肝病相关生物标志物和使用方法及相关应用
阅读：411发布：2021-03-17
专利汇可以提供肝病相关生物标志物和使用方法及相关应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 生物 标志物和生物标志物组合，可用于评估受试对象的肝病状态、监测肝脏 疾病 、区分肝脏疾病、 治疗 本发明方法评估的受试对象、提供诊断受试对象肝病状态的相关检测方法以及 试剂 盒 。，下面是肝病相关生物标志物和使用方法及相关应用专利的具体信息内容。
1.一种用于肝脏疾病的诊断方法，包括:
a.来自受试对象的生物样本；在样本中检测生物标志物组合中每种生物标志物的水平，包括表1所列的至少一种生物标志物，优选的，表3A或3B中所列的任何生物标志物组合；
b.将所测的生物标志物水平与肝病状况相关联；
c.基于相关性确定受试者的肝病状态；
d.优选的向受试者实施治疗；
2.如权利要求1所述方法，其中所述生物标记物包括:棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)比率，酪氨酸，果糖，果糖/葡萄糖比率，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和甘氨胆酸(GCA)。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤包括根据至少一个生物标志物的测量值计算评分，所述评分为模型的输出值，所述模型为基于生物标记物组合中每一个生物标记物输入值所建立的模型。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤包括将计算评分与阈值进行比较，其中如果所述评分超过所述阈值，则所述受试者为患有肝病。
5.如权利要求4所述方法，其中所述肝病是肝病的存在或肝病阶段或肝病严重程度。
6.如权利要求4所述方法，其中所述肝病可以为肝炎，脂肪性肝炎，NASH，纤维化和肝硬化。
7.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤包括将所述计算评分与阈值中的一个或多个进行比较，其中所述一个或多个阈值对应于区分肝脏疾病的较低阶段或严重程度的阈值。
8.如权利要求7所述方法，其中所述肝脏疾病指肝纤维化。
9.根据权利要求8所述方法，其中所述一个或多个阈值包括区分非肝硬化的肝纤维化的不同阶段。
10.如权利要求8所述方法，其中一个或多个阈值包括区分肝硬化的不同阶段。
11.如权利要求8所述方法，其中一个或多个阈值包括区分肝硬化和非肝硬化的肝纤维化的阈值。
12.根据权利要求11所述方法，其中所述一个或多个阈值包括区分非肝硬化的肝纤维化不同阶段的阈值。
13.根据权利要求11或12所述方法，其中所述一个或多个阈值包括区分肝硬化不同阶段的阈值。
14.根据权利要求1所述方法，其中所述关联步骤包括将所述至少一个生物标志物中的每一个生物标志物的检测水平与相应的比较水平进行比较。
15.前述任一项权利要求的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自表2中列出的生物标志物。
16.根据前述权利要求中任一项方法，其中，所述步骤包括为通过质谱测量(MS)进行检测而准备的样本。
17.根据权利要求16所述方法，其中所述MS包括飞行时间MS，离子阱MS，四极杆MS，扇形磁场MS，离子回旋共振MS和静电扇区分析仪MS中的一个或多个。
18.根据前述权利要求中任一项方法，其中所述方法包括从所述样本中提取所述至少一种生物标志物。
19.根据权利要求18所述方法，其中所述提取包括过滤所述样本以提供滤液，并测量所述滤液中的至少一种生物标志物。
20.前述权利要求的方法，其中所述方法包括在过滤前蛋白质沉淀的步骤。
21.根据前述权利要求中任一项方法，其中所述方法包括将所述至少一种生物标志物与一种或多种其他生物标志物分离。
22.根据权利要求21所述方法，其中所述分离步骤包括气相色谱法(GC)或液相色谱法(LC)。
23.根据前述权利要求中任一项方法，其中所述测量步骤包括超高效液相色谱-三重四极质谱(UPLC-TQMS)。
24.根据权利要求23所述方法，其中所述UPLC-TQMS以负离子模式执行。
25.根据前述权利要求中任一项所述方法，其中所述测量步骤包括酶分析，化学分析，比色分析或荧光分析。
26.根据前述权利要求中任一项所述方法，其中所述受试者被鉴定为具有肝脏疾病，并且所述方法还包括对所述受试对象的治疗。
27.根据权利要求26所述方法，其中所述治疗包括施用治疗剂，进行手术，停止施用受试对象先前接受的治疗剂，合理饮食，停止饮酒，锻炼或减肥。
28.根据权利要求27所述方法，其中所述治疗包括使用以下的治疗剂:顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)抑制剂，胆汁酸结合树脂，类固醇，甾体酸，胆汁酸衍生物，抗胆固醇药，抗糖尿病药。
29.根据权利要求28所述方法，其中所述治疗包括使用选自顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)抑制剂和胆汁酸结合树脂。
30.一种监测肝病所处不同阶段变化的方法，包括:
a.来自受试者的第一份生物样本和来自受试者的第二份生物样本，其中第一份生物样本取自受试者接受肝病治疗之前，第二份生物样本取自受试者治疗之后；
b.检测第一份样本和第二份样本中生物标志物组合的水平，其中所述组合包括表1中列出的至少一种生物标志物，优选的，其中该组合物包括表3A或表3B中所列的任何组合；
c.将所述第一份样本中的所述至少一种生物标志物的水平与所述第二份样本中的所述至少一种生物标志物的水平进行比较；
d.基于第一份样本中至少一种生物标志物水平相对于第二份样本中至少一种生物标志物水平的差值衡量治疗功效；
e.优选的，该方法包括在确定治疗效果后改变治疗，其中改变治疗包括改变治疗形式或治疗试剂或改变治疗剂量。
31.根据权利要求30所述方法，其中所述治疗包括施用治疗药物，进行手术，停止所述对象先前接受的治疗药物，合理饮食，停止饮酒，锻炼或减肥。
32.根据权利要求31所述方法，其中所述治疗包括使用以下的治疗药物:顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)抑制剂，胆汁酸结合树脂，类固醇，甾体酸，胆汁酸衍生物，抗胆固醇药物和抗糖尿病药物。
33.根据权利要求32所述方法，其中所述治疗包括使用选自顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)抑制剂和胆汁酸结合树脂的治疗剂。
34.一种用于检测表1中列出的多种生物标志物的试剂盒，其中:
a.该试剂盒包含至少一种内标；
b.至少一个内标:
i.不是血液，血浆或血清中天然存在的物质；
ii.同位素标记；
iii.对应于表1中列出的生物标记中的至少一种。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述至少一个内标为多个内标，所述多个内标包括对应于生物标志物组合中的每个生物标志的内标，其中所述生物标志物组合包括表3A或表3B中列出的组合。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述多个内标包含类固醇酸，脂肪酸，氨基酸或其组合，其中所述类固醇酸优选的为胆汁酸。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述类固醇酸，所述脂肪酸，所述氨基酸或其组合为相应生物标志物的稳定同位素标记的变体，并且所述试剂盒包含稳定同位素标记的每个生物标志物的变体。
38.根据权利要求34-37中任一项所述试剂盒，还包括过滤装置，其中所述至少一个内标由所述过滤器装置构成。
39.根据权利要求34-38中任一项所述试剂盒，还包括容器，其中所述容器中有所述至少一个内标。
40.根据权利要求34-38中任一项所述试剂盒，其中所述至少一个内标可以作为混合物提供。
41.如权利要求34-38中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种内标物是冷冻干燥的。
42.如权利要求34-37中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种内标可以用于GC-MS或LC-MS。
43.根据权利要求34-37中任一项所述试剂盒，包括多个容器，其中每个容器包括所述至少一个内标。
44.一种评估受试者肝脏疾病的方法，包括:
a.提供任何上述试剂盒权利要求中任一项的试剂盒；
b.执行上述权利要求中任一项所述方法，其中在所述检测步骤之前将所述样本与所述至少一个内标混合。
45.根据权利要求44所述方法，其中所述样本在提取所述生物标记之前将所述样本与所述至少一种内标混合。
46.根据权利要求45所述方法，其中所述试剂盒包括过滤装置并且所述提取步骤包括使用所述过滤装置过滤所述样本。
肝病相关生物标志物和使用方法及相关应用
[0001] 本申请主张2016年5月29日提交的编号为62/343,010的美国临时申请的优先权并将通过引用合并至本申请。
技术领域
背景技术
[0003] 肝纤维化是肝损伤引起的伤口愈合反应(Chang TT，et al.Long-term entecavir therapy results in the reversal of fibrosis/cirrhosis and continued histological improvement in patients with chronic hepatitis B.Hepatology 52，
886-893(2010)；George SL，Bacon BR，Brunt EM，Mihindukulasuriya KL，Hoffmann J，Di Bisceglie AM.Clinical，virologic，histologic，and biochemical outcomes after successful HCV therapy:a 5-year follow-up of 150patients.Hepatology 49，729-
738(2009))，是慢性肝功能衰竭和肝细胞癌的常见原因。其中，乙型、丙型肝炎病毒感染，自身免疫性疾病，胆道疾病，酗酒及酒精性脂肪性肝炎是世界范围内慢性肝病的最常见的原因，在疾病漫长的发展过程中可能导致肝纤维化和肝硬化(Bataller R，Brenner DA.Liver fibrosis.The Journal of clinical investigation 115，209-218(2005))。在发达国家，约15％到20％的脂肪肝患者最终会进展为肝纤维化和肝硬化；其中，约30-40％的患者终将死于肝功能衰竭，肝癌，或肝移植后癌症复发(Shneider BL，Gonzalez-Peralta R，Roberts EA.Controversies in the management of pediatric liver disease:Hepatitis B，C and NAFLD:Summary of a single topic conference.Hepatology 44，1344-1354(2006))。肝纤维化的检测和分期以及组织肝纤维化向肝硬化的进展一直是肝病领域的一个长期挑战。近期研究表明，肝纤维化是可以逆转的(Chang TT，et al.)，因此，对患者疗效的长期的监测和监督十分重要。
886-893(2010)；George SL，Bacon BR，Brunt EM，Mihindukulasuriya KL，Hoffmann J，Di Bisceglie AM.Clinical，virologic，histologic，and biochemical outcomes after successful HCV therapy:a 5-year follow-up of 150patients.Hepatology 49，729-
738(2009))，是慢性肝功能衰竭和肝细胞癌的常见原因。其中，乙型、丙型肝炎病毒感染，自身免疫性疾病，胆道疾病，酗酒及酒精性脂肪性肝炎是世界范围内慢性肝病的最常见的原因，在疾病漫长的发展过程中可能导致肝纤维化和肝硬化(Bataller R，Brenner DA.Liver fibrosis.The Journal of clinical investigation 115，209-218(2005))。在发达国家，约15％到20％的脂肪肝患者最终会进展为肝纤维化和肝硬化；其中，约30-40％的患者终将死于肝功能衰竭，肝癌，或肝移植后癌症复发(Shneider BL，Gonzalez-Peralta R，Roberts EA.Controversies in the management of pediatric liver disease:Hepatitis B，C and NAFLD:Summary of a single topic conference.Hepatology 44，1344-1354(2006))。肝纤维化的检测和分期以及组织肝纤维化向肝硬化的进展一直是肝病领域的一个长期挑战。近期研究表明，肝纤维化是可以逆转的(Chang TT，et al.)，因此，对患者疗效的长期的监测和监督十分重要。
[0004] 同时，对慢性肝病患者疾病严重程度的客观评估也越来越重要，如对患病程度较轻的患者的治疗前决策和评估，他们可能并不需要治疗，仅仅是定期随访就够了。随着肝纤维化和肝硬化患病率的增加，对临床医生的挑战也日益巨大。在临床常规中，用于监测肝纤维化和肝硬化状态的可靠的血清生物标志物将是一种十分理想的监测指标。慢性肝病的预后和治疗在很大程度上取决于肝纤维化的程度和进展。
[0005] 目前，肝脏组织活检是评估肝纤维化的金标准。而此种手段有很大的局限性，如侵入性检验，抽样误差，以及病理医师操作和读片误差等等。因此，临床上急需一种可用于长期监测的、非侵入性的、精确的检验方法。目前，显著的肝纤维化是抗病毒治疗的指标，而肝硬化的出现则提示患者需要特别监测门静脉高压、肝癌及其他并发症的存在可能。
[0006] 开发简单而可靠的非侵入性肝病标志物一直都是肝病领域的重要目标。然而，尽管进行了多次尝试，该领域仍未能产生可被多方接受的无创方案。目前主要的研究结果分为三类:(ⅰ)血清学标志物即肝功能相关的常规指标，(ⅱ)组成细胞外基质合成和降解的纤维化生物标志物以及参与这些过程的酶，(ii i)肝脏成像技术，如超声(US)，计算机断层扫描(CT)成像技术，磁共振成像(MRI)(Taouli B，Ehman RL，Reeder SB.Advanced MRI methods for assessment of chronic liver disease.AJR American journal of roentgenology 2009；193:14-27；.Brancatelli G，Federle MP，Ambrosini R，et al.Cirrhosis:CT and MR imaging evaluation.European journal of radiology 2007；61:57-69.)，肝脏特异性技术如瞬时弹性成像技术(FibroScan)(Talwalkar
JA.Elastography for detecting hepatic fibrosis:options and
considerations.Gastroenterology 2008；135:299-302.Sandrin L，Fourquet B，Hasquenoph JM，et al.Transient elastography:a new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis.Ultrasound in medicine&biology 2003；29:1705-
13..Meng F，Zheng Y，Zhang Q，et al.Noninvasive Evaluation of Liver Fibrosis Using Real-time Tissue Elastography and Transient Elastography(FibroScan).J Ultrasound Med 2015；34:403-10)。此类成像技术的诊断方法也有很明显的局限性，如:在腹水患者，中心静脉压升高患者和肥胖患者中的诊断效果十分有限。上述三类方法中，血清学标志物似乎由于其广泛的可用性和成本相对较低，使其具有很高的应用前景。但目前同样没有一个可被多方接受的解决方案。在过去几年的研究中，经过验证被认为是比较好的血清学标志物方法有:FibroTest(Imbert-Bismut F，Ratziu V，Pieroni L，Charlotte F，Benhamou Y，Poynard T.Biochemical markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus infection:a prospective study.Lancet 2001；357:1069-75)，AST和ALT的比值ratio(Sheth SG，Flamm SL，Gordon FD，Chopra S.AST/ALT ratio predicts cirrhosis in patients with chronic hepatitis C virus infection.Am J
Gastroenterol 1998；93:44-8.Park SY，Kang KH，Park JH，et al.[Clinical efficacy of AST/ALT ratio and platelet counts as predictors of degree of fibrosis in HBV infected patients without clinically evident liver cirrhosis].Korean J Gastroenterol 2004；43:246-51)，以及APRI指数(Wai CT，Greenson JK，Fontana RJ，et al.A simple noninvasive index can predict both significant fibrosis and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C.Hepatology 2003；38:518-26)。然而，这些研究的结果并不一致，仍然需要一种稳定的非侵入性的检测方法来判断肝脏疾病的状态。
JA.Elastography for detecting hepatic fibrosis:options and
considerations.Gastroenterology 2008；135:299-302.Sandrin L，Fourquet B，Hasquenoph JM，et al.Transient elastography:a new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis.Ultrasound in medicine&biology 2003；29:1705-
13..Meng F，Zheng Y，Zhang Q，et al.Noninvasive Evaluation of Liver Fibrosis Using Real-time Tissue Elastography and Transient Elastography(FibroScan).J Ultrasound Med 2015；34:403-10)。此类成像技术的诊断方法也有很明显的局限性，如:在腹水患者，中心静脉压升高患者和肥胖患者中的诊断效果十分有限。上述三类方法中，血清学标志物似乎由于其广泛的可用性和成本相对较低，使其具有很高的应用前景。但目前同样没有一个可被多方接受的解决方案。在过去几年的研究中，经过验证被认为是比较好的血清学标志物方法有:FibroTest(Imbert-Bismut F，Ratziu V，Pieroni L，Charlotte F，Benhamou Y，Poynard T.Biochemical markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus infection:a prospective study.Lancet 2001；357:1069-75)，AST和ALT的比值ratio(Sheth SG，Flamm SL，Gordon FD，Chopra S.AST/ALT ratio predicts cirrhosis in patients with chronic hepatitis C virus infection.Am J
