体装置,其中所述分子粘附层通过金属-硫键附接于所述至少两个金属结构。
25.权利要求19-24中任一项的微流体装置,其中所述分子粘附层为单层烷硫醇或硫代-聚乙二醇。
26.权利要求19-24中任一项的微流体装置,其中所述分子粘附层通过链霉亲合素/生物素相互作用附接于所述至少两个金属结构。
27.权利要求19-25中任一项的微流体装置,其中所述分子粘附层的外表面包含生物素部分或链霉亲合素。
28.权利要求19-25中任一项的微流体装置,其中所述至少两个金属结构的外表面包含能够结合生物素化的捕捉剂的链霉亲合素基团。
29.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述至少两个金属结构的外表面包含能够结合连接有链霉亲合素的捕捉剂的生物素部分。
30.权利要求19-28中任一项的微流体装置,其中所述分子粘附层是自组装单分子层(SAM),其中SAM的每个分子包括三个部分:(i)对纳米装置的金属表面具有特异性亲和的头部基团,(ii)对捕捉剂具有特异性亲和力的末端基团,和(iii)连接头部基团和末端基团的接头,其中该接头的长度决定金属表面与附接的捕捉剂之间的平均间隔,且能影响纳米装置的光放大。
31.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述捕捉剂为蛋白质
32.权利要求31的微流体装置,其中所述捕捉剂为抗体
33.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述捕捉剂为核酸。
34.权利要求33的微流体装置,其中所述捕捉剂为寡核苷酸。
35.任一前述权利要求的微流体装置,其中所述突出部包括选自下述构成的组的电介质或半导体材料:聚合物二氧化、氮化硅、氧化铪、氧化铝、硅、砷化镓、和氮化镓。
36.一种用于检测和/或定量液体中的分析物的系统,其包括:
(a)权利要求1的微流体装置;
(b)微流体装置的保持件;
(c)用于从标记物激发光信号的激发源;和
(d)适用于读取光信号的读出装置。
37.权利要求36的系统,其中所述激发源为:光源,其选自激光器和发光二极管;电力源;或化学品源。
38.权利要求36或37的系统,其中所述读出装置选自光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或光学传感器,其能够生成来自所述纳米传感器的光的性质的零维、一维、二维、或三维信息。
39.权利要求36-38中任一项的系统,其中该系统的尺寸适合该系统作为手持装置使用。
40.权利要求36的系统,其中该系统与移动电话集成以处理或传送该系统获得的信息。
41.一种用于检测和/或定量液体中的分析物的方法,其包括:
(a)获得权利要求1的微流体装置;
(b)使液体在该微流体装置的流体通道中流动;
(c)使液体与流体通道中的纳米传感器上的捕捉剂接触,其中该捕捉剂特异性结合分析物,且其中接触是在适合于分析物特异性结合捕捉剂的条件下进行的;并
(d)读取来自结合于或接近于捕捉剂的分析物的光信号。
42.权利要求41的方法,其中检测和/或定量液体样品中的分析物是为了诊断人的疾病或状况,液体样品是自人获得的,分析物是与疾病或状况有关的生物标志物,纳米传感器的捕捉剂特异性结合生物标志物,来自保持结合于捕捉剂的生物标志物的光信号的读取指示人具有疾病或状况。
43.权利要求42的方法,其中所述疾病或状况为感染性疾病、寄生虫疾病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神病症或选自病和肾病的器官疾病。
44.权利要求41-43中任一项的方法,其中所述液体是自食品、环境、或人或非人动物获得的,其中所述分析物是与状况有关的标志物,所述捕捉剂特异性结合标志物,且该方法包括读取来自保持结合于捕捉剂的任何标志物分子的光信号,指示受试者的状况。
45.权利要求41-44中任一项的方法,其中该方法包括:a)检测、纯化和定量选自病毒、真菌和细菌的微生物,所述微生物已经自土壤、或选自组织或体液的生物学样品分离;
或b)检测或定量选自有毒废物、炭疽的对食品安全或国家安全造成威胁的化合物或生物学样品。
46.权利要求41-45中任一项的方法,其中该方法进一步包括在分析物结合于捕捉剂之前或之后用发光标记物标记分析物,所述标记是直接的或间接的。
47.权利要求46的方法,其中所述读取包括:激发发光标记物和读取光信号。
48.权利要求47的方法,其中所述激发是使用光、电流、化学反应、或其任何组合进行的。
49.权利要求48的方法,其中所述光信号选自下述者构成的组:冷发光荧光、电致发光、化学发光、及其组合。
50.权利要求47的方法,其中所述光信号为表面增强型拉曼散射
51.权利要求41-50中任一项的方法,其包括测量所述光信号的至少一种选自下述者构成的组的性质:光的强度、波长、和位置。
52.权利要求41-51中任一项的方法,其中所述分析物为蛋白质或核酸。
53.权利要求41-51中任一项的方法,其中所述分析物为化合物。
54.权利要求41-53中任一项的方法,其中所述捕捉剂对感兴趣的分析物具有特异性亲和力,且选自下述者构成的组:蛋白质、抗体、核酸、寡核苷酸或适体。
55.权利要求41-54中任一项的方法,其中所述分析物与选自下述者的疾病有关:癌症、神经病学疾病、心血管疾病、器官疾病、感染性疾病和寄生虫疾病。
56.权利要求41-54中任一项的方法,其中所述标记物以300nm至1200nm的范围内的波长发射光。
57.权利要求41-54中任一项的方法,其中该方法包括在接触步骤(c)之前封闭纳米传感器,由此防止捕捉剂非特异性结合非靶定的分析物。
58.权利要求46的方法,其中标记是通过使分析物结合检测剂来进行的,所述检测剂特异性结合分析物且在该结合之前与发光标记物连接。
59.权利要求58的方法,其中所述检测剂是连接于发光标记物的核酸。
60.权利要求41-59中任一项的方法,其中该方法包括在所述接触步骤(c)之前封闭纳米传感器,由此防止捕捉剂非特异性结合非靶定的分析物。
61.权利要求41-60中任一项的方法,其中所述液体样品包括羊水、房水、玻璃状液、全血、成分血、血浆、血清、母乳脑脊液(CSF)、耵聍(垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰、汗、滑液、泪、呕吐物、尿或呼气冷凝液。
62.权利要求41-61中任一项的方法,其中采用传感器来检测或定量(i)与疾病的阶段关联的化合物或生物分子,(ii)微生物,(iii)对食品安全或国家安全造成威胁的化合物或生物学实体,(iv)医学或生理学监控器中的生命参数,(v)生命参数为葡萄糖、血氧水平、或总血细胞计数,(vi)来自生物样品的特定DNA或RNA,(vii)测序及比较染色体或线粒体中的DNA中的遗传序列。
63.权利要求58的方法,其中所述检测剂为包含发光标记物的第二抗体。
64.权利要求58的方法,其中所述带标记的分析物是通过链霉亲合素/生物素相互作用连接于发光标记物的。
65.一种用于制造权利要求1的微流体装置的方法,其包括:
(a)在基片的表面上图案化至少一个突出部,该突出部在图案化之后占据所述表面的一部分;
(b)将金属材料层沉积到突出部的顶部和所述表面上未被突出部占据的区域,其中各沉积是平行地发生的;
(c)在突出部周围图案化微流体通道,其中该流体通道图案化在突出部图案化与金属沉积之前或之后,或部分在突出部图案化与金属沉积之前且部分在突出部图案化与金属沉积之后;
其中突出部和金属结构形成权利要求1中的微流体装置的纳米结构。
66.权利要求65的制造方法,其中所述金属材料的沉积进一步包括在与在突出部顶部和表面的开放区域上沉积金属材料相同的过程中,在突出部侧壁上沉积相同的金属材料。
67.权利要求65的制造方法,其中该制造方法进一步包括在图案化突出部之前在所述表面上沉积金属层。
68.一种用于制造权利要求1的微流体装置的方法,其包括:
(a)在基片的表面上沉积和图案化剥离模板层,该剥离层具有暴露基片表面的孔;
(b)自剥离模板的顶部沉积金属结构和电介质/半导体突出部所需的材料,沉积的材料的一部分在孔内部且接触基片表面,沉积的材料的一部分在剥离模板的顶面上且没有直接接触基片表面;
(c)在溶液中溶解剥离模板,其中沉积在剥离模板的顶部上的材料与基片分开,而沉积在孔内部的材料保留在基片上;
(d)在突出部周围图案化微流体通道,其中该图案化微流体通道图案化在溶解剥离模板之前或之后,或部分在溶解剥离模板之前且部分在溶解剥离模板之后。
69.权利要求65-68中任一项的制造方法,其中所述图案化方法包括纳米压印。
70.权利要求65-68中任一项的制造方法,其中该制造方法进一步包括在微流体装置中的纳米传感器上沉积用于感测分析物的捕捉剂,其中该沉积在图案化微流体通道之前或之后。
71.权利要求65-68中任一项的制造方法,其中在突出部图案化和金属沉积之后在突出部周围图案化微流体通道包括:(i)在另一基片上制造开放的微流体通道,(ii)接合该基片与具有突出部和金属材料的基片;其中各基片被对齐,且在接合之后,突出部位于微流体通道内部。

说明书全文

具有增强的光学信号的微流体传感器

[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月1日提交的序列号为61/708,314的美国临时申请的权益,通过本文中的提述收录该申请用于所有目的。
[0003] 关于得到联邦政府资助的研究的声明
[0004] 本发明是在美国政府的支持下由(美国)国防部高级研究计划局(DARPA)授予的基金号FA9550-08-1-0222资助而做出的。美国政府对本发明具有某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 人们对于增强发光信号(例如荧光信号)和检测灵敏度及缩短生物学和化学测定法的测试时间存在强烈的需求。本申请涉及用于实现性能增强(即冷发光放大和检测灵敏度改进)和测定时间缩短的微结构/纳米结构和分子层和微流体通道和方法,它们的制造和应用。
[0007] 发明概述
[0008] 本公开提供,除其他事项之外,用于检测液体中的分析物的微流体装置,其包括:基片;所述基片的表面上的流体通道;和位于所述通道的某一位置的纳米传感器,该纳米传感器包括:纳米结构,该纳米结构包括至少一个纳米结构元件,每个元件包括至少两个由间隙分开的金属结构;和沉积于该纳米结构的表面上的捕捉剂,其中该捕捉剂特异性结合分析物。当分析物结合于或接近于捕捉剂时,该纳米传感器放大去往和/或来自分析物或附接于分析物的光标记物的光信号。本公开还提供能与移动智能电话集成的便携式测定系统。微流体装置还提供比没有微流体通道的装置更短的测定时间和更小的样品体积。
[0009] 附图简述
[0010] 本领域技术人员将会理解,如下所述的附图仅用于说明目的。所述附图并不意图以任何方式限制本文教导的范围。有些附图并未依比例给出。
[0011] 图1A-1I示意性地示出了纳米流体装置的一些实施方案的各种特征。
[0012] 图2示意性地示出了一种示例性的抗体检测测定。
[0013] 图3示意性地示出了一种示例性的核酸检测测定。
[0014] 图4示意性地示出了另一实施方案的核酸检测测定。
[0015] 图5示意性地示出了一种示例性的自组装单层
[0016] 图6示意性地示出系统的一个实施方案。
[0017] 图7示意性地示出了系统的另一实施方案。
[0018] 图8示意性示出智能手机的实施方案。
[0019] 图9:装置结构及其制造过程。(a-b)装置架构;(c)通过纳米压印制造的铬(Cr)点阵列的电子扫描显微镜(SEM)图像;(d-e)底部传感器和通道层的制造;(f)中间的聚二甲基烷(PDMS)入口和出口层;(g)金(Au)蒸和全部三个层的接合。
[0020] 图10:(a)模型免疫测定实验的光学机构。激光束扫描面积为100μm×100μm;(b)-(c)荧光强度与浓度的关系。五参数逻辑回归模型显示,微流体通道装置中的D2PA的检测极限为850aM;玻璃参比的检测极限为2nM,96孔板测定中的D2PA的检测极限为1fM。
[0021] 图11A和11B:流体通道中的金纳米点的纳米压印形成图案的原理图。(a)涂覆有底层的二氧化硅(SiO2)/抗反射膜(ARC)的熔融石英基片;(b)通过光刻定义出的微流体通道;(c)在底层的二氧化硅/抗反射膜和熔融石英中图案化(patterning)的微通道,在这里光刻胶被除去;(d)涂覆在基片上的二氧化硅/抗反射膜的中间层;(e)第二次光刻,以定义出用于金纳米点的纳米结构窗口(nano-featuring patterning window);(f)通过反应离子刻蚀(RIE)转印到中间层二氧化硅/抗反射膜的纳米结构窗口;(g)基片上涂覆并平坦化的压印胶层;(h)通过纳米柱压印模具在压印胶中图案化覆盖以铬掩模的纳米孔;(i)通过蒸镀和剥离纳米柱在流体通道中图案化金纳米点。
[0022] 图12A:DNA分子的荧光增强。(a)等离激元(Plasmonic)纳米结构增强荧光以实现增强荧光激发辐射发射的示意图;(b)流体通道中的等离激元D2PA结构同时拉伸DNA和增强荧光的原理图,其中圆点指示出强荧光增强的热点。
[0023] 图12B:图案化流体通道中的等离激元金D2PA的原理图。a-b,通道中的D2PA阵列的设计横截面几何尺寸:(a)密封之前;(b)为增强DNA荧光而接合之后。c-j,制造示意图:(c)涂覆有二氧化硅/抗反射膜底层的熔融石英基片;(d)熔融石英中定义的微流体通道;(e)二氧化硅/抗反射膜的中间层;(f)第二次光刻和反应离子刻蚀,以在二氧化硅(中间叠层)中定义出D2PA结构窗口;(g)压印胶中UV压印出的纳米孔;(h)剥离后熔融石英上图案化的Cr纳米点;(i)熔融石英中的纳米柱蚀刻;(j)蒸镀金之后的D2PA阵列。
[0024] 图12C:流体通道中制造的纳米柱和D2PA纳米结构。a至b,在流体通道中选择性地图案化并且与通道边缘自对齐的纳米柱的侧视(45°)SEM图像,纳米柱的尺寸为高60nm、直径115nm。(c)连接到入口/出口及附属通道的通道中的纳米柱区域的光学图像。
d-e,制造的D2PA阵列的SEM图像:(d)具有10nm的垂直腔间隙、直径为145nm的D2PA阵列的高倍率45°侧视图,剖视图作为嵌入图显示;和(e)低倍率顶视图,显示出大面积均匀的纳米结构(patterning)。(f)金沉积之后流体通道中的D2PA阵列的光学图像。
[0025] 相应的附图标记在附图的全部若干图面中均指示相应的部件。应当理解的是,附图用于示出本公开中给出的构思,并且不是依比例给出的。
[0026] 在详细解释本发明的任何实施方案之前应当理解的是,本发明的应用不限于下文描述中陈述的或附图中图示的构造细节和部件布置。
[0027] 定义
[0028] 在更详细地描述例示性实施方案之前,列出下述定义,以说明并界定说明书中使用的术语的含义和范围。
[0029] 术语“分子粘附层”或“粘附/间隔层”指具有确定厚度的一层或多层分子,其包括附接于纳米传感器的内表面和能结合至捕捉剂的外表面。它还控制从金属至发光分子或材料的距离。
