一种复杂基质的中毒样品中常见农药和鼠药的快速筛查和确证的方法
阅读：1014发布：2020-07-29
专利汇可以提供一种复杂基质的中毒样品中常见农药和鼠药的快速筛查和确证的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种复杂基质的中毒样品中常见 农药 和鼠药的快速筛查和确认的方法，包括如下步骤：1)采用气相色谱三重四级杆 串联 质谱和超高效液相色谱三重四极杆串联线性 离子阱 质谱构建常见农药的二级质谱 数据库 ，包括中文名、英文名、CAS号、分子量、分子式、保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞 电压 ；采用超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建常见鼠药的二级质谱数据库；2)对引起食物中毒的样品进行提取和 净化 ，然后分别通过气相色谱三重四级杆串联质谱和超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱进行检测，检测的条件与二级质谱数据库的 构建时 采用的方法的检测条件相同。，下面是一种复杂基质的中毒样品中常见农药和鼠药的快速筛查和确证的方法专利的具体信息内容。
1.一种复杂基质的中毒样品中常见农药和鼠药的快速筛查和确认的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)采用气相色谱三重四级杆串联质谱和超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建常见农药的二级质谱数据库，二级质谱数据库包括中文名、英文名、CAS号、分子量、分子式、保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压；
采用超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建常见鼠药的二级质谱数据库；
二级质谱数据库内包括中文名、英文名、CAS号、分子量、分子式、保留时间、定量离子对、定性离子对、去簇电压、碰撞能量；
2)对引起食物中毒的样品进行提取和净化，然后分别通过气相色谱三重四级杆串联质谱和超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱进行检测，检测的条件与二级质谱数据库的构建时采用的方法的检测条件相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，对166种常见的农药构建二级质谱数据库，其中66种常见农药采用气相色谱三重四级杆串联质谱构建，构建的二级质谱数据库如表1所示；100种常见农药采用超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建，构建的二级质谱数据库如表2所示；
优选的，步骤1)中，采用超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱对12种常见鼠药构建二级质谱数据库，构建的二级质谱数据库如表3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，构建二级质谱数据库的农药标准品和鼠药标准品的浓度为1.0mg/L，溶剂为乙腈。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，气相色谱三重四级杆串联质谱中，气相色谱条件为：分离柱为DB-5MSUI超高惰性毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm，美国Agilent公司；载气为氦气，纯度≥99.999％；恒流模式，流速：1.0ml/min；进样口温度：260℃；进样量：1μl；进样方式：不分流进样；不分流时间：1min；柱温箱程序升温：60℃保持
2min，以25℃/min升到150℃，6℃/min升到250℃，40℃/min升到280℃，保持5.23min；总运行时间为35min；
优选的，气相色谱三重四级杆串联质谱中，质谱条件为：离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；电离模式：电子轰击电离(EI)；轰击能量：70eV；灯丝电流：80μA；碰撞气：氩气(纯度≥99.999％)；碰撞池压力：2mTorr；腔体温度：40℃；溶剂延迟时间：4.5min；数据采集模式：MRM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱中，超高效液相色谱条件：ACQUITY UPLC BEH-C18柱，1.7μm，2.1mm×50mm，柱温30℃；流动相为1％的乙酸水A和乙腈B；梯度洗脱程序如下：在0-0.5min时10％乙腈，0.5-
