技术领域
[0001] 本
发明涉及一种同时测定玄参中10种核苷类成分的方法。
背景技术
[0002] 玄参系玄参科
植物玄参的干燥根，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结之功效；目前药材的
质量控制研究主要是通过测定其中的哈巴苷、哈巴俄苷的含量作为评价指标，难以实现全面客观地评价玄参的药材质量。
[0003] 核苷类成分是
生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，具有抗病毒、基因治病、免疫调节、改善脑细胞代谢等多种生物活性；有学者认为核苷可能是补益中药的共同物质
基础，核苷可作为玄参的药效物质基础，鉴于核苷类免疫调节活性与玄参滋阴功效的相关性，核苷类成分可以作为玄参药材质量评价的一项指标。
发明内容
[0004] 针对上述
现有技术存在的问题，本发明提供一种同时测定玄参中10种核苷类成分含量的方法，建立了基于UFLC-QTRAP-MS/MS技术同时测定玄参药材中多种核苷类成分含量的方法，为玄参药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的一种同时测定玄参中10种核苷类成分的方法，包括以下步骤：
[0006] 1)制备对照品溶液；
[0007] 2)制备供试品溶液：取玄参粉末1.0g(过80目)，置于25ml具塞锥形瓶中，加入10ml超纯
水，室温下超声(500W、40kHz)处理45min，过滤，滤液于12000r/min离心取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
[0008] 3)取步骤1)中的对照品溶液，在色谱-质谱条件下测定，以对照品的峰面积对相应的浓度进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围；
[0009] 4)取步骤2)中制得供试品溶液，在同样的色谱-质谱条件下，进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围；将对照品的数据与供试品溶液的数据进行对比分析。
[0010] 作为改进，所述步骤1)中配制对照品溶液的具体操作为：
[0011] 称取尿嘧啶、
鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、2′-脱
氧鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷对照品适量，加纯水配制成质量浓度分别为213.00、168.00、160.00、1011.00、190.00、156.00、1042.00、66.00、414.00、91.50μg/ml的对照品储备液；取各对照品储备液适量，加水定容至10ml制成混合对照品溶液，并逐级稀释，得到一系列不同浓度的10种核苷混合对照品溶液，以0.45μm微孔滤膜滤过，待用。
[0012] 作为改进，所述步骤2)中，选择水作
溶剂，以超声(500W、40kHz)提取，料液比为1∶10，提取时间为45min。
[0013] 主要基于试验中对提取溶剂(水、30％甲醇、50％甲醇)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20)、提取方法(回流、超声处理)及提取时间(15min、35min、45min、60min)进行了单变量考察，用紫外分光光度法对总核苷含量进行检测。结果表明，水作为最适合的溶剂可以提取出更多待测物；超声提取效果比回流提取好，且方便易行；料液比、提取时间优化后分别为1∶
10和45min。
[0014] 作为改进，所述步骤3)中，当流动相中添加5mmol/L
醋酸铵时，化合物的峰型能得到显著改善，优化后的实验色谱-质谱条件具体为：
[0015] 色谱条件：色谱柱：Waters Atlantis T3(2.1mm×150mm，3μm)；流动相：甲醇(A相)-5mmol/L醋酸铵(含0.1％
冰醋酸，B相)；梯度洗脱：0～4.5min，3％～4％A；4.5～8min，4％～18％A；8～10min，18％A；10～10.1min，18％～3％A；10.1～13min，3％A。柱温35℃，流速0.4ml/min，检测
波长254nm，进样量2μl；
[0016] 质谱条件：离子源：Turbo V，电离模式：(ESI+)；采集方式MRM；
离子化温度(TEM)：650℃。喷雾
电压：5500V；雾化气(GS1)：65L/min；辅助气(GS2)：65L/min；气帘气(CUR)：30L/min。
[0017] 鉴于核苷类免疫调节活性与玄参滋阴功效的相关性，核苷类成分可作为玄参药材质量评价的一项指标。实验结果表明，玄参核苷类成分中，以鸟苷、尿苷、腺苷、尿嘧啶含量较高；不同产地及商品药材中核苷类成分含量有所差异。本发明建立了UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定玄参药材中10种核苷含量的方法，对国内主要产区及商品药材进行比较分析，为玄参药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。
附图说明
[0018] 图1为10种核苷对照品的总离子流图；
[0019] 图2为样品的总离子流图；
[0020] 图3为尿嘧啶的MRM图；
[0021] 图4为鸟嘌呤的MRM图；
[0022] 图5为次黄嘌呤的MRM图；
[0023] 图6为尿苷的MRM图；
[0024] 图7为腺嘌呤的MRM图；
[0025] 图8为肌苷的MRM图；
[0026] 图9为鸟苷的MRM图；
[0027] 图10为2′-脱氧鸟苷的MRM图；
[0028] 图11为腺苷的MRM图；
[0029] 图12为2′-脱氧腺苷的MRM图。
具体实施方式
[0030] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体
实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
[0031] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的
说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0032] 一种同时测定玄参中不同核苷类成分的方法：
[0033] 1仪器与材料
[0034] 1.1采用的仪器
[0035] 岛津液相UFLC-20ADXR系列(日本Shimadzu公司)，配有溶剂脱气装置、自动进样器；四级杆-线性
