技术领域
[0001] 本
发明涉及显微成像的照明方法，具体来说，涉及一种暗场照明的方法，特别是利用全内反射棱镜和样品池的全内反射实现对样品池中微纳米颗粒和
生物样品的观测和研究，并且可以广泛灵活应用于现有
显微镜或者自建成像系统。
背景技术
[0002] 成像技术的基于传统的光学成像显微镜结合新的激光技术发展成现在广泛应用的
荧光显微镜，同时随着生物分子学和
纳米材料科学等的发展，研究的对象由微米尺度向纳米尺度的递进,更高
分辨率和
信噪比的技术手段成为影像学不断追求的目标。最近纳米贵金属颗粒、
碳纳米管、
量子点等具有特殊性质的纳米材料被广泛应用到合成催化、光电器件、纳米载药和生物影像等领域。例如纳米金颗粒具有特殊的
等离子体吸收和散射等光学特性、表面易于化学修饰、具有优良
生物相容性等特点，被广泛应用于生物等领域，但是由于纳米材料尺寸远小于可见光的
波长时,超过了普通显微成像的衍射极限,用传统的显微术无法直接观察
纳米级颗粒成像。因此在成像方面暗场照明技术利用了纳米颗粒自身散射性较强的光学特性,非常适用于观察纳米尺度材料。
[0003] 暗场照明技术在原理上应用了光学上的丁达尔效应，当照明光束进入溶胶时，在照明光的传播过程中，光线与颗粒作用沿着不同方向按一定统计规律被散射可以偏离原来的方向，每个微粒就成为一个发光点，从侧面可以看到一条光柱。通用的暗场照明显微成像技术一般采用斜射照明并利用环形光阑挡住中心的直射照明光，因此照明使用的聚光镜的数值孔径必须要大于成像物镜的数值孔径才能使照明光不能通过聚光器直接进入物镜，而只能从聚光器的光阑四周边及未遮暗的部位斜射到样品池中的样本上。因照明光线是斜射且
角度大于物镜的采集角度的，不能进入物镜，故由显微镜观察到的
视野背景是暗的，只能看到因光散射作用而使样品发出亮光，从而实现样品的暗场观测。由于滤除了直射光，采集的只是样品池中颗粒的散射光，因此暗背景情况下可以有效的提高信噪比。单颗粒的光散射在溶液中，横向照明光束截面的尺度比颗粒要大得多，所以入射波可以近似为平面波，又由于微粒间距离很大，因此可以看成是单颗粒对平面波的散射。散射光的空问分布反映颗粒本身的属性.不同大小、材料、形状的颗粒的散射光空间分布就有很大差别，可以通过严格的电磁理论计算，因此利用暗场成像可以有效提取观测样品的物理特性。一般适用于暗场照明的样品是相对分散度比较高，背景结构相对简单的薄的颗粒样品例如生物学中的
硅藻、细菌、
酵母、组织培养细胞、
原生动物等。适用的非生物标本包括晶体矿物和化学,胶体粒子,包含小夹杂物和
聚合物和陶瓷薄片,孔隙度差异,或折射率梯度。暗视野显微镜可以看到在明视场里看不到的样品，生物学上可以用于检查未
染色生物标本的形态和运
动能力。
[0004] 但是与明场照明区别的是暗场照明的有效工作区域相对较短，当聚光镜固定时上移或者下移物镜的范围超过这一尺度的时候，由于照明光线的发散,会导致采集效率降低和成像
质量的下降。而且由于聚光镜必须采用高数值孔径，放标本放置标本时在聚光镜前透镜与载物片之间常常使用浸油，明暗场切换需要更换聚光镜或者光阑，一般无法在实验中快速切换，并且由于照明的高数值孔径也限制了样品的厚度。所以样品和显微镜载物片的厚度收到很大限制，传统的暗场照明样品因此收到很大的限制。
[0005] 另一种利用全内反射达到纳米级分辨率的技术是全内反射显微成像技术，通过利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧
光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常不超过在200nm左右。因为经过全内反射后反射面一侧的激发光呈指数衰减，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，很大程度上降低了背景光噪声干扰观测标的，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。但是样品厚度和成像范围依然收到很大的限制。