[0030] 术语“捕捉剂反应性基团”指分子中具有化学功能的部分,其对捕捉剂具有反应性,即,能与捕捉剂中的部分(例如羟基、硫氢基、羧基或胺基团)反应生成稳定的强(例如共价)键。
[0031] 如本文中使用的,术语“捕捉剂”指经由相互作用结合靶分析物的药剂,该相互作用足以允许该药剂结合该靶分子并从不同分子的异质混合物中浓缩该靶分子。结合相互作用通常由捕捉剂的亲和区介导。典型的捕捉剂包括任何能特异性结合靶分析物的部分。-6 -7 -8 -9 -10
某些捕捉剂以小于约10 M(例如小于约10 M、小于约10 M、小于约10 M、小于约10 M、小-11 -12 -16
于约10 M、小于约10 M、至低达10 M)的解离常数(KD)特异性结合靶分子,而与其它分子没有显著结合。例示性捕捉剂包括但不限于蛋白质(例如抗体)和核酸(例如寡核苷酸、DNA、RNA,包括适体)。
[0032] 术语“特异性结合”和“选择性结合”指捕捉剂优先结合存在于不同靶分子的异质混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用会区分样品中想要的(例如有活性的)和不想要的(例如无活性的)靶分子,通常大于约10至100倍或更多(例如大于约1000或10,000倍)。
[0033] 术语“蛋白质”指任何长度的基酸聚合物形式,即大于2个氨基酸、大于约5个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基酸,通常不大于约10,000个氨基酸,可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸,和具有经过修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白,包括但不限于:具有异源氨基酸序列的融合蛋白;具有异源或同源前导序列、带有或不带有N端甲硫氨酸残基的融合物;带免疫学标签的蛋白质;具有可检测的融合配偶的融合蛋白,例如包含荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶的融合蛋白;等等。这些术语还包括在细胞中经过翻译后修饰(例如糖基化、切割、分泌、异戊二烯化、羧基化、磷酸化、等)的多肽,具有二级或三级结构的多肽,和与其它部分(例如其它多肽、原子、辅因子等)强结合(例如共价或非共价)的多肽。
[0034] 术语“抗体”意图指免疫球蛋白或其任何片段,包括能够结合抗原的单链抗体和噬菌体展示抗体。
[0035] 术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用,描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度的聚合物,或合成生成的、能够与天然存在的核酸以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交(例如能参与Watson-Crick配对相互作用)的化合物(例如美国专利No.5,948,902及其引用的参考文献中记载的PNA)。
[0036] 如本文中使用的,术语“互补”指核苷酸序列通过氢键与感兴趣的靶核酸碱基配对。在规范的Watson-Crick碱基配对中,在DNA中,腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对,嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中,胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)替换。如此,A与T互补,而G与C互补。通常,“互补”指核苷酸序列与感兴趣的靶完全互补,使得序列中的每一个核苷酸与靶核酸中对应的位置上的每一个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列不是完全互补(100%互补性),但由于核苷酸序列的某些区段与非靶序列的互补性而仍然可以与非靶序列进行碱基配对时,可以计算百分比互补性以评估非特异性(脱靶)结合的可能性。一般而言,50%或更低的互补性不引起非特异性结合。另外,70%或更低的互补性在严格杂交条件下可能不引起非特异性结合。
[0037] 如本文中使用的,术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸构成的聚合物。
[0038] 如本文中使用的,术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
[0039] 如本文中使用的,术语“寡核苷酸”表示长约10个至200个核苷酸,直至300个核苷酸或更长,例如长至500nt或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的,而且在某些实施方案中,长度小于300个核苷酸。
[0040] 如本文中使用的,术语“附接”指一个分子与另一个分子的强(例如共价或非共价)键连接。
[0041] 如本文中使用的,术语“表面附接”指分子强附接于表面。
[0042] 如本文中使用的,术语“样品”涉及含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料混合物。在特定实施方案中,样品可以是自生物学样品获得的,生物学样品例如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳脑脊液(CSF)、耵聍(垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕(nasal drainage)和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液(rheum)、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。在特定实施方案中,样品可以是自受试者(例如人)获得的,而且可以在用于主题测定法之前进行加工。例如,在分析之前,可以在使用之前自组织样品提取蛋白质/核酸,提取方法是已知的。在特定实施方案中,样品可以是临床样品,例如自患者收集的样品。
[0043] 术语“分析物”指能被捕捉剂结合和检测的分子(例如蛋白质、核酸、聚合物或其它分子、它们的复合物或颗粒)。
[0044] 术语“测定”指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。
[0045] 如本文中使用的,术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用,包括定量和定性测定二者。
[0046] 如本文中使用的,术语“发光标记物”指当处于外部激发下时能发出光的标记物。这可以是冷发光(luminescence)。荧光标记物(其包括染料分子或量子点)和冷发光标记物(例如电致发光或化学发光标记物)是发光标记物的类型。外部激发对于荧光而言是光(光子)、对于电致发光而言是电流,对于化学发光而言是化学反应。外部激发可以是上述的组合。
[0047] 短语“带标记的分析物”指这样的分析物,该分析物被发光标记物可检测地标记,使得该分析物能够通过评估该标记物的存在来加以检测。带标记的分析物可以是被直接标记的(即,可以将分析物自身直接缀合于标记物,例如通过强的键,如共价或非共价键直接缀合于标记物),或者,带标记的分析物可以是被间接标记的(即,分析物被次级捕捉剂所结合,而次级捕捉剂是被直接标记的)。
[0048] 术语“杂交”指核酸与互补核酸经Watson-Crick碱基配对的特异性结合。因而,术语“原位杂交”指核酸与中期或间期染色体的特异性结合。
[0049] 就核酸而言,术语“杂交”和“结合”可互换使用。
[0050] 术语“捕捉剂/分析物复合物”是捕捉剂与分析物的特异性结合所导致的复合物。捕捉剂和该捕捉剂所针对的分析物通常会在“特异性结合条件”或“适合于特异性结合的条件”下彼此特异性结合,其中此类条件为那些容许捕捉剂和溶液中要结合的分析物之间发生结合的条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面)。此类条件(特别是就抗体及其抗原和核酸杂交而言)是本领域公知的(参见例如Harlow and Lane(Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel,et al,Short Protocols in Molecular Biology,5th ed.,Wiley&Sons,2002)。
[0051] 如本文中使用的,术语“特异性结合条件”指生成包含彼此特异性结合的成对分子的核酸双链体或蛋白质/蛋白质(例如抗体/抗原)复合物,同时不利于并非彼此特异性结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件是杂交和清洗条件二者的总和或组合(全体),而且在必要时可以包括清洗和封闭步骤。
[0052] 对于核酸杂交,特异性结合条件可以如下实现:于42℃在50%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt氏溶液、10%硫酸右旋糖酐、和20μg/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育,接着于约65℃在0.1x SSC中清洗滤膜。
[0053] 对于抗体结合抗原,特异性结合条件可以如下实现:在封闭溶液(例如含3%BSA或脱脂奶的PBS)中封闭含有抗体的基片,接着与在封闭缓冲液中稀释的含有分析物的样品一起温育。在该温育之后,在清洗溶液(例如PBS+TWEEN 20)中清洗基片并与捕捉第二抗体(检测抗体,它识别抗原中的另一位点)一起温育。捕捉第二抗体可以缀合有光学可检测标记物,例如荧光团,诸如IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800。再次清洗之后,可以检测结合的捕捉第二抗体的存在。本领域技术人员会知道可加以修改以提高检测到的信号及降低背景噪声的参数。
[0054] 术语“次级捕捉剂”(也可称作“检测剂”)指对抗原具有高度特异性亲和力的一组生物分子或化合物。次级捕捉剂可以与光学可检测标记物,例如酶、荧光标记物等强连接,或者次级捕捉剂自身可以被另一通过生物缀合而连接有光学可检测标记物的检测剂所检测(Hermanson,“Bioconjugate Techniques”Academic Press,2nd Ed.,2008)。
[0055] 术语“生物素部分”指包含生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧代生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等的亲和剂。生物素部分以至-8
少10 M的亲和力结合链霉亲合素。生物素亲和剂还可以包含接头,例如─LC-生物素、─LC-LC-生物素、─SLC-生物素或─PEGn-生物素,其中n为3-12。
[0056] 术语“链霉亲合素”指链霉亲合素和亲合素二者,以及它们的任何以高亲和力结合生物素的变体。
[0057] 术语“标志物”指这样的分析物,它在生物学样品中的存在或丰度与某种疾病或状况相关。
[0058] 术语“键”包括共价和非共价键,包括氢键、离子键和由范德华力生成的键。
[0059] 术语“放大”指信号的量级(magnitude)的增大,例如信号增大至少10倍、增大至少100倍、、增大至少1,000倍、增大至少10,000倍、或增大至少100,000倍。
[0060] 词语“检测”表示检测某物是否存在,以及定量地测量某物的量以提供绝对或相对值,例如相对于对照分析物的值。
[0061] 词语“一”表示一或多,即,“至少一(个/种)”,除非另外指明,例如通过使用词语“单(个/种)”。
[0062] 术语“在基片的表面上”表示蚀刻入基片的表面中,以及制造到基片的表面上。
[0063] 术语“剥离过程”表示如下过程,其中可溶解材料层被沉积在基片表面上,该材料具有暴露基片一部分的开口,然后在可溶解材料顶上以及在开口内部及基片上沉积不可溶解材料,但在开口的侧壁上很少沉积;溶剂去除可溶解材料及其顶上的不溶解材料,但不去除基片上的不可溶解材料。
[0064] 下述术语对可互换且指代同一主体:“液体”和“液体样品”;“突出部”和“柱”;“突出部高度”和“柱高度”;“帽”和“盘(碟)”。本公开文本中可能出现其他指代同一事物的成对术语。
[0065] 术语“层”表示连续或不连续膜的薄层。膜可以是多个离散的元件或分子,分子单层,而且可以只覆盖表面的一部分或仅覆盖特定类型的材料(例如金属而非电介质)。
[0066] 必须注意,如本文和所附权利要求书中使用的,单数形式“一”和“该”包括复数指称,除非上下文另外明确指明,例如在使用词语“单个/单种”时。例如,提到“一种分析物”包括单种分析物和多种分析物,提到“一种捕捉剂”包括单种捕捉剂和多种捕捉剂,而提到“一种检测剂”包括单种检测剂和多种检测剂。
[0067] 示例实施方案的详述
[0068] 下面详细的描述以举例的方式而不是以限制的方式示出了本发明的一些实施方案。
[0069] 本发明涉及能够利用光学手段增强对液体中的至少一种分析物的感测(检测和/或定量)的微流体装置及相关系统的结构、部件、系统、方法、制造和应用。分析物包括各种生物和化学材料。本发明中的微流体装置被称为“通过耦合的金属纳米结构增强的微流体传感器”(MOSEC)。
[0070] 更具体地说,本发明涉及的增强包括感测灵敏度的增加、感测时间的减少和/或感测成本、感测的简化、感测的多重化、易用性和有用性。在某些实施例中,该系统可以与智能手机通信,以促进用户和保健专业人员(例如,医生或临床医师或护士等)之间的沟通。
[0071] 本发明还涉及通过使用金属和电介质纳米结构、分子结合(免疫测定和核酸测定)以及微流体通道来提高测定的检测灵敏度和速度,以及减小装置尺寸和测试样品体积。
[0072] 本发明还涉及使用金属纳米结构(也称等离激元纳米结构)和电介质纳米结构放大(增强)去往和/或来自放置在纳米结构之上或接近于纳米结构的材料的光学信号(又称“光信号”)。
[0073] 本发明还涉及使用光源、光学系统和光学检测器检测光学信号,包括荧光、冷发光和拉曼信号。
[0074] 在WO2012/024006(通过提述并入本申请)中已经公开了在没有微流体通道的MOSEC感测元件的纳米传感器中使用的金属纳米结构和分子结合过程的某些方面。然而,如本发明中所公开的,通过大大减小纳米传感器的尺寸和形状、使纳米传感器与微流体通道集成、在单个芯片上集成多个传感器和多个微流体通道、使纳米传感器与智能手机集成等新设计,与单独的纳米传感器相比,可提供许多功能上和效用上的新优势。这些优势包括:(a)纳米检测器、测定和整个系统(包括光学激发和检测)的检测器形状因数小,(b)集成所致的噪音低且信号更好;(c)样品尺寸小;(d)在单个测试运行中检测液体中的多种分析物的测定多重化;(e)测定测试时间短得多,(f)成本低得多,可以在单片上规模制造以进一步降低成本;(g)使用方便,(h)人员可接近性大大提高;(i)可用于个人保健,(j)可以与移动智能电话一起使用,和(k)测试结果快速发送到专业人员或专业的数据库
