用于离子液体样品制备的质谱兼容盐的形成
阅读：72发布：2020-12-01
专利汇可以提供用于离子液体样品制备的质谱兼容盐的形成专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 离子液体 样品制备的质谱兼容盐的形成。具体地，本发明提供了用于获得包含质谱兼容的挥发性盐或挥发性化合物的 代谢物 溶液的 试剂 和方法。，下面是用于离子液体样品制备的质谱兼容盐的形成专利的具体信息内容。
1.一种制备包含代谢物和质谱兼容的挥发性盐或挥发性化合物的水溶液的方法，所述方法包括：
任选地在含氟溶剂和/或其他与水不混溶的溶剂或液体存在下，将包含代谢物和离子液体的溶液与含氟化合物混合，从而获得双层混合物，其中所述离子液体包含带正电的有机离子和可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子，并且所述含氟化合物包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子，在所述双层混合物中第一层与第二层不混溶，所述第二层是包含代谢物和所述挥发性盐或挥发性化合物的水溶液并且所述第一层是包含所述离子液体的所述带正电的有机离子的与水不混溶的相；以及
收集所述包含代谢物和所述挥发性盐或挥发性化合物的水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子包括以下项中的一者或多者：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有1至15个碳的有机酸的共轭碱、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、氢阴离子、硼酸根，具有1至15个碳的有机酸的杂原子衍生物、烯烃衍生物、炔烃衍生物，或它们的任意组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述阳离子包括以下项中的一者或多者：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸、氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的含氮共轭酸，或它们的任意组合。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述挥发性盐或挥发性化合物包含：
以下阴离子中的一者或多者：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有1至15个碳的有机酸的共轭碱、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、氢阴离子、硼酸根，或它们的任意组合；和/或以下阳离子中的一者或多者：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸、氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的含氮共轭酸，或它们的任意组合；和/或
所述挥发性盐或挥发性化合物包含以下化合物中的一者或多者：甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氢氧化铵、水、三乙胺乙酸盐、三乙胺甲酸盐、二乙胺乙酸盐、二乙胺甲酸盐、哌啶乙酸盐、哌啶甲酸盐、碳酸氢铵、硼酸盐、氢化物、4-甲基吗啉、1-甲基哌啶、吡咯烷乙酸盐、吡咯烷甲酸盐，或它们的任意组合。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述方法在所述与水不混溶的溶剂或液体存在下进行，所述溶剂或液体是以下项中的一者或多者：己烷、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、丁烷、环己烷、庚烷，或它们的任意组合。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述离子液体中的所述带正电的有机离子由下式(I)至(VI)中的一者定义：
其中R1和R2各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
1 2
其中R和R各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子液体包含1-己基-3-甲基-咪唑(HMIM)乙酸盐、1-丁基-3-甲基-咪唑(BMIM)乙酸盐、HMIM甲酸盐，和/或BMIM甲酸盐。
8.根据权利要求1所述的方法，其中使用具有以下通式(VII)的含氟化合物中的一种或多种来执行所述方法：
[Z1-(CH2)m-SO2-N(-)-SO2-(CH2)p-Z2].M+ (VII)
其中：M+为可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子，并且
Z1和Z2独立地为全氟烷基、烷基、取代的烷基、全氟芳基、芳基或取代的芳基，其中Z1和Z2一起包括合并的总共8个或更多个氟化(例如，全氟化)的碳原子(例如，9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、30个或更多个或
40或更多个氟化碳原子)；并且m和p独立地为0、1或2。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含所述阳离子的含氟化合物是用以下阳离子中的一者或多者配制的双((全氟己基)磺酰基)酰亚胺：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸、氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根或弱碱的含氮共轭酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述含氟溶剂包含全氟化碳(PFC)、氢氟醚(HFE)、全氟己烷、全氟甲基环己烷、全氟萘烷、纳米氟丁基甲基醚，或它们的任意组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤中的至少一个步骤：
使生物样品裂解；和/或
通过直接进样质谱法、液相色谱/质谱法、气相色谱/质谱法、离子迁移/质谱法、超临界流体色谱/质谱法或它们的任意组合来量化包含代谢物和所述挥发性盐或挥发性化合物的水溶液中的代谢物。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中所述离子液体和/或所述包含代谢物的溶液还包含一种或多种水可混溶性溶剂；并且其中所述水可混溶性溶剂优选包括乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，或它们的任意混合物。
13.一种用于手动或可自动化的离子液体工作流的方法，所述方法包括：
1)使生物样品与一种或多种包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的一种或多种阴离子的离子液体接触，从而获得包含代谢物和所述离子液体的混合物；
2)执行复分解反应，以及通过以下方式从包含所述代谢物的所述混合物中去除离子液体AB的阳离子：使所述离子液体与含氟化合物CD反应并产生包含挥发性盐或挥发性化合物的代谢物溶液；以及
3)将与水不混溶的相与水相分离，所述水相包含所述代谢物溶液。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物样品包含细胞，并且使所述生物样品与所述一种或多种离子液体接触的步骤使所述细胞裂解，并且其中所述方法还包括：
-从所述代谢物溶液中去除含氟污染物；和/或
-从所述包含代谢物和所述离子液体的混合物中分离细胞和/或包含酶、蛋白质、DNA、RNA和/或脂质的其他碎片。
15.一种用于进行权利要求1-12中任意一项所述方法的包含一种或多种离子液体以及含氟化合物的试剂盒，其中所述试剂盒还可选地包含如下的一者或多者：相分离器材料或柱；碎片去除过滤装置或柱、包括过滤器的细胞培养装置、含氟亲和柱、含氟溶剂、与水不混溶的溶剂或液体、水可混溶性溶剂、与水混合的水可混溶性溶剂，或它们的任意组合，并且其中所述相分离器材料或柱；所述碎片去除过滤装置或柱；所述包含过滤器的细胞培养装置；并且/或者所述含氟亲和柱是多孔形式的；并且其中所述多孔形式任选为96孔板、48孔板、24孔板、12孔板，或6孔板。
