超临界流体色谱法用的固定相
阅读：55发布：2020-05-11
专利汇可以提供超临界流体色谱法用的固定相专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供 超临界 流体 色谱法用的固定相，其包含负载有 聚合物 的载体，所述聚合物在主链的重复单元中包含吡咯烷 酮 骨架。，下面是超临界流体色谱法用的固定相专利的具体信息内容。
1.超临界流体色谱法用的固定相，其包含负载有聚合物的载体，所述聚合物在主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架。
2.根据权利要求1所述的超临界流体色谱法用的固定相，其具有以下的式(II)所示的结构，
式(II)中，
W’为单键或任选具有支链的碳原子数1～10的亚烷基，
X为酰胺基、酯基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、醚基、亚砜基、砜基、硫醚基、或磷酸酯基，
Y为碳原子数1～30的亚烷基，
V为与载体表面键合的醚基、碳原子数1～5的烷氧基或碳原子数1～3的烷基，p为1～10，
q为10～300。
3.根据权利要求1或2所述的超临界流体色谱法用的固定相，其为球形粒子状。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的超临界流体色谱法用的固定相，其平均粒径为
0.1μm～1000μm。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的超临界流体色谱法用的固定相，其为整块状。
6.目标物质的分离方法，其包括：使用权利要求1～5中任一项所述的固定相和包含超临界流体的流动相而分离目标物质的工序。
7.超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其包括：使1-乙烯基-2-吡咯烷酮与键合有聚合性官能团的载体共聚的工序。
8.根据权利要求7所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，所述聚合性官能团为乙烯基、烯丙基、异丙烯基或在ω位具有双键的碳原子数4～12的烯基。
9.根据权利要求7或8所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，键合有聚合性官能团的载体为通过使下述式(I)所示的化合物与硅胶进行硅烷偶联而得到的表面修饰硅胶，
W-X-Y-SiR3-nZn (I)
式(I)中，
W为乙烯基、烯丙基、异丙烯基或在ω位具有双键的碳原子数4～12的烯基，X为酰胺基、酯基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、醚基、亚砜基、砜基、硫醚基、或磷酸酯基，
Y为碳原子数1～30的亚烷基，
Z为碳原子数1～30的亚烷基，
R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，
Z为能够使式(I)中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团，
n为1～3的整数。
10.根据权利要求9所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，所述W为乙烯基，
X为酰胺基或碳原子数1～3的N-烷基酰胺基，
Y为碳原子数1～5的亚烷基，
R独立地为甲基、乙基或丙基，
Z为碳原子数1～5的烷氧基、卤素、碳原子数1～20的烷基巯基、二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、咪唑基、烯丙基或2-甲基-2-丙烯基。
11.超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其包括：
使1-乙烯基-2-吡咯烷酮在末端具有反应性甲硅烷基的链转移剂的存在下进行自由基聚合而得到聚合物的工序；和
使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序。
12.根据权利要求11所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，末端具有反应性甲硅烷基的链转移剂为下述式(III)所示的化合物，
R3-nZnSi-Y-T (III)
在式(III)中，
R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，
Z为能够使式(III)中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团，
Y为碳原子数1～30的亚烷基，
T为链转移性官能团，
n为1～3的整数。
超临界流体色谱法用的固定相
技术领域
背景技术
[0002] 作为用于分析混合物的成分及其含量、并进行分离精制的方法，色谱法为最有效的方法。其利用物质相对于在柱或被称为毛细管的管中空间性固定的多孔性固体(固定相)和在其间隙中移动的流体(流动相)的固有的分配比(也可以理解为吸附平衡)来分离不同的物质。作为其代表性的例子，包括气相色谱法和液相色谱法。前者使用气体作为流动相。
[0003] 但是，为了使分离对象混于气相中进行移动，必须有一定以上的蒸气压，因此仅能应用于分子量低且不具有电荷的比较有限的分析对象。另一方面，液相色谱法使用液体作为流动相，如果选择合适的流动相，则可适用于大多数物质。但就其反面而言，由于液体的粘度一般较高，因此即使要利用长的柱、毛细管来确保良好的分离，也存在基于粘性阻力增加的限制。