[0006] 本发明的目的是克服现有暗场以及全内反射倏逝场照明技术在样品厚度和成像范围等方面的不足，提供一种较低成本，易于实现的利用照明光与样品作用的散射特性成像的新型暗场照明方法。本方法可以实现上下两侧同时观察和激发等功能，结构简单能与现有成像、检测和激发系统结合，调节便捷，可以实现对厚样本中微纳米颗粒的照明，进而更加便于开展相关生物影像精确观测和胶体特性动态测量等研究。
发明内容
[0007] 本发明的目的是克服现有暗场以及全内反射照明技术在厚尺寸样品等方面的不足，提供一种利用照明光的散射特性成像的可用于微纳米颗粒观测及研究的方法。本方法可以实现上下两侧同时观察和激发功能，结构简单能与现有成像、检测和激发系统结合，调节便捷，可以实现对厚样本的照明，进而更加便于开展相关生物影像观测和胶体特性等研究。
[0008] 为达上述目的，本发明的一种基于全内反射的暗场照明装置，采用以下的技术方案：
[0009] 一种基于全内反射的暗场照明装置，包括全内反射暗场照明显微镜，全内反射暗场照明显微镜包含载物台、上成像物镜、全内反射棱镜、下成像物镜，全内反射暗场照明显微镜的载物台上设有样品池，样品池上设有全内反射棱镜，样品池里装载样品金纳米颗粒的
水溶液，全内反射暗场照明显微镜设有对称的上光路与下光路，全内反射暗场照明显微镜的上光路一侧设有上成像物镜，全内反射暗场照明显微镜的下光路一侧设有下成像物镜，全内反射暗场照明显微镜的上光路与下光路的成像面互相重叠在样品池的中待观察区域中；
[0010] 全内反射暗场照明显微镜的上光路由上成像光电
传感器、成像透镜B、滤光片A、上成像物镜组成，全内反射暗场照明显微镜上侧设有上成像物镜，上成像物镜远离全内反射暗场照明显微镜的另一侧前面设有成像透镜B，成像透镜B远离上成像物镜的另一侧前面设有滤光片A，滤光片A远离成像透镜B的另一侧前面设有上成像
光电传感器，全内反射暗场照明显微镜的上光路发出的光束经过上成像物镜、成像透镜B、滤光片A照射到上成像光电传感器；
[0011] 全内反射暗场照明显微镜下侧(下光路)设有下成像物镜，下成像物镜远离全内反射暗场照明显微镜的另一侧设有一个与光路成45度角的二向色镜，二向色镜侧面与下成像物镜光路垂直方向设有
激光器，激光器与二向色镜之间设有扩束
准直透镜组，激光器的光路经过扩束
准直透镜组后通过二向色镜反射到达下成像物镜，聚焦在样品池。
[0012] 进一步，在一些
实施例中，所述全内反射的暗场照明装置还包含照明激光、全内反射暗场照明显微镜、全内反射棱镜、样品池。
[0013] 进一步，在一些实施例中，所述二向色镜下方设有与之垂直的反射镜，反射镜侧面与下成像物镜光路垂直方向设有有成像透镜A和滤光片B，下成像物镜的成像光束经过二向色镜、反射镜、成像透镜A和滤光片B后，将放大的影像投射到下成像光电传感器上。
[0014] 进一步，在一些实施例中，所述照明激光发出的激光经过全内反射棱镜全内反射照射到样品池中的微纳米颗粒的水溶液中，照明激光经过样品池池底的全内反射后再次进入全内反射棱镜，在全内反射棱镜中多次反射出射离开棱镜。
[0015] 进一步，在一些实施例中，所述全内反射暗场照明显微镜的激发光路由激光器、扩束准直透镜组、二向色镜、下成像物镜组成，全内反射暗场照明显微镜远离下成像物镜的另一侧(上光路)设有上成像物镜；下成像物镜下面首先设有一个45度角放置的二向色镜，二向色镜偏转激光一侧是扩束准直透镜组、激光器，激光器发出激光经过扩束准直透镜组，脉冲扩束后经过二向色镜被反射并偏转90°进入下成像物镜，汇聚到样品池中。
[0016] 进一步，在一些实施例中，所述样品池内设有样品池
载玻片，样品池下底设有0.12～0.2mm厚的样品池盖玻片。
[0017] 进一步，在一些实施例中，所述下成像物镜为：20x、50x、100x等倍的显微镜物镜，上成像物镜为：20x、50x、100x等倍的显微镜物镜；激光器的激光波长640～1060nm可调，带宽10nm的时候，飞秒的脉宽约为100fs，出光的功率约为1000mW，进入显微镜的功率为800mW；上成像物镜、下成像物镜：物镜的NA为0.65，工作距离为4.5mm，可以连续校准0到
1.2mm厚的盖玻片厚度或者
硅片厚度。
[0018] 一种基于全内反射的暗场照明方法，示例方法如下：
[0019] 全内反射棱镜内设有样品池，侧面照明激光角度和
位置可以在符合全内反射临界角度范围内调节，其中荧
光激发的模
