一种单光子/双光子无定形碳点的制备及生物应用
阅读：324发布：2020-05-18
专利汇可以提供一种单光子/双光子无定形碳点的制备及生物应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种单 光子 /双光子无定形 碳 点的制备及 生物 应用。本发明以 柠檬酸 为碳源，超支化聚酰胺-胺为 钝化 剂，采用 水 热法一步合成无定形 荧光 碳点。本发明所制备的碳点具有优异的单光子和双光子荧光性能，在水溶液或固态均能发出明亮的荧光，具有较高的量子产率并呈现激发 波长 依赖的荧光特性，可用于癌细胞的单光子和双光子成像。本发明的合成方法简单，制备的荧光碳点生物毒性小，荧光性能好，在生物成像、生物标记、药物可视输送等领域具有广阔的应用前景。，下面是一种单光子/双光子无定形碳点的制备及生物应用专利的具体信息内容。
1.一种单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
以水为溶剂，聚酰胺-胺和柠檬酸在150～200℃下水热反应1～8小时，得到棕黄色的碳点粗产物；所述碳点粗产物经透析和过滤纯化后得到单光子/双光子无定形碳点水溶液，烘干，即得所述单光子/双光子无定形碳点。
2.根据权利要求1所述的单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述聚酰胺-胺、柠檬酸和水的质量比为(0.05～2)∶(2～15)∶100。
3.根据权利要求1所述的单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述聚酰胺-胺为线性或超支化结构的聚酰胺-胺。
4.根据权利要求3所述的单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述线性或超支化结构的聚酰胺-胺由1-(2-氨乙基)哌嗪和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺按摩尔比1∶1合成。
5.根据权利要求1所述的单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸为无水或含结晶水的柠檬酸。
6.根据权利要求1所述的单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述水热反应的温度为180～200℃。
7.根据权利要求1所述的单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述水热反应是在水热釜中密封进行的，水与水热釜的体积比为1∶5～1∶2。
8.根据权利要求1所述的单光子/双光子无定形碳点的制备方法，其特征在于，所述透析采用的透析袋的截留分子量为1000～10000Da；所述过滤纯化采用的滤膜孔径为
0.22μm。
9.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点在细胞标记中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述单光子/双光子无定形碳点与细胞共孵育后得到单光子/双光子细胞图像。
一种单光子/双光子无定形碳点的制备及生物应用
技术领域
背景技术
[0002] 双光子荧光技术由于其激发光可选择近红外光，从而大大提高了穿透组织的深度，避免了紫外光对组织的损伤。与显微镜技术相结合，双光子荧光技术可降低组织背景对成像的干扰，提高分辨率，从而可对活体组织进行深层观察。与传统的双光子量子点或有机染料相比，碳点具有良好的荧光性能和生物相容性，光稳定性以及易于官能化等诸多优势，在生物医学领域具有广泛的应用前景。然而，荧光碳点的生物成像多局限于紫外光激发成像，众所周知，紫外光穿透组织的能力有限且光毒性大，从而限制了碳纳米点在生物组织或活体中的应用。因此，碳点的双光子性能一经报道立即引人瞩目。目前有关双光子碳点的研究仍存在诸多问题，如Cao等(L.Cao，X.Wang，M.J.Meziani，F.Lu，H.Wang，P.G.Luo，Y.Lin，B.A.Harruff，L.M.Veca，D.Murray，S.Y.Xie and Y.P.Sun，J.Am.Chem.Soc.2007，129，11318-11319)通过激光消融法制备碳核，并饰以聚合物提高其量子产率和生物相容性，制备了一种双光子碳点，但工艺条件苛刻而繁琐，所得碳点量子产率较低。