Gastroenterol 1998；93:44-8.Park SY，Kang KH，Park JH，et al.[Clinical efficacy of AST/ALT ratio and platelet counts as predictors of degree of fibrosis in HBV infected patients without clinically evident liver cirrhosis].Korean J Gastroenterol 2004；43:246-51)，以及APRI指数(Wai CT，Greenson JK，Fontana RJ，et al.A simple noninvasive index can predict both significant fibrosis and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C.Hepatology 2003；38:518-26)。然而，这些研究的结果并不一致，仍然需要一种稳定的非侵入性的检测方法来判断肝脏疾病的状态。
[0007] 因此，临床上急需一种生物标志物组合，来判别患者是否患有肝脏疾病，区分不同种类的肝脏疾病，对肝脏疾病进行分期并可用于监测肝脏疾病的进展。迄今为止还没有关于一种生物标志物组合用来诊断非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化和肝硬化以及其他肝病对文献报道。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明包括与肝病的患者相关的生物标志物组合。本发明包括诊断方法、诊断试剂盒和治疗方法相关的生物标志物组合。本发明的诊断方法包括:受试对象的肝脏疾病诊断，监测受试对象的肝脏疾病进展，受试对象肝病严重程度的分期，受试对象所患肝病类型的区分。本发明所述的试剂盒包含用于执行本发明所述诊断方法的一种或多种试剂。
[0010] 第一方面，本发明包括一组生物标志物组合。该生物标志物组合可被检测并用于肝病诊断。
[0011] 第二方面，本发明还提供了一种诊断方法。本发明的诊断方法包括从受试者处获得的生物样本，检测每个生物标志物水平，且基于测量的水平来评估肝病状态。
[0012] 优选的，评估步骤可涉及诊断肝脏疾病或疾病等进展，监测肝脏疾病进展或区分两种或更多种肝脏疾病，或纤维化分期。
[0013] 优选的，评估步骤还包括每种生物标志物和肝病状态相关联的水平检测。如:
[0014] a.将所述生物标志物组合中的每个生物标志物的水平转换为可被比较的水平，以及基于该可被比较的水平来评估受试对象；
[0016] c.将受试者的生物样本进行质谱分析，从中提取数据并对数据进行单变量和多变量分析。
[0017] 优选的，本发明所述肝病状态包括脂肪性肝炎(NASH)，肝纤维化，肝硬化，以及相应的分级和分期。例如，肝脏疾病状态可以是肝纤维化的分期(例如，早期，中期或晚期的代谢功能变化)或肝硬化的分期(例如，Child-Pugh肝硬化分期)。
[0018] 优选的，本发明所述受试者包括:未被诊断为患有肝脏疾病或肝纤维化的受试者，未经过肝病治疗的受试者或已经接受肝病治疗的受试者。
[0019] 优选的，本发明所述样本包括血液、血浆、血清。
[0020] 优选的，测量方法包括质谱(MS)。优选的，MS包括飞行时间质谱(TOFMS)，三重四极质谱(TQMS)或四极子飞行时间质谱(QTOFMS)。MS可以在气相色谱(GC)或液相色谱(LC)如超高效液相色谱(UPLC)下进行。如此，本发明可以用于GC-MS，LC-MS，UPLC-MS。优选的，本发明采用GC-TOFMS，UPLC-QTOFMS或LC-TQMS。
[0021] 第三方面，本发明还涉及一种治疗方法，包括向已经被本发明提供的诊断方法评估为患有肝脏疾病的受试者使用或推荐(以下统称为”使用”)此肝病治疗方法。
[0022] 优选的，此治疗方法为减少受试者与健康对照组之间的一种或多种指示肝脏损伤或肝脏疾病严重程度或进展的生物标志物水平的差距。
[0023] 优选的，本发明所述的治疗包括治疗所用试剂，如小分子治疗试剂。
[0024] 优选的，本发明所述方法进一步包括在使用所述治疗之后，测量受试者样本中的每个生物标志物水平，并将治疗后水平与治疗前水平进行比较，并评估该治疗是否具有降低受试者的肝损伤或降低肝病的严重程度或进展。优选的，该方法还包括在确定肝损伤或肝疾病的严重程度或进展后使用该治疗方法但效果不佳(例如:阈值剂量的治疗试剂并没有减缓疾病的进展和严重程度)而进行的治疗优化。
[0025] 第四方面，本发明提供了包含用于检测一种或多种生物标志物的试剂盒。所述试剂盒包含一种或多种内标，所述一种或多种内标包含每种生物标志物的至少一种内标。优选的，试剂盒为所述内标的混合物。优选的，一种或多种内标被冻干。优选的，一种或多种内标被放置在过滤装置上。优选的，在一种或多种试剂被放置在容器内。优选的，试剂盒包含用于检测生物标志物的说明书，例如评估肝脏疾病状态(例如:诊断肝纤维化)。
[0026] 第五部分，本发明提供了一种基于一种或多种生物标记物的用于评估肝病状态的软件。该软件包括用于分析受试者的生物样本质谱分析产生的图谱中提取的数据算法，其中所述数据涉及所述一种或多种生物标志物。
[0028] 优选的，一种或多种表1列出的胆汁酸。
[0029] 优选的，一种或多种表1列出的游离脂肪酸。
[0030] 优选的，一种或多种表1列出的氨基酸。
[0031] 优选的，该组生物标记物包括一种或多种表1列出的胆汁酸，一种或多种表1列出的游离脂肪酸，一种或多种表1列出的氨基酸，一种或多种表1列出的碳水化合物。
[0032] 优选的，一种或多种表2列出的胆汁酸。
[0033] 优选的，一种或多种表2列出的游离脂肪酸。
[0034] 优选的，一种或多种表2列出的氨基酸。
[0035] 优选的，该组生物标记物包括一种或多种表2列出的胆汁酸，一种或多种表2列出的游离脂肪酸，一种或多种表2列出的氨基酸，一种或多种表2列出的碳水化合物。
[0036] 优选的，该组生物标记物为表3列出的生物标记物组合(表3A或表3B中)。
[0038] 图1为基于肝病患者和健康对照(Ctrl)的差异性胆汁酸(A)，游离脂肪酸(B)和氨基酸(C)建立的OPLS-DA评分曲线。
[0039] 图2A为使用GCA，GCDCA，TCA和TCDCA诊断(即区分)0期纤维化(NASH患者)与健康对照的受试者工作特征(ROC)曲线。AUC为0.921。
[0040] 图2B为用β-丙氨酸诊断(即区分)健康对照和0期纤维化(NASH患者)的ROC曲线。AUC为1.000。
[0041] 图2C为使用C18:2(反式-9，12)诊断(即区分)健康对照和0期纤维化(NASH患者)的ROC曲线。AUC为1.000。
[0042] 图3为使用丝氨酸，DCA和7-KLCA的组合诊断(即区分)0期纤维化与1期纤维化(NAHS与纤维化)的ROC曲线。AUC为0.886。
[0043] 图4为使用丝氨酸，DCA和7-KLCA区分0期和1期(NASH和1期纤维化)的肝纤维化患者的OPLS-DA评分。
[0044] 图5为使用C14:1-顺式9，C20:4-顺式5.8.11.14，β-丙氨酸，瓜氨酸，异亮氨酸的组合诊断(即区分)纤维化患者与肝硬化患者的ROC曲线，蛋氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，酪氨酸，CDCA和GUDCA。AUC为0.942。
[0045] 图6为使用C14:1-顺式9，C20:4-顺式5.8.11.14，β-丙氨酸，瓜氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，酪氨酸，CDCA，和GUDCA建立的OPLS-DA评分来区分肝纤维化和肝硬化。
[0046] 图7为NASH，纤维化和肝硬化患者以及健康对照的GUDCA的柱状图(ng/mL，平均值±SEM)。A，所有样本；B，男性样本；和C，女性样本。与健康对照相比，NASH，肝纤维化和肝硬化患者的GUDCA显着增加，且随着肝病进展逐渐增加。**表示p<0.01。
[0047] 图8为NASH，纤维化和肝硬化患者以及健康对照的TCDCA柱状图(ng/mL，平均值±SEM)。A，所有样本；B，男性样本；和C，女性样本。与健康对照相比，NASH，肝纤维化和肝硬化患者的TCDCA显着增加，且随着肝病进展逐渐增加。**表示p<0.01。
[0048] 图9为NASH，纤维化和肝硬化患者以及健康对照的酪氨酸的柱状图(强度，平均值±SEM)。A，所有样本；B，男性样本；和C，女性样本。与健康对照相比，NASH，肝纤维化和肝硬化患者的酪氨酸显着增加，且随着肝病进展逐渐增加。**表示p<0.01。
[0049] 图10为肝纤维化患者和Child-Pugh A，B和C肝硬化患者的GUDCA的柱状图(ng/mL，平均值±SEM)。A，所有样本；B，男性样本；和C，女性样本。且随着肝病的发展逐渐增加。*表示0.05；**表示p<0.01。
[0050] 图11为肝纤维化患者和Child-Pugh A，B和C肝硬化患者的酪氨酸的柱状图(浓度，平均值±SEM)。A，所有样本；B，男性样本；和C，女性样本。随着肝脏疾病的进展逐渐增加。*表示p<0.05；**表示p<0.01。
[0051] 图12A为依据所有胆汁酸的典型判别分析建立的函数图。
[0052] 图12B为依据所有游离脂肪酸的典型判别分析建立的函数图。
[0053] 图12C为依据所有氨基酸的典型判别分析建立的函数图。
[0054] 图13为肝纤维化患者和Child-Pugh A，B和C肝硬化患者的酪氨酸的柱状图(浓度，平均值±SEM)。随着肝脏疾病的进展逐渐增加。*表示p<0.05；**表示p<0.01。
[0055] 图14A和图14B为本发明所述试剂盒。
[0056] 图15为本发明所述试剂盒。
[0057] 图16A-16K为本发明的生物标记物的诊断效能图表。
[0058] 图17A-17F为本发明的生物标志物的诊断效能图表。
[0059] 图18在肝纤维化患者和健康对照中用所有鉴定的BAs(胆汁酸)建立的OPLS-DA评分曲线。
[0060] 图19A为NASH，纤维化和肝硬化的肝病患者和糖尿病患者和对照的GCA，GCDCA，TCA，TUDCA和7-KLCA(ng/mL，平均值±SEM)的柱状图。图19B为测试组的CLD患者和糖尿病患者的BA标记物组合的ROC曲线。
[0061] 图20为GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA在对照组，NASH患者，纤维化和肝硬化患者组的典型判别分析建立的函数图。
[0062] 图21为所有差异表达BAs在HB，纤维化，肝硬化和HCC患者中的OPLS-DA评分曲线。
[0063] 图22为HB，纤维化，肝硬化和HCC患者组中的GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA的典型判别分析建立的函数图。
[0064] 图23为胆汁酸调节剂作为治疗肝癌的研究的数据。
[0065] 图24为胆汁酸调节剂作为治疗肝癌的研究的数据。
[0066] 图25为胆汁酸调节剂作为治疗肝癌的研究的数据。
[0067] 图26为胆汁酸调节剂作为治疗肝癌的研究的数据。
[0068] 图27为胆汁酸调节剂作为治疗肝癌的研究的数据。
[0069] 图28为胆汁酸调节剂作为治疗肝癌的研究的数据。
[0070] 图29为BAs协同作用促进肝癌的发生机制。
[0071] 图30为甘氨胆酸(GCA)，牛磺胆酸(TCA)，棕榈油酸(C16:1n7)，棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)，酪氨酸和果糖区分肝纤维化三种不同分期的ROC曲线。
[0072] 图31为肝病患者在随机森林模型中的分布。
[0073] 图32为用于治疗或预防肝脏疾病的有用化合物的实例。
[0074] 发明的详细说明
[0075] 方法
[0076] 概述
[0077] 本发明的一个实施例提供包括评估受试者的肝脏疾病状态在内的诊断方法。可以通过从受试者样本中测量一种或多种生物标志物的水平并将该水平与疾病状态相关联以评估肝病状态。基于此种关联，本发明可以鉴定受试对象的肝病状态。例如，肝脏疾病状态可以是肝脏疾病(例如:肝纤维化)的存在或肝脏疾病的严重程度或进展(例如:区分肝纤维化阶段或区分非肝硬化的肝纤维化和肝硬化)。本发明的方法可以有选择的用于诊断肝脏疾病或进展或其严重程度(例如:肝纤维化或肝硬化的进展)，监测肝脏疾病进展(例如:肝纤维化或肝硬化的进展)或区分两种或多种肝脏疾病。
[0078] 为了阐述本发明的一个非限制性实例，本发明使用LC-MS或GC-MS和多变量统计分析来比较肝病患者和健康对照的代谢谱以及人血清样本中的分子变化，以确定肝病的代谢物谱，肝病的生物标志物，以及监测肝病进展的方法。实施例进一步的阐述了目前的被用于诊断的生物标记物组合是基于区分肝脏疾病和肝纤维化进展的生物标记物的最优化选择。这些标记物组合具有高临床敏感性和特异性。本发明可以选择性的利用LCMS和GC-MS来鉴定患者血清样本中的一组小分子代谢物的生物标记物。
[0079] 优选的，根据本发明治疗方法，被鉴定为患有肝病的受试者接受上述肝病治疗方法。
[0080] 优选的，该诊断方法包括监测一种或多种生物标志物的水平。该监测方法包括受试者首次提供的生物样本(例如:治疗前或第一次治疗后)，及受试者第二次提供的生物样本(例如:治疗后或第二次治疗后)，测量首次样本和第二次的样本中的一种或多种生物标志物的水平，并比较首次样本和第二次的样本的生物标记物水平。
[0081] 优选的，本发明包括通过测量受试者样本中的一种或多种胆汁酸代谢物组合，将一种或多种代谢物的水平与是否存在肝脏疾病相关联。优选的，该生物标记物组合包含代谢物，例如:脂肪酸，氨基酸和/或碳水化合物(例如:表1)。优选的，代谢物选自表1中所列的生物标志物。或者，代谢物选自表2中所列的生物标志物。另外，代谢物选自表3中所列的生物标志物(例如:表3A或表3B中)。
[0082] 主要内容
[0083] 本发明方法可以测量受试者的生物样本中一种或多种生物标志物的水平。受试对象可以是任何受试对象，例如人为受试对象。
[0085] 受试对象可以来自任何年龄或性别。例如:受试者可以是成年人，非成年人，婴儿，成年动物或未成年动物。
[0086] 优选的，受试对象为男性。
[0087] 优选的，受试对象为女性。
[0088] 本发明的实施例可以选择性的比较生物标志物组合的水平与对照组的水平。优选的，对照是健康对照或包含等同于健康对照的生物标志物水平的样本。这里，健康对照指临床上无肝病(例如:通过肝穿刺活组织检查鉴定)的健康受试者。健康对照样本是指从健康对照受试者处获得的生物流体样本。
[0089] 本发明可用于对比受试者的肝脏疾病状态(例如:非典型性肝病的表型)。
[0090] 优选的，本发明可以用于评估不怀疑或倾向于怀疑患有肝病的受试者的疾病状态。
[0091] 优选的，受试对象可以是以下任一种:未曾被诊断为患有肝脏疾病的受试者，本发明所述方法所评估出的未被诊断为患有肝脏疾病的受试者，未曾或最近(例如:一年内)没有进行肝活检的受试者，未曾被诊断过乙肝或丙肝病毒感染的受试者，未曾被诊断过或没有酗酒或过度饮酒的受试者，未被诊断过或未患有非酒精性肝病(NALD)的受试者，未被诊断过或未患有糖尿病或肥胖的受试者，未被诊断过暴露于黄曲霉毒素的健康个体(例如，基于PCT/US16/57538中的HBA1c水平或其他诊断方法)，表达与健康肝功能有关的血清学标志物的受试者，不表达临床上显著大量的由胞外基质合成、降解产物、以及参与这些过程的酶组成的纤维化生物标志物的受试者，超声(US)、计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)或瞬时弹性成像(TE)(FibroScan)的结果提示未患有肝脏疾病的受试者，或者FibroTest、AST/ALT比值指数和APRI指数的结果提示未患有肝脏疾病的受试者。
[0093] 优选的，所述受试者可以是以下任一种:被诊断为乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染的受试者，被诊断为患有酒精中毒或重度饮酒的受试者，被诊断为患有非酒精性肝病(NALD)，被诊断围患有糖尿病或肥胖的受试者，已暴露于黄曲霉毒素的受试者，表达与肝功能不良相关的血清学标志物的受试者，表达临床显著大量的由细胞外基质合成和降解以及参与这些过程的酶构成的纤维化生物标志物的受试者，超声(US)、计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)或瞬时弹性成像(TE)(FibroScan)的结果提示患有肝脏疾病的受试者，或者FibroTest、AST/ALT比值指数和APRI指数的结果提示患有肝脏疾病的受试者。
[0094] 优选的，受试者未患有肝细胞癌(HCC)。或者，受试者患有HCC。虽然本发明的实施例详细描述了乙型肝炎感染的受试者的肝脏疾病(例如:脂肪性肝炎，NASH，纤维化或肝硬化)的评分模型和生物标志物，但发明人相信，生物标志物水平是由肝炎(例如:脂肪性肝炎)、纤维化或肝硬化的存在所导致的肝脏的代谢状态改变，不单纯由病毒产生影响。因此，本发明可以在有或没有乙型肝炎病毒感染的对象上实施。同理，尽管本发明的实施例详细描述了被诊断为NASH的受试者群体的脂肪性肝炎的评分模型和生物标志物标记，但是发明人相信该生物标志物水平改变是由于肝炎存在导致的肝脏代谢状态紊乱(例如:脂肪性肝炎)，并且本发明所述生物标志物可用于诊断由任何原因(酒精中毒或非酒精中毒)导致的纤维化或肝炎。因此，本发明可以在酒精或非酒精对象上实施。
[0095] 样本
[0096] 本发明方法可以测量受试者生物样本中的一种或多种生物标志物水平。
[0097] 优选的，样本包含血液、血浆或血清或包含血液、血浆、血清的样本。例如:样本可以在禁食一段时间后从受试者处获得。
[0099] 内标
[0100] 本发明可选择性的包括测量的一种或多种(例如:每种)生物标志物的内标。在测量之前，可将内标与样本混合。
[0102] 样本制备过程有时会在测量前导致生物标志物的大量损失。用于疾病预测的样本制备和分离、测量使用相同的仪器(例如:相同的LC-MS)可提高测量的准确度和精确度，用于疾病预测的样本制备和分离、测量使用不同的仪器(例如:不同的实验室)会导致不可预测的生物标志物检测信号的变化。因此，在本发明中可优选的使用内标，以在样本制备和测量时校正相应生物标志物的损失和/或信号水平变化。
[0103] 优选的，内标是与相应生物标记物相同的化合物，除了一个或多个原子被替代为稳定的同位素:(2)H，(13)C，(15)N或(18)O)。例如，一组给定生物标记物的内标由各标记物的同位素变种提供。
[0104] 优选的，一种内标在化学上是类似的但一种或多种生物标志物的内标并不相同，尽管样本制备中的反应类似，但是在检测过程不尽相同。
[0105] 优选的，内标在制备(例如:提取或纯化)和生物标记物分离的一步或数步前与样本混合。
[0106] 优选的，本发明包含多种生物标志物和每个生物标志物不同的内标，或者，提供用于多种生物标志物(例如:来自相同类别的一种或多种相应生物标记物)的一种内标。例如:十九烷-d37酸可以作为所有游离脂肪酸的内标。
[0107] 优选的，内标是同位素标记的化合物。或者，内标是样本中不存在的化合物，例如在血液、血浆或血清中未发现的化合物。
[0108] 优选的，内标是稳定的同位素标记的化合物。优选的，稳定的同位素为(2)H，(13)C，(15)N或(18)O。
[0109] 优选的，从标记的类固醇酸(例如:胆汁酸)(例如:用于胆汁酸生物标志物)、标记的脂肪酸(例如:用于脂肪酸生物标志物)和/或标记的氨基酸(例如:用于氨基酸生物标志物)中选择的一种或几种内标。
[0110] 优选的，本发明所述内标为可以确定实际样本中生物标记物水平的任何一种稳定的同位素标记代谢物。优选的，内标具有和测量的生物标志物相同化学性质的物质。例如:对于生物标记物来说，内标可通过蛋白质沉淀(例如:通过硫酸铵，三氯乙酸(TCA)，丙酮或乙醇)和/或过滤(例如:使用过滤装置)来检测回收率。至于特定的生物标志物组合，技术人员通过与相应的生物标志物具有相同或共享的化学特性来选择内标物，其中相同或共享的化学特性是指影响生物标志物和内标物的回收率的化学特性(例如:分子量体重，极性等)。
优选的，每个内标都有其相应的回收率且相对于生物标记物不大于或不小于(+/-)10％，