[0004] 作为可克服这两项缺点的技术而发明了超临界流体色谱法(SFC)。其利用了处于超临界或亚临界状态的流体与气体相比明显可更好地溶解其它化合物，与液体相比具有更低的粘度、更高的扩散速度这样的特征。使用二氧化碳作为超临界流体的SFC基于安全性、装置上的理由已得到了常规地使用，其应用正在逐渐扩大。除此之外，还包括利用电引力的色谱法、将纸、粉体固结于较薄的层的所谓薄层色谱法(液相色谱法的变形)等，但应用范围并不是很广泛。
[0005] 在液相色谱法中，使用极性高的固定相与极性低的流动相的组合的正相色谱法、以及与其极性相反的反相色谱法是典型的模式。最近，也进一步关注两相均为极性的所谓HILIC。除此以外，还已知有利用金属离子与配体的相互作用的配体交换色谱法、利用生物化学性相互作用的亲和色谱法等基于特异性相互作用的方法。一般而言其分离的机理及特征已明确，技术的发展主要是为了使分离的效率变好的粒子形状的改良。
[0006] 与此相对，超临界流体色谱法(SFC)被认为其特征与正相色谱法类似。但是，其特征、机理尚未被充分解明的点较多，也有观点认为其通过缓慢地向反相系过渡而涵盖了较宽极性范围的分离对象。
[0008] 作为修饰基团，包括：包含各种链长的饱和烷基链的修饰基团，利用烷基链或包含酰胺键、醚键的烷基链将一个或二个苯环、稠合多环芳香族烃基连接而成的修饰基团，以卤素取代苯环为特征的修饰基团，连接有卤代烷基的修饰基团，连接有2,3-二羟基丙基、CN基、NH2基等极性基团的修饰基团，作为高分子修饰基团的交联聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚乙二醇等。另外，具有石墨结构的碳也是具有特征的固定相。这些中，尤其是在SFC 中被经常使用的，是被称为2-乙基吡啶的键合有(2-吡啶基)乙基的物质，其不仅可使在普通的固定相中会发生拖尾而得到宽度较宽的峰的碱性化合物也变为尖锐的峰而洗脱，而且对于酸性化合物也能够适度地保持，因此优选使用。
[0009] 然而，正如非专利文献2中指出的那样，对各种化合物的保持的倾向相似、没有特征差异的固定相也不少。这其中，本发明人将能够识别结构非常相似的分子作为所要求的条件之一，基于此认识深入进行了可以用于 SFC的固定相的开发。
[0010] 迄今为止，已被用作SFC用的固定相的物质大多为硅胶或利用各种低分子化合物修饰硅胶表面而成的那些。另一方面，也有利用高分子修饰硅胶表面而成的固定相的报道例。例如，已知专利文献1中将在主链的重复单元中具有芳环和双极性原子团的聚合物作为固定相，不仅对各种化合物的分离是有效的，也具有良好的分子形状识别性。但是，与上述2-乙基吡啶柱不同，存在在分析碱性物质时发生拖尾，得到宽度较宽的峰这样的问题。
[0012] 另一方面，迄今为止，已知有将聚乙烯基吡咯烷酮用于色谱法用途的例子。
[0013] 具体而言，存在通过交联将不溶于溶剂的聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)(PVP) 的粒子填充于柱中而用作色谱法固定相的例子(例如，非专利文献2)。
[0014] 另外，也尝试了在作为硬质的凝胶的硅胶的表面键合PVP。
[0015] 例如，由于在蛋白、微生物的分离中将硅胶作为固定相时，有时会因所谓变性而导致目标物的性质改变、回收率显著降低，因此为了预防该情况，已有将表面利用亲水性的聚合物包覆来谋求对硅胶影响的屏蔽的方案 (非专利文献3)。
[0016] 另外，对于键合PVP的方法存在若干尝试。例如已报道了在将PVP包覆于硅胶上之后利用γ射线进行交联处理(非专利文献2)。另外，在另一报道中公开了下述方法：在硅胶上键合了具有乙烯基、甲基丙烯酰氧基的硅烷偶联剂的基础上，使其与乙烯基吡咯烷酮单体共聚(非专利文献4)。但是，这些方法通常很少被用于HPLC，这可能是由于峰较宽所导致的。
[0017] 现有技术文献
[0018] 专利文献
[0019] 专利文献1：日本特愿2012-162518号公报
[0020] 非专利文献
[0021] 非专利文献1：C.West等，J.Chromatogr.A,1203(2008)105
[0022] 非专利文献2：Kohler,Chromatographia,21(1986)573
[0023] 非专利文献3：I.Krasilnikov等，J.Chromatogr.,446(1988)211
[0024] 非专利文献4：C.R.Kou等，Fresenius J.Anal.Chem.,336(1990)409
发明内容
[0025] 发明要解决的问题
[0026] 本发明的目的在于解决上述这样的问题，提供具有良好的分子识别能力的超临界流体色谱法用的固定相。
[0027] 解决问题的方法
[0028] 本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，包含负载有主链的重复单元中具有吡咯烷酮骨架的聚合物的载体的固定相，在超临界流体色谱法中可表现出良好的分子识别能力，从而完成了本发明。
[0029] 即，本发明如下所述。
[0030] [1]超临界流体色谱法用的固定相，其包含负载有聚合物的载体，所述聚合物在主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架。
[0031] [2]上述[1]所述的超临界流体色谱法用的固定相，其具有以下的式(II) 所示的结构。
[0032] [化学式1]
[0033]
[0034] (式(II)中，W’为单键或任选具有支链的碳原子数1～10的亚烷基，X为酰胺基、酯基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、醚基、亚砜基、砜基、硫醚基(sulfide group)、或磷酸酯基，Y为碳原子数1～30的亚烷基，V为与载体表面键合的醚基、碳原子数1～5的烷氧基或碳原子数1～3的烷基。p为 1～10，q为10～300。)