3.0min乙腈由10％线性增加至95％,3.0-4.0min乙腈保持在95％，4.1min乙腈变回10％，乙腈保持在10％平衡1.9min；流速为0.3ml/min，进样体积为3μl；
优选的，质谱条件为：离子源:电喷雾离子源(ESI),离子源压力-4500V，离子源温度为
500℃；雾化气50psi，气帘气30psi，辅助加热气50psi，碰撞气压力在MRM模式下为中等(Medium)在EPI模式下为高等(High)，当MRM信号大于IDA设定的阈值2000cps时同时启动线性离子阱的EPI功能；EPI扫描参数:扫描范围50-600Da，扫描速率20000Da/s；离子阱填充时间:1.00ms；离子阱扫描步长:0.12Da；动态排除时间60s。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，样品的提取方法是：向样品中加入含有质量分数为1％乙酸和质量分数为10％丙酮的乙腈溶液，均质提取设定时间后，向其中加入MgSO4和乙酸钠的混合萃取剂，均质提取设定时间后，离心分离，上清液为提取液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：加入乙腈溶液后的均质提取时间为0.5-
1.5min，优选为1min；
优选的，加入混合萃取剂后均质提取的时间为0.5-1.5min，优选为1min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：干基固体样品匀质处理后称取2-5g于离心管中，然后向其中加入10ml乙腈溶液，均质提取1min后，加入6g MgSO4和1.5g乙酸钠，均质提取1min，离心后的上清液为提取液；
优选的，水分多的固体样品，匀质处理后称取10g于离心管中，然后向其中加入10ml乙腈溶液，均质提取1min后，加入6g MgSO4和1.5g乙酸钠，均质提取1min，离心后的上清液为提取液；
优选的，液体样品，量取5.0于离心管中，加入乙腈溶液后均质提取1min后，加入2.0g无水硫酸镁和1.5g乙酸钠，振荡离心，上清液为提取液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对提取液进行净化的方法，为使用含有
100mgPSA，50mgGCB和300mg MgSO4的净化剂进行净化；对于没有颜色的样品，使用含有
100mgPSA和300mg MgSO4的净化剂进行净化；对于样品基质中含有脂类物质的提取液，增加脱脂程序。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：净化后的提取液过0.22μm的PTFE滤膜后上机分析。
一种复杂基质的中毒样品中常见农药和鼠药的快速筛查和确
证的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种常见农药和鼠药的快速筛查和确证的方法，特别适用于复杂基质的食物中毒样品检测。
背景技术
[0002] 食物中毒是指摄入了含有生物性、化学性有毒物质的食品或者把有毒有害食品当作食品摄入后出现非传染性的急性、亚急性疾病。食入化学性有毒食品引起的食物中毒，即为化学性食物中毒，其中鼠药和农药中毒最为常见。食物中毒是现阶段我国公共卫生食品安全领域的主要问题之一。有毒有害物质引起的化学性食物中毒不仅严重危害人们的身体健康，而且造成不良的社会影响，影响区域广、涉及人员多。因此，第一时间内确定中毒原因是应对化学性食物中毒突发事件的关键。建立有效、合理、快速、灵敏的化学性食物中毒解析技术，有利于高效地对已经发生的相关事件进行追根溯源，从而起到正确处置、预防其再度发生的作用。
[0003] 鼠药和农药的种类复杂，涉及面较广，由鼠药和农药引起的食物中毒更是具有严重的社会危害性。近年来，国内外发生多起由鼠药和农药引发的食物中毒事件，各种事件连续不断的曝光触动了民众敏感的神经。因此，建立一种快速、准确、灵敏度高的应急检测技术势在必行。现阶段，处理鼠药中毒的现场快检方法主要有变色酸法、异轻拆酸铁反应法、三氯化铁定性检测法等；处理农药中毒的现场快检方法包括速测卡法、酶抑制率法和免疫胶体金试纸法、气相色谱法、高效液相色谱-紫外法测等。由于不能快速准确的定性、定量，目前的检测方法不足以满足现实需要。
发明内容
[0004] 针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种复杂基质的中毒样品中常见农药和鼠药的快速筛查和确认的方法。可用于常见鼠药和农药的快速筛查，为处理食物中毒等相关突发事件提供技术支持。
[0005] 为了解决以上问题，本发明的技术方案为：
[0006] 一种复杂基质的中毒样品中常见农药和鼠药的快速筛查和确认的方法，包括如下步骤：
[0007] 1)采用气相色谱三重四级杆串联质谱和超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建常见农药的二级质谱数据库，二级质谱数据库包括中文名、英文名、CAS号、分子量、分子式、保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压；