Kong等(B.Kong，A.Zhu，C.Ding，X.Zhao，B.Li and Y.Tian，Adv.Mater.，2012，24，5844-5848)以电化学法制备碳点，随后表面接枝具有多苯环的有机杂环分子而得到双光子碳点，该方法合成过程复杂，量子产率不高。因此，研发具有较高量子产率，生物毒性更低，制备方法简单的综合性能良好的双光子碳点尤为重要。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种制备方法简单，量子产率高，生物毒性小，综合性能良好的单光子/双光子无定形碳点的制备及其生物应用。本发明通过水热法对柠檬酸和聚酰胺-胺混合溶液的处理，得到了量子产率为10％～30％的双光子碳点，且该碳点的生物毒性很小，可很好的应用于细胞的单光子/双光子成像。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0005] 第一方面，本发明涉及一种单光子/双光子无定形碳点的制备方法，所述方法包括如下步骤：以水为溶剂，聚酰胺-胺和柠檬酸在150～200℃下水热反应1～8小时，得到棕黄色的碳点粗产物；所述碳点粗产物经透析和过滤纯化后得到单光子/双光子无定形碳点水溶液，烘干，即得所述单光子/双光子无定形碳点。
[0006] 作为优选方案，所述聚酰胺-胺、柠檬酸和水的质量比为(0.05～2)∶(2～15)∶100。
[0007] 作为优选方案，所述聚酰胺-胺为线性或超支化结构的聚合物。
[0008] 作为优选方案，所述线性或超支化结构的聚酰胺-胺由1-(2-氨乙基)哌嗪(1-(2-aminoethyl)piperazine)和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(N，N’-methylene bisacrylamide)按摩尔比1∶1合成。本发明中具体合成方法参照(Synthesis and Gene Delivery of Poly(amido amine)s with Different Branched Architecture.Biomacromolecules2010，11，489-495)。
[0009] 作为优选方案，所述柠檬酸为无水或含结晶水的柠檬酸。
[0010] 作为优选方案，所述水热反应的温度为180～200℃。
[0011] 作为优选方案，所述水热反应是在水热釜中密封进行的，水与水热釜的体积比为1∶5～1∶2。
[0012] 作为优选方案，所述透析采用的透析袋的截留分子量为1000～10000Da；所述过滤纯化采用的滤膜孔径为0.22μm。
[0013] 第二方面，本发明还涉及一种本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点在细胞标记中的应用。
[0014] 作为优选方案，本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点用于生物成像。
[0015] 作为优选方案，本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点用于癌细胞的单光子和双光子成像。
[0016] 作为优选方案，将所述单光子/双光子无定形碳点与细胞共孵育后得到单光子/双光子细胞图像。
[0017] 作为优选方案，本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点用于药物可视输送系统。
[0018] 在本发明中，所述的碳点粒径约为10nm且主要组成为无定形碳。
[0019] 在本发明中，所述的碳点在320nm左右有一个宽的紫外吸收峰，对应荧光发射峰在400～600nm之间，随激发波长从300～420nm内改变，发射峰最强位置在425～500nm之间逐渐红移。
[0020] 在本发明中，所述的碳点在水溶液中的量子产率为10％～30％，荧光寿命为11.0ns。
[0021] 在本发明中，所述的碳点具有双光子荧光特性，激发波长范围为700～900nm，双光子吸收截面最大为16000±1500GM。