[0035] [3]上述[1]或[2]所述的超临界流体色谱法用的固定相，其为球形粒子状。
[0036] [4]上述[1]～[3]中任一项所述的超临界流体色谱法用的固定相，其平均粒径为0.1μm～1000μm。
[0037] [5]上述[1]～[3]中任一项所述的超临界流体色谱法用的固定相，其为整块状。
[0038] [6]目标物质的分离方法，其包括：使用[1]～[5]中任一项所述的固定相和包含超临界流体的流动相而分离目标物质的工序。
[0039] [7]超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其包括：使1-乙烯基-2- 吡咯烷酮与键合有聚合性官能团的载体共聚的工序。
[0040] [8]上述[7]所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，上述聚合性官能团为乙烯基、烯丙基、异丙烯基或在ω位具有双键的碳原子数4～12的烯基。
[0041] [9]上述[7]或[8]所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，键合有聚合性官能团的载体为通过使下述式(I)所示的化合物与硅胶进行硅烷偶联而得到的表面修饰硅胶。
[0042] [化学式2]
[0043] W-X-Y-SiR3-nZn (I)
[0044] (式(I)中，W为乙烯基、烯丙基、异丙烯基或在ω位具有双键的碳原子数4～12的烯基，X为酰胺基、酯基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、醚基、亚砜基、砜基、硫醚基、或磷酸酯基，Y为碳原子数1～30的亚烷基，Z为碳原子数1～30的亚烷基，R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，Z为能够使式(I)中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团。n为1～3的整数。)[0045] [10]上述[9]所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，上述W为乙烯基，X为酰胺基或碳原子数1～3的N-烷基酰胺基，Y为碳原子数1～5的亚烷基，R独立地为甲基、乙基或丙基，Z为碳原子数1～5的烷氧基、卤素、碳原子数1～20的烷基巯基、二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、咪唑基、烯丙基或2-甲基-2-丙烯基。
[0046] [11]超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其包括：使1-乙烯基 -2-吡咯烷酮在末端具有反应性甲硅烷基的链转移剂的存在下进行自由基聚合而得到聚合物的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序。
[0047] [12]上述[11]所述的超临界流体色谱法用的固定相的制造方法，其中，末端具有反应性甲硅烷基的链转移剂为下述式(III)所示的化合物。
[0048] [化学式3]
[0049] R3-nZnSi-Y-T (III)
[0050] (在式(III)中，R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，Z为能够使式(III) 中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团。Y为碳原子数1～30的亚烷基， T为链转移性官能团。n为1～3的整数。)
[0051] 发明的效果
[0054] [图2]示出了使用实施例1的固定相，通过HPLC进行氢化可的松与泼尼松龙的分离的结果(a)、和通过SFC进行氢化可的松与泼尼松龙的分离的结果(b)的图。
[0055] [图3]示出了使用实施例1的固定相，通过HPLC进行3种乙酰基菲与 2种乙酰基蒽的异构体的分离的结果(a)、和通过SFC进行3种乙酰基菲与2 种乙酰基蒽的异构体的分离的结果(b)的图。
[0056] [图4]示出了使用市售品的固定相进行乙酰基菲与乙酰基蒽的分离的结果(a)、和使用实施例1的固定相进行乙酰基菲与乙酰基蒽的分离的结果(b) 的图。
[0057] [图5]示出了使用市售品的固定相进行氢化可的松和泼尼松龙的分离的结果(a)、和使用实施例1的固定相进行氢化可的松和泼尼松龙的分离的结果(b)的图。
[0058] [图6]示出了对于被统称为β-阻滞剂的4种医药品(阿普洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、吲哚洛尔)的分离，使用实施例4的固定相(活性自由基聚合 (iniferter)法)进行的结果(a)、使用实施例5的固定相(甲基丙烯酸酯共聚法) 进行的结果(b)、使用实施例1的固定相进行的结果(c)的图。
具体实施方式
[0059] 本发明的超临界流体色谱法用的固定相，包含负载有聚合物的载体，所述聚合物的主链的重复单元包含吡咯烷酮骨架。
[0060] 需要说明的是，本发明中的固定相是指在色谱法中被固定于分析用具 (柱或毛细管)的内部，使分离对象物质在与其接触的同时在其与移动的流体之间分配而实现分离的材料，在其为粒子的情况下，有时也指通过填充该粒子而形成的聚集体，另外还有时指其单个的粒子。