[0008] 采用超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建常见鼠药的二级质谱数据库；
[0009] 二级质谱数据库内包括中文名、英文名、CAS号、分子量、分子式、保留时间、定量离子对、定性离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)；
[0010] 2)对引起食物中毒的样品进行提取和净化，然后分别通过气相色谱三重四级杆串联质谱和超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱进行检测，检测的条件与二级质谱数据库的构建时采用的方法的检测条件相同。
[0011] 优选的，步骤1)中，对166种常见的农药构建二级质谱数据库，其中66种常见农药采用气相色谱三重四级杆串联质谱构建，构建的二级质谱数据库如表1所示；100种常见农药采用超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建，构建的二级质谱数据库如表2所示。
[0012] 优选的，步骤1)中，采用超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱对12种常见鼠药构建二级质谱数据库，构建的二级质谱数据库如表3所示。
[0013] 优选的，步骤1)中，构建二级质谱数据库的农药标准品和鼠药标准品的浓度为1.0mg/L，溶剂为乙腈。
[0014] 优选的，步骤1)中，气相色谱三重四级杆串联质谱中，气相色谱条件为：分离柱为DB-5MSUI超高惰性毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm，美国Agilent公司；载气为氦气，纯度≥99.999％；恒流模式，流速：1.0ml/min；进样口温度：260℃；进样量：1μl；进样方式：不分流进样；不分流时间：1min；柱温箱程序升温：60℃保持2min，以25℃/min升到150℃，6℃/min升到250℃，40℃/min升到280℃，保持5.23min；总运行时间为35min。
[0015] 进一步优选的，气相色谱三重四级杆串联质谱中，质谱条件为：离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；电离模式：电子轰击电离(EI)；轰击能量：70eV；灯丝电流：80μA；碰撞气：氩气(纯度≥99.999％)；碰撞池压力：2mTorr；腔体温度：40℃；溶剂延迟时间：4.5min；数据采集模式：MRM。
[0016] 优选的，超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱中，超高效液相色谱条件：ACQUITY UPLC BEH-C18柱，1.7μm，2.1mm×50mm，柱温30℃；流动相为1％的乙酸水A和乙腈B；梯度洗脱程序如下：在0-0.5min时10％乙腈，0.5-3.0min乙腈由10％线性增加至95％,3.0-4.0min乙腈保持在95％，4.1min乙腈变回10％，乙腈保持在10％平衡1.9min；流速为
0.3ml/min，进样体积为3μl。
0.3ml/min，进样体积为3μl。
[0017] 进一步优选的，超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱中，质谱条件为：离子源:电喷雾离子源(ESI),离子源压力-4500V，离子源温度为500℃；雾化气50psi，气帘气30psi，辅助加热气50psi，碰撞气压力在MRM模式下为中等(Medium)在EPI模式下为高等(High)，当MRM信号大于IDA设定的阈值2000cps时同时启动线性离子阱的EPI功能；EPI扫描参数:扫描范围50-600Da，扫描速率20000Da/s；离子阱填充时间:1.00ms；离子阱扫描步长:
0.12Da；动态排除时间60s。
0.12Da；动态排除时间60s。
[0018] 优选的，步骤2)中，样品的提取方法是：向样品中加入含有质量分数为1％乙酸和质量分数为10％丙酮的乙腈溶液，均质提取设定时间后，向其中加入MgSO4和乙酸钠的混合萃取剂，均质提取设定时间后，离心分离，上清液为提取液。
[0019] 进一步优选的，加入乙腈溶液后的均质提取时间为0.5-1.5min，优选为1min。
[0020] 进一步优选的，加入混合萃取剂后均质提取的时间为0.5-1.5min，优选为1min。
[0021] 进一步优选的，干基固体样品匀质处理后称取2-5g于离心管中，然后向其中加入10ml乙腈溶液，均质提取1min后，加入6g MgSO4和1.5g乙酸钠，均质提取1min，离心后的上清液为提取液。
[0022] 进一步优选的，水分较多的固体样品，匀质处理后称取10g于离心管中，然后向其中加入10ml乙腈溶液，均质提取1min后，加入6g MgSO4和1.5g乙酸钠，均质提取1min，离心后的上清液为提取液。