[0075] 微流体装置
[0076] 参考各个附图,在此处公开了用于检测和/或定量液体中的至少一种分析物的微流体装置100,其包括基片110、在基片中或在基片表面上的流体通道120、位于该通道的一个位置的纳米传感器130。纳米传感器130包括一个纳米结构层132和沉积在纳米结构132的表面上的分子粘附层和附接的捕捉剂组合134。纳米结构层132包括一个或多个元件,每个元件包括至少两个由间隙分隔开的金属结构。捕捉剂特异性结合待检测和/或定量的靶分析物。当分析物结合于或接近于捕捉剂134时,微流体装置100的纳米传感器130放大去往和/或来自分析物的光信号,或去往和/或来自附接于分析物的光标记物的光信号。光信号与分析物的性质和/或光标记物的光信号有关。光信号可以是各种冷发光(例如,化学发光或电致发光、或荧光(光致发光)),或表面增强拉曼散射(SERS)。
[0077] 微流体装置100进一步包括供液体流入流体通道130的入口150,以及,作为可选项,过滤器和分离器140,用于液体的废液器160,和可选的液体出口170。
[0078] 光放大来自下列因素中的一个或几个:纳米传感器能够(a)有效地吸收光激发(例如,可激发荧光部分的波长的光),(b)将吸收的光聚焦至特定的位置,(c)将分析物放置到大部分光所聚焦的区域,和(d)从分析物被固定的位置处高效率地发射出分析物所产生的光。
[0079] 在一些实施方案中,不同的捕捉剂被附接于纳米传感器表面,每种捕捉剂被涂覆在表面的不同位置上,例如以阵列的形式,藉此提供对不同分析物的检测的多重化,因为每个位置是专用于捕捉特定类型的分析物的。
[0080] 在一些实施例中,主题纳米传感器可进一步包括特异性地结合于捕捉剂的带标记的分析物。如上述所指出的,带标记的分析物可以被发光标记物直接或间接地标记。在分析物被发光标记物间接标记的实施方案中,分析物可以结合于本身带光学标记的次级捕捉剂,也称为检测剂(例如,第二抗体或另一种核酸)。在某些情况下,次级捕捉剂可被称为“检测剂”。在一些实施方案中,选择分子粘附层和捕捉剂层的厚度以优化光信号的放大。
[0081] 在一些实施方案中,视需要,基片的表面可以是疏水的或亲水性的。在一些情况下,基片的表面可以由任何合适的塑料制成,例如,环烯共聚物(COC),聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA),聚酸酯(PC),环烯烃聚合物(COP),液晶聚合物(LCP),聚酰胺(PA),聚乙烯(PE),聚酰亚胺(PI),聚丙烯(PP),聚(亚苯基醚)(PPE),聚苯乙烯(PS),聚甲(POM),聚醚醚(PEEK),聚醚砜(PES),聚(邻苯二甲酸乙二醇酯)(PET),聚四氟乙烯(PTFE),聚氯乙烯(PVC),聚偏二氟乙烯(PVDF),聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT),氟化乙烯丙烯(FEP),全氟烷氧基烷烃(PFA)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。基片的主要功能是提供机械支撑;而基片的另外的功能是传输和/或操纵光、疏水性和亲水性表面的不同性能、热传导的控制及其他。该材料可以是任何合适的材料。
[0082] 流体通道
[0083] 流体通道130用于流动液体,该液体是测试样品、测试试剂(如检测蛋白质、检测核酸、光标记物、溶剂、封闭溶液等)。微流体装置100可以具有多个流体通道130。每个流体通道可以具有零个、一个、和多于一个纳米传感器130。为感测的需要,流体通道可以以不同的方向取向,并且可以彼此交叉。微流体装置可靠地执行基本的功能,例如通过使用或者系统来运输、混合、或者分离使用者所需的量的流体。为了操作微流体装置的阀或者泵装置,使用热、磁、电、或者气动方法。
[0084] 入口150是供液体进入流体通道用的。
[0085] 过滤器和分离器140是可选的,用于将靶分析物与可能干涉探测的材料分离。
[0086] 废液器160也是可选的,用于储存探测中的废液。
[0087] 出口170也是可选的,用于移除废液并易化液体在流体通道中的流动。易化包括控制液体流速。
[0088] 微流体通道可以处于封闭的形式,其中通道的所有壁都是封闭的(称为“封闭通道”);或处于开放的形式,其中通道的壁之一是打开的(称为“开放壁通道”),其中毛细力将流体保持在开放通道中。
[0089] 通道可具有任何合适的宽度和深度。为了减少测定时间,通道的高度,其定义为纳米传感器表面与其顶(即对面的壁)之间的距离,应该是小的。这是因为分析物是通过扩散移动到液体中的,并且分析物从液体中的位置扩散到固定在通道壁上的捕捉剂需要耗费时间。时间通常与距离的平方成正比。减小距离可以大大减少固定的捕捉剂捕捉分析物的时间,由此大大减少测定时间。为了缩短测定时间,优选的通道高度是从2nm到50微米(μm),尽管小于100mm、200mm和500mm的通道高度也应具有比传统的96壁板测定时间更快的优势。换句话说,微流体通道应该具有这样的横截面,使得纳米传感器的上表面上的总流体厚度处于2nm到50的范围内,或者如果可容忍更长的测定时间的话,则小于500微米。通道的高度和宽度两者均可影响液体的流速,应加以优化以获得理想的流速。通道高度常常被分析物捕捉时间所预先固定,此时可利用通道宽度来调整液体流速。
[0090] 流体通道和相关元件的实施方案包括而不限于下列选择。一个通道容纳多于一个纳米传感器,每一个传感器处于通道的一个不同位置并且可以涂覆有一种不同的捕捉剂来检测一种不同的分析物。多个通道被使用,它们中的每一个具有零个、一个或者多于一个纳米传感器。额外的流体通道被用于引入不同的试剂和溶剂。通道可在基片表面上以不同方向取向并且/或者相交,相交可导致两个通道连接,或者两个通道可交叉而不连接。通道和纳米传感器的数量与对不同分析物的检测的多重化有关。液体和试剂在多个通道中可并行或者顺序地流动。
[0091] 微流体通道的数量,用于给定的微流体通道的纳米传感器的数量,以及入口、出口、废液器、过滤器、分离器和片上流体控制器(on-chip controls)的数量取决于感测的需要和待感测的分析物的数量。
[0092] 在一些多通道微流体装置中,在微流装置100上需要流体控制装置,这些装置已在例如US20130244906、US20130244337、US20130244270、US20130240073、US20130239082、US20130236375和US20130230906中描述,这些公开文献通过提述并入本申请。
[0093] 纳米传感器
[0094] 参考各附图,特别是图1C、1H、1I、2-4,纳米传感器130包括纳米结构层132和沉积在纳米结构132的表面上的分子粘附层和附接的捕捉剂组合134。
[0095] 分子粘附层和附接的捕捉剂组合134常常以不连续膜的形式出现,可以是分子单层,并且可仅覆盖纳米结构132的一部分(例如仅纳米结构层的金属)。在一些实施方案中,分子粘附层和附接的捕捉剂组合134包括两个分立的材料不同的层,一层用于分子粘附,另一层用于捕捉剂。在一些实施方案中,分子粘附层和附接的捕捉剂组合134包括单独一种分子或化合物,其同时充当分子粘附层和附着的捕捉剂。也即,在某些情况下,捕捉层可具有分子粘附层的性质,从而无需分子粘附。
[0096] 纳米结构层132以及分子粘附层和附接的捕捉剂组合134在对去往和/或来自分析物的光信号,以及/或者去往和/或来自通过附着于分析物的光标记物的光信号的检测和放大中起许多作用。这些作用包括但不限于下述。捕捉剂134选择性地定位靶分析物,而让其他分子和/或材料流过。
[0097] 光放大来自一个或几个下列因素:纳米传感器能够(a)有效地吸收光激发(例如,可激发荧光部分的波长的光),(b)将吸收的光聚焦至特定的位置,(c)将分析物放置到大部分光所聚焦的区域,和(d)从分析物被固定的位置处高效率地发射出分析物所产生的光。纳米结构也具有使用它们的拓扑特征(形状,大小等等)来定位和过滤靶分析物的功能。
[0098] 纳米结构层
[0099] 参考图1C、1H和1I,此处公开纳米结构层132的几个实施方案。纳米结构层132的一个实施方案,称为“互补平面上盘天线”(disk-on-complimentary-plane antenna)(DcP)200(图1D),包括一个或多个纳米结构元件290。元件290进一步包括:电介质或半导体的突出部220,其自流体通道的壁的表面延伸;位于突出部220顶部的金属帽230;位于突出部的底部的金属底板230。金属底板覆盖位于突出部的底部附近的至少一部分流体通道壁表面;并且金属帽220和金属底板250通过一间隙(即间距)215分开。间隙215不需要是均匀的。在一些实施方案中,间隙(即间距)215只存在于帽与底板之间的某些位置,而在它们的另一些位置,帽和底板接触(即零间隙)。每个元件中的底板具有包围突出部的孔。各个元件290的底板250连接起来形成连续的金属膜,或基本上连接起来,或者是断开的。
[0100] 图1E显示了纳米结构层132的另一个实施方案,称为“盘耦合柱上点天线阵列(disc-coupled dots-on-pillar antenna arrays)(D2PA)”201,除了一个或多个纳米点240处于突出部220的侧壁上之外,其是与DcP 200相同的结构。D2PA201的纳米结构元件
291也显示在图1E中。
[0101] 纳米结构层132的另一个实施方案,示于图1F,称为“膜上盘天线阵列(disc-on film antenna arrays)(DoF)”300,包括:一个或多个纳米结构元件380,它们中的每一个还包括位于流体通道的壁上的平坦表面;金属性的平坦且显著连续的底板350覆盖该平坦表面的一部分;位于所述金属底板350之顶上的电介质或半导体突出部320,其占据该金属底板平面的至少一部分;位于突出部顶部的金属帽330;金属帽330和金属底板350由间隙(即间距)315分隔开。间隔315不需要是均匀的。在一些实施方案中,间隙(即间距)315只存在于帽和底板之间的某些位置,而在它们的另一些位置,帽和底板接触(即零间隙)。各个元件390的底板350连接起来形成连续的金属膜,或者基本上连接起来,或者是断开的。
[0102] 纳米结构层132的另一个实施方案,如图1G所示,称为“带点膜上盘天线阵列(Disc-on-film-with dots antenna arrays)(DoFD)”301,除了一个或多个纳米点340位于突出部320的侧壁上以外,其与DcP 300结构相同。DoFD 301的纳米结构元件391也显示在图1G中。
[0103] “盘耦合柱上点天线阵列(D2PA)”的例子已被描述(见,例如,Li等人,Optics Express 201119,3925-3936和WO2012/024006,通过提述并入本申请)。
[0104] 所有实施方案中的纳米结构元件的布置可以是周期性的或非周期性的,取决于感测性能、制造成本和待感测的光学信号。通常,对于检测光学信号增强而言周期性结构比非周期性的结构更好,但往往难以以良好的精度制造,或者制造起来成本高昂。
[0105] 此外,WO2012/024006描述了指定的参数,通过提述将其并入本申请。
[0106] 在一些实施方案中,突出部的一个或更多部分的尺寸或两个部件之间的距离可以小于被放大的光的波长。例如,突出部主体220的横向尺寸、突出部主体220的高度、金属帽230的尺寸、金属点结构240之间的任何间隙与间隙之间的距离、金属点结构240和金属帽
230之间的距离可小于被放大的光的波长。如图1A所示,突出部可以按照阵列的形式布置在基片上。在特定情况下,阵列中相距最近的突出部所间隔的距离可以小于光的波长。突出部阵列可以是周期性和非周期性的。
[0107] 纳米结构的例子
[0108] 在纳米传感器中的纳米结构使用类似的材料和尺寸。这里,我们用盘耦合柱上点天线阵列(D2PA)作为例子,它应适用于本文中描述的所有纳米结构。盘耦合柱上点天线阵列(D2PA)具有三维等离激元腔天线,所述天线具有和突出部主体上的纳米尺度金属点耦合的浮动的(floating)金属帽或纳米盘。具体地,在一些实施方案中,D2PA具有基片、基片上的突出部阵列、每个突出部顶上的金属帽或纳米盘、突出部的侧壁上的纳米金属点(帽与一些点之间有间隙,相邻的点之间有间隙)、以及覆盖大部分未被突出部占据的基片区域的金属底板。金属底板厚度的规格的一个不同是:考虑到光信号的等离激元放大,对实例DcP200和DoF300的厚度没有限制,但对D2PA 201和DoFD 301而言有限制。下面将讨论这些限制。
[0109] 主题纳米传感器中可以采用的示例D2PA的详细描述在WO2012/024006中提供,通过提述将其并入本申请用于所有目的。
[0110] 在一个实施方案中,在由硅形成的基片上用SiO2制造突出部阵列,阵列周期(pitch)m、高度130nm、直径70nm。金属底板可自利用电子束蒸镀沿法线方向沉积在突出部阵列结构和基片上的40nm厚金层形成。沉积工艺在每一个SiO2突出部顶上形成金的金属帽,同时在硅基片的表面上形成金纳米孔金属底板。每个帽的厚度为40nm,直径约110nm。在整个蒸镀工艺过程中,沉积速率大约为0.4A/s,金原子扩散到SiO2突出部的侧壁上并聚集成颗粒尺寸为10nm到30nm之间的随机粒子,形成纳米尺度的金属点。
[0111] 通过蒸镀工艺形成具有金纳米帽、随机金纳米粒子金属点和底部金纳米孔板(底板)的基片。金纳米粒子分散在SiO2突出部的侧壁上,形成纳米尺度的金属点,它们之间具有约0.5nm-20nm的狭窄间隙,这可引起高度增强的电场。如在此所使用的,术语“间隙”定义为两个结构之间的最小间隔,例如两个帽之间的最小间隔或帽与相邻的点结构之间的间隔。还应指出,即使点的一部分与另一个点接触,本结构获得的增强效果仍然存在,因为还有其他的间隙存在于其他位置的相邻结构之间。
[0112] D2PA结构可通过等离子体共振和纳米天线增强光吸收。该结构可以通过帽和纳米点之间的纳米间隙以及纳米点彼此之间的纳米间隙,在帽和底板之间形成的垂直腔(对于光)和由帽阵列形成的横向腔的帮助下,增强局部电场。
[0113] 更具体地,该结构可通过纳米突出部阵列增强光吸收,并可通过这些结构增强来自表面的光学信号的反射。它可具有由帽通过点和底板形成的增强的垂直腔光吸收效应以增强光吸收。它也可以具有通过金属底板的横向腔光吸收效果以增强光吸收。本领域技术人员将会认识到,任何特定的D2PA结构可具有这些功能中的一种、几种或全部,这取决于该结构的具体构造,包括突出部阵列的间隔、突出部的大小、帽的大小、点的大小和采用的材料。