用于离子液体样品制备的质谱兼容盐的形成
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求下列两个美国临时申请的优先权：2018年8月28日提交的美国临时申请序列号62/723,873和2018年3月20日提交的美国临时申请序列号62/645,583，这两个临时申请的全部公开内容以引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及代谢物组学领域，包括用于在包含代谢物的溶液中形成质谱兼容的盐或化合物的方法、试剂、组合物、试剂盒和系统。这些方法可应用于制药和生物制药、临床诊断、合成生物学、环境保护、食品检测和农业，以及法医毒理学。
背景技术
[0004] 代谢物组学(metabolomics)是一种强大的工具，其可用于许多领域中，包括研究疾病、疾病进展以及新开发的疗法的代谢影响；测量疾病生物标记；通过测量代谢通量来优化化学生产；了解环境对生物体的影响和检测毒素；分析食品加工、质量和安全；以及检测人样品中的药物及其代谢物。已经开发了在制备代谢物组学样品期间使用离子液体来使细胞或其他生物样品裂解并猝灭代谢的策略，包括如美国专利公开US 2014/0273080和US 2015/0369711中所述，这两个美国专利公开均以引用方式并入本文。
[0005] 离子液体由带正电的有机离子(A)和平衡离子(B)组成。在分析代谢物组学样品之前，从溶液中去除带正电的有机离子(A)以防止对液相色谱和质谱系统的污染并防止在质谱分析期间对代谢物的离子抑制。为了去除带正电的有机离子(A)，利用盐复分解反应。该反应所需的组分包括：离子液体(AB)，所述离子液体(AB)用于使细胞或其他生物样品裂解并猝灭代谢；以及离子化合物(CD)，所述离子化合物(CD)可与所述离子液体相互作用以形成新离子液体(AD)，所述新离子液体(AD)本身是与水不混溶的液体，或可与与水不混溶的溶剂或液体混溶。
[0006] 在盐复分解反应期间，带正电的有机离子(A)从水相移动以形成离子络合物(AD)，所述离子络合物(AD)本身是与水不混溶的液体或是可与与水不混溶的溶剂或液体混溶的。离子(D)来自离子化合物(CD)。同时，离子(C)移动到水相中以取代带正电的有机离子(A)并与平衡离子(B)形成离子化合物。
[0007] 离子化合物(CB)可具有各种性质，但是其在一些应用中为无机水溶性盐(诸如氯化钾)或水不溶性盐(诸如磷酸银)。形成无机水溶性盐的缺点是，这些盐可能在质谱分析期间引起离子抑制，并且通常不利地影响质谱仪器的性能。水不溶性盐对该缺点提供了一些解决方案。但是形成水不溶性盐沉淀物可能需要将盐沉淀物与代谢物溶液分离的进一步步骤。取决于水不溶性盐的特性，所述水不溶性盐可能与一些代谢物形成不溶性沉淀物，从而降低含代谢物的溶液中那些代谢物的含量。取决于水不溶性盐的特性，过量的平衡离子(诸如磷酸根)可能保留在溶液中并且可能影响样品的LCMS分析。
[0008] 因此，本领域中需要这样的方法，通过所述方法可以进行盐复分解反应，使得在盐复分解反应中形成的物质是质谱兼容的。
发明内容
[0009] 在一个方面，本公开提供了制备包含代谢物和质谱兼容的挥发性盐或挥发性化合物的水溶液的方法，所述方法包括：
[0010] -将如下进行混合：
[0011] i)含氟化合物，所述含氟化合物包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子；和
[0012] ii)包含代谢物和离子液体的溶液，所述离子液体包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子，
[0013] 其中所述混合任选地在含氟溶剂和/或其他与水不混溶的溶剂或液体存在下进行，
[0014] 从而获得双层混合物，在所述双层混合物中第一层与第二层不混溶，所述第二层是包含代谢物和所述挥发性盐或挥发性化合物的水溶液并且所述第一层是包含所述离子液体的所述带正电的有机离子的与水不混溶的相；以及
[0015] -收集所述包含代谢物和所述挥发性盐或挥发性化合物的水溶液。
[0016] 在本发明的方法中，所述阴离子可包含以下阴离子中的一者或多者：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有1至15个碳的有机酸的共轭碱、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、硼酸根、氢阴离子、或它们的任意混合物。
[0017] 在本发明的方法中，所述阳离子可包含以下阳离子中的一者或多者：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸，氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的含氮共轭酸，或它们的任意组合。
[0018] 在本发明的方法中，所述挥发性盐或挥发性化合物可包含：
[0019] 以下阴离子中的一者或多者：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有1至15个碳的有机酸的共轭碱、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、硼酸根、氢阴离子，或它们的任意组合；和/或
[0020] 以下阳离子中的一者或多者：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸、氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的含氮共轭酸，或它们的任意组合。
[0022] 在一些实施方案中，在与水不混溶的溶剂或液体的存在下进行本发明的方法，所述与水不混溶的溶剂或液体为诸如以下项中的一者或多者：己烷、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、丁烷、环己烷、庚烷，或它们的任意组合。
[0023] 在一些实施方案中，所述挥发性盐包含乙酸铵。
[0024] 在本发明方法的一些方法中，所述挥发性盐或挥发性化合物包含以下化合物中的一者或多者：甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氢氧化铵、水、三乙胺乙酸盐、三乙胺甲酸盐、二乙胺乙酸盐、二乙胺甲酸盐、哌啶乙酸盐、哌啶甲酸盐、碳酸氢铵、硼酸盐、氢化物、4-甲基吗啉、1-甲基哌啶、吡咯烷乙酸盐、吡咯烷甲酸盐，或它们的任意组合。
[0025] 在本发明方法的一些中，所述离子液体中带正电的有机离子由下式(I)至(VI)中的一者定义：
[0026]
[0027] 其中R1和R2各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
[0028]
[0029] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
[0030]
[0031] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
[0032]
[0033] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
[0034]
[0035] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基；
[0036]
[0037] 其中R1和R2各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
[0038] 所述带正电的有机离子中的一种或多种可以为1-己基-3-甲基-咪唑(HMIM)根和/或1-丁基-3-甲基-咪唑(BMIM)根。在所述方法的一些方法中，所述离子液体包含HMIM乙酸盐、BMIM乙酸盐、HMIM甲酸盐，和/或BMIM甲酸盐。
[0039] 可以使用具有以下通式(VII)的含氟化合物中的一种或多种来执行本发明的方法：
[0040] [Z1-(CH2)m-SO2-N(-)-SO2-(CH2)p-Z2].M+ (VII)
[0041] 其中：M+为可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子，并且
[0042] Z1和Z2独立地为全氟烷基、烷基、取代的烷基、全氟芳基、芳基或取代的芳基，其中1 2
Z和Z一起包括合并的总共8个或更多个氟化(例如，全氟化)的碳原子(例如，9个或更多个、