7％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％。
优选的，每个内标都有其相应的回收率且相对于生物标记物不大于或不小于(+/-)10％，
7％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％。
[0111] 例如，以下为本发明中相应的生物标志物内标:
[0112] 胆酸(CA)-d4(例如:用于猪胆酸(HCA)熊去氧胆酸(UDCA)-d4(例如:用于糖基去氧胆酸(GHDCA)，牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，牛磺脱氧胆酸(TDCA)，甘氨猪胆酸('GHCA')和/或牛磺猪胆酸(THCA))
[0113] 石胆酸(LCA)-d4(例如:用于牛磺石胆酸(TLCA))
[0114] 十三烷-d 25酸(例如:用于单不饱和游离脂肪酸)
[0115] 十九烷-d37酸(例如:用于饱和游离脂肪酸)
[0116] 缬氨酸-d8(用于缬氨酸)
[0117] 亮氨酸-5，5，5-d3(用于亮氨酸)
[0118] 异亮氨酸-2-d1(用于异亮氨酸)
[0119] 酪氨酸-3，3-d2(用于酪氨酸)
[0120] 苯丙氨酸-3，3-d2(用于苯丙氨酸)
[0121] 优选的，GC-MS或LC-MS的内标。
[0122] 基于本发明所述，本领域的技术人员可以基于生物标志物组合很容易地选用的应有的内标。
[0123] 样本制备
[0124] 本发明所述的生物标志物可选择性的从样本中提取并测量。例如:方法和步骤可包括将样本与提取介质接触，从样本中提取生物标记并测量提取的脂质(例如:色谱法分离生物标记之后通过质谱法测量)。
[0125] 提取介质可以是从一种或几种样本物质中分离生物标记物的任何介质。
[0126] 优选的，提取介质包含溶液(例如:蛋白质沉淀溶液)，过滤，或两者皆有。
[0127] 检测
[0128] 本发明的方法包括通过测量生物样本中的一种或多种生物标志物水平来检测生物样本中的一种或多种生物标志物。测量方法可以是任何有效的生物标志物的测量方法。例如:可以为生物样本(例如:血液，血浆或血清)中生物标志物水平的任何体外测量方法。
[0129] 优选的，测量方法包括质谱(MS)。MS可以在气相色谱(GC)或液相色谱(LC)之后进行。优选的，MS包含GC-MS，LC-MS或超高效液相色谱(UPLC-MS)。优选的，MS可以是飞行时间，离子阱，四极杆，磁扇形，离子回旋共振，静电扇形分析器或其组合。优选的，MS包括飞行时间质谱(TOFMS)，三重四极质谱(TQMS)或四极子飞行时间质谱(QTOFMS)。
[0130] 优选的，本发明使用GC-TOFMS，UPLC-QTOFMS或LC-TQMS。
[0131] 优选的，在测量之前进行提取(例如:过滤)和/或分离(例如:色谱法)。色谱法是一种基于流动相和固定相之间分配行为差异以达到分离样本中某些成分的方法。通常，色谱柱保持固定，流动相通过色谱柱携带样本。某些样本成分在色谱柱通过需要更多时间因而可以与主要保留在流动相中且更快通过色谱柱的成分分离开来。当成分从柱中洗脱时，它们可以进行后续的测量，例如:使用质谱仪。
[0132] 优选的，根据层析柱的说明，生物标记物组合中的每一个标记物都可以从等分样本中分离出来并测量。这样的方案不需要平行样本的制备，因而为将所有生物标记物从单一等分的样本中分离出来提供了有效的方法。
[0134] 当目标生物标志物是单一物质(例如:棕榈酸或硬脂酸)时，测量步骤可包括测量分析物的水平(例如:测量指示水平的信号)。当目标生物标志物是基于多种物质的比值(例如:C22:4n6/C20:4n6比值)时，测量步骤可包括测量多种物质中的每种物质的水平且基于测量的物质水平计算目标生物标志物的水平。
[0135] 本发明关于生物标志物所使用的术语“水平”可以是样本中生物标志物的任何定量或定性，例如，量(例如:质量)或浓度(例如:w/w，w/v或摩尔浓度)。当水平为浓度时，水平为相对于样本制备(例如:提取)之前的样本原始体积(重量)。
[0136] 肝脏疾病状况
[0137] 本发明可用于评估肝病状态，例如:通过将生物标志物组合的水平与肝病状况相关联。因此，本发明可以选择性的用于鉴定受试者的肝病状态。本发明所述的肝病状态可以是任何肝病状态，例如:肝脏损伤或肝脏异常情况。优选的，肝病状态是肝脏炎症，肝脂肪变性(例如:酒精或非酒精)，肝炎，脂肪性肝炎(例如:酒精或非酒精)，肝细胞损伤，NASH，肝纤维化，肝硬化，慢性肝病，肝病的不同分期，肝病的进展或其严重程度。
[0138] 本发明所述肝病状态还包括没有脂肪性肝炎或脂肪肝的脂肪变性，例如:脂肪浸润伴有很少或不伴有炎症。
[0139] 脂肪性肝炎，如:非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种肝脏疾病，其特征为脂肪变性和炎症导致的肝细胞受损。脂肪性肝炎中的慢性炎症有时会导致瘢痕组织的形成和肝纤维化的进展。
[0140] 优选的，肝纤维化可按其分期或进展分类(例如:分层)。例如，肝纤维化分期包括S0-S4期，其中S0期可以选择性的被认为是不存在肝纤维化(基本上不存在或少量存在)，例如:S0期的脂肪性肝炎。优选的认为S1期为仅在门脉区存在(或仅基本存在)轻度纤维化或纤维化(门静脉纤维化)。可选择性的认为S2期以中度纤维化为特征，或者在门脉区之间存在纤维化，或者存在门静脉分隔但仍具有完整的肝结构，或者肝纤维化而对小叶结构没有实质损害。可选择性的认为S3的特征为严重的纤维化，或门脉区域之间以及门脉区域和中心静脉之间存在纤维化桥接，或者结构变形但没有明显的肝硬化。可选择性的认为S4期的特征为肝硬化，或假小叶的形成或肝脏结构的变化。在本发明之前，仅仅通过肝脏活组织侵入性检查才能确定这种肝纤维化的分类。然而，我们发现通过测量某些生物标志物组合，可以提供用于诊断和分类肝纤维化的依据。尽管本发明所用样本存在对纤维化分类的预先定义(例如S0-S4期)，但是这些分类为约定俗成的可以通过肝穿刺活组织检查的方式来分类。由于肝纤维化是一个纤维化逐渐增加和进展的过程，本发明可以选择性的根据生物标志物水平的变化(例如:通过模型评分)去定义新的纤维化分类(例如:通过严重性或进展)，新的分类可能和基于活检的阶段分类不完全相同。例如，纤维化可以选择性的分成两个阶段，例如:轻度纤维化(例如:S0-S2期)和重度纤维化(例如:S3-S4期)。或者，纤维化可以选择性的分层为三个阶段，例如:早期纤维化(例如:S0-S1期)，中期纤维化(例如:S2期)和晚期纤维化(例如:S3-S4期)。或者，纤维化可以通过模型分为4个或更多个不连续的分期，或者使用连续分类模型进行分类(例如:更高的分数提示纤维化程度更高)。
[0141] 令人惊讶的是，本发明提到的代谢物组可以用于鉴定或区分受试者的肝脏疾病状态。例如，本发明提到的代谢物组可用于区分纤维化和非纤维化，肝硬化和非肝硬化，肝病(例如脂肪性肝炎)和非肝病。在本发明之前，需要肝穿刺活组织检查的侵入性方法来鉴定这些受试者。
[0142] 优选的，本发明可用于区分肝纤维化和非纤维化。例如:非纤维化可以是任何非纤维化，或者是健康的肝脏或脂肪性肝炎(例如:NASH)。
[0143] 优选的，本发明提到的代谢物组用于区分肝硬化和非肝硬化。非硬化可以是任何非硬化，例如健康肝脏，非肝硬化性肝纤维化(例如:S3期纤维化)或非肝硬化性肝损伤(例如:脂肪性肝炎)。
[0144] 优选的，本发明可用于区分肝脏疾病和非肝脏疾病。例如:肝脏疾病可以是脂肪性肝炎(例如:NASH)或肝纤维化(例如:肝硬化和非肝硬化性肝纤维化)，或者是脂肪性肝炎伴肝纤维化的肝脏疾病。
[0145] 优选的，本发明可用于区分肝纤维化的分期或严重程度。
[0146] 优选的，本发明可用于区分肝硬化的严重程度。
[0147] 相关
[0148] 本发明包括将所述一种或多种生物标志物的测量水平与肝病状况相关联来评估肝病状态。基于此种相关，可鉴定受试对象的肝病状态，例如:被诊断为肝病，肝病的分类(例如:肝病类型，分期，进展或严重程度)，或监测肝病的变化(例如:肝病的进展或严重性)。通过本发明诊断的是否有肝病，肝病分类或肝病状态改变的受试对象可以选择性的接收相关肝病治疗。
[0149] 优选的，关联的具体步骤包括将一个或多个生物标志物的测量水平与各个水平(例如:某水平提示或等同于健康)进行比较。另外，可将一个或多个生物标记的测量水平输入到基于测量水平的模型中(例如:由计算机执行的数学公式或算法)。
[0150] 生物标记物的水平(例如:检测的结果)或评分(例如:模型计算的结果)和可比较的水平或可比较的评分去做对应的比较，使用诸如参考范围、区分范围、诊断、分类的阈值或截断值、非正常值等来判断受试对象是否存在肝病或肝病的严重程度。上述生物标记物的可比较的水平可以是某肝病状态未知的受试对象的生物标记物水平或评分。上述生物标记物水平或评分可以是给予某一个生物标记物或是包含其他生物标记物的标记物组合公式计算出的评分。或者，上述可比较的水平或评分可基于之前被诊断了肝病状态的对象(例如:肝穿刺活组织检查)或对比有肝脏疾病和未患有肝脏疾病的对象而得到的截断值(例如，下文实施例所提及的截断值)。优选的，上述生物标记物水平或评分可用来区分肝病严重程度或肝病进展。另外，肝病严重程度的分类(例如:分期)也被包括在本发明中，每个类别都会给出一个水平或评分的参考范围。另外，本发明还包括一个可以区分肝病状态(例如:分期，或严重程度)的公式(例如:曲线)。
[0151] 优选的，本发明包括全部生物标志物组合中每个生物标记物的全谱测量水平，并将上述全谱与可比较的生物标记物全谱进行比较。本发明的生物标志物可产生可比较的生物标志物全谱。可比较的生物标志物全谱可以是阴性对照，例如:从未患有肝脏疾病的健康对照组中的受试者的样本，或者具有肝脏疾病的较轻阶段或严重程度较轻的受试着样本。或者，可比较的全谱可以是阳性对照，例如:来自患有肝脏疾病或来自肝脏疾病分类较严重的受试者的样本。优选的，可以比较不同的全谱，其中每个可被比较的全谱对应不同的肝脏疾病分类(例如:分期或严重程度)的受试对象，以便为监测肝脏疾病提供基础，例如:监测疾病的进展，或监测治疗的有效性。作为阴性对照的全谱和作为阳性对照的全谱可以有选择的存储在计算机上。
[0152] 优选的，本发明包括一个模型(例如:算法)可以将测量的生物标志物水平与肝病状态相关联。这种模型相关性可以在已经配置好的系统中运行，例如:下载了某程序的计算机，测量的标记物的水平作为输入值带入模型计算评分。优选的，本发明的生物标志物组合的测量水平作为计算机或其他微处理器的输入值，上述计算机或微处理器可实现计算肝病状态评分的算法的模型的相关编程。
[0153] 本发明包含一个可以给出评分并根据评分进行二元决策的模型，例如:评分阈值或截断值可以用来区分受试对象是否患有某种肝病或状态，或者可以对肝病状态进行分类，例如:严重程度，分期或进展(例如:较高的分数表示受试对象处于更严重的肝病肝纤维化的阶段)。
[0154] 本发明评估的肝脏疾病状态可以是任何肝脏疾病(例如:与纤维化有关)的疾病终点。例如肝脏疾病终点可以是包括存在纤维化或特定水平肝纤维化的肝穿刺活组织检查的结果。其他肝病终点是临床上众所周知的疾病终点。
[0155] 在一个实施例中，评估肝病状态包含了评分的计算。本发明的某些评分方法是基于逻辑回归的相关性(例如:下述实施例中详述)，本发明包括任何相关性的方法。例如:在确定了一组生物标记物组合后，可以使用交叉相关，主成分分析(PCA)，逻辑回归(LogReg)，线性判别分析(LDA)等被大众所接受的方法。Eigengene线性判别分析(ELDA)，支持向量机(SVM)，随机森林(RF)，递归分叉树(RPART)，相关决策树分类技术，缩小质心(SC)，StepAIC，邻近算法，Boosting，决策树，神经网络，贝叶斯网络，支持向量机和隐马尔可夫模型，线性回归或分类算法，非线性回归或分类算法，ANOVA，分层分析或聚类算法；使用决策树的分层算法；基于内核的机器算法，例如:核偏最小二乘算法，内核匹配追踪算法，内核Fisher判别分析算法或内核主成分分析算法或其他数学和统计方法等用于计算肝病状态评分的算法。
[0156] 举例说明，评分模型可以包括逻辑回归方程和方程算出的最终值来提示是否有肝纤维化的存在(或其严重性)。例如:本发明的评分方法模型可选择性的包括下列方法:a)测量受试者血清或血浆中每种生物标志物的水平，b)将检测的生物标记物水平带入逻辑回归方程c)分析逻辑回归方程算出的最终值以确定肝病状态(例如:是否患有肝纤维化)或其严重程度。
[0157] 优选的，逻辑回归方程的建立方法如下:i)根据患者的肝脏疾病状态(例如:纤维化的严重程度)对患者进行分类，ii)根据具有区分效果的独立的生物标记物组合来建立逻辑回归分析方程以诊断或评估肝病状态，iii)结合所有的生物标记物组合来确定最终的模型。以上的例子在实施例1至实施例16，实施例19和实施例20中将会详述。
[0158] 评分模型的建立方法可参照WO 2002/016949；WO 2002/016949:WO 2010/149767，WO 2006/10357，WO 2006/082522，WO 2003/073822，WO 2011/039321，WO 2005/116901，WO 2010/058295，WO 2010/097472。
[0159] 一般而言，本发明需要用到的信息包括某一选定人群的相关信息包括生物标志物水平和他们的临床终点，如:通过肝穿刺活组织检查来确定的临床终点(例如:下文实施例中将详述)。为了计算某个个体的肝脏疾病状态评分，需从个体收集一个或多个样本以获得生物标记物水平，并将其用作输入数据，即输入到拟合的模型(例如:算法)中。
[0160] 如上所述，可以用多种方式评估本发明的结果和临床可用性。本发明旨在提供一种准确诊断肝病状况和治疗，监测的方法。本发明的准确性是指通过测定或上述方法是否可以区分具有或不具有肝脏疾病的受试者的能力，且此种区分是基于受试者样本中一个或多个生物标记物水平的变化或由此计算的分数。生物标记物水平的改变是指检测的生物标志物水平和该生物标志物的预定截断值(或阈值)不同，并且因此提示出该对象具有特定的肝脏疾病或肝脏疾病状态的变化(例如:在监测中)。生物标志物水平在患者有肝病和不患有肝病这两种状态之间的差异在统计学上是显著的，并且可以是生物标志物水平的增加或降低。尽管本发明考虑使用单一生物标志物，但对于某些特定的群体(例如:特定的遗传，生理或临床状态)，优选方法可包括若干个生物标志物组合与数学模型(如:算法)结合起来，以达到统计学上的显著性。
[0161] 和肝病状态的分类和诊断一样，改变本发明所述判断肝病状态的截断值或阈值会改变判断的灵敏度和特异性。因此，在考虑本方法的准确性和临床应用时，需要选择性的考虑灵敏度和特异性，并且注意灵敏度和特异性的截断值。使用诸如AUC等数据，可以综合考虑所有的截断值，因而有时会给出更好的诊断结果。
[0162] 使用统计学相关方法，评估肝病状态的诊断准确度的可接受的数值如下，其中AUC(用于测定ROC曲线下面积)至少大于等于0.60，例如:至少0.65，至少0.70，至少0.75，至少0.80或至少0.85。优选的，AUC的值可以更大，例如，0.875，至少0.90或至少0.95。
[0163] 优选的，通过定义诊断准确度的程度，即ROC曲线上的截断点，定义可接受的AUC值，并确定构成生物标志物水平(或分数)的组分(单独或一组)的相对浓度的可接受范围，以区别肝脏疾病状态的存在与否和肝脏疾病的状态。
[0164] 模型也可以按照下述内容进行开发和/或使用。
[0165] 评分模型的建立
[0166] 尽管本发明的实施例提供了建立本发明模型的细节，但本领域的业内人士会理解，使用本发明所述的生物标记物和相关性是运用数学模型计算的相关性指标且该指标可用其他方法建立，并不一定需要依赖于本发明所述的数据。
[0167] 例如，模型可以通过从具有代表性群体处获得的生物标志物水平来建立，所述具有代表性群体包括不表现为患有肝病或者确实未患有肝病的患者的临床终点数据(例如:通过肝穿刺活组织检查得到的结果)，例如:实施例中将详述。这些数据可以依据本发明所述的方式(例如:实施例中详述的生物标志物数据获得过程)或其他手段获得，例如:从群体，预期的(纵向的)和/或回顾性流行病学数据库，已经发表的研究，如:私人或公共数据库。生物标志物数据可以来源于某个单一研究或多个研究，通常包括关于具有代表性群体的临床终点的数据，包括本发明所述生物标志物的水平，临床指标。生物标志物水平的数据可选择地存储在永久计算机上。
[0168] 需要根据模型的建立和数据分析所需来准备具有代表性人群的数据，如下所述。例如:数据集的准备包括来自代表性群体内的每个受试者的生物标记物水平值。单纯的生物标志物水平数据可能并不完全适用于模型建立的要求。如此，可使用各种数据准备方法，例如:间隙填充技术(例如:最近邻插值)，质量检查，使用各种公式(例如:统计分类算法)的数据组合，归一化和/或变换(例如:对数据取对数来改变数据的分布以满足建立模型要求(例如，以10为底，以自然对数为底等等))。同样，数据准备过程是为了建立模型所需。用于各种不同模型类型的特定数据的准备已众所周知，并且不需要进一步描述。
[0169] 选择特定的生物标志物用于训练评估肝病状态的模型。生物标志物选择可包括用模型来验证具有代表性人群数据集并从数据集中选择提供最可重复的生物标志物。验证数据集可以包括但不限于交叉验证(cross-validation)和自助法(bootstrapping)。基于选择的生物标志物建立但模型可以用于评估肝病及其状态。但是需要指出的是，并非所有模型都基于相同的数据给出相同的结果。例如:不同的模型利用不同数量的生物标志物并产生不同的结果，从而增加了使用生物标记物组合的模型的重要性。因此，可以选择多个模型并将其与人群数据集或数据集的子集一并使用，来确定肝脏疾病状态评估的最佳模型。上述用于选择生物标记的特定模型的方法，包括统计模型，算法等。
[0170] 对于每一个基于完整数据集或某些子集而建立的模型，生物标志物是根据模型中每个生物标志物的统计学显著性来确定的。当输入值带入到每个模型中，生物标志物可选择地基于统计学显着性来确定，还可能涉及累积投票和加权。统计学显着性检验可能包括方差分析(ANOVA)。模型可包括分类模型(例如:LDA，逻辑回归，SVM，RF，树模型等)和生存模型(例如:cox)，上面已经描述了其中的许多示例。
[0171] 注意，虽然生物标记可以单独应用于上述选择的模型以鉴定其统计学显著性，但是在一些情况下，单独的生物标记可提供更少的预测能力，在这种情况下可以将生物标记组合应用于选择模型。例如:不使用单变量生物标志物，而是可以利用多变量生物标志物。也就是说，相对于与其他生物标志物组合(例如:模型的多变量输入)，单一的生物标志物可能不是好的指标，因为每个生物标志物都会带来额外的信息，这是生物标记物组合比单一生物标记物更好的原因。
[0172] 用于评估肝脏疾病状态模型的选择，训练和验证。具体而言，可以基于一个或多个标准来选择优选的模型。例如:从使用整个数据集或数据子集得到的各种模型，模型的结果不仅可以用于确定生物标记物的统计学显着性，还可用于选择最佳模型。因此，用于评估肝病状态的模型包括分类模型和存活模型。比较和验证可以重复多次以训练和验证出最优选的模型，然后将其用作评估肝脏疾病状态的模型。
[0173] 评分模型的使用
[0174] 虽然本发明提供了一些统计模型，业内人士普遍了解使用鉴定的生物标记物和相关性，以及数学模型可以用于评估肝脏疾病的状态。
[0175] 例如:提供的数学模型可以基于一个或多个生物标记的输入来计算肝脏疾病状态评分。生物标记物水平的数据可以从受试对象处获得并且优选的存储在永久存储器中。生物标志数据可以通过各种方式获得，包括自我报告，体格检查，实验室检测和现有医疗记录，图表或数据库。根据选择和训练的模型类型(例如:建立本发明所述的评分模型的方法中详述)，根据需要使用计算，变换，对数，组合，标准化等来计算生物标志物水平。计算出数据后，生物标记数据就可以作为输入值带入到模型中。
[0176] 该模型可输出肝病状态评分(例如:评分提示特定肝病状态的存在或不存在或肝病的阶段或严重程度)。通过评分和其他评估步骤确定的肝病状态可以是，例如:脂肪性肝炎(例如NASH)，肝纤维化，肝硬化或其阶段或严重程度。
[0177] 治疗
[0178] 在下文实施例，本发明包括治疗已被鉴定为患有肝脏疾病(例如:脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化不同阶段或严重程度)的受试者。
[0179] 有用的治疗包括改善或降低肝病状态，预防或减缓肝病状态的进展，预防或减缓由肝病状态引起的另一种病症(例如:肝性脑病，或癌症，如:肝细胞癌)的发展。
[0180] 本发明的诊断方法在治疗被鉴定为患有肝病的受试者中使用疗法可以涉及任何疗法，任何肝病状态以及本文所述的任何生物标志物组合。