[0023] 进一步优选的，液体样品，量取5.0于离心管中，加入乙腈溶液后均质提取1min后，加入2.0g无水硫酸镁和1.5g乙酸钠，振荡离心，上清液为提取液。
[0024] 更进一步优选的，对提取液进行净化的方法，为使用含有100mgPSA，50mgGCB和300mg MgSO4的净化剂进行净化；对于没有颜色的样品，使用含有100mgPSA和300mgMgSO4的净化剂进行净化；
[0025] 对于样品基质中含有脂类物质的提取液，增加脱脂程序。
[0026] 再进一步优选的，净化后的提取液过0.22μm的PTFE滤膜后上机分析。
[0027] 本发明的有益效果为：
[0028] 本发明通过气相色谱和液相色谱质谱技术，建立了常见鼠药和农药的液相色谱质谱和气相色谱质谱的二级数据库。其应用方法，该库涵盖了12种常见鼠药和166常见农药的质谱信息。对于基质复杂的食物中毒样品，操作简单。未知中毒样品经简单提取和净化后直接测定比对，可在1小时内获得筛查结果。与传统的气相色谱质谱和液相色谱串联质谱分析相比，大大缩短了样品的检测和处理时间，提高了检测效率，为不明原因食物中毒等相关事件的处理提供了技术支持。附图说明
[0030] 图1是本发明中水分较多的固体样品的提取净化流程图；
[0031] 图2中，A是溴敌隆标准的色谱图；
[0032] 图2中，B是溴敌隆标准的质谱图；
[0033] 图3中，A是疑似阳性样品的色谱图；
[0034] 图3中，B是疑似阳性样品的质谱图；
[0035] 图4是疑似阳性样品的谱图检索图。
具体实施方式
[0036] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0037] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0038] 1、术语解释：
[0039]
[0040] 2、本发明提供的采用气相色谱三重四级杆串联质谱构建二级质谱数据库的66种农药，包括：甲胺磷(Methamidophos)、敌敌畏(Dichlorvos)、乙酰甲胺磷(Orthene)、氧化乐果(omethoate)、甲基内吸磷(Demeton methyl)、灭线磷(Ethoprophos)、久效磷(Monocrotophos)、甲拌磷(Phorate)、α-六六六(α-HCH)、乐果(Dimethoate)、γ-六六六(γ-HCH)、五氯硝基苯(Quintozine)、β-六六六(β-HCH)、二嗪磷(Diazinon)、乙拌磷(Disulfoton)、δ-六六六(δ-HCH)、百菌清(Chlorothalonil)、氟虫腈(Fipronil)、氯唑磷(Isazophos)、异稻瘟净(Iprobenfos)、磷胺(Phosphamidon)、甲基对硫磷(Parathion-methyl)、甲基毒死蜱(Chlorpyrifos-methyl)、甲基立枯磷(Tolclofos-methyl)、七氯(heptachlor)、皮蝇硫磷(Fenchlorphos)、甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)、杀螟硫磷(Fenitrothion)、马拉硫磷(Malathion)、艾氏剂(Aldrin)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、倍硫磷(Fenthion)、对硫磷(Parathion)、三氯杀螨醇(Dicofol)、水胺硫磷(Isocarbophos)、嘧啶磷(Pirimiphos-ethyle)、甲基异柳磷(Isofenphos-methyl)、喹硫磷(Quintiofos)、杀扑磷(Methidathion)、α-硫丹(α-endosulfan)、克线磷(Fenamiphos)、丙溴磷(Profenofos)、4,4’-滴滴伊(p,p′-DDE)、狄氏剂(Dieldrin)、溴虫腈(chlorfenapyr)、β-硫丹(β-endosulfan)、p,p’-滴滴滴(p,p′-DDD)、o,p’-滴滴涕(o,p′-DDT)、乙硫磷(Ethion)、三唑磷(Triazophos)、p,p’-滴滴涕(p,p′-DDT)、哒嗪硫磷(Pyridaphenthion)、亚胺硫磷(Imidan)、胺菊酯(tetramethrin)、联苯菊酯(Bifenthrin)、氟胺氰菊酯(Tan-fluvalinate)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)、三氯杀螨砜(tetradifon)、伏杀硫磷(Phosalone)、氯氟氰菊酯(Cyhalothrin)、氯菊酯(Permethrin)、氟氯氰菊酯(Cyfluthrin)、氯氰菊酯(Cypermenthrin)、氟氰戊菊酯(flucythrinate)、氰戊菊酯(Sanmarton)、溴氰菊酯(Decamethrin)的气相色谱串联质谱检测的二级质谱数据库。