[0061] 主链的重复单元中具有吡咯烷酮骨架是指，下式所示的2-吡咯烷酮骨架键合于聚合物分子的主链。需要说明的是，在本发明中，从确保作为固定相的性能的观点出发，优选聚合物分子中的来自1-乙烯基-2-吡咯烷酮的单元的比例为80摩尔％以上。
[0062] [化学式4]
[0063]
[0064] (式中，星号表示与聚合物的主链键合的位置。)
[0065] 在本发明的固定相中，从其稳定性、分离性能的观点出发，更优选的实施方式是聚合物负载于载体，在载体与聚合物之间形成化学键。具体而言，例如可例示以下制造方法。
[0066] 在以下制造方法中，根据(1)～(7)的制造方法，会在聚合物与载体之间生成化学键(共价键)。另一方面，根据(8)和(9)的制造方法，通过使聚合物彼此在载体的表面交联而存在，聚合物不会从载体表面洗脱。
[0067] 在超临界流体色谱法用的固定相中，能够利用与载体之间的物理性结合而包覆聚合物，但在这样的情况下存在由溶剂引起聚合物洗脱的情况，所以不算是优选的方法。
[0068] (1)制造方法，其包括使1-乙烯基-2-吡咯烷酮与键合有聚合性官能团的载体进行自由基共聚的工序。
[0069] (2)制造方法，其包括使1-乙烯基-2-吡咯烷酮在末端具有反应性甲硅烷基的链转移剂的存在下进行自由基聚合而得到聚合物的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序。
[0070] (3)制造方法，其包括通过向载体表面导入成为休眠种(Dormant species) 的共价键，并使用1-乙烯基-2-吡咯烷酮从载体表面进行活性自由基聚合，从而向载体表面导入主链的重复单元中包含2-吡咯烷酮骨架的聚合物的工序。
[0071] (4)制造方法，其包括使具有聚合性双键的硅烷偶联剂与1-乙烯基-2- 吡咯烷酮共聚的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序。
[0072] (5)制造方法，其包括向载体表面导入链转移性官能团，使1-乙烯基-2- 吡咯烷酮进行自由基聚合的工序。
[0073] (6)制造方法，其包括使在起始末端具有反应性甲硅烷基的阴离子引发剂与1-乙烯基-2-吡咯烷酮进行阴离子聚合而得到聚合物的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序。
[0074] (7)制造方法，其包括使阴离子引发剂与1-乙烯基-2-吡咯烷酮进行阴离子聚合后，使包含硅烷偶联剂的终止剂发挥作用而得到聚合物的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序。
[0075] (8)制造方法，其包括将包含1-乙烯基-2-吡咯烷酮、交联剂及引发剂的组合物与载体混合后使其进行交联反应的工序。
[0076] (9)制造方法，其包括在载体的表面包覆使1-乙烯基-2-吡咯烷酮聚合而得到的聚(乙烯基吡咯烷酮)，通过γ射线或电子束的照射而进行交联反应的工序。
[0077] 在任一方法中，均可以通过调整聚合时的聚合温度、聚合溶剂、添加剂等而控制生成聚合物的立构规整性。
[0078] 对(1)的制造方法进行说明。
[0079] 用于本发明的固定相的(1)的制造方法的键合有聚合性官能团的载体，可以通过以下方法制作。
[0080] 作为键合于载体的聚合性官能团，可列举自由基聚合性官能团，例如可列举：乙烯基、烯丙基、异丙烯基，或在ω位具有双键的碳原子数4～12 的烯基。其中，优选乙烯基、烯丙基或异丙烯基。
[0081] 另外，作为载体，可列举多孔性有机载体或多孔性无机载体，可优选列举多孔性无机载体。适合作为多孔性有机载体的物质为选自聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酸酯等的高分子物质，适合作为多孔性无机载体的物质为硅胶、氧化铝、氧化锆、二氧化钛、氧化镁、玻璃、高岭土、氧化钛、硅酸盐、羟基磷灰石等。优选的载体为硅胶、氧化铝或玻璃。
[0082] 在使用硅胶作为载体的情况下，上述的聚合性官能团经由硅胶所具有的硅烷醇基而与载体形成化学键合。
[0083] 在使用硅胶以外的载体的情况下，通过进行载体的表面处理，可抑制分离对象物质相对于载体本身的过量吸附，并且可以经由通过表面处理而导入的基团而与聚合性官能团形成键合。作为表面处理剂，可列举氨丙基硅烷这样的硅烷偶联剂、钛酸酯类-铝酸酯类偶联剂。
[0084] 如上所述的键合有聚合性官能团的载体例如可通过使下述式(I)所示的化合物与硅胶发生硅烷偶联而获得。
[0085] [化学式5]
[0086] W-X-Y-SiR3-nZn (I)
[0087] (式(I)中，W为乙烯基、烯丙基、异丙烯基，或在ω位具有双键的碳原子数4～12的烯基，X为酰胺基、酯基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、醚基、亚砜基、砜基、硫醚基、或磷酸酯基，Y为碳原子数1～30的亚烷基， R各自独立地为碳原子数1～3的烷基，Z为能够使式(I)中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团。n为1～3的整数。)
[0088] 上述式(I)中，优选W为乙烯基、烯丙基或异丙烯基。
[0089] 上述式(I)中，X为W与末端的Z基的连接部的一部分，优选为酰胺基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、酯基、亚苯基。
[0090] 上述式(I)的Y优选为碳原子数1～5的亚烷基，更优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基中的任意基团。