[0114] 该结构对光学信号的增强将会是来源于该结构的特征之间的纳米间隙、来源于等离激元共振、来源于天线吸收、来源于天线辐射、来源于垂直腔、以及来源于横向腔的增强的综合效应(product)。可以从另一不同的度来看D2PA结构的元件和功能。帽和底板中的孔、帽与邻近的金属点之间以及各点彼此之间的间隙(即间距)可以影响该结构所提供的局部电场增强。每个突出部主体上的点的位置和点的数量也可以增强局部电场。每个突出部的直径和帽(capping cap)的直径可影响等离激元共振频率。二氧化硅突出部的高度可以影响腔的长度和纳米间隙的数量,也会影响帽与金底板的耦合。每个晶胞(unit cell)的突出部的数量可以影响到有效面积,并且在突出部阵列中的周期(间隔)可影响对光的相干吸收和辐射。金底板可以影响天线和腔,并且突出部的形状可以决定光依赖性吸收。
[0115] 在结构中,多个变量可以被“调谐”以增强信号。例如,可以变化帽的直径和突出部的形状来改变等离激元共振频率,金属点会影响局部的信号增强,以及每个突出部主体上的帽-点间隙、点的位置和点计数;突出部的高度会影响谐振腔长度和现有纳米间隙的数量,以及帽和金属底板之间的耦合效果。在结构的表面上的每个晶胞的突出部的总数量定义出有效面积,并且突出部的间距(跨距)影响光学能量的相干吸收和辐射。最后,金属底板的材料及厚度与天线和腔的作用有关。本领域技术人员会认识到,这些变量中的每一个均可按照本文所示的示例实施方案所要求地加以改变,来实现具有期望的特性的结构或“调谐”以实现具体的增强,而不脱离本发明的范围。
[0116] 设想了用于所述结构的各种构造。例如,D2PA结构在金属底板下方可具有SiO2层,其连续地形成突出部。另外,D2PA具有无孔的金属底板,使得突出部直接形成在底板材料上,而底板材料则沉积于底下的基片上的SiO2层之上。
[0117] 当构建本公开的D2PA结构时,底下的基片的材料可以是绝缘体、半导体或电介质绝缘体。基片不需要是单片性的,而可以具有叠层构造,包括绝缘体或半导体材料顶层(紧邻突出部的层),而基片的其余部分由任何固体材料制成。
[0118] 在基片的顶层上的突出部主体可以由绝缘材料形成,但可以是半导体。用于形成突出部的示例性材料是电介质:二氧化硅、氮化硅、氧化铪(Hf)、氧化(AlO),或半导体:硅、GaAs、GaN。一旦形成,突出部的侧壁可以为柱状(直的)、倾斜的、弯曲的,或它们的任何组合。每个突出部的高度可以从5nm到7000nm选择,并且每个突出部的横向尺寸可以从
5nm到8000nm选择。突出部的顶面的形状可以是圆形、尖的(金字塔)、多边形、椭圆形、长条形、多边形、其他类似的形状或它们的组合。阵列中的突出部之间的间隔可以是周期性的或非周期性的。对于某些应用,周期性的周期是优选的,并且对周期加以选择以最大化光吸收和辐射,这依赖于光波长。阵列中的相邻突出部之间的间隔(周期)可以从4nm到
4000nm。
[0119] 每个突出部的顶上具有金属帽,其可由:(a)单种金属元素,如金、、铝、镍;(b)多层的组合和/或多层的单种金属;(c)金属合金;(d)半导体,(e)任何其他产生等离激元的材料,或(f)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何组合。每个帽的形状可以是圆形的、尖的(如金字塔或锥形)、多边形、椭圆形、长条形、多边形、其他类似的形状或它们的组合。每个帽的形状可以与其设置所在的相关突出部的顶面的形状相同或不同。优选地,每一帽的横向尺寸从4nm到1500nm,但在一些实施方案中,为4nm到150nm,且帽的厚度为从1nm到
500nm,但在一些实施方案中,1至80nm是优选的。金属帽的直径可以大于或小于支撑突出部的直径。取决于工作波长,直径可以从0到200nm变化。
[0120] 设置于每个突出部的金属帽和金属底板之间的侧壁上的金属点的形状是近似球形、盘状、多边形、长形、其他的形状、或它们的组合。金属点的尺寸优选为1nm到200nm之间,不过在一些实施方案中,1nm到100nm是优选的,并且可以在三个维度上不同。点的确切尺寸可以就具体的光信号加以选择,并且可以为了制造的便利性以及制造点之间的相关间隙而加以调节。
[0121] 在一些实施方案中,相邻的金属点之间的间隙以及帽与邻近的金属点之间的间隙是0.1nm~200nm之间,但优选的范围为0.1nm到60nm。对于许多应用,优选小的间隙以增强光学信号。突出部上的各个金属点之间的间隙可以变化。
[0122] 在实施方案中,金属底板定义出基片上的一个金属层,每个突出部具有一个孔。金属底板的厚度被选择为从1nm到2000nm,其中50nm~200nm范围内的厚度是优选的。金属底板的材料可从与形成上述金属帽相同的材料组中选择,但对于给定的D2PA结构,金属底板可由与形成帽的材料相同或不同的材料形成。
[0123] 上面对D2PA结构的描述系示例说明可以采用的材料、形状和尺寸的范围,但这些不被认为是排他的。可以根据需要使用其他的材料、形状和尺寸,以实现期望的增强效果。对于每个D2PA结构而言,将根据由待增强的光吸收(波长,偏振)、待增强的光辐射和/或待增强的局部电场所造成的特定要求来确定确切的材料、形状和尺寸。
[0124] D2PA阵列可以用以下方法制造。第一步是提供具有一层突出部材料(如二氧化硅)的基片。下一步是采用刻印压印工艺来将具有突出部图案的模具压印到沉积在突出部材料层上方的压印胶层中。在将图案压印到压印胶而生成蚀刻掩模之后,通过蚀刻处理除去残留的材料,留下压印胶的突出部状结构的图案。随后将一层蚀刻掩模材料,如铬(Cr)或其他材料,沉积在突出部状结构的图案上方,并且除去剩余的压印胶,得到直接沉积在突出部材料层上的Cr图案。最终的蚀刻步骤,其可以是干刻(如回刻)或湿刻工艺,除去突出部材料的未受保护的部分,并且留下布置在基片表面上的突出部阵列。可选地通过干刻或湿刻工艺移除任何剩余的蚀刻掩模材料(Cr),采用蒸镀工艺以大致平行的沉积方式在结构上沉积金属底板材料、帽材料和金属点。
[0125] 本领域技术人员将认识到,各刻印步骤可以使用任何类型的已知刻印方法,包括电子束刻印、离子束刻印、光刻、或纳米压印刻印技术,来形成抗蚀剂材料中的图案。同样地,应认识到,蚀刻掩模材料可以是金属电介质或绝缘体。
[0126] 蚀刻掩模材料可以在实施刻印步骤之前或之后沉积在胶层上。如果在刻印步骤之后沉积蚀刻掩膜材料,则通常将使用剥离工艺。或者,如果首先使用纳米压印刻印步骤来生成纳米压印胶结构,则可以随后将蚀刻掩模材料沉积到所生成的沟槽中,然后实施剥离工艺。其他制作D2PA阵列的方法是可能的。
[0127] 通过对D2PA结构的各种参数进行操纵,可操纵波长从约100nm到约8000nm不等的光。
[0128] 增强结构可以构造成具有对待检测的光的波长特异的一个或多个特征。这些特征包括材料的选择、纳米尺度突出部高度、纳米尺度突出部侧壁形状、纳米尺度金属帽形状、纳米尺度金属点构造间隔、金属材料、和金属底板构造。纳米尺度金属点结构间隔的选择还包括:选择相邻的纳米尺度金属点结构之间的间隙距离和/或选择纳米尺度金属帽与相邻的纳米尺度金属点结构之间的间隙间隔。
[0129] 纳米尺度结构的基片可以是电绝缘体、电介质绝缘体或半导体。可选地,基片可以是叠层结构,其中位于基片表面的层是电绝缘体或半导体;并且其中在表面层下方的基片主体由任何固体材料组成。
[0130] 突出部主体可以由绝缘体或半导体形成,并且其顶部具有选自圆形、尖状、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或它们的任意组合的形状组的形状。突出部的侧壁表面可以为柱状的、倾斜的、或弯曲的。优选地,突出部具有在5nm至7000nm范围内的高度以及在5nm至8000nm范围内的直径。可选地,突出部可以是从基片的表面延伸的突出部阵列的一部分,且相邻突出部之间的间隔在2nm到4000nm的范围内。突出部的阵列可以定义出一个周期性阵列,其选用与选定波长相关的间距,以便利用纳米尺度结构最大化光吸收或辐射。
适于在纳米尺度结构上形成突出部的材料包括二氧化硅、氮化硅、氧化铪、氧化铝、硅、砷化镓、氮化镓。
[0131] 纳米尺度结构的金属帽在突出部的顶上由金属(如金、银、铜、铝、它们的合金或它们的组合)形成。金属帽的表面不必是均匀的,可具有任何构造,如圆形、尖状、多边形、椭圆形、条形或它们的组合。优选地,金属帽的横向尺寸的范围是从5nm至1500nm,而金属帽的垂直厚度的范围是从1nm至500nm。
[0132] 设置在纳米尺度结构的突出部侧壁上的金属点结构各自具有从大致球状、圆形、多边形、细长形或它们的组合的形状组中选择的形状,并且具有范围为1nm至600nm的尺寸,不过在一些实施方案中,1至60nm是优选的。同一突出部上的金属点结构与金属帽之间的间隙在0.5nm至600nm的范围,相邻金属点结构之间的间隙也是如此。
[0133] 纳米尺度结构的金属底板可被构造成具有孔,突出部主体从基片表面延伸通过所述孔,或者纳米尺度结构的金属底板可以是基本连续的,突出部主体设置在其上。优选地,金属底板的厚度从1nm到2000nm,例如,从50nm到200nm,并且由从金、银、铜、铝、它们的合金、或它们的组合组成的金属组中选择的金属所构成。金属底板可由与金属帽相同或不同的材料形成。
[0134] 本公开的纳米尺度结构可以通过各种方法制成。制造用于增强局部电场、吸收光或辐射光的纳米尺度结构的示例性方法包括以下步骤:提供包括绝缘或半导体材料的外表面的基片;在外表面上形成具有在5nm至7000nm范围内的高度以及在5nm至8000nm范围内的横向尺寸的突出部阵列;施加导电材料到突出部的顶上及底下的基片;并且同时(或随后)在突出部侧壁上沉积导电点结构。突出部的阵列由包括电子束刻印、离子束刻印、光学刻印或纳米压印刻印的工艺形成。
[0135] 在一个被构造为用于增强~800nm波长的光的实施方案中,D2PA纳米结构可以由周期性非金属(例如电介质或半导体)突出部阵列(200nm的跨距和~100nm的直径)、位于每个突出部顶上的金属盘(~135nm的直径)、位于突出部的底部的金属底板、随机分布在突出部壁上的金属纳米点、以及这些金属部件之间的纳米间隙构成。盘阵列和底板(均为55nm厚)形成可以高效地垂直和横向捕获激发光的三维空腔天线。取决于突出部的几9
何特征,每个突出部具有约10至50个纳米点;并且突出部密度为2.5×10个突出部/平方厘米。
[0136] 该装置可构造成检测波长在400至1000nm范围内的光。在某些实施方案中,纳米点的平均直径处于1nm至25nm的范围,且纳米点之间的间隙、以及纳米点与纳米盘之间的间隙可处于1nm至10nm的范围内。金属选自金、银、铜、铝、它们的合金、以及上述的组合。突出部的顶部具有选自下组的形状:圆形、多边形、锥形、椭圆形、长条形、或它们的任何组合。金属帽的横向尺寸的范围是从5nm到150nm。金属帽和金属底板间隔的距离为0.1nm到60nm的范围。至少一个金属点结构具有1nm到25nm范围内的尺寸。金属点结构与金属帽之间的距离、以及金属点结构与金属底板之间的距离间隔0.5nm到50nm范围内的距离。
[0137] 在具体的实施方案中,多个突出部中的两个最接近的突出部之间的间隔处于2nm到200nm的范围内。突出部具有柱状的、倾斜的或弯曲的侧壁表面。金属帽与金属底板的厚度为5nm至60nm。突出部具有小于光波长的横向尺寸或高度。金属帽具有大致与突出部相同的横向几何特征。突出部包括选自下组的电介质或半导体材料:聚合物、二氧化硅、氮化硅、氧化铪、氧化铝、硅、砷化镓、氮化镓。金属帽的横向尺寸小于光的波长。
[0138] 分子粘附层和附接的捕捉剂
[0139] 参考图2-5,分子粘附层和附接的捕捉剂组合134在一些实施方案中包括两个不同材料的分立层:分子粘附层136和附接的捕捉剂;而在一些其它实施方案中,包括同时充当分子粘附层和附接捕捉剂的单独一种分子或化合物。也即,在某些情况下,捕捉层可具有分子粘附层的性质,从而无需分子粘附。分子粘附层136可以仅覆盖纳米结构132的一部分并且可以对纳米结构132的材料而言是可选的(例如仅纳米结构层的金属)。捕捉剂可以附接于分子粘附层136的一部分。
[0140] 参考图2和3,捕捉剂的实例是抗体202或核酸500。捕捉剂也可为抗原。参考图4,核酸分子502具有功能基团,可以在没有额外的分子粘附层的条件下直接附接于纳米结构132的金属,因此发挥分子粘附层和捕捉剂二者的功能。
[0141] 如图1I所示的是如何在分子粘附层136上施加抗体捕捉剂202、捕捉目标分析物204以及使用检测剂208标记分析物的过程。
[0142] 分子粘附层136覆盖底下的D2PA的金属表面的至少一部分。分子粘附层具有两个目的。首先,分子粘附层充当间隔物。为了获得最佳的荧光,发光的标记物(例如,荧光团)不能太接近金属表面,这是因为无辐射过程会淬灭荧光。发光的标记物也不可以离金属表面太远,因为这会减少放大。理想的是,发光的标记物应与金属表面处于最佳距离。其次,分子粘附层提供良好的粘附来将捕捉剂附接于纳米传感器上。良好的粘附是通过分子粘附层的分子中具有反应性基团而实现的,这些反应性基团在一侧与捕捉剂具有高亲和力而在另一侧与纳米传感器具有高亲和力。
[0143] 参考图2和3,分子粘附层的外表面136包括捕捉剂反应性基团,即,可以与捕捉剂起化学反应的反应性基团,例如,胺反应性基团、硫醇反应性基团、羟基反应性基团、咪唑反应性基团和胍基反应性基团。为说明目的,分子粘附层136覆盖金属点结构250、金属帽230和金属底板250的所有暴露表面。然而,在一些实施方案中,粘附层136只需要覆盖金属点阵结构250、金属帽230或金属底板250的暴露表面的仅一部分。如图所示,在某些情况下,基板110可以由电介质(例如,二氧化硅)制成,虽然可使用其他材料,例如硅、砷化镓、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。同样,金属可以是金、银、铂、钯、铅、、镍、铜、铝、它们的合金或它们的组合,虽然可以使用其他材料,只要材料的等离子体频率高于光信号以及用于产生光信号的光的频率。
[0144] 分子粘附层(MAL)136可以有许多不同的构造,包括(a)交联分子的自组装单层(SAM),(b)多分子层薄膜,(c)(a)和(b)的组合,和(d)捕捉剂本身。
[0145] 在MAL的实施方案(a)中,其中分子粘附层136是交联分子或配体的自组装单层(SAM),SAM的每个分子由三部分组成:(i)头部基团(head group),其与纳米传感器的表面具有特异性的化学亲和力,(ii)末端基团,其与捕捉剂具有特异性的亲和力,和(iii)分子链,它是连接头部基团与末端基团的长分子系列,并且其长度(该长度决定金属与捕捉剂间的平均间距)可以影响纳米传感器的光放大。这样的SAM如图3所示。
[0146] 在许多实施方案中,附接在金属表面的头部基团属于硫基,即-SH。附接于金属表面的头部基团的其它的选择是羧酸(-COOH)、胺(C=N)、硒醇(-SEH)或膦(-P)。其他的头部基团,如硅烷(SiO),可以使用,如果要在电介质材料或半导体(如硅)上涂覆单层的话。