[0041] 3、本发明提供的采用超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱构建二级质谱数据库的100种农药，包括：乙烯利(ethrel)、比久(Daminozide)、马来酰肼(Maleic Hydrazide)、乙撑硫脲(Ethlenethiourea)、涕灭威亚砜(Aldicarb sulfoxide)、多菌灵(carbendazim)、久效威亚砜(Thiofanox-sulfoxide)、赤霉素(gibberellin)、噻菌灵(Thiabendazole)、灭多威(methomyl)、敌百虫(Trichlorphon,powder)、噻虫胺(clothianidin)、3-羟基克百威(Carbofuran-3-hydroxy)、6-苄基腺嘌呤(Benzyladenine)、涕灭威砜(Aldicarb-sulfone)、吡虫啉(Imidacloprid)、脱乙基莠去津(atrazine-desethyl)、三环唑(Tricyclazole)、啶虫脒(Acetamiprid)、苯线磷亚砜(Fenamiphos sulfoxide)、速灭磷(Mevinphos)、3-吲哚乙酸(Heteroauxin)、西玛通(simeton)、抗蚜威(Pirimicarb)、噻苯隆(Thidiazuron)、乙拌磷(Disulfoton)、涕灭威(aldicarb)、甲基对氧磷(paclobutrazol-ethyl)、4-吲哚丁酸(4-Indolebutyric acid)、苯线磷砜(Fenamiphos-sulfone)、甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)、4-氯苯氧乙酸(4-Chlorophenoxyaceticacid)、1-萘乙酸(1-naphthylacetic acid)、杀虫脒
(Chlordimeform)、速灭威(Metolcarb)、西草净(Simetryn)、乙拌磷亚砜(Disulfoton-sulfoxide)、残杀威(Propoxur)、克百威(methylcarbamate)、倍硫磷亚砜(Fenthion sulfoxid)、氯比脲(Forchlorfenuron)、灭草松(Bentazone)、甲拌磷亚砜(Phorate sulfoxide)、甲萘威(Carbaryl)、甲霜灵(Metalaxyl)、精甲霜灵(Metalaxyl-M)、莠去津(Atrazine)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)、扑灭通(prometon)、特丁通(terbumeton)、氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)、异丙威(Isoprocarb)、莠灭净(Ametryn)、二甲草胺(dimethachloro)、烯酰吗啉(dimethomorph)、多效唑(Paclobutrazol)、三唑醇(Triadimenol)、乙拌磷砜(Disulfoton sulfone)、嘧霉胺(Pyrimethanil)、甲拌磷砜(Phorate sulfone)、2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid)、扑灭津(propazine)、甲硫威(mercaptodimethur)、仲丁威(Fenobucarb)、特丁津(Terbutylazine)、丙森锌(Iprovalicarb)、利谷隆(Linuron)、苯线磷(Fenamiphos)、猛杀威(Promecarb)、氟环唑(Epoxiconazol)、三唑酮(triadimefon)、扑草净(Prometryn)、特丁净(Terbutryn)、戊唑醇(Tebuconazole)、苯氧威(fenoxycard)、杀虫畏(Tetrachlorvinphos)、腐霉利(Procymidone)、杀螟丹(Cartap)、灭幼脲(chlorbenzuron)、异丙甲草胺(Metolachlor)、甲草胺(Alachlor)、乙草胺(Acetochlor)、丙环唑(propiconazole)、抑菌灵(Dichlofluand)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、苯霜灵(Benalaxyl)、咪鲜胺(Prochloraz)、氟虫腈砜(Fipronil sulfone)、氟虫腈亚砜(Fipronil sulfide)、辛硫磷(phoxim)、禾草丹(Thiobencarb)、茚虫威(ndoxacarb)、异柳磷(Isofenphos)、丙草胺(Pretilachlor)、氟虫脲(Flufenoxuron)、氟节胺(Flumetralin)、丁草胺(Machette)、氟啶脲(Chlorfluazuron)、丁硫克百威(Carbosulfan)、氟虫腈(fipronil)的超高效液相色谱串联质谱检测的二级质谱数据库。