10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、30个或更多个或40或更多个氟化碳原子)；并且m和p独立地为0、1或2。
Z和Z一起包括合并的总共8个或更多个氟化(例如，全氟化)的碳原子(例如，9个或更多个、
10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、30个或更多个或40或更多个氟化碳原子)；并且m和p独立地为0、1或2。
[0043] 所述含氟化合物可包括用以下阳离子中的一者或多者配制的双((全氟己基)磺酰基)酰亚胺：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸、氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根或弱碱的含氮共轭酸。
[0044] 所述含氟化合物可以是双((全氟己基)磺酰基)酰亚胺铵盐。
[0045] 所述含氟溶剂可包括全氟化碳(PFC)和/或氢氟醚(HFE)。所述含氟溶剂可包括全氟己烷、全氟甲基环己烷、全氟萘烷(perfluorodecalin)、纳米氟丁基甲基醚，或它们的任意组合。
[0046] 所述包含代谢物和所述离子液体的溶液还可以包含一种或多种水可混溶性溶剂。在一些实施方案中，所述包含代谢物和所述离子液体的溶液还包含乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，或它们的任意混合物。
[0047] 本公开的其他方面包括用于手动或可自动化的离子液体工作流的方法。所述方法可包括以下三个步骤：1)使生物样品与一种或多种离子液体接触，所述离子液体包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的一种或多种阴离子，从而获得包含代谢物和所述离子液体的混合物；2)执行复分解反应，以及通过以下方式从包含所述代谢物的所述混合物中去除离子液体AB的所述阳离子：使所述离子液体与含氟化合物CD反应并产生包含挥发性盐或挥发性化合物的代谢物溶液；以及3)将与水不混溶的相与水相分离，所述水相包含所述代谢物溶液。在该方法中，如在本公开中所提供地执行复分解反应。所述方法还可包括从代谢物溶液中去除含氟污染物，例如通过将所述代谢物溶液加载到含氟亲和树脂上，从而将含氟污染物结合到所述树脂上；然后洗脱所述含有代谢物的溶液。
[0048] 所述方法中的生物样品可包含细胞，并且使所述生物样品与所述一种或多种离子液体接触可使所述细胞裂解。所述方法还包括从所述包含代谢物和所述离子液体的混合物中分离细胞和/或包含酶、蛋白质、DNA、RNA和/或脂质的其他碎片。
[0049] 本公开的其他方面包括用于获得代谢物溶液的试剂盒，所述试剂盒包含离子液体和含氟化合物，所述离子液体包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子，所述含氟化合物包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子。所述试剂盒还可包含以下项中的一者或多者：相分离器材料或柱；碎片去除过滤装置或柱、包括过滤器的细胞培养装置、含氟亲和柱、含氟溶剂、与水不混溶的液体、水可混溶性溶剂、与水混合的水可混溶性溶剂，或它们的任意组合。在试剂盒的一些实施方案中，来自所述相分离器材料或柱；所述碎片去除过滤装置或柱、所述包含过滤器的细胞培养装置，并且/或者所述含氟亲和柱的至少一者是多孔形式的，诸如96孔板。在所述试剂盒中，离子液体可包含选自1-己基-3-甲基-咪唑根(HMIM)和1-丁基-3-甲基-咪唑根(BMIM)的阳离子。在所述试剂盒中的一些中，离子液体包含乙酸根阴离子，并且其中含氟化合物包含铵阴离子。
[0050] 所述试剂盒中的一些可包含具有下式(VII)的含氟化合物：
[0051] [Z1-(CH2)m-SO2-N(-)-SO2-(CH2)p-Z2].M+ (VII)
[0052] 其中：M+为可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子；
[0053] Z1和Z2独立地为全氟烷基、烷基、取代的烷基、全氟芳基、芳基或取代的芳基，其中Z1和Z2一起包括合并的总共8个或更多个氟化的碳原子；
[0054] 并且m和p独立地为0、1或2。
[0055] 其他方面包括用于定量样品中代谢物的分析方法，所述分析方法包括用包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子的离子液体猝灭样品中的酶；在所述离子液体与包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子的含氟化合物的复分解反应中产生挥发性盐或挥发性化合物；以及通过以下方法中的任何一种在所述挥发性盐或挥发性化合物存在下定量代谢物：直接进样质谱法、液相色谱/质谱法、气相色谱/质谱法、离子迁移/质谱法、超临界流体色谱法/质谱法，或它们的任意组合。在所述方法中，样品可以包含在酶被猝灭之前已经通过离子液体或另一种方法裂解的细胞。附图说明
[0056] 图1是产生质谱兼容的乙酸铵的盐复分解反应的示意图。
[0057] 图2是使用改编自WO 2003/002622的方法合成包含铵阳离子的含氟化合物的示意图。
[0058] 图3A至图3F示出了白血病细胞的细胞裂解。图3A和图3B是具有PBS的对照，示出了未受影响的细胞。图3C至图3F示出了用浓度分别为10％、20％、30％或50％的BMIM OAc进行的细胞裂解。
[0059] 图4报告了用50％BMIM乙酸盐猝灭ATP代谢的结果。
[0060] 图5A至图5B报告了包含乙酸铵的代谢物样品分析的质谱结果。在图5A中，在210mM乙酸铵的存在(+)或不存在(-)下量化代谢物。在图5B中，在420mM乙酸铵的存在(+)或不存在(-)下量化代谢物。
[0062] 图7是手动或可自动化的离子液体工作流的图。
具体实施方式
[0063] 在一个方面，本公开提供了一种方法，在所述方法中在复分解反应期间形成挥发性的、质谱兼容的盐或化合物。
[0064] 在本公开中，质谱兼容的挥发性盐或挥发性化合物被定义为在质谱仪内存在的条件下易蒸发成气体的盐或化合物。在本公开中，术语“挥发性盐或挥发性化合物”可与术语“质谱兼容的挥发性盐或挥发性化合物”互换使用。虽然通常，并非本领域中已知的所有挥发性化合物都可以是质谱兼容的，但是应当理解，在本公开中，挥发性盐或挥发性化合物仅包括那些质谱兼容的挥发性盐或化合物。质谱兼容意味着这些挥发性盐或挥发性化合物不会导致对代谢物的显著离子抑制，并且不会使质谱仪系统中的灵敏度显著降级。质谱兼容的挥发性盐或化合物不会显著干扰质谱仪的性能。
[0065] 合适的阴离子是可形成质谱仪兼容的挥发性盐或挥发性化合物的阴离子。这些阴离子通常是弱酸的阴离子(共轭碱)。合适的阳离子是可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子。这些阳离子通常是弱碱的阳离子(共轭酸)。然而，磷酸根、磷酸一氢根和磷酸二氢根不形成挥发性盐，尽管它们是弱酸的共轭碱。硫酸根、硫酸氢根和硼酸根可能是挥发性的，但它们的使用取决于质谱仪源中使用的温度以及它们蒸发或转化成可蒸发的化学物质有多快。
[0066] 本公开中的方法包括在复分解反应中使离子液体与含氟的离子化合物(CD)反应，所述离子液体包含带正电的有机离子(A)和可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子(B)，所述含氟的离子化合物(CD)包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子(C)。
[0067] 在所述方法中，复分解反应可以由以下方案1表示：
[0068] AB+CD→AD+CB(方案1)
[0069] 其中：
[0070] A为离子液体中带正电的有机离子(A)，
[0071] B为可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子(B)，
[0072] AB为含有阴离子(B)的离子液体
[0073] C为可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子(C)，
[0074] D为含氟化合物，
[0075] CD为包含阳离子(C)的含氟化合物，
[0076] AD为可与含氟溶剂和/或与水不混溶的溶剂混溶的离子液体，