[0181] 优选的，治疗方法包括:施用治疗药物，进行手术(例如:肝移植)，停止施用受试者先前接受的治疗药物(例如:引发肝损伤的药物)，合理:降低卡路里或碳水化合物摄入)，停止饮酒，锻炼，或减肥治疗方案等。
[0182] 优选的，治疗方法包含治疗药物。
[0184] 优选的，有效的治疗药物可抑制回肠末端胆汁酸再摄取，减少继发性胆汁酸产生，加速从肠道排泄胆汁酸或抑制胆汁酸合成。
[0185] 优选的，治疗包括顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)抑制剂，例如:苯并硫杂庚英衍生物SC-435(参见Bhat BG，et al.Inhibition of ileal bile acid transport and reduced atherosclerosis in apoE-/-mice by SC-435.Journal of lipid research 44，1614-1621(2003))或264W94(参见Root C，Smith CD，Sundseth SS，Pink HM，Wi lson JG，Lewis MC.Ileal bile acid transporter inhibition，CYP7A1induction，and antilipemic action of 264W94.J Lipid Res 43，1320-1330(2002))，喹啉衍生物R-
1446224(参见Kurata H，et al.A novel class of apical sodium-dependent bile acid transporter inhibitors:the amphiphilic 4-oxo-1-phenyl-1，4-dihydroquinol ine derivatives.Bioorganic&medicinal chemistry letters 14，1183-1186(2004))或萘酚衍生物如S-8921(参见Hara S，et al.S-8921，an ileal Na+/bile acid cotransporter inhibitor decreases serum cholesterol in hamsters.Life sciences 60，Pl 365-370(1997))。其他有用的ASBT抑制剂包括在US2014/0323412A1(Gedulin等，申请号:US14/354，
553)中公开的任一种。ASBT抑制剂可以抑制胆汁酸从回肠向肝细胞的重吸收，从而减少循环中的胆汁酸，预防或治疗肝纤维化、肝硬化等其他的肝损伤或疾病。
1446224(参见Kurata H，et al.A novel class of apical sodium-dependent bile acid transporter inhibitors:the amphiphilic 4-oxo-1-phenyl-1，4-dihydroquinol ine derivatives.Bioorganic&medicinal chemistry letters 14，1183-1186(2004))或萘酚衍生物如S-8921(参见Hara S，et al.S-8921，an ileal Na+/bile acid cotransporter inhibitor decreases serum cholesterol in hamsters.Life sciences 60，Pl 365-370(1997))。其他有用的ASBT抑制剂包括在US2014/0323412A1(Gedulin等，申请号:US14/354，
553)中公开的任一种。ASBT抑制剂可以抑制胆汁酸从回肠向肝细胞的重吸收，从而减少循环中的胆汁酸，预防或治疗肝纤维化、肝硬化等其他的肝损伤或疾病。
[0186] 优选的，本发明所述治疗包括胆汁酸结合树脂，例如:考来维仑(参见Aldridge MA，Ito MK.Colesevelam hydrochloride:a novel bile acid-binding resin.The Annals of pharmacotherapy 35，898-907(2001))或考来烯胺或(参见Einarsson K，et al.Bile acid sequestrants:Mechanisms of action on bile acid and cholesterol metabolism.European Journal of Clinical Pharmacology 40，S53-S58)。胆汁酸结合树脂可去除肠道胆汁酸，胆汁酸肠肝循环减少，从而减少胆汁酸，预防或治疗肝纤维化、肝硬化或其他肝损伤的严重程度。
[0187] 优选的，治疗方法还包含类固醇酸。有效的类固醇酸包括其非共轭和共轭的任何形式。优选的，类固醇酸是胆汁酸，例如:熊脱氧胆酸。
[0188] 优选的，本发明所述治疗包括胆汁酸衍生物，如奥贝胆酸(OCA)(参见Trivedi PJ，Hirschfield GM，Gershwin ME.Obeticholic acid for the treatment of primary biliary cirrhosis.Expert review of clinical pharmacology 9，13-26(2016))。胆汁酸衍生物可抑制胆汁酸合成，从而减少胆汁酸，预防或治疗肝纤维化、肝硬化或其他肝损伤的严重程度。
[0189] 优选的，本发明所述治疗包括施用抗胆固醇剂，包括他汀类，胆汁酸结合树脂(例如:考来烯胺，考来替泊或考来维仑)，贝特类，依泽替米贝，洛美达派，植物甾醇或奥利司他。
[0190] 优选的，本发明所述治疗包括施用US2014/0323412A1(Gedulin等人，申请号:US 14/354，553)中公开的任何治疗剂(例如:ASBT抑制剂或吸收抑制剂)。
[0191] 优选的，本发明所述治疗包括给予胆汁酸或其衍生物，(例如:Jia，申请号:PCT/US16/57538；Miljkovic等人，申请号:US 6，060，46；，Kramer等人，申请号:EP 0417725A2，Pellicciari，申请号:US 8，445，472)中提到的治疗化合物。
[0192] 一种胆汁酸结合树脂
[0193] 优选的，本发明所述治疗包括Jia申请的PCT(申请号:PCT/US16/57538)中公式I包含的任何化合物。
[0194] 优选的，本发明所述治疗包括对患有肝脏疾病状态的受试者的任何护理。
[0195] 优选的，本发明所述治疗包括施用苦艾蒿，波普瑞韦，布美他尼，考来烯胺，考来替泊，呋塞米，哈维尼，氢氯噻嗪，乳果糖，麦考酚酸莫酯，螺内酯，奥匹替韦，替拉瑞韦，噻嗪，氨苯蝶啶，氢氯噻嗪，Viekira Pak，维生素K，植物甲萘醌，皮质类固醇，胆汁酸，利尿剂，白蛋白和抗生素。
[0196] 本发明所述治疗可包括，例如:抗糖尿病药(例如:二甲双胍，罗格列酮或吡格列酮)，减肥药，合理饮食(例如:卡路里或碳水化合物限制)或运动。上述治疗可用于患有脂肪性肝炎的受试者，例如:几乎没有或没有肝纤维化(例如:S0或S1期)。上述治疗可以使受试者对胰岛素更敏感，并且可以帮助减少脂肪性肝炎，如:NASH患者的肝损伤。
[0197] 有效的治疗可包括中断对象先前服用的治疗剂或停止某种治疗药物。许多治疗药物会增加肝脏负担并且促使肝脏朝向纤维化或其更高阶段发展。
[0198] 本发明所述治疗包括有效减少或逆转肝脏疾病或减轻、预防肝脏疾病的进展，并且通过治疗将受试者的生物标志物水平变为肝脏疾病较轻的水平，例如:根据测量的生物标志物水平或基于测量生物标志物水平的评分。
[0199] 优选的，本发明还包括评估受试对象的疾病状态，评估:区分不同阶段或不同严重程度的两种或更多种肝脏疾病，还包括基于上述评估或基于鉴定的阶段或严重程度选择治疗方法。
[0200] 例如，某种治疗优选的用于肝病状态更为严重的受试者。
[0201] 或者，第一种治疗优选的用于肝病状态更为严重的受试者，第二种治疗优选的用于肝病状态不那么严重的受试者。第一种治疗和第二种治疗可能会有不同程度的副作用，不同侵袭性或不同死亡率。
[0202] 例如，对于处于严重纤维化阶段(例如:晚期肝硬化)的受试者，优选的选择肝移植；对于纤维化不太严重的受试者，优选的施用治疗药物(例如:小分子治疗药物，ASBT抑制剂，吸收抑制剂，胆汁酸或其衍生物，抗糖尿病药物，类固醇酸或胆汁酸结合树脂。
[0203] 再例如:优选的为处于严重阶段的受试者施用治疗药物(例如:小分子治疗药物，ASBT抑制剂，吸收抑制剂，胆汁酸或其衍生物，类固醇酸或胆汁酸结合树脂)，优选的为肝病状态不那么严重的受试者施用第二种治疗例方法，如:施用抗糖尿病药物或体重减轻药物或改变生活方式(例如:限制卡路里或碳水化合物的摄入或运动)。
[0204] 优选的，上述方法可以对处于更严重阶段或晚期纤维化的受试者具有更严重的副作用、侵袭性或死亡率。例如:向处于肝病严重阶段的受试者(例如:晚期肝纤维化)施用肝移植，向处于中度或重度纤维化的受试者施用效力较强的治疗药物(例如:具有较大副作用或死亡率)，向处于轻度纤维化的受试者施用效力较弱的治疗药物(例如:具有较小副作用或死亡率)，向处于更轻的纤维化阶段或没有纤维化的脂肪性肝炎受试者施用改变生活方式的治疗方法。
[0205] 本领域业内人士可以根据不同程度发副作用、侵入性或死亡率为处于不同纤维化分期和严程度的受试对象选用两种(或多种)治疗方法。
[0206] 监测
[0207] 在一个实施例中，本发明的方法包括检测一种或多种生物标志物的水平。本发明的检测方法包括从受试对象提取第一次生物样本和第二次生物样本，其中第一次样本为首次从受试者处获得的样本，第二次生物样本为第二次从受试者处获得的生物样本，其中第二次样本收集时间晚于第一次样本时间，分别测量第一次样本和第二次样本中的每一种或多种生物标志物水平，以比较第一次样本和第二次样本中生物标记物水平的变化或将测量的水平与肝脏疾病状态相关联，并比较第一次的肝脏疾病状态与第二次的肝脏疾病状态。
[0208] 优选的，第一次样本收集在受试者接受治疗之前，第二次样本收集在受试者接受治疗之后。因此，本发明所述的测量生物标志物水平可以进一步监测受试者的肝脏疾病状态或监测疗效。
[0209] 优选的，如果第一次样本和第二次样本的一种或多种生物标志物水平的比较不提示肝病严重程度(例如:实质)减轻，则需要改进治疗方案。
[0210] 试剂盒
[0211] 在一个实施例中，本发明提供了用于检测生物标志物组合的试剂盒，包括检测一种或多种生物标志物的一种或多种内标。上述的一种或多种内标为每个生物标记物提供至少一种内标。
[0212] 优选的，试剂盒包含一种容器，一种过滤装置或两者皆有(例如:容器中包含过滤装置)。优选的，容器中包括一个或多个内标。优选的，过滤装置包括一个或多个内标(例如:过滤装置包括内标)。试剂盒的实例见图14A，图14B和图15。
[0213] 优选的，GC-MS或LC-MS的内标。
[0214] 优选的，一个或多个内标。优选的，内标以混合物的形式提供。或者，多个内标中的一个或多个可以分开。
[0215] 优选的，一种或多种内标以固体或液体的形式提供。优选的，一种或多种内标可以脱水或冷冻干燥(例如:冻干)的形式提供。例如:固体内标可以在使用试剂盒之前溶解于溶液中。
[0216] 优选的，内标为本发明所述任何内标。
[0217] 优选的，所述的一种或多种内标包含标记的类固醇酸(例如:胆汁酸)，标记的脂肪酸和/或标记的氨基酸。标记方式可以是例如:同位素，如:(2)H或(13)C。
[0218] 优选的，每个内标与相应生物标志物是相同的化合物，不同的是内标的一个或多个原子被稳定同位素(例如:(2)H，(13)C，(15)N或(18)O)标记。例如:把每种生物标志物的同位素标记变体当作生物标志物组的内标。优选的，该生物标记物组合可以是表3中所列的任何组合(即，表3A或表3B)。
[0219] 优选的，试剂盒包括过滤装置。优选的，过滤装置上有一个或多个内标(例如:图14和图15所示)。优选的，试剂盒提供过滤装置和容器或过滤装置在容器内(例如:图14和图15所示)。优选的，过滤装置可从容器中移除(例如:图14A所示)。优选的，过滤装置安装到过滤装置保持器上，例如，可放置在容器(例如:圆柱形过滤装置支架和/或图14和图15所示的过滤装置支架)中的过滤装置支架上，例如:过滤装置支架就是容器本身，例如:图14A所示。优选的，当过滤装置放置在容器内时，过滤装置的每侧保持一定体积的液体，例如:通过在过滤装置的每侧保持一定的空隙或空腔(例如:图14B所示)。这样，容器可以通过离心使过滤装置一侧的溶液通过过滤装置到过滤到另一侧。过滤装置上可以放置内标。通过分析滤液(例如:GCMS或LCMS)以测量生物标记和内标。优选的，过滤装置可以通过孔径的大小，从而允许内标和生物标志物组合通过，但其他成分如蛋白质(例如沉淀的蛋白质)不可通过。例如，过滤装置可以是孔径为0.22μm的过滤器。优选的，过滤装置的材料为聚偏二氟乙烯，纤维素(例如:乙酸纤维素)或尼龙。优选的，过滤装置含有抗氧化剂，如:丁基化羟基甲苯(BHT)。
[0220] 优选的，内标可与抗氧化剂如丁基羟基甲苯(BHT)混合。试剂盒可以提供类似的抗氧化剂，从而延长试剂盒的保质期。
[0221] 优选的，试剂盒提供包含一种或多种内标的容器。优选的，容器可以是管型，小瓶或多孔板。试剂盒可以是单个容器(例如:单孔或单室)，或多个容器(例如:多孔或多室)。试剂盒可以包含多孔板(例如，96孔微量滴定板)。也可以是其他类似的容器。在某些试剂盒中，容器可适用于测量样本中一种或多种代谢物的含量和内标。在某些试剂盒中，用于测量受试者样本中一种或多种代谢物含量和内标的容器用于光谱分析，例如色谱-质谱法。例如，该容器可以被用于GC-TOFMS和/或LC-TQMS。在另一些试剂盒中，该容器可以用于对受试者样本中的一种或多种代谢物的其他特性分析(例如:酶促，化学，比色，荧光计量等)。
[0222] 某些试剂盒可以包括多个容器。例如，某些试剂盒包括含有内标在内的一个或多个容器。另外，某些试剂盒包括含有内标在内的一个或多个容器以及用于测量受试者样本中一种或多种代谢物含量和内标的额外的容器(例如:多孔板或额外的小管或小瓶)。在某些试剂盒中，有一个容器容纳一个或多个内标，同时可以测量受试样本中一种或多种代谢物的含量和内标。某些试剂盒包含多孔，多室等容器，内标可以选择性的放置在一个或多个孔或室中。某些试剂盒中，内标被放置在容器外部，使用时需要把内标溶解到容器内。
[0223] 某些试剂盒可以接受来自一个或一个以上受试者的生物样本。例如:多室或多孔的容器，来自受试者的生物样本可以分布到一个或多个小室或小孔中。在一些情况下，一个或多个受试者的样本会被分配到多个小室或小孔中。试剂盒的容器通常为容纳流体样本(例如:流体生物样本或已被预先处理为可以当作流体样本来分析的固体样本)的容器。
[0224] 某些试剂盒还包括用于测量样本中一种或多种代谢物含量和内标的试剂。试剂盒会提供一个或多个额外的容器来承载这些试剂。
[0225] 试剂盒中的内标可以放置在相同或者不同的容器中。容器可以是微量滴定板的形式，例如:适合在GC-MS或LC-MS中使用。微量滴定板可以有足够数量的小孔以接收一个或一个以上的内标。内标的浓度已知，容器每个小孔中已经含有内标或需要将已知量的内标逐一加入到微量滴定板的小孔内。将内标加入到容器中之后，将样本加入到微量滴定板内。
[0226] 计算机模块以及自动化系统
[0227] 本发明的方法还包括使用计算机和相关硬件设备，计算机用于处理计算、相关、产生报告等。下述一个实施例中提供了包含测量模块(例如:将分析出的含量信号转换成生物标志物水平)、评估模块(例如:将生物标志物水平与肝病状态相关联或将生物标志物水平作为输入值带入数学模型计算评分)和/或产生评估结果模块(例如:程序)的非暂时性(例如:不易丢失)计算机存储器。优选的，本发明提供了一种包括微处理器和存储器的计算机，其中微处理器为执行模块。
[0228] 测量和/或评估(例如:相关、计算分数)的步骤包括用计算机运行模块(例如，由微处理器运行内存上的程序)。例如，测量模块可以将代表生物标志物水平的信号通过计算转换为生物标志物的水平。优选的，测量模块可以用检测到的内标水平来标准化生物标志物的水平。评估模块包括将生物标记物水平作为输入值带入算法(例如:计算肝脏疾病状态的评分或比较生物标记物水平的算法)得到评分从而确定受试对象的肝病状态。可选择的，还包括可以产生评估结果报告的模块。评估的报告包括可视化的报告、链接到一个数据库等等。
[0229] 本发明还包括利用计算机或模拟机器的自动化诊断系统。测量的生物标志物组合可以用于各种诊断系统。该诊断系统包括生物样本的检测结果。该诊断系统可以处理多种生物样本，可以处理同一个样本的不同的检测结果。该诊断系统包括用于收集，存储和/或追踪每个样本的检测结果并存储于数据库中。例如:非易失性存储设备(例如:硬盘驱动器，闪存，磁带或纸质文件)。优选的，该诊断系统包括结果的报告。
[0230] 生物标记物组合
[0231] 本发明所述的生物标志物组合可用于本发明相关的方法、试剂盒等。
[0232] 优选的，该生物标志物组合包含表1中列出的一种或多种生物标志物。
[0233] 优选的，该生物标志物组合包含表2中列出的一种或多种生物标志物
[0234] 优选的，该生物标志物组合可以是表3中列出的任何组合(即，在表3A或表3B中)。表3A至CJ列出了诊断肝脏疾病状态(例如:肝炎，肝纤维化或肝硬化)或区分肝病进展状态或严重程度(例如:肝纤维化严重程度)的88个组合。
[0235] 衡量疾病状态的生物标志物可以是某种物质(胆汁酸，脂肪酸或氨基酸)，也可以是基于多个物质水平而计算出来的值。例如，可以是计算出的物质比例(例如:二十二碳四烯酸(C22:4n-6)/花生四烯酸(C20:4n6)的比例)或一种或多种物质的相对一种或多种物质总和的相对比值(例如:百分比)。
[0236] 优选的，本发明所述的一组生物标志物可以包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10种及以上更多种的生物标志物组合。
[0237] 在本发明可选择性的包含一种或多种胆汁酸，一种或多种氨基酸和/或一种或多种游离脂肪酸。
[0238] 优选的，本发明所述生物标志物组合包括一种或多种其他的生物标志物，如:AST(天冬氨酸转氨酶)，ALT(丙氨酸转氨酶)，AST/ALT，铁蛋白，血小板，凝血酶原指数，透明质酸，如US2011/0313276A1所述。生物标志物组合也可选择性的不包含这些生物标志物中的一个或多个(或每个)。
[0239] 优选的，生物标志物组合包括一种或多种其他生物标志物，例:如α2-巨球蛋白，触珠蛋白，载脂蛋白A1，总胆红素和/或γ-谷氨酰转肽酶(GGT)(例如:经性别和年龄矫正后)如EP2786287A1所述。生物标志物组也可选择性的不包含这些生物标志物中的一种或多种。
[0240] 优选的，生物标志物组合包括一种或多种其他生物标志物，诸如α2-巨球蛋白，AST，ALT，GGT，γ-球蛋白，总胆红素，白蛋白，α1-球蛋白，2-球蛋白，触珠蛋白，β-球蛋白，apoA1，IL10，例如:TGF-β1，apoA2和/或apoB，如WO 2002/016949中所述。生物标志物组合也优选的不包含这些生物标志物中的一种或多种。
[0241] 尽管本发明详述了多种不同的生物标记物组合，下面三个实施例列出了三个有效的例子。
[0242] 在一个实施例中，本发明的生物标记物组合包含一种或多种牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，牛磺胆酸(TCA)，12-甲基十三酸(C14:0(C15:0iso)，亚油酸(C18:2n6t)，反油酸(C18:1n9t)，β-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸。这样的生物标记物组合可用于肝脏疾病的诊断(例如:肝纤维化或肝硬化)。
[0243] 在一个实施例中，本发明的生物标记物组合包含一种或多种牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，牛磺胆酸(TCA)Ketocholic acid(7-KLCA)，牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，肉豆蔻脑酸(C14:1n5)，棕榈油酸(C16:1n7)，反油酸(C18:1n9t)，芥酸(C22:1n9)，二十碳四烯酸(C22:4n-6)/花生四烯酸(C20:4n6)，亚油酸(C18:2n6)/γ-亚麻酸(C18:3n6)，棕榈酸(C16:0)棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)，酪氨酸，果糖，果糖/葡萄糖比。这样的生物标记物组合可用于肝病的分期(例如:区分早期，中期或晚期纤维化)。