(Chlordimeform)、速灭威(Metolcarb)、西草净(Simetryn)、乙拌磷亚砜(Disulfoton-sulfoxide)、残杀威(Propoxur)、克百威(methylcarbamate)、倍硫磷亚砜(Fenthion sulfoxid)、氯比脲(Forchlorfenuron)、灭草松(Bentazone)、甲拌磷亚砜(Phorate sulfoxide)、甲萘威(Carbaryl)、甲霜灵(Metalaxyl)、精甲霜灵(Metalaxyl-M)、莠去津(Atrazine)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)、扑灭通(prometon)、特丁通(terbumeton)、氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)、异丙威(Isoprocarb)、莠灭净(Ametryn)、二甲草胺(dimethachloro)、烯酰吗啉(dimethomorph)、多效唑(Paclobutrazol)、三唑醇(Triadimenol)、乙拌磷砜(Disulfoton sulfone)、嘧霉胺(Pyrimethanil)、甲拌磷砜(Phorate sulfone)、2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid)、扑灭津(propazine)、甲硫威(mercaptodimethur)、仲丁威(Fenobucarb)、特丁津(Terbutylazine)、丙森锌(Iprovalicarb)、利谷隆(Linuron)、苯线磷(Fenamiphos)、猛杀威(Promecarb)、氟环唑(Epoxiconazol)、三唑酮(triadimefon)、扑草净(Prometryn)、特丁净(Terbutryn)、戊唑醇(Tebuconazole)、苯氧威(fenoxycard)、杀虫畏(Tetrachlorvinphos)、腐霉利(Procymidone)、杀螟丹(Cartap)、灭幼脲(chlorbenzuron)、异丙甲草胺(Metolachlor)、甲草胺(Alachlor)、乙草胺(Acetochlor)、丙环唑(propiconazole)、抑菌灵(Dichlofluand)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、苯霜灵(Benalaxyl)、咪鲜胺(Prochloraz)、氟虫腈砜(Fipronil sulfone)、氟虫腈亚砜(Fipronil sulfide)、辛硫磷(phoxim)、禾草丹(Thiobencarb)、茚虫威(ndoxacarb)、异柳磷(Isofenphos)、丙草胺(Pretilachlor)、氟虫脲(Flufenoxuron)、氟节胺(Flumetralin)、丁草胺(Machette)、氟啶脲(Chlorfluazuron)、丁硫克百威(Carbosulfan)、氟虫腈(fipronil)的超高效液相色谱串联质谱检测的二级质谱数据库。
[0042] 4、本发明提供了12种鼠药，包括：异杀鼠酮(Valone)、杀鼠酮(Pindone)、杀鼠灵(Warfarin)、杀鼠迷(Coumatetralyl)、氯杀鼠灵(Coumachlor)、敌鼠(Diphacinone)、氯敌鼠(Chlorophacinone)、溴敌隆(Bromadiolone)、鼠得克(Difenacoum)、氟鼠灵(Flocoumafen)、溴鼠灵(Brodifacoum)、噻鼠酮(difethialone)的超高效液相色谱串联质谱检测的二级质谱数据库。
[0043] 5、本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的：
[0044] 5.1采用气相色谱三重四级杆串联质谱和超高效液相色谱三重四极杆串联线性离子阱质谱构建常见农药和鼠药的二级质谱数据库。具体步骤包括：
[0045] 5.1.1标准溶液制备，分别称量12种鼠药和166种农药，以乙腈为溶剂，配制成0.1-1.0mg/L的标准溶液；
[0046] 5.1.2气相色谱三重四级杆串联质谱数据采集，将1.0mg/L的66种农药标准品首先进行三重四极杆质谱条件的优化，主要包括母离子、子离子、碰撞能量、扫描时间的选择和优化。通过全扫描质谱得到每种农药的保留时间，根据各农药时间划分时间段，在每1个时间段尽量减少所检测目标化合物的数量。在全扫描色谱图中选择分子离子或信号强度高且质荷比较大的特征离子作为母离子，然后采用子离子扫描，对选定的母离子进行二次轰击，获得其子离子谱图，最后在MRM模式下，优化所选子离子的最佳碰撞能量，确定最佳的仪器条件，建立66种常见农药的气相色谱三重四级杆串联质谱数据库，包含英文名、CAS号、分子量、分子式、保留时间等信息。