离子阱质谱仪(API 4000，美国AB SCIEX公司)，配有离子喷雾
接口；CentriVap离心浓缩仪(美国Labconco公司)；KQ-500B
超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司，超声功率500W、40kHz)；BSA2245型
电子分析天平(十万分之一，德国赛多利斯公司)；
ME36S型电子分析天平(百万分之一，德国赛多利斯公司)；
[0036] 1.2试药
[0037] 对照品尿嘧啶(批号：100469-200401)、次黄嘌呤(批号：140661-200301)、鸟嘌呤(批号：140631-200904)、尿苷(批号：887-200202)、腺嘌呤(批号：110886-200001)、肌苷(批号：40669-201104)、腺苷(批号：110879-200202)均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98％；鸟苷(批号：1001103046)、2′-脱氧鸟苷(批号：1000943454)、2′-脱氧腺苷(批号：2513C105)均购自美国Sigma公司，纯度均>98％。水为超纯水，甲醇为色谱纯(德国默克公司)，其余
试剂为分析纯；
[0038] 1.3选材
[0039] 玄参不同产地样品实地采集于国内主产区，商品药材取自南京部分药店或药房，均经专业人员鉴定为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。样品信息见表1。
[0040] 表1玄参样品信息
[0041]
[0042] 2实验方法
[0043] 2.1色谱条件
[0044] 色谱柱：WatersAtlantis T3(2.1mm×150mm，3μm)；流动相：甲醇(A相)-5mmol/L醋酸铵(含0.1％冰醋酸，B相)；梯度洗脱：0～4.5min，3％～4％A；4.5～8min，4％～18％A；8～10min，18％A；10～10.1min，18％～3％A；10.1～13min，3％A。柱温35℃，流速0.4ml/min，检测波长254nm，进样量2μl；
[0045] 2.2质谱条件
[0046] 质谱条件：离子源：Turbo V，电离模式：(ESI+)；采集方式MRM；离子化温度(TEM)：650℃。喷雾电压：5500V；雾化气(GS1)：65L/min；辅助气(GS2)：65L/min；气帘气(CUR)：30L/min，优化的质谱条件参数见表2。
[0047] 表2优化的质谱条件参数
[0048]
[0049] 2.3对照品溶液制备
[0050] 精密称取尿嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、2′-脱氧鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷对照品适量，加纯水配制成质量浓度分别为213.00、168.00、160.00、1011.00、190.00、156.00、1042.00、66.00、414.00、91.50μg/ml的对照品储备液。取各对照品储备液适量，加水定容至10ml制成混合对照品溶液，并逐级稀释，得到一系列不同浓度的
10种核苷混合对照品溶液，以0.45μm微孔滤膜滤过，供分析用。
[0051] 2.4供试品溶液制备
[0052] 取玄参粉末1.0g(过80目)，精密称定，置于25ml具塞锥形瓶中，加入10ml超纯水，室温下超声(500W、40kHz)处理45min，过滤，滤液12000r/min离心取上清液，过0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
[0054] 精密吸取“2.3”项下不同浓度系列对照品溶液及混合对照品储备液各2μl，在“2.1”“2.2”所述色谱-质谱条件下测定，以对照品的峰面积(Y)对相应的浓度(X)进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围；按
信噪比(S/N)约为3计算检测限(LOD)，以S/N约为10计算定量限(LOQ)，见表3。
[0055] 表3 10种核苷标准曲线、定量限和检测限
[0056]
[0057] 2.6方法学考察
[0058] 精
密度试验精密吸取一定浓度的混合对照品溶液，连续进样6次，测定各对照品峰面积，10种核苷对照品的峰面积相对标准偏差见表4。
[0059]
稳定性试验取玄参S7样品供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样分析，10种核苷类成分峰面积的相对标准偏差见表4。
[0060] 重复性试验称取玄参样品6份，每份1.0g，精密称定，分别按“2.4”项下所述供试品溶液制备方法制备供试液，进样测定，10种核苷类成分的含量相对标准偏差见表4。
[0061] 表4精密度、重复性和稳定性试验结果
[0062]
[0063] 加样回收试验取6份已知含量的玄参样品0.5g，精密称定，分别精密加入一定量的10种核苷对照品，按“2.4”项下供试品溶液制备方法制备加样回收供试品溶液，并按样品测定方法进行测定，计算回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表5。
[0064] 表5加样回收率试验结果
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] 3样品含量测定
[0069] 将供试品溶液注入液相/质谱联用仪，依照上述条件测定，根据相应线性关系计算供试样品中10种核苷类成分的含量。
[0070] 3.110种核苷对照品、样品的总离子流图和10种玄参样品的MRM色谱图(见“说明书附图”图1～图12)
[0071] 3.210种样品含量的测试结果(如表6所示)
[0072] 表6 10种玄参样品中核苷类成分含量
[0073]
[0074] 注：“-”表示未检测出。
[0075] 对玄参的国内主要产区及商品药材进行比较分析的实验结果表明，玄参核苷类成分中，以腺苷、尿苷、鸟苷、含量较高；不同产地及商品药材中核苷类成分含量有所差异，其中湖北(S9)和浙江磐安(S4)产玄参的核苷类成分总量较高，这与对玄参药材品质的传统认知是一致的，这也证明了把核苷类成分作为玄参药材质量评价的重要指标是科学的，本实验建立的UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定玄参药材中10种核苷含量的方法是可行的，为玄参药材内在质量的综合评价和全面控制提供了新的方法参考。
[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