[0244] 在一个实施例中，本发明的生物标记物组合包含一种或多种棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)比率，果糖，果糖/葡萄糖比率。这样的生物标记物组合可用于肝病的分期(例如:区分早期，中期或晚期纤维化)。
[0245] Table 1 Markers of Liver Disease Status
[0246]
[0247]
[0248]
[0249] 表2：
[0250] Table 2 Markers of Liver Disease Status
[0251]
[0252]
[0253] Table 3A Biomarker Panels(‘PANELS’)
[0254]
[0255] Table 3A continued
[0256]
[0257] Table 3A continued
[0258]
[0259] Table 3A Continued
[0260]
[0261] Table 3A continued
[0262]
[0263] Table 3A Continued
[0264]
[0265]实施例
[0266] 以下实施例详细的介绍了生物标志物组合的发现以及它们在构建预测模式中的用途，以及运用它们来诊断肝脏疾病的准确性。在血清样本中检测代谢物全谱，使用LC-MS和GC-MS检测样本中代谢物水平，并且使用统计学方法分析。这些实施例详细阐述了如何使用本发明所述的生物标志物组合来评估肝脏疾病状态，例如:NASH的存在，肝纤维化和肝硬化的分期。
[0267] 实施例1研究人群
[0268] 上海中医药大学附属曙光医院(中国上海)和厦门中医医院(中国厦门)共入组504名诊断为肝纤维化和肝硬化的患者，年龄分布为15-75岁。上述诊断依据《中国慢性乙型肝炎防治指南》(中国肝脏病学会，中华医学会，中华肝脏病学会，中华医学会肝病学分会，中国传染病学会，中华医学会)和《中国慢性乙型肝炎防治指南(2005)》(中国医学杂志(Engl)2007；120:2159-73)。排除标准包括:年龄小于15岁或大于75岁，怀孕或哺乳期妇女，感染人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)或戊型肝炎病毒共同感染(HEV)，糖尿病，其他肝脏疾病，肝脏移植，胃肠疾病，胰腺炎，使用过精神药物，6个月内饮酒，6周内使用过抗生素、益生菌等(ajaj JS，Heuman DM，Hylemon PB，et al.Randomised clinical trial:Lactobacillus GG modulates gut microbiome，metabolome and endotoxemia in patients with cirrhosis.Aliment Pharmacol Ther 2014；39:1113-
25)。此外，我们排除了肝硬化诊断不明的患者以及无法空腹提供血液样本的患者。
25)。此外，我们排除了肝硬化诊断不明的患者以及无法空腹提供血液样本的患者。
[0269] 上海曙光医院体检中心入组502名受试者作为健康对照。健康对照组和入组的肝病患者年龄、性别和BMI无显着差异(表4)。健康对照组受试者经曙光医院常规生化检测确认无炎症和代谢疾病(表4)。进行B超检查以排除脂肪肝患者。排除标准包括:年龄大于75岁或年龄小于15岁，怀孕，哺乳期妇女，有显着的心肺、肾脏、胃肠疾病或肝脏疾病，急性或慢性感染，恶性肿瘤，需要治疗的其他急性或慢性疾病，在过去2个月内使用过任何处方药。该研究经上海中医药大学和厦门中医医院人体研究委员会批准。所有入组的受试着皆签署了研究知情同意书。
[0270] 表4为慢性肝病患者的人口学特征和临床资料。研究包括502例患者(72％为男性，平均年龄为36.66±11.85岁)，其中46例为0期纤维化，174例为1期纤维化，136例为2期纤维化，57例为3期肝纤维化，39例为肝硬化肝功能A级，30例肝硬化肝功能B级，16例肝硬化肝功能C级。除了失代偿期肝硬化患者外，上述患者的诊断皆基于肝脏穿刺活检。与健康对照相比，肝病患者的丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，直接胆红素(DBIL)，间接胆红素(IBIL)，总胆红素(TBIL)，γ-谷氨酰转移酶(GGT)，总胆汁酸TBA)，平均血小板体积(MPV)，血小板计数(PCT)，血小板分布宽度(PDW)，总蛋白(TP)，球蛋白(GLB)和平均红细胞血红蛋白(MCH)以及白蛋白(ALB)(BUN)，胆固醇(CHOL)，红细胞压积(HCT)，甘油三酯(TG)，前白蛋白(PALB)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，血小板(PLT)，红细胞(RBC)和白细胞WHC)显著提高。随着肝纤维化程度逐渐加重，肝硬化肝功能等级逐渐变高，血清ALB，HCT，HGB，PALB，PCT，PLT，RBC，TP，CHE，FT3，FT4，Fib，PTA和CHOL水平逐渐下降，血清ALP，BUN，APTT，TBA，HBcAb，INR，PT，TT，TBIL，DBIL和IBIL水平均显着升高。GGT，GLB和AHCV的血清水平也随着肝纤维化阶段的增加而增加，但在肝硬化患者中降低。
[0271] 该研究获得了两家医院的伦理委员会的批准，所有参与者在研究之前皆签署了知情同意书。
[0272] Table 4.Demographic data of testing population
[0273]
[0274]
[0275]
[0276] 实施例2肝穿刺活组织检查
[0277] 除了被诊断为失代偿性肝硬化的肝病患者，其余肝病患者在入组后1周内接受超声指导下的肝组织活检。样本用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，组织切片用苏木精伊红和Masson染色。最小长度至少为1.5cm且至少需要6个门脉区域皆有才能诊断。根据Scheuer的分期(Scheuer PJ，Standish RA，Dhillon AP.Scoring of chronic hepatitis.Clinics in liver disease 2002；6:335-47，v-vi.)进行炎症的组织学分级(G0至G4)和肝纤维化的分期(S0至S4)。上述分类均由中国上海复旦大学的三名病理学家独立盲法评估，结果通过Kappa一致性检验。
[0278] 实施例3血清样本收集
[0279] 使用LH750血液学分析仪和Synchron DXC800临床系统(Beckman Coulter，美国)进行血液学和生化常规的检测。用化学发光免疫分析仪(CLIA)系统(LUMO，Shinova Systems，上海，中国)测量血清透明质酸(HA)和层粘连蛋白(LN)的浓度。使用自动凝血分析仪(STAGO Compact，Diagnostica Stago，法国)测量凝血功能。使用实时聚合酶链式反应(PCR)系统(LightCycler，480，罗氏，美国)检测血清HBV-DNA水平。
[0280] 实施例4统计分析
[0281] 连续型变量用平均值±SEM表示，分类变量用数字表示。用单因素分析(ANOVA，Student t-检验，非参数检验)来确定肝纤维化患者与健康对照、不同阶段肝纤维化患者之间差异显著的变量。p<0.05为显著。将数据导入SIMCA-P+13.0软件(Umetrics， 瑞典)后，进行多元统计分析、正交偏最小二乘-鉴别分析(OPLS-DA)以得到对照和肝纤维化患者的胆汁酸的整体概况。然后，使用OPLS-DA以区分不同阶段的肝纤维化患者。通过逐步逻辑回归构建预测模型，识别与每个临床终点(S1，
[0282] S2，S3的肝纤维化患者，肝功能A，B，C级的肝硬化患者)相关的独立因素。通过受试者工作特征曲线(ROC)评估单个生物标志物和生物标志物组合的总体诊断效能。上述统计分析使用SPSS 22.0(IBM SPSS，美国)软件。用SPSS对胆汁酸数据进行典型判别分析。使用Graphpad Prism 6.0(GraphPad software，CA，美国)绘制柱状图。
[0283] 实施例5血清胆酸的分析
[0284] 血清样本制备
[0285] 将50μl血清与150μl甲醇(含有0.10μM的CA-D4，UDCA-D4和LCA-D4作内标)混合，将混合物振荡2分钟，静置10分钟，在4℃20000g离心10分钟，将160μL上清转移到干净的真空管中。用乙腈(0.1％甲酸)和水(0.1％甲酸)重新溶解残余物至体积为40μL。离心后，上清液用于UPLC-MS/MS分析。
[0286] 方法验证
[0287] 将标准储备溶液混合以获得混合储备溶液，将含有全部胆汁酸标准品的校准溶液以0.610，1.221，2.441，4.883，9.766，19.531，39.063，78.125，156.250，312.5，625.0，1250.000和2500.00ng/mL的浓度梯度和BA血清混合。校准曲线和相应的回归系数通过内标获得。
[0288] 仪器
[0289] 在前文中的测量方法的基础上测量血清BA(Xie G，Zhong W，Li H，et al.Alteration of bile acid metabolism in the rat induced by chronic ethanol consumption.FASEB journal:official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2013；27:3583-93.Garcia-Canaveras JC，Donato MT，Castell JV，Lahoz A.Targeted profiling of circulating and hepatic bile acids in human，mouse，and rat using a UPLC-MRM-MS-validated method.Journal of lipid research 2012；53:2231-41)。本发明使用配备有二元溶剂输送管理器和样本管理器的沃特世ACQUITY超高性能液相色谱系统(沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州)。质谱仪为具有ESI的Waters XEVO TQ-S仪器(Waters，Milford，MA)。整个LC-MS系统安装了MassLynx 4.1软件。
[0290] 所有色谱均使用ACQUITY BEH C18色谱柱(1.7μm，100mm×2.1mm)(Waters，Milford，MA)。
[0291] LC-MS分析
[0292] 流动相包括含有的0.1％甲酸的LC-MS标准的水(流动相A)和包含0.1％甲酸的LC-MS标准的乙腈(流动相B)，流速为0.3mL/min。流速为0.45mL/min，流动相浓度梯度如下:0-1分钟(5％B)，1-5分钟(5-25％B)，5-15.5分钟(25-40％B)，15.5-17.5分钟(40-95％B)，17.5-19分钟(95％B)，19-19.5分钟(95-5％B)，19.6-21分钟(5％B)。温度为45℃，所有样本的体积为5μl。
[0294] 数据分析
[0295] 使用TargetLynx applications manager 4.1版本(Waters Corp.，Milford，MA)分析UPLC-MS的原始数据，以获得矫正后的方程和样本中每种BA的定量浓度。使用student t检验来检验各组BAs的差异。使用错误发现率(FDR)来矫正p值。p<0.05为显着。
[0296] 表5为LC-MS/MS分析BAs的MRM转换和质谱参数。
[0297]
[0298]
[0299] 实施例6血清氨基酸分析
[0300] 每100μL血清样本加入两个内标(10μL L-2-氯苯丙氨酸水溶液，0.3mg/mL，甲醇中溶解10μL十七烷酸，1mg/mL)，在-20℃下用300μL甲醇来分离代谢物:氯仿(3:1)萃取代谢物10分钟。12，000rpm离心10分钟，将300μL上清液用于进一步分析。样本在室温下真空干燥。
将残余物在80℃下用80μL甲氧胺(15mg/mL，吡啶中)进行两步衍生化90分钟，在70℃下用80μLBSTFA(1％TMCS)处理60分钟。除了用于质控的内标外，还制备一个由多个内标组成的质控样本，并且每10个样本插入一个质控样本，质控样本与其他样本进行相同的干燥和衍生化步骤。样本用Pegasus HT系统(Leco Corporation，St Joseph，美国)与Agilent 6890N气相色谱仪按照“对照-CRC-对照”的顺序进行分析。每10个血清样本后处理一个质控样本。进样量为1μL。温度为270℃。使用DB-5MS毛细管柱(30m×250μm I.D.，膜厚度为0.25μm；
Agilent J&W Scientific，CA，美国)分离代谢物。使用氦气作为气体载体，流速为1.0毫升/分钟。GC柱温度从80℃开始持续2分钟，然后以10℃/分钟升温至180℃，以6℃/分钟升至230℃，最后以40℃/分钟升至295℃。295℃为最终温度并保持8分钟。转印界面和离子源的温度分别设定为270℃和220℃。电子碰撞电离(70eV)将m/z范围设定为30-600。采集速率设置为
20个频谱/秒。
将残余物在80℃下用80μL甲氧胺(15mg/mL，吡啶中)进行两步衍生化90分钟，在70℃下用80μLBSTFA(1％TMCS)处理60分钟。除了用于质控的内标外，还制备一个由多个内标组成的质控样本，并且每10个样本插入一个质控样本，质控样本与其他样本进行相同的干燥和衍生化步骤。样本用Pegasus HT系统(Leco Corporation，St Joseph，美国)与Agilent 6890N气相色谱仪按照“对照-CRC-对照”的顺序进行分析。每10个血清样本后处理一个质控样本。进样量为1μL。温度为270℃。使用DB-5MS毛细管柱(30m×250μm I.D.，膜厚度为0.25μm；
Agilent J&W Scientific，CA，美国)分离代谢物。使用氦气作为气体载体，流速为1.0毫升/分钟。GC柱温度从80℃开始持续2分钟，然后以10℃/分钟升温至180℃，以6℃/分钟升至230℃，最后以40℃/分钟升至295℃。295℃为最终温度并保持8分钟。转印界面和离子源的温度分别设定为270℃和220℃。电子碰撞电离(70eV)将m/z范围设定为30-600。采集速率设置为
20个频谱/秒。
[0301] 实施例7血清游离脂肪酸的分析
[0302] 血清FFA提取
[0303] 将30μL血清样本加入同位素标记的内标溶液(10μl C19:0-d37，5μg/mL)。用500μL异丙醇:己烷:2M磷酸(40:10:1)提取混合溶液并震荡2分钟。在室温下保存20分钟后，向样本中加入400μl己烷和300μL水，震荡2分钟，以12，000rpm离心5分钟。将400μL上清液的等分并转移到玻璃样本瓶中。用另外的400μl己烷提取残余物，然后震荡2分钟并以12，000rpm离心5分钟。将等份的400μL上清液转移到相同的玻璃取样小瓶中在室温下真空干燥。将残余物溶于80μL甲醇中并用UPLC-QTOFMS分析。
[0304] UPLC-QTOFMS定量分析血清中的FFA
[0305] 使用超高效液相色谱系统将5μL的上清液注射到保持在40℃100mm×2.1mm、1.7μmBEH C18柱(Waters，USA)上沃特斯，美国)中。二元梯度洗脱体系由水(A)和含20％v/v异丙醇(B)的乙腈组成，分离梯度为:70％B(0-2分钟)，70-75％B(2-5分钟)，75-80％B(5-10.0分钟)，80-90％B(10.0-13.0分钟)，90-100％B(13.0-16.0分钟)；100％B(16.0-21.0分钟)；100％至70％B(21.0-22.5分钟)，70％B(22.5-24.0分钟)。流速为0.4mL/min。所有样本在4℃保存、分析。样本按照“对照-疾病-对照”的顺序交替进行以减少系统分析偏差。用配备有负离子模式操作的电喷雾离子源的Waters Q-TOF premier(Manchester，英国)收集质谱数据。温度设定为120℃，锥形气体流量为50L/h，去溶剂化气体温度为450℃，去溶剂化气体流量为600L/h。毛细管和锥形电压分别设定为2.5kV和55V。亮氨酸脑啡肽浓度为100ng/mL，流速为0.1mL/min(ES-模式下的m/z 554.2615)。
[0306] 使用MarkerLynx Applications Manager 4.1版本(Waters，Manchester，英国)分析UPLC-QTOFMS ESI-原始数据。保留时间(RT)和m/z对为每个离子的标识，产生每个峰的离子强度列表，得到包含任意分配的峰值指数(保留时间-m/z对)的三维矩阵，样本名称(观察值)和离子强度信息(变量)。内标用于质量控制。通过使用保留时间和精确质量与FFA内标进行比较来确定样本中的FFA。
[0307] 实施例8 NASH，肝纤维化和肝硬化患者的胆汁酸全谱总共23种胆汁酸，包括：甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，鹅脱氧胆酸(CDCA)，脱氧胆酸(DCA)，甘氨脱氧胆酸(GDCA)，胆酸(CA)，熊脱氧胆酸(UDCA)，甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，甘氨猪脱氧胆酸(GHDCA)，牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，牛磺脱氧胆酸(TDCA)，牛磺胆酸(TCA)，甘氨λ-鼠胆酸(Gλ-MCA)，λ-鼠胆酸(λ-MCA)，7-酮木焦胆酸(7-KLCA)7-酮脱氧胆酸(7-KDCA)，石胆酸(LCA)，牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，猪脱氧胆酸(HDCA)，3-酮胆酸(3-KCA)，牛磺λ-鼠胆酸(Tλ-MCA)。与健康对照相比，肝病患者中的牛磺石胆酸(TLCA)和甘氨石胆酸(GLCA)显着增加；与肝纤维化和肝硬化患者相比，GCDCA，GCA，CDCA，CA，UDCA，GUDCA，GHDCA，TCDCA，TCA，7-KLCA，LCA，TUDCA，3-KCA，Tλ-MCA，TLCA和GLCA的水平在对照组中较低，在纤维化患者中显着增加(p＜0.01)，并且在肝硬化患者中增加的更多(表6)。
[0308] Table 6.Serum bile acid concentrations in testing population
[0309]
[0310]
[0311] 00257 Note：Values are mean concentration(ng/mL)±SEM measured using UPLC-MS/MS.＊＊，p＜0.01when compared tohealthy controls
[0312] 实施例9NASH，肝纤维化和肝硬化患者的脂肪酸谱
[0313] 在不同进展/严重程度的肝病患者和健康对照中共鉴定出50种游离脂肪酸(表7)。根据这些数据，游离脂肪酸水平随着肝病的存在和/或进展而改变(具体脂肪酸上升或下降如表中所示)。数据表明，这些生物标记物可用于区分肝脏疾病与健康对照或区分肝脏疾病状态(例如：进展或严重程度)。
[0314] Table 7 Serum fatty acid concentrations in testing population
[0315]
[0316]
[0317]
[0318] 00259 Note：Values are mean concentration(ug/mL)±SEM measured using UPLC-QTOFMS.＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01 whencompared to healthy controls.[0319] 实施例10NASH，肝纤维化和肝硬化患者的氨基酸谱
[0320] 在具有不同进展/严重程度的肝病患者和健康对照中总共鉴定出来29个氨基酸(表8)。这些数据表明，氨基酸水平随着肝病的存在和/或进展而改变(具体上升和下降如表中所示)。数据表明，这些生物标记物可用于辨别肝脏疾病与健康对照或区分肝脏疾病状态(例如：进展或严重程度)。
[0321] Table 8 Serum amino acid concentrations in testing population.