[0077] CD为挥发性盐或挥发性化合物。
[0078] 这些方法包括在含氟溶剂和/或其他与水不混溶的溶剂或液体(诸如，己烷、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、丁烷、环己烷和庚烷，或它们的任意组合)存在下，将包含代谢物、水和一种或多种离子液体的混合物与含氟化合物混合，所述一种或多种离子液体包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子，所述含氟化合物包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子；以及获得双相组合物，所述双相组合物包含第一相和第二相，所述第二相与所述第一相不可混溶。所述第一相是与水不混溶的相，其包含通过复分解反应获得的第二新形成的离子液体以及含氟溶剂和/或其他与水不混溶的溶剂或液体，所述第二相是包含代谢物和通过复分解反应获得的挥发性盐和/或挥发性化合物的溶液。所述反应混合物还可包含一种或多种水可混溶性溶剂和/或缓冲剂和/或其他添加剂。在一些方法中，所述离子液体是10wt％至100wt％的水溶液。所述溶液还可包含至少一种缓冲剂和/或至少一种水可混溶性溶剂。优选地，包含阴离子B的离子液体是50wt％的水溶液，所述水溶液还可包含至少一种水可混溶性溶剂和/或缓冲剂和/或酸和/或碱和/或其他添加剂。
[0079] 这些方法可以在-80℃至300℃的范围内的温度下进行。可以使用直至溶剂沸点的任何温度。
[0080] 在本发明方法中，使含有阴离子的离子液体与含有阳离子的含氟化合物分别以在从1:100至100:1的范围内的摩尔比反应。
[0081] 在本公开的本发明方法的复分解反应中获得的挥发性化合物或挥发性盐可包含任何的以下阴离子：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有约15个或更少的碳的有机酸(包括有机酸的杂原子衍生物、烯烃衍生物、炔烃衍生物)、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、硼酸根、氢阴离子，或它们的任意组合。
[0082] 在本公开的本发明方法的复分解反应中获得的挥发性化合物或挥发性盐可包含任何的以下阳离子：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸，氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的其他含氮共轭酸，或它们的任意组合。
[0083] 在本发明方法的复分解反应中获得的一些挥发性化合物或挥发性盐包括：
[0084] -以下阴离子中的一种或多种：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有约15个或更少的碳的有机酸(包括有机酸的杂原子衍生物、烯烃衍生物、炔烃衍生物)、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、硼酸根、氢阴离子，或它们的任意组合；和/或
[0085] -以下阳离子中的一种或多种：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸、氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的其他含氮共轭酸，或它们的任意组合。
[0086] 在本发明方法的复分解反应中获得的特别优选的挥发性化合物或挥发性盐包括但不限于：甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氢氧化铵、水、三乙胺乙酸盐、三乙胺甲酸盐、二乙胺乙酸盐、二乙胺甲酸盐、哌啶乙酸盐、哌啶甲酸盐、碳酸氢铵、硼酸盐、氢化物、4-甲基吗啉、1-甲基哌啶、吡咯烷乙酸盐、吡咯烷甲酸盐，或它们的任意组合。
[0087] 在本发明方法中产生的特别优选的挥发性、质谱仪兼容的盐或化合物是乙酸铵。
[0088] 在一个方面，本公开提供了产生与代谢物溶液混合的挥发性、质谱仪兼容的盐或化合物的方法。所述方法可以作为代谢物组学离子液体样品制备工作流的一部分来实践。
[0089] 产生挥发性、质谱仪兼容的盐或化合物的本发明的复分解方法改善了样品中代谢物的检测、分析和分离，包括通过液相色谱质谱(LCMS)方法、气相色谱质谱(GCMS)方法、离子迁移-质谱法和/或其他质谱方法来检测代谢物。本公开的方法可以包括通过液相色谱-质谱系统分析代谢物。分析可包括液相色谱法，包括高效液相色谱法、微米液相色谱法或纳米液相色谱法或超高压液相色谱法。分析还可包括液相色谱/质谱法(LCMS)、离子迁移-质谱法、气相色谱/质谱法(GCMS)、毛细管电泳(CE)、毛细管电泳色谱法(CEC)或超临界流体色谱-质谱法。
[0090] 术语“代谢物”在本文中以其常规含义使用，是指一种或多种为代谢过程的底物或产物的化合物。代谢物可包括通过活细胞中的代谢过程产生的底物或产物，所述代谢过程包括但不限于糖酵解、三羧酸循环(即，TCA循环、克雷布斯循环(Krebs cycle))、还原性戊糖磷酸循环(即，卡尔文循环)、糖原代谢、戊糖磷酸途径，以及其他代谢过程。因此，代谢物可包括但不限于葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-磷酸、3-磷酸甘油醛、磷酸二羟丙酮、1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolruvate)、丙酮酸、乙酰CoA、柠檬酸、顺乌头酸、d-异柠檬酸、-酮戊二酸、琥珀酰CoA、琥珀酸盐、富马酸、苹果酸、草酰乙酸、1,5-二磷酸核酮糖、3-磷酸甘油酸、1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油醛、核酮糖-5-磷酸、乙醇、乙醛、丙酮酸、6-磷酸葡萄糖酸内酯、6-磷酸葡萄糖酸、核糖-5-磷酸、木酮糖-5-磷酸、7-磷酸景天庚酮糖、4-磷酸赤藓糖以及其他代谢物。代谢物可包括药物化合物和药物代谢物或食物化合物和食物代谢物。
[0091] 在本公开的离子液体工作流中，将离子液体加入到生物样品中以裂解细胞和/或使酶变性和/或抑制酶，并产生包含代谢物的混合物。所述离子液体包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子。“裂解”细胞意味着细胞破裂或破碎开，使得细胞的内部内容物(包括代谢物在内)释放到周围介质(即，离子液体，所述离子液体通常是离子液体的水溶液)中。在一些实施方案中，细胞裂解还可包括细胞器的裂解，所述细胞器为例如细胞核、线粒体、核糖体、叶绿体、溶酶体、液泡、高尔基体，中心粒等，使得细胞器的内容物也被释放到周围介质中。
[0092] 术语“生物样品”是指整个生物体或其组织、细胞和/或组成(例如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道分泌物和精液)的子集。“生物样品”还可以指从整个生物体或其组织、细胞或组成部分或它们的级分或部分制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于例如血浆，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部，泪液，唾液，乳汁，血细胞，肿瘤，器官。在某些实施方案中，已从动物、植物和/或真菌中取出生物样品。
[0093] 本公开的生物样品可包括细胞。术语“细胞”以其常规意义使用，是指活的真核生物和原核生物的基本结构单元。在某些实施方案中，细胞包括原核细胞，诸如细菌。在其他实施方案中，细胞包括真核细胞，所述真核细胞可包括但不限于可从动物、植物和/或真菌获得的组织培养细胞系、酵母细胞和原代细胞。
[0094] 在细胞裂解/蛋白质变性/酶破坏完成并且已从样品中取出蛋白质/细胞碎片后，进一步的步骤包括复分解反应，通过所述复分解反应离子液体的阳离子从代谢物溶液中分离出，并且产生了挥发性盐和/或化合物。
[0095] 离子液体是这样的盐，在所述盐中平衡离子配位不良，并且导致所述盐在100℃以下呈液体形式。术语“离子液体”以其常规含义使用，是指液态盐。离子液体可包含水和其他添加剂。例如，离子液体可以是与水的混合物。当与水混合时，以重量计离子液体与水的比可以在100:0至1:99的范围内。在本公开中，包含水的离子液体被称为离子液体。
[0096] 用于本发明方法的合适离子液体包含可形成一种或多种挥发性盐或挥发性化合物的一种或多种阴离子。