[0022] 在本发明中，所述的碳点具有固体荧光的特性，固体量子产率为5～17％，在不同激发波长下分别得到深蓝、亮绿、亮黄和红色发光。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0024] 1、本发明采用聚酰胺-胺和柠檬酸在180～200℃条件下经水热反应制备单光子/双光子无定形碳点；制备工艺简单，水溶性好，适合工业化生产；
[0025] 2、本发明的碳点具有较高的量子产率，量子产率在具有双光子性能的碳点中基本属于最高者；
[0026] 3、本发明的碳点细胞毒性小，碳点的浓度达400μg/mL时，细胞存活率仍在80％以上，适合应用于生物医药领域；
[0028] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0029] 图1为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的透射电镜TEM图(对应实施例1的产物)；
[0030] 图2为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的X射线衍射图(对应实施例1的产物)；
[0031] 图3为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的XPS分析图(对应实施例1的产物)；其中，图a为碳点表明C，N，O的标准峰谱图，图b为碳原子的三种化学键形式C＝C(284.8eV)，C-O(285.7eV)and C＝O(288.8eV)的表征；
[0032] 图4为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的热重分析图，图a、图b分别表示N2和O2环境下的TGA分析曲线(对应实施例1的产物)；
[0033] 图5为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的红外光谱图，图中a、b、c分别代表原料柠檬酸、聚酰胺-胺和碳点的红外光谱(对应实施例1的产物)；
[0034] 图6为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的单光子荧光发射谱图，其中曲线CA、HPAAs和C-dots分别代表柠檬酸、聚酰胺-胺以及碳点的荧光发射谱图，三者测试的浓度相同(对应实施例1和2的产物)；
[0035] 图7为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的紫外吸收谱图，其中CA、HPAAs和C-dots分别代表柠檬酸、聚酰胺-胺以及碳点的紫外吸收谱图，内嵌图为碳点溶液在自然光(左)和紫外光(右)照射下的照片。(对应实施例1的产物)；
[0036] 图8为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的荧光性能受激发光的影响，图中标注为300nm，320nm，340nm，360nm，380nm，400nm，420nm的曲线分别表示对应激发波长下的荧光发射曲线(对应实施例1的产物)；
[0037] 图9为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的荧光性能受pH值的影响(对应实施例1的产物)；
[0038] 图10为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的荧光寿命图(对应实施例1的产物)；
[0039] 图11a为本发明所述单光子/双光子无定形碳点在不同功率激发光作用下的双光子荧光发射谱图，图11b为本发明所述单光子/双光子无定形碳点在不同功率激发光作用下的双光子拟合直线(对应实施例1的产物)；
[0040] 图12为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的固体荧光图，图a、图b、图c、图d分别表示在360nm，450nm，530nm，580nm的光激发时的得到的蓝色，绿色，黄色和红色的固体荧光图片(对应实施例1的产物)；
[0041] 图13为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的细胞毒性(MTT法)(对应实施例5)；
[0042] 图14为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的单光子和双光子荧光细胞成像图(对应实施例5)；其中，图a为单光子荧光成像的明场时照片，图b为单光子细胞成像效果图，图c为双光子荧光成像的明场时照片，图d为双光子细胞成像效果图。