[0147] 在许多实施方案中,末端基团可包括各种捕捉剂反应性基团,包括但不限于,N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤素取代的苯酚酯、五氟苯酚酯、硝基取代的苯酚酯、酸酐、异氰酸盐或酯、异硫氰酸盐或酯、亚氨酸酯、来酰亚胺、碘乙酰基、酰肼、醛、或环氧化物。其他合适的基团在本领域是已知的,并可例如Hermmanson,“Bioconjugate ndTechniques”Academic Press,2 Ed,2008中所描述的。末端基团可在它们组装到纳米传感器表面之后化学附接到分子链,或在它们组装到表面之前与分子链在一起合成。
[0148] 其他的末端基团是羧基-COOH基团(用EDC/NHS活化以与配体上的–NH2形成共价结合);胺,-NH2,基团(通过用EDC/NHS活化的酰胺键与配体上的-羧基形成共价结合);环氧,与–NH2反应(不需要交联剂的配体);醛,(与配体上的–NH2反应而不需要交联剂);硫醇,-SH,(通过类似SMCC的生物缀合手段连接配体上的–NH2);以及谷胱甘肽,(GHS)(理想地用于捕捉GST标记蛋白质)。
[0149] 分子链可以是碳链,可以调整其长度来改变发光标记物与金属之间的距离,以便优化光信号。在一个实施方案中,如将在例子中详细描述的,SAM层是二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯),其头部基团是通过硫金键与金表面结合的–SH,而末端基团是结合捕捉剂的伯胺位点的NHS酯,以及长度1.7nm的分子烷烃链。
[0150] 在许多实施方案中,连接头部基团和末端基团的分子链是烷烃链,其仅由碳原子和氢原子组成,所有的键均是单键,并且碳原子不联合成环状结构,而是形成简单的线性链。分子链的其它选择可以是来自聚合物,如聚(乙二醇)(PEG)、聚(乳酸)(PLA)等等的配体。分子链与头部基团所附接的金属表面以及末端基团所附接的捕捉剂均无化学反应性。链的长度,其决定分析物与纳米传感器表面的距离,可以加以优化以获得最大的信号放大。如下面将更详细地描述的那样,分子链可具有例如0.5nm到50nm的厚度。
[0151] 在主题纳米传感器中使用的分子粘附层可以由这样的自组装单层(SAM)组成,其一侧牢固地附接到金属(通过例如硫原子)并且在另一侧(外部)以捕捉剂反应性基团为末端,所述捕捉剂反应性基团例如胺反应性基团、硫醇反应性基团、羟基反应性基团、咪唑反应性基团和胍基反应性基团。单层可具有疏水性或亲水性表面。最常用的捕捉剂反应性基团是NHS(其为胺反应性)和马来酰亚胺(其为巯基反应性),但许多其他的也可使用。
[0152] 在一些实施方案中,分子粘附层可以是烷硫醇的自组装单层(见,例如,Kato Journal of Physical Chemistry 2002106:9655-9658),聚乙二醇硫醇(见,例如,Shenoy et al Int.J.Nanomedicine.20061:5157),芳香硫醇,或某些其他的以硫醇为末端的链。
[0153] 硫醇基可以使用的原因是(a)硫醇硫与金及其他金属相互作用以形成牢固和稳定的键(见,例如,Nuzzo et al.,J.AM.Chem.Soc.1987109:2358-2368);和(b)范德华力使烷烃与其他链堆积,导致SAM自发组织(见,例如,Love et al.,Chem.Rev.2006105:1103-1169)。此外,末端基团可供用于直接附接捕捉分子或进一步的化学修饰。
[0154] 在一些实施方案中,可以使用烷硫醇。据估计,在烷硫醇的拥挤单层中有4×10142
个烷硫醇分子/cm(Nuzzo等人,J.Am.Chem.Soc.1987109:733-740),这大约相当于对底下的表面上的每个金原子一个烷硫醇键。由烷硫醇组成的自组装单层可通过将金基片浸泡在烷硫醇溶液中来产生(见,例如,Lee et al.Anal.Chem.2006,78:6504-6510)。金与还原的烷硫醇(SH基团)和烷基二硫化物(-S-S-)均能够反应(见,例如,Love et al.Chem.Rev.2005,105:1103-1169)。
[0155] 一旦制得聚乙二醇硫醇或烷硫醇的自组装单层膜,则有多种策略可以用来将捕捉剂连接到自组装单层。在一个实施方案中,捕捉剂,如链霉亲和素(SA),可以附接到SAM,用来固定生物素化捕捉剂。
[0156] 在一个实施方案中,链霉亲和素(SA)本身可以用作SAM的功能基团(如末端基团),以交联与SA具有高亲和力的捕捉剂分子,如生物素分子,包括肽、寡核苷酸、蛋白质和糖。
[0157] 亲合素、链霉亲合素的功能基团与生物素基团具有很高的亲和力,形成亲合素-生物素。这样的高亲和力使亲合素/链霉亲合素能够良好地充当功能基团、且生物素基团充当互补功能基团结合。这些功能基团可以将分子粘附层结合到纳米传感器、在分子粘附层和捕捉剂之间结合并将发光标记物结合到次级捕获剂。在一个实施方案中,含巯基反应性基团的分子粘附层可通过将金表面连接到胺末端的SAM,并使用磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸(磺基SMCC)进一步修饰所述胺基团产生马来酰亚胺活化表面。马来酰亚胺活化的表面是反应性硫醇基团,而且可用于连接含有硫醇(例如半胱氨酸)基团的捕捉剂。
[0158] 在另一个实施方案中,可以通过例如在琥珀酰亚胺基烷基二硫化物,诸如二硫代双-磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯(DSP)或二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)的1-10mM溶液中浸泡金基片来生成含有胺反应性基团(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))的分子粘附层(参见例如Peelen et al J.Proteome Res.20065:1580-1585和Storri et al Biosens.Bioelectron.199813:347-357)。
[0159] 在另一个实施方案中,可使用以羧基为末端的SAM诸如12-羧基-1-十一烷硫醇来生成含有胺反应性基团(NHS)的分子粘附层。在这种情况中,可以在1-乙基-3(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDC)存在下将SAM的表面连接至NHS以生成与伯胺形成稳定酰胺键的中间体(参见例如Johnsson et al Anal.Biochem.1001,198:268-277)。
[0160] 在另一个实施方案中,分子粘附层可含有蛋白A,蛋白A以高亲和力结合IgG,其它免疫球蛋白形式(例如IgE)的Fc区。
[0161] 在另一个实施方案中,可以通过与具有羧基末端的SAM与1,1’-羰基二吲哚(CDI)反应来添加吲哚基团(其与胺也有反应性)。
[0162] 在另一个实施方案中,可使用具有醛末端的链烷硫醇单层来固定化蛋白质和具有胺为末端的DNA寡核苷酸二者,而且可以在氮川三乙酸(NTA)修饰的金表面上固定化带his标签的融合蛋白。
[0163] 可以将硫醇反应性基团连接至合成的DNA和RNA寡核苷酸,包括适体;具有硫醇末端的适体能容易地商业合成。也可以将硫醇反应性基团连接至含有半胱氨酸基团的蛋白质,例如抗体。可以将硫醇化分子附接于马来酰亚胺修饰的表面(参见例如Smith et al Langmuir 2002,19:1486-1492)。在某些情况下,可以使用插在末端Cys后面的氨基酸间隔物(例如Ser-Gly-Ser-Gly),其相对于缺乏间隔物的肽提高结合的量。对于寡核苷酸,可使用烷烃间隔物。按照相同方式可以将合成的含有末端硫醇的碳水化合物与金拴系。
[0164] 胺反应性基团能与伯胺(诸如赖氨酸残基上的游离胺)形成键。除蛋白质以外,胺反应性表面还可用来固定化其它生物分子,包括含有赖氨酸残基的肽和合成具有胺末端的寡核苷酸。
[0165] 在MAL(b)的实施方案中,其中分子粘附层136是多分子层薄膜,该分子可以通过物理吸附或强结合而涂覆在D2PA纳米传感器上。在一个例子中,可以将蛋白A涂覆在D2PA纳米传感器表面的全部或部分区域上,在这种情况下,蛋白A可以通过物理吸附过程沉积,具有4纳米到5纳米的厚度。在另一个例子中,该层可为聚合物的薄膜,所述聚合物如聚乙二醇(PEG),其在一端具有功能性头部基团,如巯基(-SH)。该功能PEG分子层与D2PA纳米传感器的表面形成强键。PEG分子层的厚度可以通过改变PEG聚合物链的长度来调整。另一个例子是无定形的SiO2薄膜,其使用物理或化学沉积方法(例如蒸镀、溅射、溶胶-凝胶法)附接到D2PA纳米传感器表面。在沉积过程中可以精确控制SiO2薄膜的厚度。
[0166] 在MAL(c)的实施方案中,其中分子粘附层136是多分子层薄膜和SAM的组合,可以首先沉积SAM层,再沉积多分子层。
[0167] 在一个例子中,分子粘附层可首先含有链霉亲合素单层,接着是与链霉亲合素具有高结合亲和力的分子的其它层,所述分子诸如生物素、生物素化分子,包括肽、寡核苷酸、蛋白质、和糖。
[0168] 在一个例子中,分子粘附层可含有SAM层二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)(DSU)和蛋白A层。DSU SAM层通过硫-金键结合纳米传感器的金属表面,而且具有NHS-酯末端基团,后者结合蛋白A上的伯胺位点。在特定情况中,捕捉抗体通过它们的Fc区与DSU顶上的此类蛋白A双层接合。蛋白A能确保抗体的取向,以改善捕捉效率。
[0169] 在MAL(d)的实施方案中,其中分子粘附层136本身是捕捉剂,捕捉剂具有这样的头部基团,该头部基团与主题纳米传感器(即D2PA)的金属或突出部侧壁具有高亲和力。常用头部基团之一是硫醇反应性基团。硫醇反应性基团可以连接至合成的DNA和RNA寡核苷酸,包括适体;具有硫醇末端的适体能容易地从商业渠道获得。硫醇反应性基团也可以连接至含有半胱氨酸基团的蛋白质,例如抗体。使用MAL自身作为捕捉剂的另一个例子是抗体片段层,例如半IgG、Fab、F(ab’)2、Fc。抗体片段通过位于铰链区中的硫醇-内肽酶直接与金属表面接合。该实施方案在图4中示出。在这个实施方案中,核酸包括直接结合到纳米传感器的头部基团。其余的步骤如描述的那样进行。
[0170] 分子吸附层厚度应在0.5nm到50nm范围内,例如,1nm到20nm。分子粘附层的厚度可以针对特定的应用来优化,通过例如增加或减少使用的SAM的接头(烷烃或聚(乙二醇)链)的长度来优化。假设接头中的每个键为0.1到0.15nm,那么最优的SAM可包含5至50个碳原子(例如,在某些情况下,10至20个碳原子)的聚合物接头。
[0171] 可通过捕捉剂与分子粘附层表面上的捕捉剂反应性基团之间的反应将捕捉剂附接到分子粘附层,来制作纳米传感器。
[0172] 可以通过任何方便的方法,如上面所讨论的那些方法,来将捕捉剂附接到分子粘附层。在许多情况下,可通过高亲和力强相互作用,如生物素和链霉亲和素之间高亲和力强相互作用,来将捕捉剂附接于分子粘附层。因为链霉亲和素是蛋白质,可以使用任何上述的胺反应性方法将链霉亲和素连接到分子粘附层的表面。可以通过将生物素化的捕捉剂点样到链霉亲和素上而将它们固定。在其它实施方案中,可以通过形成强键的反应,例如蛋白质的赖氨酸残基中的胺基团或胺化寡核苷酸与NHS酯在捕捉剂和分子粘附层之间产生酰胺键的反应,将捕捉剂附接于分子粘附层。在其它实施方案中,可以通过蛋白质的半胱氨酸残基中的巯基或巯基-寡核苷酸与分子粘附层上的巯基反应性马来酰亚胺之间的反应将捕捉剂附接于分子粘附层。将捕捉剂与各种反应性基团连接的规程是本领域众所周知的。
[0173] 在一个实施方案中,捕捉剂可以是捕捉蛋白的核酸,或捕捉剂可以是捕捉核酸(例如,DNA,RNA)的蛋白质。核酸能经由序列特异性(紧密)或非序列特异性(松散)的键来结合蛋白。
[0174] 在某些情况下,可以使用如下方法制造主题纳米传感器:(a)在基片的顶面上图案化至少一个突出部;(b)沉积顶面的金属材料层;(c)让沉积在突出部顶上的金属材料形成帽,沉积在突出部底部的金属材料形成金属底板,沉积在侧壁上的金属材料形成至少一个金属点结构;而且,如上所述,(d)在沉积的金属材料的顶上沉积分子粘附层,其中分子粘附层覆盖金属点结构、金属帽和/或金属底板的至少一部分,其中分子粘附层的外表面包括捕捉剂反应性基团。
[0175] 此外,(a)中的图案化包括直接压印(模压)材料,所述材料的电性质可以是为电介质或半导体,并可以是聚合物或由单体或低聚物固化形成的聚合物,或无定形无机材料。该材料可以是厚度从10纳米到10毫米的薄膜,或带有基片的多层材料。压印(即模压)意指:模具在其表面上具有结构,将模具压入要压印的材料中,在该材料中形成该结构的反向结构(inverse)。基片或顶上的压印层可以是塑料(即聚合物),例如聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、其他的丙烯酸树脂和相似材料。
压印可以使用滚筒刻印机通过筒对筒的技术完成。这样的处理,具有很大的经济优势,从而降低成本。
[0176] 微流体装置的制造
[0177] 可以各种方式制造微流体装置100。在此处给出一些例子。制造微流体装置的关键部件的一种方法包括:(a)在基片表面上图案化至少一个突出部,在图案化之后,所述突出部占据表面的一部分;(b)沉积金属材料层到突出部的顶上以及未被突出部占据的表面区域,其中各沉积平行地发生;(c)围绕突出部图案化微流体通道,其中微流体图案化在突出部图案化和金属沉积之前或之后,或部分在突出部图案化和金属沉积之前、部分在突出部图案化和金属沉积之后;其中突出部和金属结构形成微流体装置的纳米结构。
[0178] 上述的制造方法,其中金属材料的沉积还包括,在与突出部顶上和表面开放区域上的沉积的相同的工艺中,在突出壁侧壁上沉积相同的金属材料。权利要求4的制造方法,其中,制造方法还包括在图案化突出部之前在表面上沉积金属层。
[0179] 制造微流体装置100的关键部件的另一种方法包括:(a)在基片的表面上沉积并图案化剥离模板层,剥离层具有露出基片表面的孔;(b)从剥离模板的顶部沉积金属结构和电介质/半导体突出部需要的材料,所沉积的材料的一部分在孔内并与基片表面接触,并且沉积材料的一部分位于剥离模板的顶面并且不直接与基片表面接触;(c)在溶液中溶解剥离模板,其中,沉积在剥离模板的顶部的材料与基片分离,而沉积在孔内的材料被保留在基片上,(d)围绕突出部图案化微流体通道,其中图案化是在溶解剥离模板之前或之后,或部分在溶解剥离模板之前、部分在溶解剥离模板之后。
[0180] 在上述两种制造方法中,图案化方法均包括纳米压印,并且制造方法还包括将用于感测分析物的捕捉剂沉积在微流体装置中的纳米传感器上,其中沉积是在图案化微流体通道之前或之后。此外,在上面的制造中,在突出部图案化和金属沉积之后,围绕突出部图案化微流体通道包括:(i)在另一基片上制造开口微流体通道,(ii)将基片与突出部和金属材料接合;其中,在接合后,基片对齐并且突出部位于微流体通道内部。
[0181] 系统