[0097] 在本发明方法中，离子液体可包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子和根据式(I)-(VI)中任一项的阳离子。
[0098] 在一些实施方案中，离子液体包含式(I)的阳离子：
[0099]
[0100] 其中R1和R2各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
[0101] 在一些实施方案中，离子液体包含式(II)的阳离子：
[0102]
[0103] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
[0104] 在一些实施方案中，离子液体包含式(III)的阳离子：
[0105]
[0106] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
[0107] 在一些实施方案中，离子液体包含式(IV)的阳离子：
[0108]
[0109] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
[0110] 在一些实施方案中，离子液体包含式(V)的阳离子：
[0111]
[0112] 其中R是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
[0113] 在一些实施方案中，离子液体包含式(VI)的阳离子：
[0114]
[0115] 其中R1和R2各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
[0116] 在本发明方法的一些方法中，使用至少两种或更多种离子液体的混合物，其中所述混合物中的至少一种离子液体包含本公开中描述的一种或多种阴离子。
[0117] 优选的离子液体包括包含以下阴离子中的一种或多种的那些离子液体：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有约15个或更少的碳的有机酸(包括有机酸的杂原子衍生物、烯烃衍生物、炔烃衍生物)、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、硼酸根、氢阴离子，或它们的任意组合。
[0118] 优选的离子液体包括包含一种或多种具有式(I)至(VI)中任一项的阳离子以及以下阴离子中的一种或多种的那些离子液体：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有约15个或更少的碳的有机酸(包括有机酸的杂原子衍生物、烯烃衍生物、炔烃衍生物)、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、硼酸根、氢阴离子，或它们的任意组合。
[0119] 在一些优选的实施方案中，离子液体包含1-己基-3-甲基-咪唑根(HMIM)和/或1-丁基-3-甲基-咪唑根(BMIM)，以及可形成挥发性盐或挥发性化合物的一种或多种阴离子。
[0120] 在一些优选的实施方案中，离子液体包含HMIM和/或BMIM，以及以下阴离子中的一种或多种：硫酸根、硫酸氢根、碳酸根、碳酸氢根、乙酸根阴离子、甲酸根阴离子、三氟乙酸根阴离子、具有约15个或更少的碳的有机酸(包括有机酸的杂原子衍生物、烯烃衍生物、炔烃衍生物)、硫根、氢硫根、氰根、二氰胺根、硝酸根、三氯乙酸根阴离子、氢氧根、硼酸根、氢阴离子，或它们的任意组合。
[0121] 在本公开中一些方法使用包含HMIM乙酸盐和/或BMIM乙酸盐的离子液体进行，所述HMIM乙酸盐和BMIM乙酸盐在本公开中分别称为HMIMOAc和BMIM OAc。
[0122] 本发明的复分解方法是用任意上述离子液体和至少一种具有以下通式(VII)的含氟化合物来进行的：
[0123] [Z1-(CH2)m-SO2-N(-)-SO2-(CH2)p-Z2].M+ (VII)
[0124] 其中：M+是可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子，优选地，M+是以下阳离子中的一种或多种：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸，氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的其他含氮共轭酸，或它们的任意组合；并且
[0125] Z1和Z2独立地为全氟烷基、烷基、取代的烷基、全氟芳基、芳基或取代的芳基，其中1 2
Z和Z一起包括合并的总共8个或更多个氟化(例如，全氟化)的碳原子(例如，9个或更多个、
10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、30个或更多个或40或更多个氟化碳原子)；并且m和p独立地为0、1或2。
Z和Z一起包括合并的总共8个或更多个氟化(例如，全氟化)的碳原子(例如，9个或更多个、
10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、30个或更多个或40或更多个氟化碳原子)；并且m和p独立地为0、1或2。
[0126] 在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2是相同的基团。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2是不同的基团。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为氟化基团或全氟化基团。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2中的至少一者是氟化基团或全氟化基团。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为全氟烷基。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为全氟丁基。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为全氟戊基。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为全氟己基。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为全氟庚基。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为全氟辛基。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2各自为全氟芳基。在式(IX)的某些实施方案中，Z1和Z2一起包括合并的总共10个或更多个全氟化碳原子。在式(VII)的某些实施方案中，Z1和Z2一起包括合并的总共12个或更多个全氟化碳原子。
[0127] 在式(VII)的某些实施方案中，m和p各自为0。在式(VII)的某些实施方案中，m+p＝1。在式(VII)的某些实施方案中，m+p＝2。在式(VII)的某些实施方案中，m+p＝3。在式(VII)的某些实施方案中，m+p＝4。
[0128] 本公开中优选的含氟化合物包括用可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子配制的双((全氟己基)磺酰基)酰亚胺(在本公开中称为NTf6)。本公开中优选的含氟化合物包括用以下阳离子中的一种或多种配制的NTf6：铵根、三甲基铵根、吡啶离子、咪唑离子、哌啶离子、嘧啶共轭酸，氢阳离子(氢根)、水合氢离子、三乙基铵根、二乙基铵根、吗啉根、4-甲基吗啉根、1-甲基哌啶根、吡咯烷根、弱碱的其他含氮共轭酸，或它们的任意组合。
[0129] 包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子的特别优选的含氟化合物是双((全氟己基)磺酰基)酰亚胺铵(NH4NTf6)。
[0130] 在本公开的方法中，式(VII)的含氟化合物的阳离子平衡离子和离子液体的阴离子平衡离子经选择为使得：在复分解反应中形成挥发性的质谱兼容的盐或化合物。因此，合适的离子液体和含氟化合物包括但不限于：包含阴离子的任何离子液体和包含阳离子的任何含氟化合物，所述离子液体和所述含氟化合物当在复分解反应中反应时产生任意以下盐/化合物：甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氢氧化铵、水、三乙胺乙酸盐、三乙胺甲酸盐、二乙胺乙酸盐、二乙胺甲酸盐、哌啶乙酸盐、哌啶甲酸盐、碳酸氢铵、硼酸盐、氢化物、4-甲基吗啉、1-甲基哌啶、吡咯烷乙酸盐、吡咯烷甲酸盐，或其他挥发性盐或化合物。