块被替换匹配激发光的二项色镜，用于反射导入激光器的飞秒光束并透过照明光或者荧光，上光路装置搭建成像系统；
[0020] 样品池的观测样品可以为微纳米颗粒，在实验前将4℃低温保存的60nm直径的金纳米颗粒溶液，用去离子水或者蒸馏水稀释100～2000倍，然后超声5～10min后使用，使颗粒均匀分布在溶液中；
[0021] 将配置好的金纳米颗粒溶液放置在超声清洗过的样品池中，用洁净的棱镜盖上密封，放置到全内反射暗场照明显微镜的载物台的中心位置上，在明场条件下，找到样品池的底部，然后打开下成像光电传感器、上成像光电传感器，将图像显示在电脑上，便于调节；
[0022] 激光激发样品的荧光和照明激光与样品相互作用的散射光或者荧光，由样品池一部分进入上成像物镜，一部分进入下成像物镜，其余的部分耗散掉；
[0023] 进入下成像物镜的荧光或者散射光经过二向色镜，再被反射镜反射并偏转经过成像透镜A和滤光片B，被下成像光电传感器采集；
[0024] 进入上成像物镜的荧光或者散射光经过成像透镜B和滤光片A，被上成像光电传感器采集；
[0025] 打开激光器，通过调节反射镜，调整入射激光的角度和位置，使得激光经过棱镜后发生全内反射；微调节激光和样品池，使得激光刚刚入射到样品池中心的底部，在显示屏中可以观察到调节到合适位置。可以观察到，在合适的位置视野背景较低，主要是非成像面的颗粒和样品池等的散射光，再调整物镜位置，可以看到颗粒明亮的散射光。最后调整激光强度和光电传感器的参数，得到合适的影像；
[0026] 在暗场全内反射照明条件下，可以观察到颗粒在溶液中的
布朗运动，然后打开激光器；可以进行双
光子荧光激发或者光学微操控研究。
[0027] 本发明可应用于微纳米颗粒和生物样品等的光学显微成像和研究的全内反射暗场照明方法。基于照明光的全内反射实现对样品的暗场照明，利用样品散射光或者荧光作为
信号光成像和检测，可以实现对微纳米尺度样品的观察和测量，并且对现有照明和成像装置具有良好的适用性和兼容性。本方法的核心在于利用全内反射使得照明光在全内反射棱镜和样品池内多次全内反射，形成全内反射暗场照明，可以实现对微纳米尺度样品的照明和成像等功能。
附图说明
[0028] 图1所示为本发明实施例的结构示意图；
[0029] 图2所示为本发明实施例的全内反射梯形棱镜和样品池示例；
[0030] 图3所示为本发明实施例的全内反射梯形棱镜和样品池一体化加工实例；
[0031] 图4所示为本发明实施例的全内反射弧形棱镜和样品池一体化加工实例；
[0032] 图5所示为本发明实施例的全内反射暗场照明成像的实例。
[0033] 附图标记说明如下：
[0034] 激光器101、下成像光电传感器102、上成像光电传感器103、二向色镜104、反射镜105、扩束准直透镜组201、成像透镜A 202、成像透镜B 203、全内反射暗场照明显微镜300、上成像物镜301、全内反射棱镜302、照明激光303、样品池304、下成像物镜305，样品池载玻片311、样品池盖玻片312、滤光片A 401、滤光片B 402。
具体实施方式
[0035] 为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。
[0036] 为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。
[0037] 本发明包括全内反射暗场照明显微镜300，参见附图1所示，全内反射暗场照明显微镜300的载物台上放置样品池304，样品池304上设有全内反射棱镜302，样品池304里装载样品金纳米颗粒的水溶液，全内反射暗场照明显微镜300设有对称的上光路与下光路，全内反射暗场照明显微镜300的上光路一侧设有上成像物镜301，全内反射暗场照明显微镜300的下光路一侧设有下成像物镜305，全内反射暗场照明显微镜300的上光路与下光路的成像面互相重叠在样品池304的金纳米颗粒的水溶液中。
[0038] 全内反射暗场照明显微镜300包括载物台、下成像物镜305、上成像物镜301。
[0039] 下成像物镜305为：50x的显微镜物镜，上成像物镜301为：50x的显微镜物镜。