[0091] 上述式(I)的R优选为甲基或乙基。
[0092] 需要说明的是，式(I)中，在X为“酰胺基”的情况下，包括-N-CO-Y和 -CO-N-Y的实施方式，在X为“N-烷基酰胺基”的情况下，包括-NR-CO-Y和 -CO-NR-Y的实施方式。
[0093] 在上述式(I)中，从合成容易的方面出发，优选W为乙烯基而X为酰胺基或N-烷基酰胺基的实施方式、和W为异丙烯基而X为酰胺基或N-烷基酰胺基的实施方式。
[0094] 需要说明的是，优选以下实施方式：在式(I)的X为“酰胺基”的情况下，在-CO-NH-的结构中Y键合于氮，在为“N-烷基酰胺基”的情况下，在 -CO-NR-(R为碳原子数1～3的烷基)的结构中Y键合于氮。
[0095] 上述式(I)中的Z为离去基团，只要是可使式(I)中的硅原子与构成载体的诸如氧这样的原子之间形成键合即可，可以为任何原子团。为了操作的容易性和反应性的平衡良好，通常使用的离去基团可列举碳原子数1～5的烷氧基，特别优选为甲氧基或乙氧基，可列举卤素(氯、溴或碘)、碳原子数 1～20的烷基巯基、诸如二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、咪唑基这样的含氮基团、烯丙基或2-甲基-2-丙烯基。可根据离去基团的种类而调整反应条件(也包括添加催化剂)。
[0096] 上述式(I)所示的化合物可以通过使具有以上述式(I)的W表示的结构的化合物、与具有上述式(I)的-Y-SiR3-nZn的结构的化合物进行反应而获得。
[0097] 通过这些化合物之间的反应，可生成上述式(I)的“-X-”。
[0098] 作为具有以W表示的结构的化合物，可列举：键合于乙烯基的1-位的氢任选被碳原子数为1～12的烷基取代的α-烷基丙烯酸、或键合于乙烯基的1-位的氢任选被碳原子数为1～12的烷基取代的α-烷基丙烯酸的卤化物。
[0099] 作为具有上述式(I)的-Y-SiR3-nZn的结构的化合物，可列举具有作为上述说明的X的前体的基团、且具有碳原子数为1～5的烷氧基作为离去基团的硅烷偶联剂。具体而言，可列举氨基烷基烷氧基硅烷、羟基烷基烷氧基硅烷。
[0100] 本发明使用的键合有聚合性官能团的载体，优选为通过使以上述式(I) 表示的化合物与硅胶发生硅烷偶联而获得的表面修饰硅胶。
[0101] 也可以与使用以上述式(I)表示的化合物不同地，首先将具有上述式(I) 的-Y-SiR3-nZn的结构的化合物(例如氨基烷基烷氧基硅烷、羟基烷基烷氧基硅烷)与作为载体的硅胶进行偶联之后，使用具有以W表示的结构的化合物 (例如键合于乙烯基的碳上的氢任选被烷基取代的α-(烷基)丙烯酸)来引起反应。
[0102] 就本发明的固定相而言，在利用上述说明(1)的制造方法进行制造时，是使1-乙烯基-2-吡咯烷酮与键合有聚合性官能团的载体进行共聚而得到的固定相。
[0103] 作为该共聚的实施方式，可列举针对1-乙烯基-2-吡咯烷酮的乙烯基和聚合性官能团这两者使它们共聚的实施方式，此时的反应条件可以使用公知的方法。
[0104] 使用上述说明的原料、制造方法所获得的本发明的固定相具有以下结构。
[0105] [化学式6]
[0106]
[0107] (式(II)中，W’为源自式(I)的W、通过加成聚合而生成的基团，X为酰胺基、酯基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、醚基、亚砜基、砜基、硫醚基、亚苯基、或磷酸酯基，Y为碳原子数1～30的亚烷基，V为与载体表面键合的醚基，或未反应的上述式(I)中示出的Z基、或R基。)
[0108] 在上述式(II)中，作为W’的具体例，可列举单键或任选具有支链的碳原子数1～10的亚烷基。可优选列举单键、亚甲基、亚乙基或三亚甲基。
[0109] 式(II)中的X以及Y的优选基团可采用与上述式(I)相同的那些。
[0110] 在式(II)中，可列举p为1～10，q为10～300左右，q优选为15～250，进一步优选为20～200。需要说明的是，在p、q均为2以上的情况下，在式(II) 中，可视为包含具有吡咯烷酮残基的单元与载体的键合的单元分别连续的嵌段共聚物形式，但式(II)仅显示出了各自的残基的数量，推定实际上可能为无规共聚物。
[0111] 关于式(II)中的V，在上述式(I)所示的化合物中，在n＝1的情况下，V＝R，在n＝2的情况下，相对于全部V的数量，R基的比例为50％，未反应的Z 基或Z基基于反应而在载体表面发生了置换后的结构分别为0～50％及 50％～0％，在n＝3的情况下，未反应的Z基或Z基基于反应而在载体表面发生了置换后的结构分别为0～100％及100％～0％。
[0112] 下面，对用于获得本发明的固定相的(2)的制造方法进行说明。
[0113] (2)的制造方法为包括在末端具有反应性甲硅烷基的链转移剂的存在下进行自由基聚合的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序的制造方法。
[0114] 作为(2)的制造方法中使用的末端具有反应性甲硅烷基的链转移剂，可以例示下述式(III)所示的化合物。本发明中的反应性甲硅烷基是指，下述的式(III)的键合有Z所示那样的离去基团的甲硅烷基，具有相对于包含硅的金属氢氧化物可通过缩合而形成Si-O-M形式的键合的性质。在以下其它制法中使用的化合物中也相同。
[0115] [化学式7]
[0116] R3-nZnSi-Y-T (II1)
[0117] (在式(III)中，R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，Z为能够使式(III) 中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团。Y为碳原子数1～30的亚烷基，T为链转移性官能团。n为1～3的整数。)