[0131] 参考图1，其是根据本发明方法的复分解反应的示意图。使包含代谢物和BMIM OAc的混合物与NH4NTf6反应。所述混合物还包含含氟溶剂、水，以及任选地至少一种水可混溶性溶剂。所述反应导致形成双相混合物，即第一相和第二相，其中所述第一相与所述第二相不可混溶，并且其中所述第一相是包含含氟溶剂和BMIM·NTf6的有机层，并且所述第二相是包含代谢物和乙酸铵的溶液。
[0132] 参考图2，其是NH4NTf6的合成示意图。基本上如WO 2003/002622A1中所述地进行合成。具体地，在步骤1中，用氢阳离子获得NTf6，然后将其在甲醇存在下与氢氧化铵反应，如图2所示。对于本领域的技术人员显而易见的是，包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子的其他含氟化合物可通过遵循与结合图2描述的方案类似的方案获得。
[0133] 在含氟溶剂的存在下进行本公开的复分解方法，所述含氟溶剂与水不混溶并且在复分解反应中形成单独的与水不混溶的相。含有来自离子液体AB的阳离子A的含氟离子液体(AD)在复分解反应期间溶解到与水不混溶的相中，从而与包含代谢物的溶液分离。所述复分解反应还可包含水可混溶性溶剂和/或其他添加剂。合适的水可混溶性溶剂包括但不限于乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基磺酰胺，以及它们的任何混合物。其他添加剂可包括甲酸或乙酸。
[0134] 合适的含氟溶剂包括但不限于全氟化碳(PFC)和氢氟醚(HFE)。全氟化碳包括但不限于全氟己烷、全氟甲基环己烷和全氟萘烷。氢氟醚包括但不限于纳米氟丁基甲基醚(例如，HFE-7100)。在一些实施方案中，含氟溶剂是氢氟醚，例如HFE-7100。含氟溶剂可以是纯的，或者其可以包含添加剂。应当理解，可以在复分解反应之前或在离子液体与含氟化合物之间的复分解反应已经开始、部分完成或完全完成之后加入含氟溶剂。或者，可以在将具有包含本公开的任何阴离子的离子液体的代谢物溶液与包含本公开的任何阳离子的含氟化合物混合的同时或不久之后加入含氟溶剂。
[0135] 在复分解反应中形成的挥发性盐或挥发性化合物可以是乙酸铵，其可以在离子液体工作流的盐复分解步骤期间形成。在其他实施方案中，还可以形成如上所述的其他羧酸铵或其他挥发性盐或化合物，以代替或者补充乙酸铵。
[0136] 先前，所形成的离子化合物是非挥发性无机盐(即，氯化钾)，所述非挥发性无机盐会对经由LCMS、GCMS或其他代谢物分析仪器/方法进行的样品中代谢物的检测造成干扰。挥发性离子对或挥发性化合物不会对经由LCMS、GCMS或其他代谢物分析仪器/方法进行的样品中代谢物的检测造成干扰到与无机离子对相同的程度，因为它们在质谱分析中常用的温度下蒸发。
[0137] 本公开提供了在离子液体代谢物组学样品制备方法期间形成挥发性离子对或挥发性化合物(诸如乙酸铵)的方法。当特别地通过LCMS或通过其他代谢物检测方法进行分析时，这种挥发性离子对或挥发性化合物(诸如，乙酸铵)的形成导致代谢物峰形状、代谢物分辨率和对代谢物离子的灵敏度得到改善。还预计与水溶性无机盐相比，乙酸铵对用于分析使用离子液体方法制备的代谢物组学样品的LCMS系统的灵敏度和性能的长期影响更小。还预计与离子液体AB的阳离子A相比，乙酸铵对用于分析使用离子液体方法制备的代谢物组学样品的LCMS系统的灵敏度和性能的长期影响更小
[0138] 本公开的其他方法包括获得代谢物溶液的方法，所述方法包括使生物样品裂解的步骤。这些实施方案包括用包含本公开中提供的一种或多种阴离子的离子液体来使生物样品裂解；将包含代谢物和离子液体的溶液与裂解碎片分离；以及执行与含氟化合物的复分解反应，所述含氟化合物包含可形成本公开中提供的挥发性盐或挥发性化合物的一种或多种阳离子。本公开中描述的任意离子液体可以单独使用或与其他离子液体组合使用。
[0139] 本公开提供了裂解溶液，所述裂解溶液包含5wt％至100wt％的包含本公开中描述的一种或多种阴离子的离子液体。裂解溶液通常是水基的。它还可包含一种或多种水可混溶性溶剂、着色剂、pH指示剂、酸、碱和/或缓冲剂。裂解反应可在室温下进行。裂解反应的持续时间可以从简单地将生物样品与裂解溶液混合到混合并将混合物孵育一段时间而变化。通常，裂解溶液的体积取决于生物样品的体积/重量。通常，每一体积或重量当量的生物样品可使用10至2000体积的裂解溶液。例如，5μl至1,000μl的裂解溶液可用于0.5μl的生物样品。
[0140] 在已经完成生物样品的裂解之后，可以根据需要进行将包含代谢物和离子液体的溶液与不需要的碎片分离的步骤，这取决于生物样品。取决于生物样品，碎片可能包括细胞膜、脂肪、变性蛋白质、DNA、RNA等。分离碎片的步骤可包括但不限于离心、过滤和/或柱色谱法。也可以使用本领域的技术人员已知的用于从溶液中分离固体的其他方法。
[0141] 参见图3A至图3F，这些图是用细胞裂解缓冲液裂解后的细胞的照片，所述细胞裂解缓冲液包含各种浓度的包含乙酸根的离子液体(10％、20％、30％或50％的BMIM OAc的水溶液(w/v))。图3A和3B示出了悬浮在PBS中的对照细胞。对照显示没有显著的细胞裂解。图3C至图3F显示离子液体(如图3C至图3F中所示的各种浓度的BMIM OAc水溶液(w/v))有效地裂解细胞，反应效率取决于BMIM OAc的浓度、和/或BMIM OAc的量、和/或生物样品的细胞量/大小。如图3F所示，用包含50wt％BMIM OAc的水基裂解溶液使所有或几乎所有细胞裂解，而如图3C所示，当使用包含10wt％BMIM OAc的水基裂解溶液时仍存在一些完整细胞。
[0142] 参考图4，其报告了测量细胞裂解物中ATP的量的酶反应的结果。如图4所示，包含乙酸根阴离子的离子液体有效地猝灭细胞裂解物中的酶，从而阻止细胞裂解物中的ATP降解。该效应是时间依赖性的——完整ATP的量随着细胞收获后的时间而减少。然而，包含乙酸根阴离子的离子液体阻止了ATP的降解。该效应是浓度依赖性的。包含50％的BMIM OAc水溶液(w/v)的裂解溶液比包含10％的BMIM OAc水溶液(w/v)的裂解溶液更有效地猝灭ATP代谢。
[0143] 本公开的其他方面提供了用于分析包含代谢物和一种或多种挥发性盐或化合物的样品的方法。这些分析方法可用于各种行业中，包括在制药和生物制药、临床诊断、学术界、合成生物学、环境保护、食品检测和农业，以及法医毒理学中。可以进行所述分析方法以研究新开发的疗法的代谢影响；测量疾病生物标记；通过测量代谢通量来优化化学生产；了解环境对生物体和毒素检测的影响；分析食品加工、质量和安全；或检测人样品中的药物及其代谢物。
[0144] 所述分析方法包括但不限于通过液相色谱和/或质谱系统来分析代谢物。所述分析可包括液相色谱法(LC)，包括高效液相色谱法(HPLC)、微米液相色谱法或纳米液相色谱法或超高压液相色谱法(UHPLC)。分析还可包括液相色谱/质谱法(LCMS)、离子迁移-质谱法、气相色谱/质谱法(GCMS)、毛细管电泳(CE)、毛细管电泳色谱法(CEC)，和/或超临界流体色谱-质谱法。
[0145] 对包含代谢物和挥发性盐和/或挥发性化合物的样品的分析可以通过使用任何方便的方案进行，诸如通过质谱法、红外光谱法、UV-可见光谱法、比色法，以及核磁共振光谱法。在某些实施方案中，通过气相色谱-质谱法进行化学分析。在其他实施方案中，通过液相色谱-质谱法、离子迁移质谱法和/或超临界流体色谱-质谱法进行化学分析。
[0146] 本公开的方法可以包括通过液相色谱和质谱系统来分析代谢物。分析可包括液相色谱法，包括高效液相色谱法、微米液相色谱法或纳米液相色谱法或超高压液相色谱法。分析还可包括液相色谱/质谱法(LCMS)、离子迁移-质谱法、气相色谱/质谱法(GCMS)、毛细管电泳(CE)、毛细管电泳色谱法(CEC)，和/或超临界流体色谱-质谱法。
[0147] 用于主题方法的质谱仪系统可以是任何方便的质谱系统，其通常含有用于使样品离子化的离子源、用于分离离子的质量分析器，以及检测离子的检测器。在某些情况下，质谱仪可以是所谓的“串联”质谱仪，其能够分离前体离子、使前体离子碎裂以及分析碎裂的前体离子。此类系统在本领域中是公知的(参见例如7,534,996、7,531,793、7,507,953、7,145,133、7,229,834和6,924,478)，并且可以以各种配置实施。在某些实施方案中，串联质谱可以使用在空间上分开的单独质量分析器进行，或者在某些情况下，使用单个质谱仪进行，在所述单个质谱仪中不同的选择步骤是在时间上分开的。“在空间上”的串联MS涉及仪器部件(QqQ或QTOF)的物理分离，而“在时间上”的串联MS涉及使用离子阱。