[0040] 全内反射暗场照明显微镜300的上光路由上成像光电传感器103、成像透镜B203、滤光片A 401、上成像物镜301组成，全内反射暗场照明显微镜300另一侧设有下成像物镜305，下成像物镜305远离全内反射暗场照明显微镜300的另一侧经过二向色镜104和反射镜105后有成像透镜A 202和滤光片B 402，成像光束经过成像透镜A 202和滤光片B
402后将放大的影像投射到下成像光电传感器102上。全内反射暗场照明装置主要有照明激光303、全内反射暗场照明显微镜300、样品池304组成。
[0041] 照明激光303发出的激光经过全内反射棱镜302全内反射照射到样品池304中的金纳米颗粒的水溶液中，照明激光303经过样品池304池底的全内反射后再次进入全内反射棱镜302，在全内反射棱镜302中多次反射出射离开棱镜。
[0042] 全内反射暗场照明显微镜300的激发光路由激光器101、扩束准直透镜组201、二向色镜104、下成像物镜305组成，全内反射暗场照明显微镜300远离下成像物镜305的另一侧(上光路)设有上成像物镜301。下成像物镜305下侧首先设有一个45度角放置的二向色镜104，二向色镜104偏转激光一侧是激光器101，扩束准直透镜组201，激光器101发出激光经过扩束准直透镜组201，脉冲扩束后经过二向色镜104被反射并偏转90°进入下成像物镜305，汇聚到样品池304中。
[0043] 激光激发样品的荧光和照明激光303与样品相互作用的散射光或者荧光由样品池304一部分进入上成像物镜301，一部分进入下成像物镜305，其余的部分耗散掉。进入下成像物镜305的荧光或者散射光经过二向色镜104，被反射镜105反射并偏转经过成像透镜A 202和滤光片B 402，被下成像光电传感器102采集。进入上成像物镜301的荧光或者散射光经过成像透镜B 203和滤光片A 401，被成像光电传感器103采集。
[0044] 图2是全内反射梯形棱镜和样品池部件分开示例，全内反射棱镜302下面是样品池载玻片311，样品池载玻片311下面是样品池盖玻片312。
[0045] 图3是全内反射梯形棱镜和样品池一体化加工实例，样品池304(梯形)设置在全内反射棱镜302中，样品池304下面设有样品池盖玻片312。
[0046] 图4是全内反射弧形棱镜和样品池一体化加工实例，带全内反射棱镜302的样品池304(弧形)，样品池304下面设有样品池盖玻片312。
[0047] 在其中一个实施例中，基于常规或者自行设计的倒置荧光显微镜的成像功能模块和激发功能模块；放置于常规倒置荧光显微镜二维载物台上由照明激光、全内反射棱镜302、样品池304组成的照明功能模块；上成像光路可扩展功能模块。
[0048] 系统的成像以及激发功能模块的配置是为了实现相关功能而必须配置的装置，主要由观测下成像物镜305、二向色镜104、反射镜105(高反射率镜片)、成像透镜A 202(成像消色差透镜)、滤光片B 402(带通滤光片)和下成像光电传感器102(带成像CCD或者CMOS相机)组成的成像光路；以及在二向色镜104分离的可包括连续或者
脉冲激光器101，以及扩束准直透镜组201(扩束透镜组)等组成的使得系统具备捕获或者激励等功能的激发功能模块。
[0049] 照明功能模块作为发明的核心，主要包括激光以及附属调
制模块，包括连续或者脉冲激光器、模式优化激光滤波的透镜针孔物镜、光路位移角度控制反射镜组以及吸收出射激光的吸收池或者发黑
挡板；由高折射率材料加工成的导入激光，并使得照明激光303经过多次全内反射到达样品池304中心的全内反射棱镜302；样品池304主要是承载全内反射棱镜302并放置样品，其下底设有由0.17mm厚的样品池盖玻片312。
[0050] 上成像光路可扩展功能模块由另一个观测上成像物镜301、成像透镜B 203(成像消色差透镜)、滤光片A 401(带通滤光片)和上成像光电传感器103(带成像CCD或者CMOS相机)组成的成像光路。其设置主要是由需求而定，目的是增加一个维度观测系统，其配置与系统的成像以及激发功能模块在光学上并无差异。
[0051] 在一些实施例中，全内反射暗场照明显微镜的主光路为成像装置，采集在全内反射暗场照明中样品的散射光，滤光片B 402为多层干涉膜或者光学玻璃，滤出激发光，采集散射光和荧光。全内反射暗场照明显微镜下光路的逆光束方向设有一个45度角的二向色镜104，二向色镜104在750nm到1050nm反射率高于95％，在350nm到680nm透射率大于5％，多层