[0322]
[0323]
[0324]
[0325] 00261 Note：Values are mean intensities±SEM measured using GC-TOFMS.＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01 when compared to heaithycontrols.
[0326] 实施例11区分纤维化与健康对照的生物标志物
[0327] OPLS-DA显示使用23种胆汁酸(图1A，R2Xcum＝0.719，R2Ycum＝0.778，Q2Ycum＝0.744)，游离脂肪酸(图1B，R2Xcum＝0.664，R2Ycum＝0.829，Q2Ycum＝0.806)和氨基酸(图
1C，R2Xcum＝0.516，R2Ycum＝0.793，Q2Ycum＝0.785)可区分肝纤维化和健康对照。
1C，R2Xcum＝0.516，R2Ycum＝0.793，Q2Ycum＝0.785)可区分肝纤维化和健康对照。
[0328] 实施例12区分NASH与健康对照的生物标志物
[0329] 为了评估血清代谢物在NASH患者和对照之间的潜在区分效能，我们基于鉴定的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸分别建立来逻辑回归模型。
[0330] 通过前向逐步分析，我们认为GCA，GCDCA，TCA和TCDCA可以有效区别NASH或其他脂肪性肝炎疾病(表9)。使用这些代谢物，我们建立了如下的回归模型：
[0331]
[0332] 我们用ROC曲线来评估胆汁酸作为诊断NASH的非侵入性生物标志物的潜在有效性。ROC分析显示胆汁酸生物标志物对于NASH患者与对照者的区别很大，曲线下面积(AUC)为0.921(95％CI＝0.866-0.976)(图2A)。使用0.384的截断值，灵敏度和特异性分别为84.8％和87.0％(表10)。我们还发现，C18：2(trans 9，12)可以区分NASH患者与对照，曲线下面积(AUC)为1.000(95％CI＝1.000至1.000)(图2C)。使用0.5μg/mL的截断值，灵敏度和特异性均达到100％(表11)。
[0333] 我们还发现β-丙氨酸可以区分NASH患者与对照，曲线下面积(AUC)为(图2B)。使用111709的截断值，灵敏度和特异性均达
到100％(表12)。
到100％(表12)。
[0334] Table 9 Logistic regression analysis of a NASH-associated signature for a biomarker panel.
[0335] Coefficient S.E. Pvalue
GCDCA -.006 .002 .008
GCA .010 .004 .020
TCDCA .102 .027 .000
TCA -.061 .017 .000
Constant -2.023 .493 .000
GCDCA -.006 .002 .008
GCA .010 .004 .020
TCDCA .102 .027 .000
TCA -.061 .017 .000
Constant -2.023 .493 .000
[0336] 00268 P values were calculated using tne Wald test.
[0337] Table 10 Diagnosis accuracy of a biomarker panel(GCDCA，GCA，TCDCA and TCA)for the detection of patients with NASH compared to healthy controls.[0338]
[0339] 00269
[0340] Table 11 Diagnosis accuracy of C18：2(trans 9，12)for detection of patients with NASH compared to healthy controls.
[0341]
[0342] 实施例13区分NASH和肝纤维化的生物标志物
[0343] 为了评估血清代谢物在区分NASH患者和纤维化患者的潜在作用，基于鉴定的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸建立了逻辑回归模型。
[0344] 通过前向逐步分析，我们认为丝氨酸，DCA和7-KLCA可以在回归模型中对疾病状态进行有效预测(表13)。
[0345] 通过ROC曲线来评估生物标记物区分NASH患者纤维化分期的非侵入性生物标志物的潜在效果ROC结果显示代谢物生物标志物在鉴别NASH患者纤维化有效，曲线下面积(AUC)为0.866(95％CI＝0.822至0.949)(图3)。使用0.724的截断值，灵敏度和特异性分别为86.4％和84.8％(表14)。丝氨酸，DCA和7-KLCA建立的OPLS-DA评分曲线显示肝纤维化患者和NASH患者之间的分离(图4，R2Xcum＝0.666，R2Ycum＝0.654，Q2Ycum＝0.643)。
[0346] Table 13 Logistic regression analysis of metabolite signatures for discriminating NASH from S1 fibrosis subjects.
[0347] Coefficient S.E. P value
Serine 0.000 0.000 0.041
DCA -0.014 0.003 0.000
7-KLCA 0.678 0.111 0.000
Constant -2.067 1.089 0.058
Serine 0.000 0.000 0.041
DCA -0.014 0.003 0.000
7-KLCA 0.678 0.111 0.000
Constant -2.067 1.089 0.058
[0348] 00274 P Values were calculated using the Wald test.
[0349] Page 92 of 175 Attorney Docket#WJ_PCT_29_May_2017
[0350]
[0351] Table 14.Diagnosis accuracy of a panel signatures for discriminating NASH subjects from S1 fibrosis subjects.
[0352]
[0353] 实施例14区分肝纤维化和肝硬化的生物标志物
[0354] 为了评估血清代谢物在区分纤维化患者和肝硬化患者之间的区分的潜在作用，基于鉴定的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸建立了逻辑回归模型。
[0355] 通过前向逐步分析，我们认为C14.1.cis.9，C20.4.cis.5.8.11.14，β-丙氨酸，瓜氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，酪氨酸，鹅脱氧胆酸，和甘氨熊脱氧胆酸是回归模型中疾病状态的有效预测因子(表15)。
[0356] 通过ROC曲线来评估代谢生物标记物作为区分NASH患者纤维化分期的非侵入性生物标志物的潜在作用。ROC分析显示代谢物生物标志物在区分纤维化患者和肝硬化患者无肝硬化患者方面有效，曲线下面积(AUC)为0.842(95％CI＝0.911-0.974)(图5)。使用0.256为截断值，敏感性和特异性分别为83.5％和95.3％(表16)。代谢物生物标记C14：1cis-9，C20：4cis-5，8，11，14，β-丙氨酸，瓜氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，酪氨酸，CDCA和GUDCA建立的OPLS-DA评分曲线显示肝纤维化患者和肝硬化患者之间的分离(图6，R2Xcum＝0.488，R2Ycum＝0.529，Q2Ycum＝0.513)。
[0357] 表15用于判别肝纤维化和肝硬化的生物标记物组的逻辑回归分析。
[0358] Table 15 Logistic regression analysis of panel signature for discriminating fibrosis from cirrhosis patients.
[0359] Page 93 of 175 Attorney Docket#WJ-PCT-29_May_2017
[0360]
[0361] Coefficien1 S.E. P value
C14.1.cis.9 5.785 1.705 .001
C20.4..cis.5.8.11.14. -4.331 1.469 .003
Beta-Alanine .000 .000 .003
Citrulline .000 .000 .018
lsoleucine .000 .000 .007
Methionine .000 .000 .008
Omithine .000 .000 .018
Phenylalanine .000 .000 .008
Proline .000 .000 .044
Threonine .000 .000 .000
Tyrosine .000 .000 .051
CDCA .002 .001 .000
GUDCA .002 .001 .198
C0nstant -6.259 1.285 .000
C14.1.cis.9 5.785 1.705 .001
C20.4..cis.5.8.11.14. -4.331 1.469 .003
Beta-Alanine .000 .000 .003
Citrulline .000 .000 .018
lsoleucine .000 .000 .007
Methionine .000 .000 .008
Omithine .000 .000 .018
Phenylalanine .000 .000 .008
Proline .000 .000 .044
Threonine .000 .000 .000
Tyrosine .000 .000 .051
CDCA .002 .001 .000
GUDCA .002 .001 .198
C0nstant -6.259 1.285 .000
[0362] 00278 P values were calculated using the Wald test.
[0363] 表16区分肝纤维化和NASH的代谢物特征的诊断准确性。
[0364] Table 16.Diagnosis accuracy of metabolite signatures for detection of patients with NASH compared to fibrosis.
[0365]
[0366] 实施例15不同阶段肝纤维化和肝硬化患者的代谢物全谱
[0367] 肝脏疾病通常从脂肪性肝炎(例如：NASH)逐渐进展至肝纤维化甚至肝硬化。GUDCA，TCDCA和酪氨酸水平随肝病进展而逐渐增加(图7，8和9)。肝纤维化也可以通过进展或严重程度进行分期，例如S1，S2和S3(无肝硬化)和S4(即肝硬化)。类似地，晚期S4纤维化即肝硬化可以通过进展或严重程度进一步分期，例如肝功能A-C。我们比较了肝纤维化和肝硬化患者不同阶段的胆汁酸水平，结显示，GUDCA和酪氨酸在三个阶段的纤维化患者和三个肝硬化患者阶段的血清中均有差异性表达(图10，11和13)。
[0368] 利用上述差异性表达的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸的典型判别分析结果显示，肝纤维化S1，S2，S3和肝硬化A，B和C级聚类成六组(图12A，12B和12C)。组1-6对应于各个阶段S1，S2，S3，CPA，CBP和CPC。结果，在S1的171例患者中，正确分类145例，正确率为84.8％。第S2，S3和S4以及CP A，B和C级肝硬化患者的正确分类率分别为91.1％，82.5％，82.1％，
70.0％和93.8％(表17，表18和表19)。
70.0％和93.8％(表17，表18和表19)。
[0369] 表17检测的胆汁酸对肝病分级的准确性。
[0370] Table 17.Accuracy of Stage Classification with all the measured bile acidsa
[0371]
[0372] 表18游离脂肪酸对肝病分级的准确性。
[0373]
[0374] 表19检测的氨基酸对肝病分级的准确性。
[0375]
[0376] 实施例16胆汁酸分析
[0377] 进一步数据分析提示了其他的具有诊断潜力的胆汁酸生物标记物。比较肝纤维化和肝硬化患者胆汁酸(BA)水平时，GCDCA，GCA，CDCA，CA，UDCA，GUDCA，GHDCA，TCDCA，TCA，7-KLCA，LCA，TUDCA，3-KCA，THCA，TLCA和GLCA在对照组受试者中的水平非常低，而在纤维化患者中的水平显着增加，且在肝硬化患者中的水平增加的更为显著。
[0378] 这些数据结果显示，这些胆酸可以作为肝病诊断或区分肝病分期的生物标志物组合。
[0379] 实施例17试剂盒
[0380] 本发明所述试剂盒示例包括对应生物标志物的已知量同位素标记(例如:用C13标记)内标。该试剂盒可以包含所有的内标的混合物，也可能包含单独的每种内标。该试剂盒测量待评估的代谢物全谱中的每个内标的量，并与受试者的样本中相应生物标志物量进行比较。每种内标在试剂盒中可以是固体也可以是液体。如果内标为固体，则在使用试剂盒前需要将其悬浮于溶液中。试剂盒可以选择的包含每种代谢物生物标志物的至少一种标记内标。
[0381] 试剂盒示例包括至少一个容器，包含代谢物组谱中的内标。容器可以是小管，小瓶或多孔或多室板。容器可以具有单个小室，容器也可以具有多个小室。例如:容器可以是多孔板(例如，96孔微量滴定板)。其他类似的容器也可以。在一些试剂盒中，容器可适用于测量对象样本中的一种或多种生物标志物的内标。在一些试剂盒中，容器用于测量受试者样本中一种或多种代谢物的内标并用于光谱分析，例如:色谱-质谱法。例如:容器可以用于GC-TOFMS和/或LC-TQMS。在其他试剂盒中，容器可用于检测受试者样本中的一种或多种代谢物的其他测试(例如:酶促，化学，比色，荧光计量等)。如上所述，内标可以混合放在一个或多个小瓶或小管中，或者在一个或多个腔的小室中。
[0382] 一些试剂盒包含多个容器。例如，一些试剂盒包括具有内标的一个或多个容器。另外，一些试剂盒可以包括一个或多个具有内标的容器以及用于测量受试者样本中一种或多种代谢物的内标的额外容器(例如，多孔板或另一个小管或小瓶)。一些试剂盒可以存在一种容器容纳一个或多个内标。在容器是多孔或多室的试剂盒中，代谢物的内标可位于一个或多个孔或室中。在一些试剂盒中，代谢物的内标必须分散到一个或多个孔或腔室中。试剂盒的容器也可以接受来自至少一个受试者的生物样本。例如:试剂盒的容器包括多个小室，受试者的生物样本可以分布到一个或多个小室中。在一些情况下，可以将一个或多个受试者样本分配到多个小室中。试剂盒的容器通常接受流体样本(例如，流体生物样本或已被处理为流体的固体生物样本)。
[0383] 一些试剂盒还包括用于测量内标和生物标记物的定量试剂以及在受试者样本中的一种或多种代谢物。这些试剂可以在试剂盒内的一个或多个额外的容器中。
[0384] 试剂盒示例包括多个内标，每个内标在单独的容器中或在相同的容器中。容器可以选用与GC-MS或LC-MS设备配套的微量滴定板。微量滴定板有足够数量的小室以接收至少一种内标。内标具有已知浓度。在将内标分配到容器中之后，将一部分目标样本分配到微量滴定板中。可以将目标样本分成一个或多个小样本。如果将多个小样本分配到微量滴定板中，则可将每个小样本分配到单独的滴定孔中。另外，如果多个小样本被分配到微量滴定板中，则每个小样本的量可以不同。
[0385] 实施例18试剂盒的使用
[0386] 试剂盒可用于实施本发明所述方法:通过对代谢物全谱中的代谢物定量来评估肝病状态。例如:本发明所述试剂盒可用于诊断(例如:确定是否存在)肝病。另外，本发明所述试剂盒可用于确定患有肝病的受试者是否对肝病的治疗有效果。
[0387] 本发明所述试剂盒可用于评估受试者生物样本。样本可以是流体样本(例如:血浆或血清)。试剂盒还可以在不处理样本的情况下评估受试者样本中的代谢物全谱。试剂盒可能需要提前处理受试者样本中的代谢物。
[0388] 医生优选的从受试者处取样并将样本送至临床实验室，然后使用本发明所述试剂盒进行测试。或者，医生所在的临床机构或医疗机构可以使用本发明所述试剂盒进行检测。
[0389] 试剂盒可用于检测受试者样本中一种或多种代谢物的水平。例如:试剂盒可用于受试对象样本的光谱分析。试剂盒也用于光谱分析，例如:气相色谱和/或液相色谱。例如:可将试剂盒用于受试者样本中代谢物的LC-TQMS分析。或者，试剂盒可以用于不同类型的代谢物特异性测试(例如:酶促，化学，比色，荧光测定等)从而检测受试者样本中的代谢物水平。试剂盒内的内标可以用于阳性对照，来检测受试样本中代谢物的水平。试剂盒的内标可用于校准和/或测量受试者样本中代谢物的水平。根据检测类型来测量受试样本中代谢物的水平，可以将不同成分分装到一个或多个含有内标容器中。然后根据检测结果报告评估个人状况，如有必要，提供建议或选择合适的治疗方法。
[0390] 实施例19生物标志物组合和诊断模型
[0391] 从实施例8详述的23个胆汁酸标志物列表中，选择具有诊断效能的生物标记物亚组。根据差异倍数(FC)，曲线下面积(AUC)和重要性(VIP)选择下列物质:GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA。在对照和所有肝脏疾病(NASH，纤维化，肝硬化)患者中建立OPLS-DA模型(表20)。
[0392] 表20用于区分肝病患者和正常对照的一组生物标记物组合中各标记物的ROC曲线下面积。
[0393] Table 20 Area under the curve(AUC)of ROC curve analysis for each biomarker 0f a selected panel for the differentiation of liver disease patients compared to controls.
[0394]
[0395] 通过上述七个代谢物组合，使用逻辑回归建立多变量模型。上述代谢物组合为胆汁酸组合。逻辑回归(LR)将上述七种胆汁酸合并成一个胆汁酸标记。将疾病(CHB)和健康对照，或疾病(CHB)和疾病(纤维化)或疾病(纤维化)和疾病(肝硬化)的二元结果作为应变量，七种胆汁酸构作为自变量，建立逻辑回归模型，截断值为0.5；最大迭代次数为20。统计软件为SPSS 23.0(IBM SPSS，美国)。逻辑回归模型的ROC曲线用模型的拟合概率作为灵敏度和特异性的切点绘制。
[0396] 基于测试集的数据建立了以下用于评估肝脏疾病状态(例如：疾病的诊断)的回归模型。在训练集上训练的每个模型以确定受试者肝病状态的可能性。区分NASH患者和健康对照，基于七个BAs(表21)建立逻辑回归模型如下：
[0397] 00302 Probability＝exp{-1.923-0.004(GCDCA)+0.010(GCA)+0.116(TCDCA)-0.072(TCA)-0.035(GUDCA)-0.122(TUDCA)+0.025(7-KLCA)}/(1+exp{-1.923-0.004(GCDCA)+0.010(GCA)+0.116(TCDCA)-0.072(TCA)-0.035(GUDCA)-0.122(TUDCA)+0.025(7-KLCA)})
[0398] 表21为区分NASH患者与对照组生物标记物组合的逻辑回归分析。
[0399] 00303 Table 21 Logistic regression analysis of biomarker signatures of a selected panel for discriminating NASH subjects from comparison with controls.
[0400]
[0401] Page 104 of 175 Attorney Docket#WJ_PCT_29_May_2017
[0402]
[0403]TUDCA -0.122 0.339 0.720 0.886 0.456 1.720
Constant -1.923 0.690 0.005 0.146
Constant -1.923 0.690 0.005 0.146
[0404] 使用Wald检验计算P值。
[0405] 区分NASH患者和纤维化患者，基于七个BAs(表22)建立的逻辑回归模型如下：
[0406] 00306 Probability＝exp{-0.511-0.0003(GCDCA)+0.001(GCA)+0.007(TCDCA)-0.007(TCA)-0.003(GUDCA)+0.083(TUDCA)+0.491(7-KLCA)}/(1+eexp{-0.511-0.0003(GCDCA)+0.001(GCA)+0.007(TCDCA)-0.007(TCA)-0.003(GUDCA)+0.083(TUDCA)+0.491(7-KLCA)})
[0407] 表22为区分NASH患者与肝纤维化患者的生物标志物组合的逻辑回归分析。
[0408] 00307 Table 22 Logistic regression analysis of biomarker signatures of a selected panel for discriminating NASH from fibrosis
[0409]
[0410] 使用Wald检验计算P值。
[0411] 区分肝硬化患者和纤维化患者，基于七个BAs(表23)建立的逻辑回归模型如下：
[0412] 00310 Probability＝exp{-2.514-0.0002(GCDCA)+0.001(GCA)+0.0004(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.020(TUDCA)+0.020(7-KLCA)}/(1+exp{-2.514-0.0002(GCDCA)+0.001(GCA)+0.0004(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.020(TUDCA)+0.020(7-KLCA)})
[0413] 表23为区分患有肝硬化患者的肝纤维化患者的生物标志物组合的逻辑回归分析。
[0414] 00311 Table 23 Logistic regression analysis of biomarker signatures of a selected panel for discriminating patients with fibrosis from patients with cirrhosis.