[0148] 示例性质谱仪系统可包含含有离子化装置的离子源、质量分析器和检测器。如本领域中常规的，离子源和质量分析器通过一个或多个中间真空室分开，离子经由例如转移毛细管等从离子源转移到所述中间真空室中。同样如本领域中常规的那样，中间真空室还可以含有分离器(skimmer)，以在离子束进入通往高真空中的质量分析器的离子转移光学器件(例如，离子导向器等)之前富集在离开转移毛细管的离子束中含有的分析物离子(相对于溶剂离子和气体)中。
[0149] 离子源可依赖于任何类型的离子化方法，包括但不限于例如电喷雾离子化(ESI)、大气压化学离子化(APCI)、电子轰击(EI)、大气压光致离子化(APPI)，基质辅助的激光解吸离子化(MALDI)或电感耦合等离子体(ICP)离子化，或它们的任意组合(以提供所谓的“多模”离子化源)。在一个实施方案中，前体离子可以通过EI、ESI或MALDI制备，并且所选择的前体离子可以通过碰撞或使用光子碎裂以产生随后分析的产物离子。同样，可以采用各种不同的质量分析器中的任何一种，包括飞行时间(TOF)质量分析器、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质量分析器、离子阱质量分析器、四极或双聚焦磁电扇区质量分析器，或它们的任意混合物。在一个实施方案中，质量分析器可以是扇区质量分析器、传输四极质量分析器，或飞行时间质量分析器。
[0150] 参见图5A和图5B，它们报告了在存在或不存在挥发性盐(乙酸铵，AmOAc)的情况下各种代谢物的液相色谱/质谱分析的结果。在210mM乙酸铵(图5A)或420mM乙酸铵(图5B)的存在下测量各种代谢物的离子计数。将测量结果与不含乙酸铵的代谢物标准品进行比较。从图5A和图5B中可以看出，对于许多代谢物标准品，峰面积等同于或大于未加入乙酸铵时的峰面积。
[0151] 参考图6，其报告了下述比较分析的结果，在所述比较分析中在通过传统代谢物组学样品制备方法获得代谢物之后定量化所述代谢物(上部小图)，在通过传统代谢组学样品制备方法并且向样品中加入氯化钾或乙酸铵获得代谢物之后定量化所述代谢物(中间小图)，或通过形成氯化钾或乙酸铵的离子液体工作流获得代谢物之后定量化所述代谢物(下部小图)。
[0152] 已经尝试了几种不同的途径来从在离子液体工作流期间产生的含水代谢物样品中去除不希望的无机盐。这些途径中的大多数途径没有成功地去除盐，不会显著影响代谢物样品和/或对代谢物样品中所关注的代谢物的检测。先前的途径包括蒸发和代谢物在有机溶剂中的再溶解(极大损失了几乎所有类别的极性代谢物)，经由形成相对不可溶的氯化银盐进行的盐沉淀(损失了含磷酸根的代谢物)，磁性离子液体，以及SEC、离子交换和PGC型色谱的组合。最近描述的另一种途径是在过量的含磷酸根的化合物存在下形成水不溶性磷酸银盐，以防止含磷酸根的代谢物的沉淀。
[0153] 形成挥发性盐或挥发性化合物(即乙酸铵)代替不溶性盐的主要优点是1)不需要用过量的含磷酸根的化合物来防止含磷酸根的代谢物的沉淀，并且2)没有形成固体沉淀物，固体沉淀物可能会干扰一些代谢物组学样品制备工作流的液体处理步骤。
[0154] 本公开的一些实施方案包括使用1-丁基-3-甲基-咪唑(BMIM)乙酸盐作为离子液体(AB)，所述离子液体(AB)用于裂解细胞和/或猝灭代谢。其他含有乙酸根或其他羧酸根阴离子的离子液体也是合适的。
[0155] 在本公开的一些实施方案中，含氟化合物包含铵作为阳离子。在盐复分解反应期间使用的一种优选的含氟化合物(CD)是铵NTf6，其为含氟的NTf6化合物的铵盐。
[0156] 本公开的其他方面提供了用于手动或可自动化的离子液体工作流的方法。该方法包括：1)使生物样品与一种或多种包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的一种或多种阴离子的离子液体接触，从而获得包含代谢物和所述离子液体的混合物；2)执行复分解反应，以及通过以下方式从包含所述代谢物的所述混合物中去除离子液体AB的所述阳离子：使所述离子液体与含氟化合物CD反应并产生包含挥发性盐或挥发性化合物的代谢物溶液；以及3)将与水不混溶的相与水相分离，所述水相包含所述代谢物溶液。在该方法中，复分解反应可以如本公开中提供的执行。
[0157] 用于手动或可自动化离子液体工作流的方法的其他实施方案可包括从代谢物溶液中去除含氟污染物的步骤。所述含氟污染物可包含式(VII)化合物的水解副产物。含氟污染物的示例包括但不限于含氟磺酸盐和/或含氟磺酰胺。在一些实施方案中，通过以下方式来从代谢物溶液中去除含氟污染物：将代谢物溶液加载到含氟亲和树脂上，从而将含氟污染物结合到所述树脂上；以及洗脱所述包含代谢物的溶液。
[0158] 用于手动或自动化离子液体工作流的方法可以用本公开中描述的任何生物样品执行。所述生物样品中的一些生物样品可包含细胞，使此类生物样品与一种或多种离子液体接触可使所述细胞裂解。
[0159] 用于手动或可自动化离子液体工作流的方法的实施方案中的一些还可包括从包含代谢物和离子液体的混合物中分离细胞和/或包含酶、蛋白质、DNA、RNA和/或脂质的其他碎片。
[0160] 本公开的其他方面包括用于获得代谢物溶液的试剂盒，所述试剂盒包含离子液体和含氟化合物，所述离子液体包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子，所述含氟化合物包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子。所述试剂盒还可包含以下项中的一者或多者：相分离器材料或柱；碎片去除过滤装置或柱、包括过滤器的细胞培养装置、含氟亲和柱、含氟溶剂、与水不混溶的溶剂或液体、水可混溶性溶剂、与水混合的水可混溶性溶剂，或它们的任意组合。在所述试剂盒中，来自相分离器材料或柱；碎片去除过滤装置或柱、包含过滤器的细胞培养装置，并且/或者含氟亲和柱的至少一者是多孔形式的，诸如96孔板。
[0161] 在所述试剂盒中，离子液体可包含选自1-己基-3-甲基-咪唑根(HMIM)和1-丁基-3-甲基-咪唑根(BMIM)的阳离子。所述试剂盒中的一些包含含有乙酸根阴离子的离子液体，并且其中含氟化合物包含铵阴离子。在所述试剂盒中的一些中，含氟化合物是式(VII)化合物。
[0162] 图7是手动或可自动化的离子液体工作流的图。图7示出了使细胞裂解、去除细胞碎片和酶、执行复分解反应、分离与水不混溶的相以及去除含氟污染物的步骤。如图7中可见，细胞或其他生物样品可使用包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子的离子液体进行裂解，或与包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子的离子液体接触。在裂解后，可以通过使裂解物通过SPE色谱柱来去除细胞碎片/酶。例如，可以使用C18SPE板以同时处理多个微样品。也可以使用其他SPE柱、分子量截留过滤器和/或离心来“清理”样品。
[0163] 可以在相分离器板中进行包含代谢物的溶液和与水不混溶相的分离，所述与水不混溶相包含离子液体与含氟化合物(AD)的络合物。
[0164] 最后，代谢物溶液可以进一步通过含氟亲和树脂以去除含氟污染物。例如，可以使用si-荧光染料板。
[0165] 在该方法中可以利用任何常规的含氟亲和树脂。合适的含氟亲和树脂包括但不限于含氟亲和色谱树脂，诸如Fluoro-PakTM和Fluoro-PakTM II柱(Berry&Associates)和SiliaBondTM Fluorochrom(SiliCycle)。合适的含氟亲和树脂包括含氟二氧化硅，其包含用含氟碳链衍生化的二氧化硅。合适的含氟亲和树脂还包括含氟的苯乙烯基、苄基和/或二乙烯基-苄基聚合物。
[0166] 合适的洗脱溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃以及它们的任意组合。任意所述洗脱溶剂可以纯净使用或作为与水的混合物使用，所述混合物的比率为选自100:0至0:100的溶剂与水的重量比范围。
[0167] 优选地，溶剂用作0.1％至99％的水溶液。