[0118] 在式(III)中，R优选为甲基、乙基或丙基。Z为离去基团，只要是可使式(III)中的硅原子与构成硅胶的氧之间形成键合即可，可以为任何原子团。
[0119] 为了操作的容易性和反应性的平衡良好，作为通常使用的离去基团，为碳原子数1～5的烷氧基，其中可以例示甲氧基或乙氧基，卤素(氯、溴或碘)、诸如二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、咪唑基这样的含氮基团，另外也可以使用烯丙基、异丙烯基，可根据离去基团的种类而调整反应条件(也包括添加催化剂)。Y更优选为碳原子数1～10的亚烷基。T为链转移性官能团。链转移性官能团是指，在聚合反应中会活跃地发生伴随生长活性种的移动及再引发反应的链转移反应的官能团。通过具有链转移性官能团，能够在一定程度上控制生成聚合物的分子量、末端结构。作为链转移性官能团的具体例，优选经卤化的碳原子数1～12的烷基、末端具有硫醇基的碳原子数1～12的烷基或基团内具有二硫基的碳原子数1～12的烷基。
[0120] 上述经卤化的碳原子数1～12的烷基的卤素可列举氯、溴或碘，作为其烷基，可列举碳原子数1～3的烷基。
[0121] 通过在这样的链转移剂的存在下，将少量的自由基产生剂用于催化剂而进行1-乙烯基-2-吡咯烷酮的自由基聚合，可得到具有下述式(IV)所示的结构的化合物。此时，能够根据链转移剂和单体的摩尔比而实现一定程度的分子量的控制。自由基产生剂可以使用在聚合反应中使用的公知的那些，作为其具体例，可列举偶氮化合物、过氧化物。
[0122] [化学式8]
[0123]
[0124] (式IV中，T’为源自式(III)的T、通过链转移反应而生成的基团。Y、R、 Z表示与式(III)中相同的含义，q为2～300的整数。)
[0125] 在式(IV)中，就T’而言，在T为末端键合有卤素的碳原子数1～12的烷基的情况下，T’为其卤素被取代了的碳原子数1～12的亚烷基残基，在T为末端具有硫醇基的碳原子数1～12的烷基或在基团内具有二硫基的碳原子数 1～12的烷基的情况下，T’为硫醚。
[0126] 本发明的固定相的(2)的制造方法中使用的载体，可以使用与在(1)的制造方法中使用的载体相同的那些。
[0127] 关于通过硅烷偶联反应而使式(IV)所示的化合物与载体键合的方法，可以使用公知的硅烷偶联的方法。
[0128] 可推测，式(IV)所示的化合物与载体键合而得到的固定相具有以下结构。
[0129]
[0130] (式V中，T’为源自式(III)的T、通过链转移反应而生成的基团。q为2～300 的整数。V为与载体表面键合的醚基、或未反应的上述式(III)中示出的Z基、或R基。)[0131] 关于式(V)中的V，在上述式(III)所示的化合物中，在n＝1的情况下， V＝R，在n＝2的情况下，相对于全部V的数量，R基的比例为50％，未反应的Z基或Z基基于反应而在载体表面发生了置换后的结构分别为0～50％及50％～0％，在n＝3的情况下，未反应的Z基或Z基基于反应而在载体表面发生了置换后的结构分别为0～100％及100％～0％。
[0132] 下面，对(3)的制造方法进行说明。
[0133] 通过向载体表面导入成为休眠种的稳定的共价键，从表面进行活性自由基聚合，能够在诸如硅胶这样的载体表面导入主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物。
[0134] 在该方法中，可以向诸如硅胶这样的载体表面上高密度地导入主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物，可以获得可高度取向的刷状聚合物。
[0135] 关于上述“成为休眠种的稳定的共价键的导入和活性自由基聚合”，将经常使用的例子示于以下(i)～(iii)。
[0136] (i)在诸如硅胶这样的载体表面导入可利用铜/铁/钌等过渡金属催化剂而活化的碳-卤键，并利用单电子氧化还原机理可逆地进行卤素的夺取和送回，由此使1-乙烯基-2-吡咯烷酮的聚合以活性的方式进行。通过使用该技术，能够在诸如硅胶这样的载体表面上高密度地导入主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物。
[0137] (ii)在诸如硅胶这样的载体表面导入例如烷氧基胺，该烷氧基胺的碳- 氧键在发生热解离而生成碳自由基和氮氧自由基(nitroxide)时，N-甲基-2-吡咯烷酮发生聚合，同时生长碳自由基以可逆的方式迅速地被氮氧自由基封闭(capping)而再次变回休眠种，聚合反应得以控制。通过使用该技术，能够在诸如硅胶这样的载体表面上高密度地导入主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物。
[0138] (iii)在向诸如硅胶这样的载体表面导入硫代羰基化合物、碘化合物的情况下，基于聚合物末端间的自由基种与休眠种的交换反应的可逆的链转移会迅速地发生，全部的聚合物链得到同样生长的机会，分子量的控制成为可能。通过使用该技术，能够在诸如硅胶这样的载体表面上高密度地导入主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物。
[0139] 在上述(i)～(iii)的任一项中，就载体而言，除了硅胶以外均可以使用与上述(1)、(2)的制造方法所使用的载体相同的那些。
[0140] 下面，对(4)的制造方法进行说明。
[0141] 该制造方法为包括使具有聚合性双键的硅烷偶联剂与N-甲基-2-吡咯烷酮共聚的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序的方法。