具体实施方式
[0043] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0044] 实施例1
[0045] 称取20mmol N，N’-亚甲基双丙烯酰胺置于50ml反应瓶中，加入10ml去离子水、N，N-二甲基甲酰胺或者N，N-二甲基甲酰胺/水的混合溶剂，混合均匀，然后在磁力搅拌下加入20mmol1-(2-氨乙基)哌嗪，密封后，通氮气10到15分钟，置于60℃的恒温水浴中搅拌反应120小时。自然冷却至室温，得到浅黄色的粘稠状溶液，用丙酮沉淀、洗涤，将沉淀产物溶解后再次沉淀，重复上述过程1～2次，所得粘稠物于60℃下真空干燥48小时，得淡黄色聚合物。调节溶剂水与N，N-二甲基甲酰胺的体积比，可合成一系列支化结构不同的聚酰胺-胺。
[0046] 称取100mg聚酰胺-胺固体和1.051g柠檬酸固体，溶解于10mL去离子水中，超声分散至充分溶解后，将混合液体移至附有四氟乙烯内衬的水热反应釜(30mL)中，密封后置入电热鼓风干燥箱中，200℃的反应5小时后，自然冷却至室温，即可得到棕黄色的碳点水溶液。将得到的碳点水溶液用10000Da分子量的透析袋透析24小时，用孔径为0.22μm的滤膜过滤。将透析液收集到圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪蒸干后置于真空干燥箱中干燥，得到棕黄色的碳点固体。
[0047] 碳点的形貌，结构和性质表征如下：
[0048] 本发明所述的碳点在透射电镜下为10nm左右的颗粒(图1)，粒径分布比较均一，高分辨电镜分析未检测到石墨化层结构，根据X射线衍射(图2)结果可知，碳点在2θ＝19.15°(0.46nm)处有一个较宽的峰，表明该碳点为无定形的结构。X射线光电子能谱(图3)测试则证实碳点的表面有C，N，O三种元素的存在，三种元素所占的摩尔比分
2
别为64.2％，34.0％和1.8％，解析高分辨C1S谱图表明了碳元素的存在形式为spC＝C(284.8eV)，C-N(285.4eV)，C-O(286.2eV)和C＝O(289.0eV)。从不同气氛下热重分析(图
4)结果可知，碳点在195℃时热解的峰与柠檬酸相似，在420℃时的热解峰与聚酰胺-胺类似，且在氮气气氛中残重约为16％，表明碳点中仍含有柠檬酸和聚酰胺-胺结构，而被碳化的碳含量约为16％；在空气环境中576℃时仍有明显的裂解峰，该温度比石墨相低40℃，且样品最终完全裂解，表明本发明所制备的碳点是柠檬酸和聚酰胺-胺反应后经过一定程度的碳化而得到的无定形碳材料。
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别为64.2％，34.0％和1.8％，解析高分辨C1S谱图表明了碳元素的存在形式为spC＝C(284.8eV)，C-N(285.4eV)，C-O(286.2eV)和C＝O(289.0eV)。从不同气氛下热重分析(图
4)结果可知，碳点在195℃时热解的峰与柠檬酸相似，在420℃时的热解峰与聚酰胺-胺类似，且在氮气气氛中残重约为16％，表明碳点中仍含有柠檬酸和聚酰胺-胺结构，而被碳化的碳含量约为16％；在空气环境中576℃时仍有明显的裂解峰，该温度比石墨相低40℃，且样品最终完全裂解，表明本发明所制备的碳点是柠檬酸和聚酰胺-胺反应后经过一定程度的碳化而得到的无定形碳材料。
[0049] 为进一步研究碳点的化学组成，经比较柠檬酸、聚酰胺-胺和碳点红外谱图(图5)，发现碳点的谱图(c)中包含聚酰胺-胺(b)特征吸收峰，而仅有微弱的柠檬酸(a)特征-1 -1 -1
吸收峰，特别是1540cm 处仲胺峰的消失，1654cm 处伯胺峰的减弱，以及1384cm 处叔胺峰的明显增强，表明原料中大部分柠檬酸被碳化或参与了与聚酰胺-胺的酰胺化反应，形成了无定形的碳点。
吸收峰，特别是1540cm 处仲胺峰的消失，1654cm 处伯胺峰的减弱，以及1384cm 处叔胺峰的明显增强，表明原料中大部分柠檬酸被碳化或参与了与聚酰胺-胺的酰胺化反应，形成了无定形的碳点。