[0168] 至少在一些实施方案中，洗脱溶剂可包含添加剂。合适的添加剂可包括质子化试剂。在一些实施方案中，添加剂是羧酸。在一些实施方案中，添加剂是甲酸。在一些实施方案中，添加剂是乙酸。在一些实施方案中，洗脱溶剂包括乙腈和任选的羧酸，所述羧酸可以是甲酸。在一些实施方案中，洗脱溶剂是0.1％至80％的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液还任选地包含0.01％至5％的甲酸。
[0169] 本公开的其他方面提供了用于量化样品中的代谢物的分析方法，所述方法包括用包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阴离子的离子液体猝灭样品中的酶；在所述离子液体与包含可形成挥发性盐或挥发性化合物的阳离子的含氟化合物的复分解反应中产生挥发性盐或挥发性化合物；以及通过以下方法中的任何一种在所述挥发性盐或挥发性化合物存在下定量代谢物：直接进样质谱法、液相色谱/质谱法、气相色谱/质谱法、离子迁移/质谱法、超临界流体色谱法/质谱法，或它们的任意组合。在这些方法中，样品可包含在酶被猝灭之前已经被裂解的细胞。
[0170] 本公开还提供了以下非限制性实施例。
[0171] 实施例1.制备代谢物组学样品
[0172] 将细胞过滤并用PBS/DPBS或等渗NaCl(温度可在0.5℃至37℃的范围内变化)洗涤。使细胞裂解并用BMIM乙酸盐猝灭代谢，并使细胞裂解物通过过滤器。加入一定体积的水(±缓冲剂或酸或碱)以清除板的滞留体积。该水可以在将细胞裂解物拉过过滤器之前加入，以降低细胞裂解物溶液的粘度并使得更容易将细胞裂解物溶液拉过过滤板。过滤的裂解物溶液包含代谢物和离子液体。
[0173] 在C18SPE柱上“清理”该代谢物溶液，并使用洗脱溶剂(即流动相)将极性代谢物从柱上推离。也可以使用其他SPE柱、或分子量截留过滤器和/或离心来“清理”样品。
[0174] 在含氟液体即HFE 7100的存在下，通过与NH4-NTf6的盐复分解反应而将BMIM从代谢物溶液中去除。BMIM进入与水不混溶的层以与NTf6形成盐，并且铵离子转移到水层并与最初与BMIM缔合的乙酸根形成挥发性盐。
[0175] 所述挥发性乙酸铵盐是质谱兼容的，对代谢物峰形的影响有限，并且对代谢物的离子抑制效应有限。此外，乙酸铵不会随着时间的推移在质谱系统中显著积聚，因为它在用于质谱分析的温度和压力下蒸发。
[0176] 使用含氟SPE柱去除任何形成的经水解的NTf6。
[0177] 为了将代谢物样品注射到液相色谱柱上，可以将样品在水和/或水可混溶性溶剂中稀释以降低乙酸铵浓度，所述水可混溶性溶剂为诸如乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或其他水可混溶性溶剂。为了考虑到样品稀释，可以注入较大样品体积的稀释溶液。
[0178] 实施例2.用BMIM乙酸盐来裂解K562白血病细胞
[0179] 以指定的百分比(10％、20％、30％和50％)制备BMIM乙酸盐的水溶液(w/v)。将50μl指定的BMIM乙酸盐溶液加入已用PBS洗涤并沉淀的500,000个K562细胞中。将BMIM细胞溶液涡旋约1分钟。将1μl每种BMIM乙酸盐细胞溶液加入到19μl PBS中，并用台盼蓝1:1稀释该溶液以标记具有被裂解膜的细胞。作为对照，将1ml PBS加入到用PBS洗涤过的约500,000个K562细胞中。将20μl对照溶液用台盼蓝1:1稀释以标记任何具有被裂解膜的细胞。使用Countess成像仪(Invitrogen)对所有细胞样品进行成像。这些照片如图3A至图3F所示。
[0180] 未被台盼蓝染色的细胞(未裂解的细胞)被圈出。参见图3A和图3B中的对照。10％BMIM OAc不会导致完全细胞裂解(可见完整细胞)，如图3C所示。相比之下，20％、30％和50％的BMIM OAc溶液似乎裂解所有细胞。分别参见图3D至图3F。与50％BMIM OAc溶液相比，
20％和30％的BMIM OAc溶液含有更多具有圆形形状的被台盼蓝染色的裂解细胞，表明用
50％BMIM OAc溶液更完全地破坏了细胞/细胞膜。
20％和30％的BMIM OAc溶液含有更多具有圆形形状的被台盼蓝染色的裂解细胞，表明用
50％BMIM OAc溶液更完全地破坏了细胞/细胞膜。
[0181] 实施例3.分析用于猝灭ATP代谢的K562白血病细胞裂解物
[0182] 每个样品使用约500,000个K562细胞。用PBS洗涤细胞，然后加入50μL细胞裂解缓冲液(10％、25％、35％或50％的BMIM乙酸盐水溶液(w/v))或对照溶液(PBS或DI水)。将细胞与裂解溶液或对照溶液一起孵育5分钟、30分钟、60分钟或240分钟。孵育后，将细胞样品在4℃下离心或置于冰上。从离心样品中去除上清液后，将所有样品在干冰上快速冷冻并在-80℃下贮藏隔夜。
[0183] 第二天，将样品解冻，并取等分试样以使用来自Promega的OneSolution CellTiter Glo试剂进行ATP测定。使用0.001-1μM ATP制备ATP标准曲线，其中用于处理细胞的每种裂解溶液或对照溶液具有单独的标准曲线。
[0184] ATP分析的结果报告在图4中。发现BMIM乙酸盐略微降低CellTiterGlo试剂的生物发光光输出，因此用ATP制备标准曲线并测试BMIM乙酸盐的每种浓度以测定细胞样品中的ATP浓度。发现50％BMIM乙酸盐在室温下维持从细胞中提取的ATP水平达四个小时，而在相同时间段内在所有其他样品中发现ATP降解。此外，50％BMIM乙酸盐溶液具有最高的ATP水平，表明该水平的BMIM乙酸盐能够从细胞中提取比任何其他条件更多的ATP。
[0185] 实施例4.分析在存在或不存在乙酸铵的情况下代谢物标准品的峰面积。
[0186] 用两种不同浓度的乙酸铵，210mM(参见图5A)和420mM(参见图5B)，来评定乙酸铵对代谢物标准品的LCMS分析的影响。对于许多代谢物标准品，峰面积等同于或大于未加入任何乙酸铵时的峰面积。
[0187] 一些代谢物标准品显示为在乙酸铵存在下峰面积减小，所述代谢物标准品特别地为葡萄糖、海藻糖、还原型谷胱甘肽和乙酰乙酰CoA。葡萄糖和海藻糖二者在这些运行中都具有早期洗脱时间，因此当从柱上洗脱较高含量的乙酸铵时它们可以被从柱上洗脱。因此，葡萄糖和海藻糖可能由于来自乙酸铵的离子抑制而具有降低的信号，或者葡萄糖和海藻糖可能与乙酸铵形成加合物，所述加合物未包括在本分析中。值得注意的是，尽管大多数代谢物标准品在向样品中加入420mM乙酸铵时仍保持其峰面积，但是所述峰形状中的一些在使用420mM乙酸铵时并不理想，并且可见伸舌峰(peak fronting)和/或峰加倍(peak doubling)。当使用210mM乙酸铵和3或4μl进样体积时，代谢物标准品的峰形与不含乙酸铵的样品一致。
[0188] 实施例5.比较分析包含乙酸铵的代谢物组学样品。
[0189] 图6提供了与形成氯化钾的离子工作流相比，通过传统代谢物组学样品制备方法制备的代谢物组学样品的光谱。参见图6中的上部小图。
[0190] 图6还提供了与形成乙酸铵的离子工作流相比，通过传统代谢物组学样品制备方法制备的代谢物组学样品的光谱。参见图6中的下部小图。
[0191] 在使用传统代谢物组学样品制备方法或形成氯化钾或乙酸铵的离子液体工作流制备的细胞样品中检测到了化合物特征的相对峰面积曲线。曲线的颜色强度表示找到的每种化合物特征的相对峰面积。使用Profinder来辨识峰，并使用批量递归特征提取(Batch Recursive Feature Extraction)来对峰面积进行积分。峰高的最小阈值设为10,000个计数。
[0192] 向使用传统代谢物组学样品制备方法制备的样品中加入氯化钾减少了可检测到的化合物特征的数量。参见图6中的上部小图。
[0193] 形成氯化钾的离子液体方法形成的样品具有与传统方法样品中加入氯化钾时看到的相同化合物特征损失。除了随着加入氯化钾而降低的化合物特征之外，形成氯化钾的离子液体方法还具有其他缺失的代谢物特征。参见图6中的上部小图。
[0194] 向使用传统方法制备的样品中加入乙酸铵对检测到的化合物特征及其峰面积的影响有限。形成乙酸铵的离子液体方法使得样品的化合物特征与使用传统方法时发现的那些化合物特征相当。另外，当使用形成乙酸铵的离子液体方法时，发现了许多在使用传统样品制备方法时未发现的化合物特征。这些化合物特征可以是从细胞中提取的(使用传统方法未提取到的)另外代谢物，或者它们可以是在离子液体方法的步骤期间加入到样品中的非代谢物化合物。参见图6中的下部小图。
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