[0415]
[0416] 用于区分NASH患者与健康对照(表21)但多变量ROC曲线的AUC值为0.935(95％CI＝0.855至0.985)(图16A和16D)。使用0.429的截断值，灵敏度为87.0％，特异性为89.1％。矫正了BMI，年龄和性别后(表25)，血清BA统计学显著(p＜0.001)，比值比为567.635(95％CI，60.667至5311.080)。为了区分NASH和纤维化患者，模型的AUC值为0.861(95％CI＝
0.780至0.942)(图16B和16E，表22)。灵敏度和特异性分别为88.8％和82.6％，使用0.811为截断值(表24)。矫正BMI，年龄和性别后，血清BA标记仍然显著(p＜0.001)，比值比为75.243(95％CI，24.451至232.654)(表26)。为了区分纤维化与肝硬化患者(表23)，模型AUC为
0.889(95％CI＝0.851-0.926)，78.8％的灵敏度和87.2％的特异性(图16C和16F，表24)。矫正BMI，年龄和性别后，血清BA仍然显着(p＜0.001)，比值比为177.141(95％CI，38.264至
820.068)(表27)。
0.780至0.942)(图16B和16E，表22)。灵敏度和特异性分别为88.8％和82.6％，使用0.811为截断值(表24)。矫正BMI，年龄和性别后，血清BA标记仍然显著(p＜0.001)，比值比为75.243(95％CI，24.451至232.654)(表26)。为了区分纤维化与肝硬化患者(表23)，模型AUC为
0.889(95％CI＝0.851-0.926)，78.8％的灵敏度和87.2％的特异性(图16C和16F，表24)。矫正BMI，年龄和性别后，血清BA仍然显着(p＜0.001)，比值比为177.141(95％CI，38.264至
820.068)(表27)。
[0417] 表24不同研究组中ROC曲线下面积、灵敏度和特异性。
[0418] Table 24 Area under the ROC Curve(AUC)，Sensitivity，and Specificity According toDifferent Study Groups.＊
[0419]
[0420] 00313 ＊Cl denotes confidence interval.
[0421] *CI为置信区间。
[0422] 表25逻辑回归分析显示用于诊断NASH的胆汁酸标记物组合是独立于BMI、年龄和性别的指标。
[0423] Table 25 Logistic regression analysis reveals identified BA panel signature for the diagnosis of NASH patients from controls was independent of the possible confounding risk factors including BMI，age and sex.
[0424]3
Odds ratio(95％Cl) S.E. P value
NASH-associated BA signature 567.635(60.667-5311.080) 1.14E+00 2.72E-08BMI1 1.033(0.866-1.232) 9.00E-02 7.21E-01
Age1 1.026(0.959-1.098) 3.40E-02 4.55E-01
Sex2 0.560(0.099-3.182) 8.86E-01 5.13E-01
Odds ratio(95％Cl) S.E. P value
NASH-associated BA signature 567.635(60.667-5311.080) 1.14E+00 2.72E-08BMI1 1.033(0.866-1.232) 9.00E-02 7.21E-01
Age1 1.026(0.959-1.098) 3.40E-02 4.55E-01
Sex2 0.560(0.099-3.182) 8.86E-01 5.13E-01
[0425] P值用Wald检验计算。1BMI和年龄是连续变量。2男性或者女性。3奇异值大于1表示与连续变量的较低值或分类变量的参考组相比，奇异值大于1表示较高的肝纤维化可能性。
[0426] 表26逻辑回归分析显示用于诊断NASH中肝纤维化病人的胆汁酸特征与BMI、年龄和性别不相关。
[0427] Table 26 Logistic regression analysis reveals identified BA signature for the diagnosis of fibrosis patients from NASH patients was independent of the possible confounding risk factors including BMI，age and sex.
[0428] Odds ratio(95％CI)3 S.E. P value
Fibrosis-associated BA signature 75.243(24.451-232.654) 5.75E-01 5.39E-14BMI1 1.001(0.895-1.119) 5.70E-02 9.87E-01
Age1 0.993(0.959-1.030) 1.80E-02 7.20E-01
Sex2 0.392(0.143-1.073) 5.14E-01 6.80E-02
Fibrosis-associated BA signature 75.243(24.451-232.654) 5.75E-01 5.39E-14BMI1 1.001(0.895-1.119) 5.70E-02 9.87E-01
Age1 0.993(0.959-1.030) 1.80E-02 7.20E-01
Sex2 0.392(0.143-1.073) 5.14E-01 6.80E-02
[0429] P值用Wald检验计算。1BMI和年龄是连续变量。2男性或者女性。3奇异值大于1表示与连续变量的较低值或分类变量的参考组相比，奇异值大于1表示较高的肝纤维化可能性。
[0430] 表27逻辑回归分析显示用于诊断肝纤维化病人中肝硬化病人的胆汁酸特征谱与BMI、年龄和性别不相关。
[0431] Table 27 Logistic regression analysis reveals identified BA signature for the diagnosis of cirrhosis patients from fibrosis patients was independent of the possible confounding risk factors including BMI，age and sex.
[0432]
[0433] P值用Wald检验计算。1BMI和年龄是连续变量。2男性或者女性。3奇异值大于1表示与连续变量的较低值或分类变量的参考组相比，奇异值大于1表示较高的肝纤维化可能性。
[0434] 结果显示，本发明所述BA组合的AUC高于AST/ALT比值，TBIL，MELD评分，APRI和FIB-4(图16A-C和图17A-D，进一步的细节在补充材料)。证明了BA组合与传统临床参数相比具有更强大的诊断能力。
[0435] 用GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCAd的典型判别分析结果画图显示，对照，NASH患者，纤维化和肝硬化聚类成四类(图20)。在169个对照中，132或78.1％分类正确。NASH，纤维化和肝硬化患者的正确分类率分别为63.0％，80.7％和70.6％(表28)。
[0436] 患者血清GUDCA和TCDCA水平逐渐升高过程与肝脏疾病从NASH到纤维化以及纤维化到肝硬化的进展一致(图16G和16H)。将BA组合的水平与65例糖尿病患者进行比较，可以正确区分糖尿病患者和肝病患者(图16J和16K和图19)。
[0437] 表28利用GCA、GCDCA、TCA、TCDCA、GUDCA、TUDCA、DCA和7-KLCA水平对正常对照、NASH、肝纤维化和肝硬化的分类结果。
[0438] Table 28 Classification results of patients with NASH，fibrosis，cirrhosis and controls using the bile acid levels of GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA，DCA and 7-KLCAa
[0439]
[0440] 实施例20生物标志物组合评分模型评估肝病状态
[0441] 在不包括实施例8所述测试集中任何肝病受试者的一个新的验证集中测量上述胆汁酸组合的水平。验证集包括502名非糖尿病、非酒精性、没有肝脏疾病的健康受试者。来自该组受试者的数据见表29。还在这些受试者中检测了其他肝病相关标志物(例如：ALB，ALP，ALT，AST)。
[0442] 验证集还包括慢性乙型肝炎的471名肝病受试者(慢性肝病，CLD)，没有一例包含在测试集中。这471例肝病患者包括132例无纤维化的乙型肝炎患者、30例纤维化S1期患者、26例纤维化S2期患者、20例纤维化S3期患者、49例CP A型肝硬化、99例CP B型肝硬化、22例CP C型肝硬化以及93例肝细胞癌患者伴随CP C型肝硬化。我们检测了验证集的GCA、GCDCA、TCA、TCDCA、GUDCA、TUDCA、DCA和7-KLCA水平，其结果在表30中显示。验证集中的检测结果与测试集的结果一致。
[0443] 表29验证集样本的人口统计学数据。
[0444]
[0445]
[0446]
[0447]
[0448] 表30验证集样本中血清胆汁酸浓度。
[0449]
[0450] 上述模型结果表明，血清BA水平越高肝脏疾病风险越高。验证集的结果再一次证明了这七种胆汁酸区分受试者的能力。在对年龄，性别和BMI进行校正后，验证集血清样本的生物标记物组合水平代入训练集中训练的NASH vs对照建立的模型可以成功区分HB患者与健康对照(AUC：0.808(95％CI：0.747-0.868))；带入训练集中训练的NASH vs纤维化模型可以成功区分HB患者和纤维化患者(AUC：0.861(95％CI：0.796-0.926)；带入训练集中训练的纤维化和肝硬化模型可以成功区分纤维化患者和肝硬化患者(AUC：0.792(95％CI：0.705-0.879))(图17A-C)。此外，矫正了年龄，性别和BMI后，七种胆汁酸组合能够区分肝硬化患者和HCC患者(AUC：0.871(95％CI：0.815-0.926))(图17D)
[0451] 新验证集中新建立的模型如下：
[0452] using the newly established model：Probability＝exp{0.503-0.001(GCDCA)-0.0002(GCA)+0.001(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.0001(TUDCA)+0.029(7-KLCA)}/(1+exp{0.503-0.001(GCDCA)-0.0002(GCA)+0.001(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.0001(TUDCA)+0.029(7-KLCA)})which was图17E所示为验证集中GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA血清水平改变的柱状图。使用GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA可以将HBV，纤维化，肝硬化和HCC的患者聚类成四个组(图21和图
22)。图17F显示不同纤维化分期S1，S2和S3和肝硬化不同CP分级A，B和C以及HCC的肝硬化患者的GUDCA水平。
22)。图17F显示不同纤维化分期S1，S2和S3和肝硬化不同CP分级A，B和C以及HCC的肝硬化患者的GUDCA水平。
[0453] 我们发现上述胆汁酸组合的AUC大于之前报道的AST/ALT比值，TBIL，MELD评分，APRI和FIB-4(图17A-D)。这证明了单独使用或与本文所述其他生物标志组合使用时，该组的生物标志物分类作用显著。
[0454] 实施例21通过用胆汁酸调节剂治疗和预防肝癌
[0455] 该实施例详述了失调的胆汁酸(BAs)与肝脏疾病的密切相关，且由于肠道微生物菌群的改变。该实施例显示，在链脲佐菌素和高脂肪饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌的小鼠模型中，包括脱氧胆酸盐(DCA)，牛磺胆酸盐(TCA)，牛磺鹅脱氧胆酸盐(TCDCA)和牛磺胆酸盐(TLCA)等疏水BA在肝内滞留。另外，慢性HFD喂养的小鼠自发形成了肝BA水平显着增加的肝脏肿瘤。通过2％消胆胺喂养的NASH-HCC小鼠模型，通过增强疏水性BAs的肠排泄来治疗性调节BA水平可以显着阻止HCC发展。肠道微生物菌群的改变与肝脏和粪便中BA水平改变密切相关。HFD诱导的炎症抑制了关键BA转运蛋白，导致肝内BA浓度持续增加。该研究还显示BA处理的正常人肝细胞增殖显着增加，TCDCA处理的HepG2细胞中肿瘤抑制基因CEBPα的下调表达，表明几种疏水BA可协同促进肝癌发生。
[0456] 由此推测，BAs的肝内积累可诱导持续的肝细胞损伤，导致纤维化和恶性肿瘤的后续发展。使用链脲霉素高脂肪饮食(STZ-HFD)诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)-HCC小鼠模型，从脂肪变性到NASH，纤维化以及最终HCC肝病进展高度相关，并且该模型组近100％的小鼠最终引发了HCC。该假设在慢性HFD喂养的小鼠和人正常肝细胞和肿瘤细胞中得到进一步证实。
[0457] 材料和方法
[0458] 小鼠和饮食
[0459] 实验1:本发明使用由STZ与HFD偶联诱导的NASH-HCC C57BL/6J小鼠模型。无病原体的14日龄C57BL/6J小鼠购自日本CLEA公司(日本东京)，将新生雄性小鼠分成两组:对照组和模型(STZ-HFD)组。对照组中的小鼠不经任何处理地喂养正常饮食(来自CLEA Japan Inc.的CE-2，由12kcal％脂肪，29kcal％蛋白质，59kcal％碳水化合物组成)。STZ-HFD组的小鼠在出生后第2天接受200μg STZ(Sigma，MO，美国)单次皮下注射，4周后喂食HFD(来自CLEA japan Inc.，HFZ的STZ-FHD组)直到16周(图23A)。在实验过程中，所有动物的体重每周记录一次。在第6，8，12和20周，将每组6只小鼠安乐死，并收集肝脏，血浆和粪便样本。实验2:除实验1外，我们喂养C57BL/6J雄性小鼠，观察肝脏癌变，并进一步证实BAs会促进肝脏癌变。包括两组小鼠:(1)对照；(2)HFD。我们在不同的时间点处死小鼠，第58周，我们在HFD喂养的小鼠中观察到HCC形成。
[0460] 实验3:我们发现实验1中发生肝癌的小鼠BA水平显着增加；重复NASH-HCC小鼠模型来验证BA结合树脂消胆胺能否减弱/防止肝癌发生。本实验包括三组小鼠:(1)对照(n＝9)；(2)模型(STZ-HFD，n＝30)和(3)在STZ-HFD-BA树脂(n＝30)组。所有步骤与实验1相同。
在第20周，小鼠安乐死，收集肝脏，血浆和粪便样本(图26A)。
在第20周，小鼠安乐死，收集肝脏，血浆和粪便样本(图26A)。
[0461] 所有的动物手术都根据国家科学院制定国立卫生研究院出版的《NIH出版物86-23，1985年修订的实验动物护理和使用指南》进行。
[0462] 血清ALT和AST的测量
[0463] 使用FUJI DRI-CHEM 7000(Fujifilm，Tokyo，日本)测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。
[0464] 组织学评估
[0465] 将肝组织固定在10％中性福尔马林缓冲液中，包埋在石蜡块中，并通过常规HE染色。计算个体NAFLD活动评分。
[0466] 胆汁酸的测量
[0467] 通过超高效液相色谱三重四极杆质谱法(UPLC-TQMS)定量测量血浆，肝脏和粪便中的BA水平。使用ACQUITY BEH C18色谱柱(1.7μm，100mm×2.1mm)(Waters，Milford，MA)分离物质。使用MassLynx 4.1版本进行数据采集，并且使用TargetLynx程序管理器4.1版本(Waters Corp.，Milford，MA)进行BA定量。
[0468] 肠道微生物菌群
[0469] 使用细菌标签编码的FLX 16S rDNA扩增子焦磷酸测序(bTEFAP)方法表征肠道细菌的多样性。
[0470] 实时定量聚合酶链式反应
[0471] 使用RLT Plus和AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)中的匀浆组织裂解物提取DNA和RNA。使用RNA纳米6000芯片和安捷伦生物分析仪2100上的1μL RNA评估RNA。在Applied Biosystems 7900 FAST Real-Time PCR Systems(Applied Biosystems)上通过比较循环阈值方法一式三份测量靶mRNA的表达。正向和反向引物购自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)。将靶基因的表达标准化为ACTB水平，并使用“dCT”也称为比较Ct方法计算靶基因的相对表达量。
[0472] 肝脏中TG，IL-6和TNF-α的测量
[0473] 使用BlueGene Biotech，中国的Elisa试剂盒测量肝脏中的甘油三酯(TG)，白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平。
[0474] 血浆，肝脏和粪便中LPS的测量
[0475] 使用小鼠LPS Elisa试剂盒(BlueGene Biotech，中国上海)测定血浆，肝脏和粪便中脂多糖(LPS)的水平。
[0476] 统计分析
[0477] 使用GraphPad Prism(6.0版本；GraphPad Software，San Diego，USA)和SPSS 22.0(IBM SPSS，USA)处理所有统计分析。数据表示为平均值±SEM。BA测量中的各组之间的差异通过t检验分析并使用Holm-Sidak方法校正。p<0.05为显着。用Spearman相关分析来评估肝脏和粪便中肠道微生物群和BA水平之间的相互作用，相关系数从1.0(最大正相关)到-
1(最大反相关)，0为不相关。
1(最大反相关)，0为不相关。
[0478] 细胞培养和BA处理
[0479] 正常人肝细胞系WRL-68和THLE-2购自Sigma。收获细胞后在PBS中漂洗两次，重悬于10％活性炭剥离的FBS无糖DMEM(Life Technologies)中，并以5×104/孔的密度接种到6孔板中。将葡萄糖(Glc，Sigma)稀释到27.5mM，将油酸(OA，Sigma)稀释到0.3mM以模拟体外高葡萄糖和脂肪条件。将5种胆汁酸，CA，TLCA，TCA，TCDCA，GCDCA，DCA或LCA中的每一种以5μM，50μM，100μM或200μM的浓度加入培养基中。14天后，
[0480] 将正常培养基(含有10％FBS的DMEM-F12)加入各孔中置换用过的培养基。在正常培养基中检测细胞增殖和生长。此外，用western印迹分析分析癌蛋白c-myc表达的改变。
[0481] 人类癌细胞系HepG2购自Sigma，在10％胎牛血清(FBS，Life Technologies)的DMEM-F12(Life Technologies)中培养。收获细胞，用PBS漂洗两次，接种于10％活性炭剥离的FBS和6mM葡萄糖的无糖DMEM(Life Technologies)中。将5种胆汁酸，CA，UDCA，TCDCA，DCA或LCA中的每种以100μM的浓度加入培养基中。14天后，用新鲜正常培养基(含有10％FBS的DMEM-F12)代替用过的培养基。然后检测细胞增殖，用western印迹分析肿瘤抑制蛋白CEBPα的表达。