[0182] 参考图5,还提供了系统400,其包括:主题纳米传感器、用于纳米传感器的保持件(未示出)、从标记物(即发光标记物)诱发光信号的激发源410;和适于读取光信号的读取器420(例如光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或能够产生纳米传感器的表面的二维光谱图的成像装置)。容易想到的是,该系统还可以具有放大、过滤、调节、控制和存储来自读取器的电信号并控制读取器和样本保持件的位置的电子器件、计算机系统软件和其它硬件。样品保持件的位置可以沿一个或所有三个正交方向移动,以容许读取器扫描来自样品的不同位置的光信号。
[0183] 激发源可以是(a)光源,例如,波长适于激发特定荧光团的激光器和带有用于选择波长的滤光器的灯或发光二极管;或(b)电源,用于提供电流,以从纳米传感器激发出光(当使用电致化学发光标记物时可采用)。图6和7中示出了一个示例性系统。参考图6和7,激发系统可以包括激光器、激光光学器件(包括扩束器、透镜、反射镜和激光带通滤波器)、读取器(例如,具有CCD传感器的分光计),其它光学器件(例如,长波通滤波器、分束器和透镜),以及用于纳米传感器的保持件。在某些情况下,保持件可以在具有X-Y和Z运动的机动台上。
[0184] 在特定情况下,激光带通滤波器过滤掉波长与激光器不同的光,且长波通滤波器将会仅允许从光学可检测标记物发出的光穿过。由于不同的荧光标记物吸收处于不同的光谱范围的光,应选择荧光标记物使其峰值吸收波长与激光激发波长匹配,以达到最佳的量子效率。在许多实施方案中,从纳米传感器上的荧光标记物发出的光信号的波长比激光器波长长至少20纳米。因此应该调谐纳米传感器的等离激元共振以覆盖荧光标记的吸收峰、发射峰和激光激发波长。在一些实施方案中,激发和荧光的波长范围可以从100nm至20000nm。优选的范围是从300nm到1200nm。600-850nm的范围是优选的,原因是背景噪声低。
[0185] 系统,其中激发源来自由光源(激光器和发光二极管)、电力源(electrical source)(例如电源(power supplies))和化学来源(如化学制品)构成的组。
[0186] 系统,其中,读取器选自光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或光学传感器,所述光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或光学传感器能够产生来自纳米传感器的光的性质的零、一、二、或三维信息。
[0187] 与移动智能电话集成的系统
[0188] 本发明中的检测器和系统可以适用于手持系统,例如蜂窝电话或智能电话(图8)。系统具有手持电话的尺寸,并且系统可以完全处于电话或电话的一部分的内部。微流体装置可以制造在大小为现今手机的SIM卡的典型大小的小盒上。集成的光学元件也具有类似于SIM卡的尺寸。(需要给出SIM卡和检测器的尺寸)发光二极管(LED)可以用作照明源、以及薄膜光滤波器和CCD检测器。整个系统可以安装在蜂窝电话内部,或者作为独立的芯片载体,同时使用蜂窝电话的电源、信号和计算能力。此外,系统可以使用蜂窝电话的远程通信系统,将信号发送到医院、医生和必要的位置,甚至直接发送到计算机系统中。整个装置可以用一只手握持,优选具有人手掌那样的大小。
[0189] 迅速的优势的原因是它具有非常小的横截面,并且捕捉剂对分析物的捕捉取决于通道的横截面(给出通道的横截面)。此外,微流体通道易于多重化,以便于同时测量许多不同的分析物。它也有助于将原来需要占用桌面设备的整个系统集成为手持式或口袋大小的仪器。这种集成将大大减少光感测的噪声并改善它的信号。它使用起来也非常方便,并且成本低。它可与蜂窝电话一起使用,因此,可以有更多不易应用的应用。它将使更多的人以低成本更容易且方便地使用,并允许更多的人使用传感器。因此它提供更易于使用。低噪声意味着在桌面系统中可能有来自大系统中的漏光、振动和光散射的噪声。通过使用集成系统,噪声可以被消除,因为成本低是来自几个方面的。其中之一是,这些芯片可以以单片方式制造,并且至少一部分组件可以单片地制造并且可以是非常便宜的材料。使用面积也要小得多,成本降低。
[0190] 系统与移动电话集成以处理或传递通过该系统获得的信息。集成装置,系统(a)使用智能电话的硬件或软件的某些部分,和/或(b)被内置为该电话的一部分,或部分内置在电话中,或者完全分开,但仍手持。
[0191] 测定方法
[0192] 主题微流体装置可用于检测样品中的分析物。一种用于感测和/或定量液体中的一种或多种分析物的方法包括:(a)提供微流体装置100;(b)使液体在微流体装置的流体通道中流动;(c)使液体与流体通道中的纳米传感器上的捕捉剂接触,其中该捕捉剂特异性结合分析物,且其中接触是在适合于分析物特异性结合捕捉剂的条件下进行的;并(d)读取来自结合于或接近于捕捉剂的分析物的光信号。在上述步骤(a)中,在接合于捕捉剂之前,可以用或不用发光标记物标记分析物(也称作直接或间接标记)。在接合之前不用发光标记物标记分析物的实施方案中,分析物在接合于捕捉剂之后,可结合于自身被光学标记的第二捕捉剂(即检测剂)(例如第二抗体或另一核酸)、经过标记的次级捕捉剂或经过标记的检测剂(此类过程也称作间接标记分析物)。在使用间接标记的感测中,在上述读取步骤(b)之前去除未结合分析物的经过标记的次级捕捉剂。在使用直接标记的感测中,在上述读取步骤(b)之前,去除未结合分析物的光学标记物。
[0193] 在读取测定上的发光标记物的过程中,对发光标记物施加激发(光、电、化学或其组合),并检测光的特性,包括强度、波长、和位置。
[0194] 在某些实施方案中,该方法包括将捕捉剂附接于主题纳米传感器的分子粘附层以生成纳米传感器,其中该附接是通过如上文描述的捕捉剂与分子粘附层上的分子中的捕捉剂反应性基团的化学反应进行的。接下来,该方法包括使含有靶分析物的样品与纳米传感器接触,该接触是在适合于特异性结合的条件下进行的,靶分析物特异性结合捕捉剂。这个步骤之后,该方法包括去除任何未结合于捕捉剂的靶分析物(例如通过在结合缓冲液中清洗纳米传感器的表面);然后,添加缀合有光学可检测标记物的检测剂以检测靶分析物。去除未结合靶分析物的检测剂之后,可以将纳米传感器与读取系统一起使用,以读取来自保持结合于纳米传感器的检测剂的光信号(例如波长在300纳米至1200纳米的范围中的光)。容易想到的是,该方法进一步包括用发光标记物标记靶分析物。这可以在接触步骤之前或之后进行,即在分析物结合于捕捉剂之后。在某些实施方案中,在使分析物与纳米传感器接触之前标记分析物。在其它实施方案中,在分析物结合纳米传感器的捕捉剂之后标记分析物。而且,如上文提到的,可以直接标记分析物(在这种情况中,可以在该方法开始时将分析物强连接于发光标记物)或间接标记分析物(即通过使靶分析物结合第二捕捉剂,第二捕捉剂特异性结合靶分析物且连接有发光标记物,例如经过标记的第二抗体或经过标记的核酸)。在一些实施方案中,该方法可包括在接触步骤(b)之前封闭纳米传感器,由此防止捕捉剂非特异性结合非靶分析物。
[0195] 适合于特异性结合和靶分析物特异性结合捕捉剂的条件包括恰当的温度、时间、溶液pH水平、环境光水平、湿度、化学试剂浓度、抗原-抗体比、等。
[0196] 在某些实施方案中,可使用核酸捕捉剂来捕捉蛋白质分析物(例如DNA或RNA结合蛋白)。在备选实施方案中,可使用蛋白质捕捉剂(例如DNA或RNA结合蛋白)来捕捉核酸分析物。
[0197] 样品可以是液体样品,而且,在某些实施方案中,样品可以是来源于细胞、组织、或体液的临床样品。感兴趣体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。
[0198] 测定的一些步骤显示于图4和5。捕捉剂和它们的结合配偶(包括分析物)之间的分子相互作用的方法的通用方法是本领域公知的(参见例如Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,First Edition(1988)Cold spring Harbor,N.Y. 和 Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley&Sons,1995)。图4和5中显示的方法是例示性的;那些图中描述的方法并非实施测定法的唯一方式。
[0199] 一种例示性抗体结合测定法的一些步骤显示于图2。在这种测定中,依照上文描述的方法将纳米传感器连接于抗体以生成纳米传感器200,其包含连接于纳米传感器的分子粘附层的抗体202。在生成纳米传感器200之后,在适合于特异性结合的条件下使纳米传感器与含有靶分析物(例如靶蛋白质)的样品接触。抗体202特异性结合样品中的靶分析物204。在自纳米传感器清洗掉未结合的分析物之后,在适合于特异性结合的条件下使纳米传感器与用发光标记物208标记的第二抗体206接触。在自纳米传感器去除未结合的第二抗体之后,可以读取纳米传感器以鉴定和/或定量初始样品中分析物204的量。
[0200] 一种例示性核酸结合测定的一些步骤显示于图3。在这种测定中,依照上文描述的方法将纳米传感器130连接于核酸(例如寡核苷酸)以生成纳米传感器500,其包含连接于分子粘附层的核酸分子502。在生成纳米传感器200之后,使纳米传感器与含有靶核酸504的样品在适合于靶核酸504和核酸捕捉剂502特异性杂交的条件下接触。核酸捕捉剂504特异性结合样品中的靶核酸504。在自纳米传感器清洗掉未结合的核酸之后,在适合于特异性杂交的条件下使纳米传感器与用发光标记物508标记的次级核酸506接触。在自纳米传感器去除未结合的次级核酸之后,可以读取纳米传感器以鉴定和/或定量初始样品中核酸504的量。
[0201] 可使用主题装置实施的增强型DNA杂交测定的一个例子是夹心杂交测定。捕捉DNA为在其3’端用硫醇功能化的单链DNA。检测DNA为在其3’端用荧光标记物(例如IRDye800CW)功能化的单链DNA。捕捉和检测DNA均具有20bp的长度。它们是以不同序列合成的,与靶定DNA的不同区域形成互补结合。首先,通过硫-金反应在D2PA纳米传感器的金属表面上固定化捕捉DNA。然后,将靶定DNA添加至纳米传感器,以供捕捉DNA捕捉。最后,将经过荧光标记的检测DNA添加至纳米传感器以检测固定化的靶定DNA。在清洗掉未结合的检测DNA之后,测量从纳米传感器表面发出的荧光信号,用于检测和定量靶DNA分子。
[0202] 在图2和3中显示的实施方案中,可以使用次级捕捉剂(即“检测剂”)来检测结合的分析物,次级捕捉剂可缀合有荧光团或催化合成可目测或用成像系统检测的生色化合物的酶。在一个实施方案中,可以使用辣根过氧化物酶(HRP),它能将生色底物(例如TMB、DAB、或ABTS)转变成有色产物,或者,在使用化学发光底物时生成冷发光产物。在特定实施方案中,由标记物生成的光信号具有300纳米至900纳米范围的波长。在某些实施方案中,标记物可以是电化学发光的,因此,可以通过给传感器提供电流来生成光信号。
[0203] 在一些实施方案中,次级捕捉剂(即检测剂),例如第二抗体或次级核酸,可以连接有荧光团,例如呫吨染料,例如荧光素和罗丹明染料,诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常以其缩写FAM和F指称)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE或J),N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基
5 5
罗丹明(TAMRA或T),6-羧基-X-罗丹明(ROX或R),5-羧基罗丹明-6G(R6G或G ),6-羧
6 6
基罗丹明-6G(R6G或G ),和罗丹明110;花青染料,例如Cy3、Cy5和Cy7染料;香豆素,例如伞形酮;苯甲亚胺染料,例如Hoechst 33258;菲啶染料,例如德克萨斯红;乙啡啶染料;
吖啶染料;咔唑染料;吩噁嗪染料;卟啉染料;聚甲川染料,例如花青染料,诸如Cy3、Cy5、等;BODIPY染料和喹啉染料。主题应用中通常使用的具体的感兴趣的荧光团包括:芘,香豆素,二乙基氨基香豆素,FAM,氯三嗪基荧光素,荧光素,R110,曙红,JOE,R6G,四甲基罗丹明,TAMRA,丽丝胺,ROX,荧光素,德克萨斯红,萘荧光素,Cy3,和Cy5,IRDye800,IRDye 800CW,Alexa 790,Dylight 800,等。
[0204] 初级和次级捕捉剂应当以高特异性亲和力结合靶分析物。然而,初级和次级捕捉剂不能是相同分子,因为它们需要结合抗原中的不同位点。一个例子是抗人β-淀粉状蛋白捕捉抗体6E10和检测G210,在这种情况中6E10只结合人β-淀粉状蛋白肽上的第10个胺位点,而G210只结合第40个胺位点。捕捉剂和次级捕捉剂彼此不反应。另一个例子使用家兔抗人IgG作为捕捉抗体和驴抗人IgG作为检测抗体。因为捕捉和检测剂来源于不同宿主物种,所以它们彼此不反应。
[0205] 用荧光团标记物蛋白质(例如第二抗体)和核酸的方法是本领域公知的。化学发光标记物包括吖啶酯和磺酰胺,鲁米诺和异鲁米诺;电化学发光标记物包括钌(II)螯合物,其它的也是已知的。
[0206] 应用
[0207] 本主题方法和组合物可用于多种应用,此类应用一般是分析物检测应用,其中至少定性地(即使不是定量地)检测给定样品中特定分析物的存在。用于进行分析物检测测定的方案是本领域技术人员公知的,不需要在本文中铺陈。通常,怀疑含有感兴趣分析物的样品与主题纳米传感器的表面在足以令分析物结合其相应捕捉剂(捕捉剂拴系于传感器)的条件下使接触。捕捉剂对靶定的感兴趣分子具有高特异性亲和力。此亲和力可以是抗原-抗体反应,其中抗体结合抗原上的特定表位,或者可以是两条或更多条互补核酸链之间的序列特异性的DNA/RNA或DNA/RNA杂交反应。因此,如果感兴趣分析物存在于样品中,那么它很可能结合于传感器上捕捉剂的部位,并在传感器表面上形成复合物。就是说,捕捉到的分析物固定化在传感器表面。在去除未结合的分析物之后,接下来检测传感器的表面上这种结合复合物的存在(即固定化的感兴趣分析物),例如使用经过标记的次级捕捉剂。
[0208] 感兴趣的特定分析物检测应用包括杂交测定,其中采用核酸捕捉剂,和蛋白质结合测定法,其中采用多肽,例如抗体。在这些测定法中,首先制备样品,并在样品制备后,在特异性结合条件下使样品与主题纳米传感器接触,由此在与附接于传感器表面的捕捉剂互补的靶核酸或多肽(或其它分子)之间形成复合物。
[0209] 在一个实施方案中,捕捉寡核苷酸为合成单链DNA,长20-100个碱基,一端硫醇化。这些分子固定化在纳米传感器的表面上,用于捕捉具有与固定化的捕捉DNA互补的序列的靶定单链DNA(其长度可为至少50bp)。在杂交反应之后,加入其序列与靶定DNA的未被占据的核酸互补的检测单链DNA(可以长20-100bp)以与靶杂交。检测DNA的一端缀合有荧光标记物,其发射波长在纳米传感器的等离子激元共振以内。因此,通过检测从纳米传感器表面发出的荧光发射,能精确检测和定量靶单链DNA。捕捉和检测DNA的长度决定解链温度(在解链温度以上核苷酸链会分开)、错配的程度(链越长,错配越低)。选择互补结合的长度的关注点之一取决于最小化错配同时保持尽可能高的解链温度的需求。另外,确定杂交长度的总长度以实现最佳信号放大。