[0142] 作为具有聚合性双键的硅烷偶联剂，例如可列举具有下式(I)表示的结构的化合物。
[0143] [化学式9]
[0144] W-X-Y-SiR3-nZn (I)
[0145] (式(I)中，W为乙烯基、烯丙基、异丙烯基，或在ω位具有双键的碳原子数4～12的烯基，X为酰胺基、酯基、碳原子数1～3的N-烷基酰胺基、醚基、亚砜基、砜基或磷酸酯基，R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，Z为能够使式(I)中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团，Y为碳原子数 1～30的亚烷基。n为1～3的整数。)
[0146] 上述式(I)中的Y优选为碳原子数1～5的亚烷基，更优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基中的任意基团。
[0147] R优选为甲基或乙基。
[0148] Z为离去基团，在载体为例如硅胶的情况下，只要是可使式(I)中的硅原子与构成该硅胶的氧之间形成键合的那些即可，可以为任何原子团。即使在载体不是硅胶的情况下，也为可使式(I)中的硅原子与构成载体的原子之间形成键合的离去基团。
[0149] 为了操作的容易性和反应性的平衡良好，作为通常使用的离去基团，为碳原子数1～5的烷氧基，其中可以例示甲氧基或乙氧基、卤素(氯、溴或碘)、诸如二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、咪唑基这样的含氮基团，另外也可以使用烯丙基、异丙烯基，可根据离去基团的种类而调整反应条件(也包括添加催化剂)。
[0150] 在上述(4)的制造方法中，就载体而言，除了硅胶以外也可以使用与上述(1)、(2)的制造方法所使用的载体相同的那些，就1-乙烯基-2-吡咯烷酮而言，也可以使用与(1)、(2)的制造方法相同的那些。
[0151] 在该制造方法中，通过在聚合物合成时使用适当的链转移剂、上述的活性自由基聚合法，也能够实现分子量的控制。对于通过硅烷偶联反应使得到的聚合物与载体键合的方法，可以使用公知的硅烷偶联的方法。
[0152] 下面，对(5)的方法进行说明。
[0153] 该制造方法为包括向载体表面导入链转移性官能团，使1-乙烯基-2-吡咯烷酮进行自由基聚合的工序的制造方法。
[0154] 如上所述的键合有链转移性官能团的载体例如可通过使以下述式(VI) 表示的化合物与(使用硅胶作为载体时的情况下)硅胶进行硅烷偶联而获得。
[0155] [化学式10]
[0156] T-Y-SiR3-nZn (VI)
[0157] (在式(VI)中，T为链转移性官能团，Y为碳原子数1～30的亚烷基，R 各自独立地为碳原子数1～5的烷基，Z为可使式(VI)中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团。n为1～3的整数。)
[0158] 在式(VI)中，R优选为甲基、乙基或丙基。Z为离去基团，只要是可使式(VI)中的硅原子与(载体为硅胶的情况下)构成硅胶的氧之间形成键合的那些即可，可以为任何原子团。即使在载体不是硅胶的情况下，也为可使式(VI) 中的硅原子与构成载体的原子之间形成键合的离去基团。
[0159] 就T而言，可以优选使用与(2)相同的那些，就R、Z而言，可以优选使用与(1)、(2)、(4)所使用的基团相同的那些。
[0160] 本发明使用的键合有链转移性官能团的载体，优选为通过使以上述式 (VI)表示的化合物与硅胶发生硅烷偶联而获得的表面修饰硅胶。
[0161] 通过在表面导入有(化学键合有)链转移性官能团的载体的存在下，使用少量的自由基产生剂作为催化剂而进行N-甲基-2-吡咯烷酮的自由基聚合，能够将聚合物固定于载体表面。在上述(5)的制造方法中，就载体而言，除了硅胶以外也可以使用与上述(1)、(2)的制造方法所使用的载体相同的那些。另外，就自由基产生剂而言，也可以使用与(2)的制造方法所使用的自由基产生剂相同的那些。
[0162] 下面，对(6)的方法进行说明。
[0163] 该制造方法为包括使在起始末端具有反应性甲硅烷基的阴离子引发剂与1-乙烯基-2-吡咯烷酮进行阴离子聚合而得到聚合物的工序、和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序的制造方法。
[0164] 如上所述的在起始末端具有反应性甲硅烷基的阴离子引发剂，例如通过使以下述式(VII)表示的化合物与(在使用硅胶作为载体的情况下)该硅胶进行硅烷偶联而获得。
[0165] [化学式11]
[0166] R3-nZnSi-Y-M (VII)
[0167] (式(VII)中，R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，Z为可使式(VII)中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团，Y为任意氢任选被具有芳环的基团取代的碳原子数1～30的支链或直链状的亚烷基。M为碱金属或碱土金属。n为1～3的整数。)
[0168] 在式(VII)中，R优选为甲基、乙基或丙基，Y，Z可优选列举与上述式 (I)相同的那些，M可优选列举锂、钠、钾或镁。
[0169] 就Y而言，作为任选取代任意氢的包含芳环的基团，例如可列举具有1 个或2个苯基的碳原子数4～20的烷基，更具体而言，可列举1,1-二苯基己基等。
[0170] 在这样的阴离子引发剂的存在下，可通过公知的方法合成主链的重复单元中包含末端具有反应性甲硅烷基的吡咯烷酮骨架的聚合物。