[0047] 5.1.3超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱数据采集。用蠕动泵以7μL/min的流速连续注射，分别将0.1mg/L的12种鼠药和100种农药标准品注入ESI离子源中，分别在正、负离子检测方式下对每种化合物进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到准分子离子峰，对准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，优化碰撞能。选取有代表性，具有丰富的离子碎片信息的质谱图，分别建立并储存碰撞能量为20,35,50和35±15eV时的二级质谱图至数据库，同时加入化合物的信息，包括化合物名称、CAS号、分子量、分子式、采集条件等信息。
[0048] 5.2样品提取，如图1所示：
[0049] 5.2.1对于蔬菜、水果等含水分多的样品，匀质处理后称取10g于50mL离心管中，对于茶叶等干基的样品2-5g，称取相应质量的匀质样品于50mL离心管中，在加乙腈之前先加10ml蒸馏水充分浸泡30min。然后于50mL样品离心管中加入10.00ml乙腈(含1％乙酸和10％丙酮)，均质提取1min，然后加入QuEChERS萃取盐包(包括6g MgSO4和1.5g乙酸钠)。加入萃取盐包后均质提取1min，离心3-5min，取4ml上清液净化。
[0050] 5.2.2对于血液或尿液等液体样品，量取5.0mL于50mL具塞离心管中，加入乙腈(含1％乙酸和10％丙酮)均质提取1min，加入2.0g无水硫酸镁和1.5g乙酸钠，振荡离心，取上清液待净化。
[0051] 5.3复杂基质样品的净化和基质效应的消除
[0052] 为了尽可能的减小基质效应的影响，根据样品基质的不同，选择不同的净化试剂进行样品的净化。对于有颜色的样品，使用含有100mgPSA，50mgGCB和300mg MgSO4进行净化；对于没有颜色的样品，使用含有100mgPSA和300mg MgSO4进行净化；如果样品基质中含有脂类物质，需要加一步脱脂的程序，在这项工作中，我们使用安捷伦的增强脂质去除产品(EMR)作为脱脂剂。EMR对于长链脂肪烃的去除效率优于C18，它可以去除基质中的大部分脂质杂质，大大减少了基质的干扰并提高了回收率。净化后样品过0.22μm的PTFE滤膜后上机分析。
[0053] 5.4气相色谱串联质谱的测定条件
[0054] 5.4.1气相色谱条件分离柱为DB-5MSUI超高惰性毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，美国Agilent公司)；载气为氦气(纯度≥99.999％)；恒流模式，流速：1.0ml/min；进样口温度：260℃；进样量：1μl；进样方式：不分流进样；不分流时间：1min。柱温箱程序升温：
[0055] 60℃保持2min，以25℃/min升到150℃，6℃/min升到250℃，40℃/min升到280℃，保持5.23min；总运行时间为35min。
[0056] 5.4.2质谱条件离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；电离模式：电子轰击电离(EI)；轰击能量：70eV；灯丝电流：80μA；碰撞气：氩气(纯度≥99.999％)；碰撞池压力：2mTorr；腔体温度：40℃；溶剂延迟时间：4.5min；数据采集模式：MRM。
[0057] 表1 66种农药的中文名、英文名、CAS号、保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞能量
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062] 5.5超高效液相色谱三重四级杆串联线性离子阱质谱条件
[0063] 5.5.1超高效液相色谱条件ACQUITY UPLC BEH-C18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)，柱温30℃。流动相为1％的乙酸水(A)和乙腈(B)。梯度洗脱程序如下：在0-0.5min时10％乙腈，
0.5-3.0min乙腈由10％线性增加至95％,3.0-4.0min乙腈保持在95％，4.1min乙腈变回
10％，乙腈保持在10％平衡1.9min。流速为0.3ml/min，进样体积为3μl。
0.5-3.0min乙腈由10％线性增加至95％,3.0-4.0min乙腈保持在95％，4.1min乙腈变回
10％，乙腈保持在10％平衡1.9min。流速为0.3ml/min，进样体积为3μl。
[0064] 5.5.2质谱条件离子源:电喷雾离子源(ESI),离子源压力-4500V，离子源温度为500℃；雾化气50psi，气帘气30psi，辅助加热气50psi，碰撞气压力在MRM模式下为中等(Medium)在EPI模式下为高等(High)，当MRM信号大于IDA设定的阈值2000cps时同时启动线性离子阱的EPI功能。EPI扫描参数:扫描范围50～600Da，扫描速率20000Da/s；离子阱填充时间:1.00ms；离子阱扫描步长:0.12Da；动态排除时间60s。