[0210] 主题传感器可用于诊断疾病或状况的方法,其包括:(a)从怀疑具有疾病或状况的患者获得液体样品,(b)使样品与主题纳米传感器接触,其中纳米传感器的捕捉剂特异性结合疾病的生物标志物,且其中接触是在适合于生物标志物特异性结合捕捉剂的条件下进行的;(c)去除未结合于捕捉剂的任何生物标志物;并(d)读取来自保持结合于纳米传感器的生物标志物的光信号,其中光信号指示患者具有疾病或状况,其中该方法进一步包括在生物标志物结合捕捉剂之前或之后用发光标记物标记生物标志物。正如下文会更详细描述的,患者可能被怀疑患有癌症,且抗体结合癌症生物标志物。在其它实施方案中,患者被怀疑具有神经病学病症,且抗体结合神经病学病症生物标志物。
[0211] 主题传感器的应用包括但不限于:(a)检测、纯化和定量与某些疾病(例如感染性和寄生虫疾病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神病症和器官疾病,例如病、肾病)的阶段相关的化合物或生物分子;(b)检测、纯化和定量来自环境(例如水、土壤、或生物学样品,例如组织、体液)的微生物,例如病毒、真菌和细菌;(c)检测、定量对食品安全或国家安全造成威胁的化合物或生物学样品,例如有毒废物、炭疽;(d)定量医学或生理学监控器中的生命参数,例如葡萄糖、血氧水平、总血细胞计数;(e)检测和定量来自生物样品(例如细胞、病毒、体液)的特定DNA或RNA;(f)测定和比较染色体和线粒体中的DNA中的遗传序列用于基因组分析;或(g)检测反应产物,例如在药品合成或纯化过程中。
[0212] 可以在各种样品基质中进行检测,诸如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。
[0213] 在一些实施方案中,主题生物传感器可用于通过检测样品中来自病原体的靶核酸来诊断病原体感染。例如,靶核酸可以来自选自下组的病毒:人免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2),人T-细胞白血病病毒1和2(HTLV-1和HTLV-2),呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒,乙肝病毒(HBV),丙肝病毒(HCV),Epstein-Barr病毒(EBV),人乳头瘤病毒(HPV),水痘带状疱疹病毒(VZV),巨细胞病毒(CMV),单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2),人疱疹病毒8(HHV-8,也称作卡波西肉瘤疱疹病毒)和黄病毒,包括黄热病毒、登革病毒、日本脑炎病毒和西尼罗病毒。然而,本发明不限于检测来自上述病毒的DNA序列,而是可以没有问题地应用于在兽医和/或人医中重要的其它病原体。
[0214] 基于它们的DNA序列同源性,人乳头瘤病毒(HPV)进一步细分成超过70种不同类型。这些类型引起不同的疾病。1、2、3、4、7、10和26-29型HPV引起良性疣。5、8、9、12、14、15、17和19-25和46-50型HPV在免疫系统削弱的患者中引起损害。6、11、34、39、41-44和
51-55型在生殖器区和呼吸道的粘膜上引起良性尖形疣。16和18型HPV是医学上特别令人关注的,因为它们引起生殖器粘膜的上皮发育异常且与子宫颈阴道、阴和肛管浸润性癌的高比例有关。据信人乳头瘤病毒的DNA的整合在子宫颈癌的致癌作用中是决定性的。
例如,人乳头瘤病毒可以通过它们的衣壳蛋白L1和L2的DNA序列来检测。相应地,本发明的方法尤其适合于检测组织样品中16和/或18型HPV的DNA序列,用于评估癌发生的险。
[0215] 在一些情况中,纳米传感器可用于检测以低浓度存在的生物标志物。例如,纳米传感器可用于检测容易获取的体液(例如血、唾液、尿、泪、等)中的癌抗原,检测容易获取的体液中的组织特异性疾病的生物标志物(例如神经病学病症(例如阿尔茨海默氏抗原)的生物标志物),检测感染(特别是检测低滴度潜伏病毒,例如HIV),检测母血中的胎儿抗原,及检测例如受试者血流中的外源化合物(例如药物或污染物)。
[0216] 下表提供可使用主题纳米传感器(与适宜的单克隆抗体联合使用时)来检测的蛋白质生物标志物及其相关疾病的清单。表中还指出生物标志物的一种潜在来源(例如“CSF”;脑脊液)。在许多情况中,主题生物传感器能在与所标示的体液不同的体液中检测那些生物标志物。例如,在CSF中找到的生物标志物能在例如尿、血或唾液中鉴定到。
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221] 如上所述,主题纳米传感器可用于检测样品中的核酸。除了上文描述的诊断应用之外,主题纳米传感器还可用于各种药物发现和研究应用。例如,主题纳米传感器可用于多种应用,包括但不限于疾病或状况的诊断或监测(其中核酸的存在提供疾病或状况的生物标志物)、药物靶的发现(其中例如核酸在疾病或状况中差异表达,且可以作为药物治疗的靶)、药物筛选(其中通过评估核酸水平来监测药物的效果)、药物易感性测定(其中药物易感性与特定核酸谱有关)和基础研究(其中期望鉴定样品中核酸的存在,或者,在某些实施方案中,两份或更多份样品中特定核酸的相对水平)。
[0222] 在某些实施方案中,可以使用上述方法获得两份或更多份不同核酸样品中核酸的相对水平,并进行比较。在这些实施方案中,通常将自上文描述的方法获得的结果相对于样品中核酸的总量(例如组成性RNA)标准化,并进行比较。这可以通过比较比率或通过任何其它手段来实现。在特定实施方案中,可以比较两份或更多份不同样品的核酸谱以鉴定与特定疾病或状况有关的核酸。
[0223] 在一些例子中,不同样品可以由“实验”样品(即感兴趣样品)和“对照”样品(实验样品可以与其比较)组成。在许多实施方案中,不同样品是成对的细胞类型或其级分,一种细胞类型是感兴趣的细胞类型,例如异常细胞,而另一种是对照,例如正常细胞。如果比较两个细胞级分,这些级分通常是来自两种细胞中每一种的相同级分。然而,在某些实施方案中,可以比较同一细胞的两个级分。例示性的成对细胞类型包括,例如,从组织活检(例如具有疾病,如结肠、乳腺、前列腺、肺、皮肤癌等,或受到病原体感染等等的组织)分离的细胞,与来自相同组织(通常来自同一患者)的正常细胞;在组织培养中培养的永生的(例如具有增殖突变或永生化转基因的细胞)、受到病原体感染的、或经过处理(例如用环境或化学剂,诸如肽、激素、改变的温度、生长条件、生理应激、细胞转化等)的细胞,与正常细胞(例如除了不是永生的、未受感染、或未经处理等等之外,在其它方面与实验细胞相同的细胞);从具有癌症、疾病的哺乳动物、衰老的哺乳动物、或暴露于某种条件的哺乳动物分离的细胞,和来自属于同一物种(优选属于同一家族)的健康或年轻的哺乳动物的细胞;及来自同一哺乳动物的已分化细胞和未分化细胞(例如一种细胞是另一种细胞的祖细胞)。在一个实施方案中,可采用不同类型的细胞,例如神经元和非神经元细胞,或者不同状态(例如对细胞施加刺激之前和之后)的细胞。在本发明的另一个实施方案中,实验材料是对病原体(诸如病毒,例如人免疫缺陷病毒(HIV)等)感染易感的细胞,而对照材料是对病原体感染有抗性的细胞。在本发明的另一个实施方案中,成对样品由未分化细胞(例如干细胞)与已分化细胞代表。
[0224] 尽管为了清楚理解起见已经通过举例说明较为详细地描述了上述实施方案,但本领域普通技术人员根据上述教导容易想到可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。实施例
[0225] 根据下述实施方案可以进一步理解本教导的各个方面,它们不应解释为以任何方式限制本教导的范围。
[0226] 实施例I
[0227] 制备及演示使用微流体通道内的新型纳米等离激元传感器进行超灵敏和快速荧光免疫测定
[0228] 下面的实施例提供了对微流体通道内集成有新型纳米等离激元传感器的微流体装置的制造和性能的说明。新的测定已经证明,相比于传统的96孔板免疫测定,模型直接6
蛋白A免疫测定具有超过玻璃参比的10倍的检测极限增强(从2nM到850aM,即120ng/ml到50fg/ml)且温育时间减少到六分之一(2小时到20分钟)。
[0229] 材料和方法I
[0230] 该测定具有位于微流体通道内的D2PA传感器(图9,图面A)。D2PA传感器由电介质纳米柱阵列(200nm的周期、70nm的直径和56nm的高度)组成,其中每个柱的顶上有Au纳米盘,底部有Au底板,并且在柱的侧壁上具有随机纳米点(5nm至15nm)(图9,图面B)。所有的金属部件彼此自对齐并且彼此之间具有纳米间隙。
[0231] 微流体测定的制造通过三层技术完成,其中分别制造每一层,然后组装起来。这三层是:底部的D2PA传感器通道层、中间的PDMS入口和出口层、以及顶上的薄玻璃覆盖层(图9,图面B)。为了制造D2PA,首先通过纳米压印图案化铬点阵列。然后通过反应性离子蚀刻(RIE)在光刻定义区域中生成纳米柱。然后,通过先光刻再RIE,制造6个浅的微通道(5μm深、400μm宽)和方形储存器(5μm深、500μm宽)。最后,在选定的传感器区域上蒸镀40nm的金。在密封前,将装置浸渍在1,4-二噁烷溶液中的二硫代双(琥珀酰亚胺基十一烷酸酯)(DSU)中,以涂覆自组装单层(SAM),作为用于免疫测定的捕捉剂。
[0232] PDMS入口和出口通过旋涂和压印制造[5]。首先将8μm厚的PDMS膜旋涂在薄的玻璃盖玻片上,然后用硅压印模具压印。在压印后,将PDMS固化,然后从硅模具剥离。最后,将具有D2PA的底层对齐并与PDMS/薄玻璃盖接合(图9,图面A-G)。
[0233] 为了比较,我们还制造了参比装置:(a)微流体装置,与D2PA微流体测定的相同,只是没有金,用于检查纳米等离激元的效果;及(b)96孔板上的D2PA板(例如,大的流体容积并且无微流体通道),用于检查微流体通道的效果。
[0234] 已经使用直接荧光免疫测定对微流体装置的检测限的增强和测定温育时间的减少进行了测试,该直接荧光免疫测定使用DSU单层作为捕捉剂来检测带荧光标记(IRDye800CW)的蛋白A。在测试中,将体积100μL、浓度1fM到100nM(60fg/ml至6mg/ml)的PBS缓冲溶液中的带标记的蛋白A以5μL/min的流速分别地注入通道中(每一个测定一个浓度)。蛋白A分子通过酯-胺反应被捕捉到DSU SAM上,未结合的分子用100μL洗涤液(PBS+0.5%TWEEN-20)以10μL/min的流速洗去。
[0235] 常规的96孔板参比中的测定以标准的方式进行:首先将100μL带标记的蛋白A溶液加入分别的孔中并且让其温育2小时。然后,用洗涤液洗涤每个孔三次。为了读取免疫测定,通过配备有EM-CCD的倒置显微镜收集荧光信号(图10,图面A)并且在100μm×100μm的面积上求平均。对于每个浓度,重复测量5次以获得标准偏差。
[0236] 结果和讨论I
[0237] 已观察到,在微通道D2PA中较之参比的显著的LoD的增强和温育时间减少。事实上,对新的等离激元装置,实现了六个数量级的检测灵敏度(LoD)的增强。图10的图面B显示了微通道D2PA测定和两个参比的荧光强度与蛋白质A浓度的关系。使用标准的五参数逻辑回归模型,微通道D2PA测定显示了850aM的极限LoD(50fg/ml),这比对没有Au涂层6
的参比样品进行的相同测定(LOD=2纳摩nM)的结果好约10倍。D2PA的参比在96孔板测定中给出了1fM的LoD,类似于微通道D2PA测定的结果。
[0238] 检测限的改善可以归结于两个原因:(1)D2PA的巨大的荧光增强[8];(2)合适的粘合剂和间隔层DSU,其捕捉了蛋白A并且平衡了等离激元增强和金属结构的淬灭作用。
[0239] 已经发现,该微流体测定的微通道D2PA测定中的温育时间是96孔板中的D2PA的六分之一(从2小时到20分钟)。这种迅速的温育是分子与捕捉层(即D2PA表面)之间的平均扩散距离大幅减少的缘故。
[0240] 实施例II
[0241] 通过纳米压印刻印和组合抗蚀剂叠层上的剥离在流动通道内集成金属纳米结构,用于荧光和拉曼增强。
[0242] 该实施例描述了如何通过纳米压印刻印和组合多层压印胶上的剥离来制造在微流体通道内集成金属纳米结构的微流体装置,所述组合多层压印胶是由从不同的制造步骤形成的多层二氧化硅和聚合物组成的。叠层的剥离使最终的纳米特征可以在内部流体通道的适当位置精确对齐。该方法提供了高生产量且低成本的图案化以及与各种流体通道设计的兼容性,对于纳米流体系统中的荧光和拉曼散射增强将会是有用的。
[0243] 材料和方法II
[0244] 所制造的微流体装置包括不同宽度(2-8μm)的微流体通道,在通道内部具有纳米尺度的金属阵列。整个制造有三个环节:(I)在熔融石英基片上图案化微流体通道,(ii)图案化纳米尺度金属结构,及(iii)使用载玻片密封微通道的顶上。步骤(ii)是使用称为“使用组合多层胶剥离(LUCS)”的方法完成的,其中从制造中的几个刻印步骤组合起来的胶层形成三维叠层,其具有有关纳米特征的大小、面积和对齐的全部信息。因此,当通过去除组合胶叠层剥离金属纳米结构时,它们不仅在很大的面积上被明确定义,而且还被叠层的尺寸所准确地定义,并且精确地对齐到微通道内的设计区域中。
[0245] LUCS中的主要步骤是:(1)在熔融石英基片中使用二氧化硅/抗反射膜/ARC作为掩模图案化微流体通道(图11,图面a-c),(2)不去除剩余的第一二氧化硅/抗反射膜层,旋涂第二层二氧化硅/抗反射膜,并且将二氧化硅成为带状(图11,图面d-f),(3)旋涂第三压印胶并且在该压印胶中压印纳米孔,(4)通过铬纳米掩模将纳米孔一直转印到所述熔融石英基片中(图11,图面g-h),(5)采用多层压印胶叠层作为模板,沉积和剥离金属,以便仅在微通道中的所需位置形成金属点(图11,图面i),(6)可选地在熔融石英中选择性地蚀刻纳米柱,接着进行其他工艺,和(7)用玻璃板密封顶上。
[0246] 这里,LUCS采用三个抗蚀剂叠层的组合掩膜:前两个叠层各自由二氧化硅(SiO2)和ARC(一种类似抗反射涂层材料的交联聚合物,购自Brewer Science公司的XHRiC-16)组成,第三层是顶上压印胶。为了制造承载二氧化硅/抗反射膜叠层的微通道,将1”见方的熔融石英晶片用溶剂(丙酮和2-丙醇)和RCA-1(NH4OH:H2O2:去离子水=1:1:5,80℃,15分钟)彻底清洗,然后沉积底部叠层SiO2/ARC(10/30nm厚,在180℃烤ARC 30分钟)。然后使用光刻(抗蚀剂AZ 5214e,~1.4μm厚)和反应性离子刻蚀(RIE,Plasma Therm SLR720)来图案化SiO2/ARC/熔融石英,蚀刻穿过SiO2/ARC叠层并在熔融石英基片中形成50nm深的通道。在反应性离子刻蚀(RIE)中针对SiO2、ARC和石英分别使用CHF3(10sccm,150W,
5mtorr)、氧气(10sccm O2,50W,2mtorr)、和CF4/H2(33/7sccm,300W,50mtorr)。然后用溶剂去除光致抗蚀剂(图11B)。