[0482] 上述过程使用的一抗有:c-myc(Santa Cruz)，CEBPα(Santa Cruz)和Actin(Li-cor)并按制造商指示的浓度稀释使用。
[0483] 结果
[0484] STZ-HFD诱导的NASH-HCC小鼠中肝脏BA显着增加，在雄性C57BL/6J小鼠中成功发现脂肪变性，NASH，纤维化和HCC的病理表型。新生小鼠皮下注射STZ诱导出轻度胰岛炎症和胰岛破坏。出生4周后，给予STZ引发的小鼠HFD，导致从脂肪肝到NASH，纤维化和HCC的连续性组织学改变(图23A)。值得注意的是，所有HFD喂养的小鼠都发展为HCC(图23B)。H&E染色(图23C)显示脂肪肝，但6周时无炎性病灶，中度炎性浸润的脂肪肝包括嗜中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞，第8周时肝细胞的气球样变性，第12周时慢性纤维化和第20周NAFLD活动评分增加。
[0485] 在STZ-HFD小鼠中观察到体重增加伴有肝损伤加重。与正常小鼠相比，STZ-HFD组肝脏重量显着增加，特别是在纤维化和HCC阶段(图23D)。STZ-HFD组小鼠空腹血糖和肝脏TG显着升高(图23E和23F)。STZ-HFD小鼠血清ALT和AST轻度升高。与对照相比，STZ-HFD组血浆、肝脏和粪便中的内毒素(脂多糖，LPS)水平显着增加(图23G)。
[0486] 在第12周和第20周，模型小鼠肝脏中TCA，DCA，GCA，TDCA，TLCA，TUDCA，TCDCA和总BA的水平显着增加(图23H)。BAs肝脏积累发生于肝纤维化阶段，而同一时期粪便中BAs消失，HCC阶段逐渐增加。在所有BA中，与对照相比，TCDCA是模型小鼠肝脏中最显着增加的一个胆汁酸。除了这些BA之外，模型小鼠中的血浆和粪便中的LCA增加。
[0487] 与对照组相比，模型组纤维化阶段(第12周)粪便中的主要BA，CA和CDCA降低，而在血浆和肝脏中，上述胆汁酸水平增加。模型组的总粪便BAs比纤维化阶段的对照略低，而在HCC阶段，其在纤维化和HCC阶段的血浆和肝脏中的水平升高。
[0488] 肝脏肿瘤在慢性HFD喂养小鼠模型中的发展
[0489] 在STZ-HFD处理的小鼠中观察到肝脏中的BAs显着增加，我们假设HFD诱导的高浓度BA和它们在肝脏中滞留可能会促进肿瘤的发生发展。由于STZ已经被国际癌症研究机构归类为潜在的致癌物，所以我们研究了单独使用HFD是否会诱导肝癌，尽管我们在STZ干预20周的雄性小鼠中没有观察到HCC。在长期的HFD干预研究中，HFD喂养58周以上的小鼠的一半以上(6只)中观察到肝脏肿瘤(图24A和24B)。在HFD喂养的诱导HCC小鼠中，肝重量(图
24C)和肝与体重比(图24D)显着增加。血浆，肝脏和粪便中的LPS水平在HCC小鼠中均显着增加(图24E)。肝脏和血浆BAs，TCA，GCA和TCDCA在HFD组的所有小鼠中均增加，与正常相比，在发生HCC的小鼠中具有统计学显着性(图24F和24G)。
24C)和肝与体重比(图24D)显着增加。血浆，肝脏和粪便中的LPS水平在HCC小鼠中均显着增加(图24E)。肝脏和血浆BAs，TCA，GCA和TCDCA在HFD组的所有小鼠中均增加，与正常相比，在发生HCC的小鼠中具有统计学显着性(图24F和24G)。
[0490] 增加疏水性BA的肠代谢可预防HCC的发生发展
[0491] 结果显示HFD诱导的肝Bas积累会促进肝肿瘤。为了确定BAs在HCC发展中的作用，我们重复了STZ-HFD小鼠模型并且减少了口服消胆胺的小鼠中BA的量(图25A)。我们观察到，与STZ-HFD模型组相比，消胆胺显着降低肝脏恶性病变的发生率和病变大小(图25B)。消胆胺治疗使STZ-HFD组小鼠肝脏在组织学上趋向于正常，并且在血液和肝组织病理学特征的逆转也支持上述改变(图25C和25D)。消胆胺给药后，IL-6，TNF-α，胶原蛋白1型和癌相关基因磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Gpc3)的表达趋于正常(图25E)。BA转运蛋白(图25E)以及BAs，DCA，TCA和TCDCA改变(图25F)，并且消胆胺干预后血浆也相应的减少。消胆胺干预后，肠道微生物群的中断和血浆，肝脏和粪便中LPS的水平也恢复正常(图25G和25H)。
[0492] 肠道菌群在肝癌发生过程中显着改变并与BA相关
[0493] 宏基因组学数据显示，在第6,8,12和20周，STZ-HFD干预小鼠的肠道微生物群发生显著改变(图26A-26D)。特定微生物的相对丰度随肝病进展而变化。在模型组中，粪便中的厚壁菌门和安定菌门的OTUs的相对丰度(％)显着增加，而类杆菌和变形菌门与对照相比显着降低(图26B)。模型组梭状芽孢杆菌，拟杆菌属和脱硫弧菌属的水平显着增加(图26C)。粪便梭菌，类杆菌，奇异菌，脱硫孤菌的OTUs的相对丰度(％)显着增加，而Paasutterella spp。和Akkermansia spp模型组与对照组相比显着降低(图26D)。据报道，所有这些细菌都与BA解偶联，脱羟基化以及BA降解成CO2和H2O有关。
[0494] 图26E中肠道微生物群落变化与BA浓度之间的Spearman相关分析显示TCDCA与Barnesiella(r＝-0.31，p＝0.033)，Odoribacter(r＝-0.29，p＝0.047)，Parasutterella(r＝-0.34，p＝0.019)，存在显著的负相关；和Paraprevotella(r＝-0.48，p＝0.001)，Xylanibacter(r＝0.40，p＝0.05)，埃希氏菌(r＝0.41，p＝0.004)存在显着正相关。TCA与Parabacteroides(r＝0.46，p＝0.001)，Alistipes(r＝0.40，p＝0.005)和Sarcina(r＝0.30，p＝0.038)显著相关。GCA与Alistipes(r＝0.34，p＝0.017)和Parabacteroides(r＝
0.30，p＝0.036)显著相关。TLCA与Parasutterella(r＝-0.30，p＝0.036)，Paraprevotella(r＝-0.42，p＝0.003)，Parabacteroides(r＝0.29，p＝0.043)和Escherichia(r＝0.50，p＝0.000)显著相关。TDCA与Alistipes(r＝0.51，p＝0.000)和Parabacteroides(r＝0.58，p＝0.000)显著相关。
0.30，p＝0.036)显著相关。TLCA与Parasutterella(r＝-0.30，p＝0.036)，Paraprevotella(r＝-0.42，p＝0.003)，Parabacteroides(r＝0.29，p＝0.043)和Escherichia(r＝0.50，p＝0.000)显著相关。TDCA与Alistipes(r＝0.51，p＝0.000)和Parabacteroides(r＝0.58，p＝0.000)显著相关。
[0495] CDCA与Oribacterium(r＝0.31，p＝0.03)和slackia(r＝0.38，p＝0.009)丰度呈正相关，CA与寡单胞菌呈正相关(r＝0.53，p＝0.0001)与parabacteroides呈负相关(r＝-0.29，p＝0.046)。另一方面，类杆菌与LCA(r＝0.60，p＝8.6E-06)，DCA(r＝0.41，p＝
0.005)，TLCA(r＝0.37，p＝0.012)和TDCA(r＝0.38，p＝0.008)。梭菌与DCA(r＝0.31，p＝
0.032)和LCA(r＝0.64，p＝1.1E-06)，GLCA(r＝0.46，p＝0.001)和GDCA(r＝0.48，p＝
0.001)。TACCA(r＝-0.51，p＝0.000)，GCA(r＝-0.55，p＝0.000)，TLCA(r＝-0.32，p＝
0.027)0.000)和TCA(r＝-0.62，p＝0.000)，Parasutterella与DCA(r＝-0.38，p＝0.009)，LCA(r＝-0.69，p＝8.6E-08)呈负相关。粪肠杆菌与DCA呈显著负相关(r＝-0.39，p＝
0.008)。LCA与Barnesiella(r＝-0.57，p＝3.3E-05)和异味细菌(r＝-0.58，p＝4.8E-05)也呈显著负相关。
0.005)，TLCA(r＝0.37，p＝0.012)和TDCA(r＝0.38，p＝0.008)。梭菌与DCA(r＝0.31，p＝
0.032)和LCA(r＝0.64，p＝1.1E-06)，GLCA(r＝0.46，p＝0.001)和GDCA(r＝0.48，p＝
0.001)。TACCA(r＝-0.51，p＝0.000)，GCA(r＝-0.55，p＝0.000)，TLCA(r＝-0.32，p＝
0.027)0.000)和TCA(r＝-0.62，p＝0.000)，Parasutterella与DCA(r＝-0.38，p＝0.009)，LCA(r＝-0.69，p＝8.6E-08)呈负相关。粪肠杆菌与DCA呈显著负相关(r＝-0.39，p＝
0.008)。LCA与Barnesiella(r＝-0.57，p＝3.3E-05)和异味细菌(r＝-0.58，p＝4.8E-05)也呈显著负相关。
[0496] BA积聚会下调BA运输和合成相应基因
[0497] 基因表达分析显示参与BA转运和肝脏合成的基因下调(图27A)。在NASH和纤维化的小鼠模型中，小鼠肝脏中FXR表达显着降低，表明下调肝外排转运蛋白，从而导致肝细胞中BA沉积增加，诱导肝损伤。第6,8,12和20周时BSEP显着下调，第6周CYP7A1上调，导致HCC病理发展中肝BA沉积的显着增加。与在第6,8,12和20周小鼠肝脏中观察到异常高的BA水平一致。所有这些表明HFD诱导的脂肪肝导致BA合成和运输失调，显着抑制肝FXR和BSEP表达。STZ-HFD抑制BA摄取转运蛋白，牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)，顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)和SHP的表达。
[0498] 细胞因子表达在肝癌发生中显着增加
[0499] 在组织学上可分辨的胶原沉积之前，炎性相关基因、脂肪变性和脂肪性肝炎的相关基因如:IL-6和TNF-α的表达增加，纤维化相关基因，TIMP金属肽酶抑制剂1(TIMP-1)和胶原蛋白1型的表达上调，肝癌相关基因(基质金属蛋白酶9(MMP-9)和Gpc3的表达上调(图27B)，所有这些结果表明STZ-HFD-诱导的炎症氧化应激抑制了BA转运蛋白，导致肝内BA浓度增加(图23)，促进了几种重要的促炎因子、纤维化和癌症标志物的表达。
[0500] BAs启动正常肝细胞向恶性转化并抑制肿瘤抑制基因CEBPα在HepG2细胞中的表达[0501] 研究发现BAs特别是DCA，LCA，TLCA，TCDCA，TCA，CA，UDCA和GCDCA在高葡萄糖和脂肪酸浓度的培养下的正常人肝细胞中有肿瘤促进作用，这个发现进一步验证了我们的假设。我们发现在高葡萄糖(27.5mM)和油酸(0.3mM)的条件下，经DCA，LCA，CA和TCDCA处理，促进了WRL-68(图28A)和THLE-2以及HepG2细胞的增殖(图28B)。然而，TLCA，TCA和GCDCA处理对WRL-68细胞的增殖几乎没有影响。这些结果表明DCA，LCA或TCDCA能够在高糖和高脂微环境中加速正常肝细胞的生长速度，可能导致肝细胞的恶性转化。
[0502] 在高葡萄糖和高脂肪条件下，与贴壁细胞相比，DCA或LCA并不增强WRL-68的贴壁生长。
[0503] DCA，LCA和TCDCA增加了WRL-68细胞中癌蛋白c-myc的表达(图28C)，TCDCA降低了HepG2细胞中肿瘤抑制基因CEBPα的表达(图28D)。
[0504] 在本发明研究之前缺乏对肠道微生物介导的肝病发展及其向HCC发展的确切机制。我们的研究指出:肝脏胆汁酸-微生物代谢轴在肠道微生物群和肥胖相关的肝癌发生之间具有内在联系。
[0505] 使用NASH-HCC小鼠模型，在肝脏疾病进展期间，随着肠道微生物组成的显着改变，我们发现一组疏水性细胞毒性BAs在肝脏中的积累显著增加。通过微生物菌群和BA的生化改变(解离，去羟基化，脱氢)，以及BA的抗菌作用，BA和肠道微生物之间存在强烈的双向相互作用。我们推测肠道菌群是依赖于FXR产生作用的。FXR和BA之间的相互作用也是双向的，其中FXR控制肝和肠中的BA合成、转运和代谢，BA激活FXR。FXR有助于BA水平的稳定和降低BA毒性。在大鼠肝脏中，FXR激活会导致BSEP和SHP的表达上调。SHP干扰控制BA合成的转录基因Cyp7a1和Cyp8b1。SHP还影响NTCP表达，钠依赖性BA摄取载体从门静脉到肝脏。在回肠末端，FXR活化引起回肠BA结合蛋白下调和OSTα/β(BA重吸收所必需的肠BA转运蛋白)的表达上调。结果显示，FXR，BSEP，SHP，Cyp7a1，Cyp8b1，NTCP和OSTα表达降低会导致BAs在肝脏中的积累，是由于从肝脏到胆汁的转运泵速率降低并且增加了BA的重吸收。
[0506] 结果表明，DCA可能在某些方面促进HCC发展。BA，特别是GCA，TCA，GCDCA，TCDCA，GDCA，DCA和TDCA被认为是胃肠道癌症的病原体。加入DCA，LCA或TCDCA后正常人细胞WRL-68和THLE-2或HepG2细胞的增殖速率说明持续暴露于高水平的BAs可诱导突变和异常增殖。转录因子c-myc介导重要的生物效应，包括细胞生长，增殖，分化和凋亡的丧失，在人HCC中已经观察到c-myc的过表达。先前的报道显示，DCA和CDCA等BAs可以在酸性环境中成为c-myc的强效诱导剂，并且更近期的研究进一步证实，在酸性条件下DCA和CDCA通过激活c-myc转录来增加人胃癌细胞内端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达。在Fxr缺失小鼠中观察到血清和肝BAs水平升高以及IL-1β表达增加、β-连环蛋白及其靶基因c-myc升高，在12个月的时候自发形成肝细胞损伤、腺瘤和癌。
[0507] 在小鼠模型中我们发现高BA水平的肝脏存在炎症，脂肪性肝炎，纤维化和细胞凋亡。已知炎症刺激细胞死亡并增加细胞更新，从而促进肝脏肿瘤发生、STZ干预和连续HFD刺激产生的氧化应激和炎症，如TNF-α，MMP-9，Timp-1，IL-6。
[0508] 为了证实HFD诱导的BA沉积能否诱导肝肿瘤形成，我们给C57BL/6J小鼠喂HFD共58周。长期饲喂HFD可诱发小鼠肝肿瘤，其中血浆和肝脏中的TCDCA，TCA和GCA显着增加。TCDCA治疗HepG2细胞显着增加细胞增殖、减少表达CEBPα，表明BA可能有促肿瘤作用。研究表明，CEBP表达升高可以抑制CEBP基因敲入小鼠的肝癌发生，研究表明，BA通过SHP可以结合CEBPα的启动子中的功能性FXR位点从而激活和编码SHP基因。此外，肝脏原发性BA传感器FXR还抑制gankyrin的表达，gankyrin是介导HCC发生发展的肿瘤抑制蛋白(例如p53，HNF4α和CEBPα)下调的小蛋白酶体亚基。
[0509] 消胆胺的口服给药显着降低了IL-6，TNF-α的水平以及1型胶原蛋白和Gpc3胶原蛋白的表达，并且可以预防小鼠的肿瘤发生，以降低升高的BA水平或抵消肠BA的促炎和致癌毒性，这为治疗提供了新的思路。
[0510] 基于这些结果，我们认为BA可以通过多种机制协同促进肝癌发生(图29)。第一种机制是:BA缓慢改变肝细胞的代谢。研究结果显示继发性BA和TCDCA能够在高葡萄糖和高脂肪环境中加速正常肝细胞的生长速率。根据已广泛报道的次级BAs细胞凋亡诱导效应，长期暴露于过量的BAs会导致抗细胞凋亡的肝细胞的增加和选择性生长。持续暴露于高水平BA的肝细胞导致凋亡细胞的持续减少，凋亡抵抗的肝细胞和/或未修复的DNA损伤的细胞增加。
[0511] 第二种机制是BA诱导的胆汁淤积性肝损伤，由于长期暴露于过量BAs导致氧化应激增加，导致DNA损伤、肝细胞中线粒体损伤和细胞膜破裂，最终导致肝细胞癌ROS水平增加，激活Ras和NF-κB。我们的研究表明，HFD诱导的肝损伤是由于肠道中二级BAs的产生增加以及BSEP的下调导致肝脏循环和胆汁酸积累增加所致。
[0512] 抑制FXR在肝脏中的抗炎作用是BA促进的肝脏肿瘤发生的另一种机制。肝FXR通过抑制促炎转录因子NF-κB激活而发挥抗炎活性。然而，这种抑制也是双向的由BA介导的。在炎症条件下，促炎性细胞因子TNF-α和IL-6调节FXR-α2表达升高同时BSEP表达被抑制48，胆小管收缩减少，导致BA在肝细胞中积累。另一方面，肝BA浓度增加可以刺激并激活TNF受体信号传导的Kupffer细胞(肝固有巨噬细胞)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/促分泌素激活的细胞因子TNF-α和IL-JNK途径。肝脏中的活化的NF-κB抑制肝FXR信号传导，下调SHP。已知Fxr-/-Shp-/-小鼠长期暴露于升高的BAs会发生自发性肝肿瘤。
[0513] 我们的结果显示，BA诱导的肠内LPS生成增加也可能是肥胖相关肝癌发生的重要因素。LPS已被认为是肝损伤发病机制中的重要因子，并且已被证明会促进肝纤维化。在慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制中，肠道BA失调可能是增加细菌LPS吸收的因素[50]，从而促进机体的全身性炎症反应。这些过程也是双向调节的，因为LPS水平的增加涉及BA排泄和胆汁流量的减少，导致细菌LPS的肠吸收进一步增加。研究结果表明，消胆胺干预后，参与炎症和氧化应激的基因减弱，肝脏病理状态改善。
[0514] 总而言之，BA促进肝癌发生发展是一个复杂的过程，涉及多种机制，多种代谢器官(肝脏，胆汁，肠和肠道微生物组)以及不同BA物种之间的协同作用。HFD诱导的或与肥胖有关肝癌的发生可以通过改变的肠道微生物来调节，是长期高浓度的肝BA积累所致。
[0515] 该实施例表明胆汁酸调节药物可以预防或减缓肝癌进展，为存在相关病症的受试者提供新的治疗思路。
[0516] 实施例22其他的生物标记物组合
[0517] 上文使用单变量和多变量分析来评估和选择潜在的生物标志物。单变量分析包括正态分布变量(例如，学生t检验和ANOVA)的参数检验，以及不遵循正态分布的非参检验(例如Mann Whitney U检验和Kruskal Wallis检验)。我们还使用了偏最小二乘法(PLS)，Pearson/Spearman相关性，聚类，多元线性/逻辑回归和随机森林进一步评估代谢生物标志物区分肝纤维化不同阶段的能力。利用发现的潜在生物标志物列表，本发明开发了其基于随机森林(RF)的机器学习算法，以获更有效的生物标志物组合。牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，牛磺胆酸(TCA)，7-酮咯酸(7-KLCA)，牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，肉豆蔻脑酸(C14:1n5)，棕榈油酸(C16:1n7)，反油酸(C18:1n9t)，芥酸(C22:1n9)，二十二碳四烯酸(C22:4n-6)(C20:4n6)，亚油酸(C18:2n6)/γ-亚麻酸(C18:3n6)比值，棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)比值，酪氨酸，果糖，果糖/葡萄糖比值被证明对肝纤维化具有最强的区分能力，例如区分纤维化分期和/或肝硬化。
[0518] 基于甘氨胆酸(GCA)，牛磺胆酸(TCA)，棕榈油酸(C16:1n7)，棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)，酪氨酸和果糖建立的随机森林模型的受试者工作特征曲线(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)等于0.96(图30)。
[0519] 上述代谢物所建立的随机森林模型可以用来预测新样本处在肝脏疾病某一阶段的概率(图31)。
[0520] 因此，本实施例中所述生物标志物组合可以诊断受试者是否患有肝脏疾病和/或区分肝纤维化的不同阶段。此外，上述生物标记可以单独使用或与本发明所述的其他生物标记物组合使用来诊断肝脏疾病和/或区分肝纤维化的不同分期。
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