[0050] 通过紫外-可见光光谱和荧光光谱研究了其荧光性质。如图6所示，在360nm紫外光激发下，碳点在水溶液中的荧光发射峰(曲线标注为C-dots)位置在480nm附近，有很大的斯托克位移，有利于荧光性能的进一步应用。与经过相同处理工艺的聚酰胺-胺(曲线HPAA)或柠檬酸(曲线CA)制备的碳点相比，本发明的碳点荧光强度增幅显著，表明碳点的荧光是水热处理和两种原料协同作用所致。在紫外光照射下，碳点水溶液发出较强的蓝色荧光(图7内嵌图)，碳点分别在330nm处有一个较宽的吸收峰(图7)，而原料聚酰胺-胺和柠檬酸在300nm以上没有明显的吸收，这与荧光强度的对比图(图6)一致。本发明的碳点与其它碳点类似，具有荧光发射波长随激发波长变化的特点，如图8所示，随着激发波长从300nm红移到420nm，碳点的发射峰位置出现较小尺度的红移，从425红移到485nm。与此同时，荧光发射强度则先升后降，且在360nm激发时达到最大值。通过考察碳点的荧光性能随pH值变化的影响发现，如图9所示，碳点的荧光强度随pH波动且在pH值为8～9时达到峰值，但碳点在不同pH值条件下的荧光强度仍然能满足应用需求。此外，本发明的碳点，具有较好的光稳定性且荧光寿命(图10)长达τ＝11.02±0.18ns，与普通荧光分子相比具有更高的应用价值。
[0051] 本发明所述的碳点，不仅在单光子激发光作用下具有良好的荧光性能，在808nm的近红外双光子激光激发条件下也表现出良好的荧光性能。如图11所示，随着激发光源功率的增大，碳点溶液发出的荧光强度呈逐渐增强的趋势，荧光强度与激发功率的平方值呈现良好的线性关系，表明碳点具有很好的双光子吸收特性。测定的双光子吸收的截面积为16000±1500GM，也表明碳点具有良好的双光子吸收性能。
[0052] 本发明所述的碳点不仅在水溶液中具有优异的单、双光子性能，在固体状态下，仍能发出明亮的荧光(图12)，图a、图b、图c、图d分别表示在360nm，450nm，530nm，580nm的光激发时，碳点固体分别发射出蓝，绿，黄，红色的固体荧光，对应的固体量子产率为16.3％，是目前报道的所有碳点中固体量子产率的最高值。本发明碳点在不同激发波长下获得蓝、绿、黄和红色荧光，有望于应用于多通道成像。
[0053] 实施例2
[0054] 称取20mmol N，N’-亚甲基双丙烯酰胺置于50ml反应瓶中，加入10ml去离子水、N，N-二甲基甲酰胺或者N，N-二甲基甲酰胺/水的混合溶剂，混合均匀，然后在磁力搅拌下加入20mmol1-(2-氨乙基)哌嗪，密封后，通氮气10到15分钟，置于60℃的恒温水浴中搅拌反应120小时。自然冷却至室温，得到浅黄色的粘稠状溶液，用丙酮沉淀、洗涤，将沉淀产物溶解后再次沉淀，重复上述过程1～2次，所得粘稠物于60℃下真空干燥48小时，得淡黄色聚合物。调节溶剂水与N，N-二甲基甲酰胺的体积比，可合成一系列支化结构不同的聚酰胺-胺。
[0055] 称取200mg聚酰胺-胺固体和1.5g柠檬酸固体，分别溶解于10mL去离子水中，超声分散至充分溶解后，将两份溶液分别移至附有四氟乙烯内衬的水热反应釜1(体积为30mL)和反应釜2(体积为30mL)中，密封后将两个反应釜同时置入电热鼓风干燥箱中，
200℃的反应5小时后，自然冷却至室温。聚酰胺-胺溶液比水热处理前颜色变得稍黄，柠檬酸溶液则基本上没有颜色变化，用硫酸奎宁做参比，测定二者的量子产率。在溶液中量子产率计算公式为：
200℃的反应5小时后，自然冷却至室温。聚酰胺-胺溶液比水热处理前颜色变得稍黄，柠檬酸溶液则基本上没有颜色变化，用硫酸奎宁做参比，测定二者的量子产率。在溶液中量子产率计算公式为：
[0056]
[0057] 其中，Φ代表待测样品的量子产率，ΦR代表参比物的量子产率，I表示待测样品的荧光发射谱图的积分面积，IR表示参比物的荧光发射谱图的积分面积，A表示待测样品在该浓度下的紫外吸收值，AR表示参比物在该浓度下的紫外吸收值，η是待测样品溶液的折射率，ηR是参比物溶液的折射率。将原料聚酰胺-胺和柠檬酸分别经过相同条件的水热处理后制备碳点，分别测定其量子产率。根据表1所示的测定结果，发现二者的量子产率均远低于本发明碳点的量子产率，这证实碳点的高量子产率是两种原料协同作用的结果。
[0058] 表1 碳点与水热处理的原料的量子产率对比表
[0059]序号 物质 最大激发波长(nm) 量子产率(％)
1 硫酸奎宁 346 54.0
2 柠檬酸水热 317 2.0
3 聚酰胺-胺水热 326 4.7
4 碳点 360 17.1
1 硫酸奎宁 346 54.0
2 柠檬酸水热 317 2.0
3 聚酰胺-胺水热 326 4.7
4 碳点 360 17.1