[0247] 然后,在图案化的熔融石英晶片上沉积中间叠层SiO2/ARC(15/40nm厚)层,并通过二次光刻和反应性离子刻蚀定义到横穿流体通道的矩形开口中(图11A,d-e)。然后移除光刻胶,露出中间的SiO2/ARC叠层中选择性的纳米结构窗(图11,f)。这样,仅有与刻印定义的开口重叠的流动通道区域(其中二氧化硅/ARC叠层被蚀刻掉)会形成纳米结构。
[0248] 为了在纳米压印中生成均匀的纳米特征,在纳米压印机(Nanonex NX2000)中,借助平的硅模具,用热压印胶(Nanonex NXR-1025,250nm)将熔融石英基片平坦化(200psi,130℃,5分钟)(图11,g)。对平坦化后的压印胶进行压印以形成200nm跨距的纳米孔阵列(200psi,130℃,4分钟),然后通过遮光蒸镀覆盖上5nm厚的Cr纳米孔掩模(图11,h)。最后,用O2RIE去除压印胶残余层,并且通过电子束蒸镀和RCA-1中剥离(80℃,10分钟)在通道中纳米图案化30/3nm厚的金/铬纳米点(图11,i)。然后,制造的器件可以用臭氧处理,并用干净的熔融石英盖玻片密封。
[0249] 结果与讨论II
[0250] 采用上述方法制备出不同宽度的微流体通道(2-8μm)。在纳米压印中,采用2
15×15mm的跨距200nm的纳米柱模具,其中柱宽度60nm,高度130nm。在抗蚀剂层中均匀定义出压印的纳米孔,覆盖整个晶片上的不同的微图案化区域。如电子扫描显微镜图像的截面图所示,压印胶忠实地填充在流体通道内部。
[0251] 在RCA1溶液中小心地进行组合压印胶层的剥离,该溶液溶解ARC层并除去顶上所有沉积的金属点。剥离之后,仅在流动通道中制造30/3nm厚的60nm大小的Au/Cr纳米点。金属纳米点的厚度被选择成小于流体通道深度,从而保证纳米结构完全纳入流体结构内部,并且提供流体结构的平坦表面,便于整个器件的成功接合和可靠的测试。纳米点在不同宽度的通道中自对齐,并且通过在另一次光刻和RIE中图案化入口和出口而进一步集成到流体系统中。该演示表明我们的方法可以实现流体结构内部的快速、大面积的纳米图案化,纳米结构向各种几何特征的流体系统的灵活集成,以及纳米尺度上多层次对齐的大的容限。
[0252] 这种LUCS方法还可以用于图案化非金属材料和/或制造其他复杂的纳米图案,如网格、棒和三角,仅需使用相应的压印模具即可。例如,使用不同的柱模具通过纳米压印图案化直径为115nm的方形熔融石英纳米柱,并且在流体通道中对齐。使用该LUCS方法,也可以在流动系统中制造有功能且更复杂的纳米结构,如等离激元盘耦合柱上点天线阵列(D2PA),并且用于实时荧光和表面增强拉曼散射(SERS)增强测量。
[0253] 通过多层次刻印步骤和自对齐集成,所提出的LUCS纳米制作技术允许独立控制微通道的几何特征(例如,位置、宽度和深度)和纳米点的几何特征(如周期、大小、形状、厚度和材料),从而使纳米结构向微流体系统中的优化灵活集成成为可能。因为所有的制造步骤都是标准技术,可以在单批次中生产几十甚至上百个器件,从而使通量最大化。目前,制造一整个批次可能需要最多24小时左右,主要受蒸镀的真空等待时间限制。相信通过进一步优化,加工时间可缩短。
[0254] 实施例III
[0255] 在集成有自对齐的纳米等离激元结构的纳米光电流体系统中的λ-DNA连续流的增强荧光成像
[0256] 下面的实施例说明了如何设计、制作并使用集成有等离激元盘耦合柱上点天线阵列(D2PA)的微流体器件系统,以及如何使用这样的器件实时感测单个DNA链的特性。制造使用了新的制造方案,其采用自对齐纳米压印刻印,用于在流体通道内部选择性地纳米图案化,采用优化的芯片清洁程序以降低表面粗糙度,以及采用室温直接接合技术,用于芯片密封。优化D2PA几何特征,以实现可靠的芯片集成、λ-DNA分子的拉伸、高的量子效率的染料(0.46)的有效的荧光增强(最多30倍)以及连续的DNA流动成像。
[0257] 材料和方法III
[0258] 微流体器件在微流体通道内具有D2PA。为了成功集成到流体芯片中,需要适当地设计D2PA等离激元(plasmonic)结构的几何特征。垂直方向上,流体通道的深度d(d=h+t+w,图12b,图面a)需要大于柱高度h加上金厚度t。如此,D2PA的金盘顶与盖玻片保持小的间隔w来避免弯曲盖玻片(图12b,图面b)。横向上,等离激元D2PA结构需要仅被定义在通道内,以免造成表面粗糙度。这是由自对齐纳米压印图案化方法实现的。
[0259] 自对齐纳米压印使用新的复合掩模实现,该掩膜在流体通道的目标区域和整个芯片上定义出纳米图案(图12B,图面c-j)。复合掩模使用三个叠层,包括SiO2/ARC层(ARC,交联聚合物,常用作抗反射涂层[17])的底部和中间叠层以及顶部纳米压印胶层,以便分别图案化流体通道、纳米结构(nano patterning)区域和纳米等离激元(plasmonic)结构。反应性离子刻蚀(RIE)工艺自然地使SiO2/ARC剥离聚合物掩膜与通道边缘自对齐,从而在通道中完美地对齐纳米图案。
[0260] 详细的芯片制造包括以下步骤。首先,将底部SiO2/ARC叠层,其由40nm厚的旋涂ARC(180℃烤30分钟)和15nm的电子束蒸镀SiO2组成,涂覆在1”的方形熔融石英芯片上(图11B,c)。然后光刻和RIE(100W下的10sccm CHF3用于SiO2和熔融石英,50W下10sccm的O2用于ARC)蚀刻穿过SiO2/ARC层并且图案化底下的熔融石英成为200μm宽、1mm长、120nm深的通道,使SiO2/ARC掩模自对齐于熔融石英通道边缘(图11B,d)。其后,将SiO2/ARC的中间叠层(15/40nm)沉积在芯片上(图11B,e),并且通过另一光刻和CHF3RIE将这一SiO2层图案化形成横穿通道的孤立的条带(图11B,f),其中仔细调整蚀刻时间以最小化ARC的刻蚀损伤。然后,使用纳米柱模具(方柱,直径为115nm,200nm周期)紫外线压印芯片(150PSI,20℃,4分钟,紫外线照射5秒),以在紫外线固化无硅压印胶中形成纳米孔(Nanonex NXR-2110,~200nm厚)(图11B,g)。紫外线纳米压印是优选的,因为紫外线压印胶具有较低的粘度,允许实现在非平整芯片表面上良好的压印胶填充。当通过四个方向阴影遮挡蒸镀在抗蚀剂层上涂覆铬纳米孔掩模后,使用氧RIE去除纳米孔中的残留层。然后,蒸镀15nm的铬,用RCA-1(NH3H2O:H2O2:去离子水=1:1:5,80℃)清洗20分钟剥离ARC聚合物层及之上的铬和二氧化硅层,仅在流体通道中生成铬纳米点掩模,并且自对齐于通道边缘(图11B,h)。铬纳米点掩模CF4/H2RIE形成60nm高的纳米柱,然后被CR-7蚀刻剂蚀刻(图11B,i)。然后将纳米柱区域连接到700nm深的入口/出口储存器以及通过光刻和RIE定义的附属微通道,使用喷砂机钻出通孔并且使通孔对齐到储存器。最后,在溶剂及H2SO4/H2O2中(1:1,100℃,1小时)彻底清洗芯片,并且沉积50nm厚的金到纳米熔融石英柱上,在流体通道生成等离激元D2PA天线阵列(图11B,j)。将该器件在溶剂和臭氧中进一步清洁(15分钟)并且用熔融石英盖玻片密封,用于检测DNA分子(图11B,i-j)。
[0261] 从扫描电子显微镜(SEM)图像清晰可见,纳米压印将纳米柱图案化为60nm高和115nm宽的对称正方形(图12A,选择性自对齐于通道(图12C,b-c)。在金沉积后,由于金在柱上的去湿和扩散,金D2PA天线阵列具有增大的直径(~145nm)(图12,d),并且自组装金纳米点也点缀在柱侧壁上(图12C,d插入图)。通过光刻,D2PA阵列以大面积的被均匀地图案化(图12,e),并且在六个200μm宽的流体通道中被定义为150μm宽的区域(图
12C,f),留下25μm的无金的纳米柱区域,用于荧光增强的比较(图12C,f)。
[0262] 为了可靠的密封流体芯片,仔细地进行了所有的制造、清洗、接合程序。首先,在制造过程中,横向对齐的纳米压印图案化消除了通道外面的金属表面粗糙度,并且垂直通道深度(d=120nm)被设计为比总D2PA高度大10nm(柱高度h=60nm,金厚度t=50nm),以排除接合中的盖玻片弯曲。其次,在关键制造步骤中,例如在通孔钻孔和最终的金沉积中,仔细地保护装置的表面,例如使用光致抗蚀剂(AZ 9260,~15μm厚)和蓝胶带(Semiconductor Equipment Corp.)加以保护,以避免在装置表面上砂碎屑或金属片可能导致接合中接触不良。第三,钻孔装置用1:1混合的H2SO4/H2O2(在最后的金沉积之前)和臭氧(在金沉积之后)彻底地清洗,以移除任何沉积的聚合物和粉尘颗粒,也增加了表面上的硅烷醇基团(-SiOH)密度以便于更好的接合。
[0263] 在认真地解决上述问题的基础上,将1”的方形流体器件在室温下直接接合到经过2
H2SO4/H2O2和臭氧处理的熔融石英盖玻片(0.17μm厚,24×24mm )。通过轻轻地将两者压合在一起,形成初始接触区域,该区域立即扩展,在不到1秒内覆盖整个器件,在器件中心没有明显气泡。然后在将器件用于流体测试之前,使器件在室温下存放过夜。室温晶片直接
2
接合预期有0.1-0.2J/m的接合强度[18-20],虽然这比使用高温(>1000℃)退火的永
2
久性接合强度小得多(~2J/m),但允许对可靠的流体操作而言足够长的测试时间(在我们的测试中,>24小时)。由于用臭氧清洗代替酸或高温处理,金等离激元纳米结构不会被降解,从而允许最好的D2PA性能。
[0264] 在晶片接合和隔夜存放后,将流体装置小心地安装到自制的流体夹具上,其用于加载运行缓冲液和DNA,以及连接电源到装置。然后向该装置中装入含0.1重量%POP6(Applied Biosystems)的0.5X TBE缓冲液,在10V电润湿8小时以轻轻赶走微通道内的所有气泡,然后装入30μL含有DNA的0.5X TBE缓冲液。缓冲液包含用POPO-3荧光染料(Invitrogen公司)5:1标记的λ-DNA(48.5kb,16.5μm,NEB公司),氧清除系统(3%β-巯基乙醇,4mg/mLβ-D-葡萄糖,0.2mg/mL葡萄糖氧化酶和0.04mg/mL的过氧化氢酶),以及10mM抗脱色二硫苏糖醇(DTT)。用POPO-3染料来标记DNA,因为它是具有较高的量子效率(0.46)的稳定的插层染料,它具有低的背景噪声(未结合于DNA的时候不产荧光)和高灵敏度(当接合到DNA时亮度增加到>1000倍),并且它的吸收(~534nm)与金D2PA天线阵列的共振良好匹配。在倒置荧光显微镜(Eclipse TE300,Nikon)上进行DNA成像,利用水银灯在546nm的绿色的发射线作为激发源。DNA分子在电泳(10V)驱动下从微储存器流入D2PA集成流体通道,对流体通道~45°施加电场。用油浸物镜(100倍,1.4NA)将照明光聚集在样品上并采集荧光信号。荧光信号通过555nm二色分束器和带通滤光器(590/60,Nikon),然后被AndorIxon3电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)照相机记录。
[0265] 显然,积累在流体通道边缘处的DNA分子受到电场驱动,但是在通道外面没有发现荧光信号,显然说明装置被良好地密封。事实上,室温密封的装置持续了24个小时而没有明显的渗漏,但随后降解变快,并且在润湿72小时后开始严重泄漏。经过测试,装置可以与盖玻片分离,用溶剂和DI水润洗,以1:1混合的H2SO4/H2O2彻底清洁以除去沉积的金、聚合物和灰尘,并保存以供未来重新使用。
[0266] 为了评价D2PA纳米结构的等离激元性质,通过共聚焦光谱仪测量了D2PA样品的反射和透射光谱(LabRam ARAMIS,HORIBA),用Olympus物镜(50X,NA 0.75)采集信号。吸收作为扣除反射和透射的单一度(unity)计算。显然,在~548nm共振波长,D2PA结构相比于相同厚度的金膜(18%)具有大得多的吸收(70%),改善吸收>50%(即,D2PA增强的吸收,D2PA吸收减去Au膜吸收)。这样短波长共振允许D2PA等离激元共振密切匹配于激励光源(~546nm)和插层染料POPO-3的吸收(534nm),以获得最好的光学成像性能。
[0267] 为了使用内置于流体通道中的D2PA天线阵列获得连续成像,电泳驱动插层有POPO-3染料的λ-DNA分子流过D2PA和熔融石英纳米柱区域的边界,其中电场对边界~45°施加。以0.3秒每的持续时间连续捕获荧光图像。从成像可以看出,纳米柱区域中的DNA分子不能被有效成像,但在D2PA区域中清晰可见,表明D2PA等离子激元结构的检测大大增强。在有D2PA和没有D2PA的两个区域中,平均强度分别为~2100和~210,使得平均荧光增强因子为10,与直接从图像中探查得到的DNA的强度值一致。在D2PA区域中最大的DNA荧光强度是~6000,对应于一些特定的热点处的大约30的增强因子。
[0268] 高量子产率染料(0.46)标记的λ-DNA分子(48.5KB,染色后轮廓长度~22μm[26],回转半径~0.73μm)的如此巨大的荧光增强以前没有报道过。我们的流体系统中的这样的高荧光增强有几个关键原因:(1)激发(546nm波长)下的D2PA结构可以有效地增强电场来更好地激发POPO-3染料分子(吸收峰534nm),并且它们还可以减少处于激发态上的荧光团的寿命,并导致更多的光子发射;(2)大的卷曲DNA分子(回转半径,Rg~
0.73μm])被纳米结构(D2PA和纳米柱)之间的低于80nm的间隙拉伸成直径2nm的线性
2
链[29],因而可以更接近电场集中所在的热点;(3)热点的高密度(每μm上25个D2PA天线),包括围绕金盘天线的外围纳米间隙(垂直10纳米、横向15-20纳米)(场增强>200倍)和Au盘天线的边缘附近(横向~20纳米、垂直~40nm)(场增强~10倍),提供了高的电场及荧光强度增强);(4)D2PA天线所致的纳米约束(垂直~70nm,从金底板到盖玻片;
横向60nm,金盘与金盘之间),增大了有效染料激发的机会,例如在垂直腔间隙和金天线边缘的热点中找到DNA的几率为~5%和~30%。
[0269] 50个连续的图像的平均荧光图像清晰地显示出D2PA区域中带有孤立亮斑的DNA流动痕迹,但在纳米柱区域中的信号非常微弱。这一观察进一步证实了等离激元纳米结构对增强流体通道中的分子检测的重要性。D2PA区域中明亮的荧光点对应于等离激元荧光增强最高的那些斑。由于纳米压印形成图案化的D2PA天线阵列预计具有非常均匀的几何特征,并因此具有非常均匀的光学性质,这样的效果可能主要地归因于在流动过程中DNA(以及因此插层的染料)的空间波动。正如前面所讨论的,线性化的DNA分子(2nm直径)流动通过D2PA天线之间的纳米沟槽(金盘与金盘之间~60nm宽)并且在其中随机波动,因此与等离激元热点具有不同的距离,并因此具有不同的荧光增强效率。靠近天线的边缘或垂直纳米腔间隙的DNA分子预计会达到最大增强的信号,并显示为亮斑。等离激元D2PA结构的连续成像是由于周期为200nm的高密度结构,该周期非常接近于EM-CCD照相机的分辨率(每个像素~150nm)。通过减少进一步D2PA跨距并且增强热斑密度,我们期待实现更亮和更连续的DNA荧光信号。
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