镀膜设计引入低色散。全内反射暗场照明显微镜300下光路从样品池304中透射过来并经过下成像物镜305(聚焦物镜)出来的光束通过二向色镜104、反射镜105、成像透镜A 202、滤光片B 402后到达下成像光电传感器102，并在下成像光电传感器102(成像装置)中完成实时成像。使用的激光器101的激光波长640-1060nm可调，带宽10nm的时候，飞秒的脉宽约为100fs，出光的功率约为1000mW，进入显微镜的功率为800mW。
[0052] 观测上成像物镜301、下成像物镜305：物镜的NA为0.65，工作距离为4.5mm，可以连续校准0到2mm厚的盖玻片厚度或者硅片厚度。
[0053] 使用的样品是溴化十六烷基三甲铵包被的直径60纳米的的金纳米球。样品的透射电镜图，金颗粒形状规整，大小基本均匀，尺寸略有差异，因此可以用来作为成像和研究的对象。对应由于60nm颗粒共振散射激
光谱的波峰在532nm左右，连续绿光532nm激光器，功率200mW，光功率
稳定性波动小于3％，光斑模式TEM00，M因子小于1.3。
[0054] 不使用上成像光路的情况下全内反射棱镜302可以采用分光棱镜或者直角角棱镜，光束入射棱镜进入样品池304并在池底发生全内反射后再通过棱镜出射，棱镜的外形和尺寸可做相应
修改。
[0055] 全内反射棱镜302和样品池304可以一体化加工，样品池304底部利用样品池盖玻片312密封，专有设计减少了界面损耗。
[0056] 全内反射棱镜302的材质应适用于能较理想的产生全内反射折射率应大于溶液，以水为例1.33，照明光波长的光学损耗低小于1dB/km，易于加工为选择标准，可以列举的有
石英玻璃、K9玻璃等常用光学玻璃，甲基丙烯
树脂、聚苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、环烯
烃树脂、甲基丙烯-苯乙烯共聚物树脂、环烯烃-链烯烃共聚物树脂、聚酯树脂等光学塑料，凡是可以满足以上条件的材料皆可以作为加工全内反射棱镜302的原料。
[0057] 照明激光303可以是连续光，脉冲光；激光的波长范围包括紫外光，可见光，红外光等，波长的选择与被照明样品有关，同时也应与探测器和系统的兼容性保持一致。
[0058] 一种基于全内反射的暗场照明方法，具体方法如下：
[0059] 系统的搭建如图实验系统是基于一种倒置荧光显微镜，样品池304和全内反射棱镜302如图上下放置，侧面照明激光角度和位置可以在符合全内反射临界角度范围内调节，其中荧光激发的模块被替换匹配激发光的二项色镜，用于反射导入飞秒光束并透过照明光或者荧光，上光路装置按照需求搭建成像等系统。观测样品为金纳米颗粒，在实验前将4℃低温保存的60nm直径的金纳米颗粒溶液用去离子水或者蒸馏水稀释100～2000倍，然后超声5～10min后使用。
[0060] 将配置好的金纳米颗粒溶液放置在超声清洗过的样品池中，用洁净的棱镜盖上密封，放置到显微镜的载物台的中心位置上。在明场条件下，找到样品池的底部，然后打开光电传感器将图像显示在电脑上，便于调节。
[0061] 打开激光器，通过调节反射镜调整入射激光的角度和位置，使得激光经过棱镜后发生全内反射。微调节激光和样品池，使得激光刚刚入射到样品池中心的底部，在显示屏中可以观察到调节到合适位置。可以观察到，在合适的位置视野背景较低，主要是非成像面的颗粒和样品池等的散射光，再调整物镜位置，可以看到颗粒明亮的散射光。最后调整激光强度和光电传感器的参数等，得到合适的如图5的影像，可以清晰的分辨出液体中焦面上下的纳米颗粒。
[0062] 在暗场全内反射照明条件下，可以观察到颗粒在溶液中的布朗运动，然后打开激光器，可以进一步进行双光子荧光激发或者光学微操控等研究。
[0063] 利用此发明能够实现对样品池中微纳米颗粒和生物样品等较厚样本的观测和研究，能与现有成像、检测和激发等系统灵活结合，便于调节改造，同时保证了良好的适用性和兼容性，可以应用于生物影像观测和胶体特性等相关研究领域。
[0064] 以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附
权利要求为准。