[0060] 实施例3
[0061] 1.称取20mmol N，N’-亚甲基双丙烯酰胺置于50ml反应瓶中，加入10ml去离子水、N，N-二甲基甲酰胺或者N，N-二甲基甲酰胺/水的混合溶剂，混合均匀，然后在磁力搅拌下加入20mmol1-(2-氨乙基)哌嗪，密封后，通氮气10到15分钟，置于60℃的恒温水浴中搅拌反应120小时。自然冷却至室温，得到浅黄色的粘稠状溶液，用丙酮沉淀、洗涤，将沉淀产物溶解后再次沉淀，重复上述过程1～2次，所得粘稠物于60℃下真空干燥48小时，得淡黄色聚合物。调节溶剂水与N，N-二甲基甲酰胺的体积比，可合成一系列支化结构不同的聚酰胺-胺。
[0062] 2.称取1.051g柠檬酸和5mg聚酰胺-胺，1.051g柠檬酸和100mg聚酰胺-胺以及1.051g柠檬酸和200mg聚酰胺-胺，分别溶解于15mL去离子水中，超声分散至充分溶解。
[0063] 3.将上述三份溶液分别移至附有四氟乙烯内衬的水热反应釜(体积为50mL)中，180℃反应3小时，自然冷却，测定各碳点溶液的荧光量子产率。当聚酰胺-胺的加入量为
5mg时，碳点在水溶液中的荧光量子产率为20.1％，当聚酰胺-胺的加入量为100mg时，碳点在水溶液中的荧光量子产率为19.6％，当聚酰胺-胺的加入量为200mg时，碳点在水溶液中的荧光量子产率为17.2％。
5mg时，碳点在水溶液中的荧光量子产率为20.1％，当聚酰胺-胺的加入量为100mg时，碳点在水溶液中的荧光量子产率为19.6％，当聚酰胺-胺的加入量为200mg时，碳点在水溶液中的荧光量子产率为17.2％。
[0064] 实施例4
[0065] 1.称取20mmol N，N’-亚甲基双丙烯酰胺置于50ml反应瓶中，加入10ml去离子水、N，N-二甲基甲酰胺或者N，N-二甲基甲酰胺/水的混合溶剂，混合均匀，然后在磁力搅拌下加入20mmol1-(2-氨乙基)哌嗪，密封后，通氮气10到15分钟，置于60℃的恒温水浴中搅拌反应120小时。自然冷却至室温，得到浅黄色的粘稠状溶液，用丙酮沉淀、洗涤，将沉淀产物溶解后再次沉淀，重复上述过程1～2次，所得粘稠物于60℃下真空干燥48小时，得淡黄色聚合物。调节溶剂水与N，N-二甲基甲酰胺的体积比，可合成一系列支化结构不同的聚酰胺-胺。
[0066] 2.称取1.051g柠檬酸和100mg聚酰胺-胺，溶解于15mL去离子水中，超声分散至充分溶解，形成混合溶液；配置相同的混合溶液3份。
[0067] 3.将上述3份相同的混合溶液分别转移至含有四氟乙烯内衬的水热反应釜(体积为50mL)中，置入180℃的电热鼓风干燥箱，分别反应1小时，3小时和5小时后，自然冷却，测定各碳点溶液的荧光量子产率，分别为12.8％，18.2％和20.1％。
[0068] 实施例5
[0069] 1、单光子/双光子无定形碳点的制备
[0070] 此实施例中双光子碳点的制备方法如实施例1所示。
[0071] 2、碳点的细胞毒性评价
[0072] 为考察本发明碳点的细胞毒性，利用MTT(噻唑蓝)比色法，考察L929细胞(小鼠成纤维细胞)与碳点共同孵育48小时后细胞的存活率(图13)。用96孔板培养L929细胞，将10，20，50，100，200，400μg/mL的碳点溶液加入50μL到培养有L929细胞的孔中，孵化48小时后，测定细胞的存活率。多次重复试验表明，当碳点的浓度高达400μg/mL时，细胞的存活率仍然在80％以上，表明碳点对细胞的生长没有显著影响，具有很好的生物相容性。极小的细胞毒性是碳点在生物上得以应用的基础。
[0073] 3、碳点在细胞成像上的应用
[0074] (1)单光子紫外激发荧光成像
[0075] 利用6孔板培养Hela细胞(人子宫颈癌细胞)，加入50μL浓度为2mg/mL的碳点溶液后共同孵育4小时后，取出培养液，固定细胞后，封片，在荧光显微镜下观察细胞。在紫外光(330～380nm)激发条件下，细胞可以发出明亮的绿色光，成像效果良好(图14a，b)。
[0076] (2)双光子近红外激发荧光成像
[0077] 利用6孔板培养Hela细胞(人子宫颈癌细胞)，加入50μL浓度为2mg/mL的碳点溶液后共同孵育4小时后，取出培养液，固定细胞后，封片，在荧光显微镜下观察细胞。在双光子近红外光(808nm)激发条件下，细胞也可以发出明亮的绿色光，成像效果良好(图14c，d)。
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