[0065] 表2 99种农药的中文名、英文名、CAS号、保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞能量
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071] 表3 12种鼠药及内标的中文名、英文名、CAS号、保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞能量
[0072]
[0073]
[0074] 5.6样品信息的采集和结果的判定
[0075] 按5.2、5.3的方法对食物中毒样品进行提取和净化，然后分别通过GC-MS/MS和UPLC-MS-Qtrap特定的MRM质谱采集条件进样检测。根据样品的保留时间和质谱碎片与所述的常见农药和鼠药的二级质谱数据库进行搜索比对，将获得的MS2或EPI谱图与谱库中该化合物的谱图匹配，当匹配值超过85时，为确证分析的有效判断依据，当匹配值小于50时可判为阴性。同时按照常规定性的要求，试样溶液和标准溶液在同样的测试条件下，试样溶液中保留时间和标准物质保留时间相对偏差在±3％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致。定量离子与定性离子的丰度比应符合表4的要求。
[0076] 表4定量离子与定性离子丰度比的要求
[0077]
[0078] 实施案例
[0079] 实施例1：在一起集体的食物中毒事件中，患者普遍出现头晕、四肢无力、牙龈出血、血尿的症状，医生怀疑是鼠药中毒，采集了病人的血液和尿液进行筛查和检测。具体步骤为：
[0080] (1)样品提取：准确量取血液和尿液样品5mL于50mL具塞离心管中，加入乙腈(含1％乙酸和10％丙酮)均质提取1min，加入2.0g无水硫酸镁和1.5g乙酸钠，振荡离心，取上清液待净化。
[0081] (2)样品净化
[0082] 取3mL上清液加100mgPSA和300mg MgSO4进行净化，离心后取上清液过0.22μm的PTFE滤膜后上机分析。
[0083] (3)上机检测：通过超高效液相色谱-三重四级杆串联线性离子阱质谱仪对样品进行筛查和检测；
[0084] (4)超高效液相色谱-三重四级杆串联线性离子阱质谱仪条件为：
[0085] 高效液相色谱仪：UPLC-Water I-class；
[0086] 色谱柱：Waters BEH C18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)；
[0087] 柱温：40℃；
[0088] 流速：0.3mL/min；
[0089] 梯度洗脱流动相：A：5mM乙酸铵B：乙腈；
[0090] 流动相梯度：0～0.5min，10％B；0.5～3.0min,10％～95％B；3.0～4.0min 95％B；4.0～4.1min,95％～10％B，4.1～6min,10％B。
[0091] 进样体积：3μl。
[0092] 质谱条件：离子源:电喷雾离子源(ESI),离子源压力-4500V，离子源温度为500℃；雾化气50psi，气帘气30psi，辅助加热气50psi，碰撞气压力在MRM模式下为中等(Medium)在EPI模式下为高等(High)，4种气体均为氮气；Q1和Q3均为单位分辨率；去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能量(collision energy，CE)等质谱参数见表3。
[0093] 扫描模式：采用MRM→IDA→EPI→谱库检索模式。待测样液进入质谱系统后，首先进行MRM扫描，当MRM信号低于IDA设定的阈值2000cps时，只进行MRM扫描；当MRM信号大于IDA设定的阈值2000cps时同时启动线性离子阱的EPI功能，将获得的EPI图谱与已经建立好的标准谱库进行比对检索，同时进行定性和定量分析。EPI扫描参数:扫描范围50～600Da，扫描速率20000Da/s；离子阱填充时间:1.00ms；离子阱扫描步长:0.12Da；动态排除时间60s。
[0094] (5)结果判定
[0095] 通过UPLC-MS-Qtrap检测，在病人的血液中检出了溴敌隆，其色谱图和质谱图如图2(A,B)所示，目标化合物的保留时间和二级质谱碎片均与溴敌隆标准品一致，如图3(A,B)所示。将样品中的溴敌隆的EPI谱图与谱库中溴敌隆的EPI谱图进行匹配，其匹配度为92＞
85，所以可判定样品中检出溴敌隆，质谱库匹配结果如图4。该样品前处理时间为15min，检测时间15min，比对时间为5min，整个筛查过程耗时35min。
85，所以可判定样品中检出溴敌隆，质谱库匹配结果如图4。该样品前处理时间为15min，检测时间15min，比对时间为5min，整个筛查过程耗时35min。
[0096] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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