[0171] 需要说明的是，在由于聚合时的副反应而难以在起始末端直接导入硅烷偶联剂的情况下，也可以通过合成利用保护基保护了起始末端的衍生物，并在聚合后脱保护，定量地转换为硅烷偶联剂而获得。对于将如上所述地进行得到的聚合物与载体进行硅烷偶联反应而键合的方法，可以使用公知的硅烷偶联的方法。
[0172] 下面，对(7)的方法进行说明。
[0173] 该制造方法为以下制造方法，其包括：使阴离子引发剂与1-乙烯基-2- 吡咯烷酮进行阴离子聚合，使具有反应性甲硅烷基的终止剂发挥作用而得到聚合物的工序；和使得到的聚合物在载体表面进行硅烷偶联的工序。在难以向终止末端直接导入硅烷偶联剂的情况下，可以使用被保护基保护了的衍生物并在终止后脱保护，定量地转换为硅烷偶联剂而获得。
[0174] 使用阴离子引发剂的聚合可以采用公知的方法。另外，具有反应性甲硅烷基的终止剂例如可列举以下述式(VIII)表示的化合物。
[0175] [化学式12]
[0176] R3-nZnSi-Y-Z’(VIII)
[0177] (在式(VIII)中，R各自独立地为碳原子数1～5的烷基，Z为可使式(VIII) 中的硅原子与载体之间形成键合的离去基团，Y为任意氢任选被包含芳环的基团取代的碳原子数1～30的支链或直链状的亚烷基。Z’为通过生长阴离子末端与终止剂的反应而离去的基团，n为1～3的整数。)
[0178] 作为Z的具体例，可优选列举在上述式(I)中作为具体例列举的那些。
[0179] 作为Z’的具体例，可列举：卤素(氯、溴或碘)，碳原子数1～5的烷氧基、其中优选为甲氧基或乙氧基，烷基巯基，诸如二甲基氨基、二乙基氨基、吡咯烷基、咪唑基的含氮基团，烯丙基或2-甲基-2-丙烯基。可根据离去基团的种类而调整反应条件(也包括添加催化剂)。
[0180] 就Y而言，作为任选取代任意氢的包含芳环的基团，例如可列举具有1 个或2个苯基的碳原子数4～20的烷基，更具体而言，可列举1,1-二苯基己基等。
[0181] 对于使如上所述地得到的聚合物与载体通过硅烷偶联反应而键合的方法，可以使用公知的硅烷偶联的方法。
[0182] 下面，对(8)的制造方法进行说明。
[0183] 该制造方法包括使包含1-乙烯基-2-吡咯烷酮、交联剂及引发剂的组合物和载体混合而进行交联反应的工序。
[0184] 在该制造方法中，通过使该单体与交联剂共聚而制成不溶性的聚合物。具体而言，可以使该载体吸收将1-乙烯基-2-吡咯烷酮和相对于上述单体为 0.01-1当量的作为交联剂的例如二乙烯基苯、亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯等、适量的自由基引发剂、根据需要的溶剂混合而成的物质，并设定为由引发剂引发聚合的条件。
[0185] 另外，作为自由基引发剂，可以使用在常规的自由基聚合反应中使用的公知的那些，作为其具体例，可列举偶氮化合物、过氧化物。
[0186] 下面，对(9)的制造方法进行说明。
[0187] 关于(9)的制造方法的详情，记载于非专利文献2。
[0188] 首先使载体分散于溶解有聚(乙烯基吡咯烷酮)的溶液，除去溶剂。除去溶剂后，对在表面包覆有聚(乙烯基吡咯烷酮)的载体施加热。作为此时的温度，可列举50℃～180℃左右。通过施加热，将聚(乙烯基吡咯烷酮)固定化至载体上，之后照射γ射线、电子束而引发交联反应，从而使载体与聚(乙烯基吡咯烷酮)键合。
[0189] 通过上述(1)～(9)的任意方法获得的固定相均具有作为超临界流体色谱法用的固定相优异的性能。
[0190] 经过上述的操作获得的负载于本发明的固定相的载体的主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物的重均分子量，优选为1,000～5,000,000。需要说明的是，例如对于上述式(II)、(IV)所示的结构的情况而言，本发明所述的聚合物的重均分子量为作为主链的重复单元的-(CH2-CAB)n-部位的重均分子量。
[0191] 从聚合物在溶剂中的溶解性、使聚合物负载于载体时粒子的凝聚的防止、在流动相溶剂中的溶解的抑制、与载体形成化学键合时的键合量的保持等观点出发，上述重均分子量优选为上述范围。最合适的量根据聚合物的种类而不同。
[0192] 需要说明的是，由于在本发明的固定相的制造方法(1)中，1-乙烯基-2- 吡咯烷酮的聚合与固定化至硅胶是同时发生的，因此可以由聚合溶液的上清液估算重均分子量。
[0193] 在制造方法(2)、(4)、(6)、(7)中，在使主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物键合于载体之前，测定该聚合物的重均分子量。
[0194] 重均分子量可通过以聚苯乙烯作为标准物质的凝胶渗透色谱法(GPC) 方法进行测定。
[0195] 在本发明的固定相中的使用制造方法(1)～(7)获得的那些中，由于主链的重复单元中包含吡咯烷酮骨架的聚合物是共价键合于载体表面的，因此即使将原本可溶解这些聚合物的溶剂或包含该溶剂的混合溶剂用作展开溶剂，也不会发生溶解，不会损害作为固定相的功能。
[0196] 另外，本发明的固定相中的使用制造方法(8)、(9)获得的那些，也由于聚合物彼此在载体上是发生交联的，因此即使将原本可溶解这些聚合物的溶剂或包含该溶剂的混合溶剂用作展开溶剂，也不会发生溶解。
[0197] 由于本发明的固定相的比表面积与所使用的载体的比表面积相当，因此只要选择具有期望的比表面积的载体即可。在载体为例如硅胶的情况下，可以通过选择适当的制品而进行调整。一般而言，在使聚合物负载于载体的实施方式中，在负载的前后，比表面积不会有误差以上的变化，因此固定相的比表面积可视为与所使用的载体的比表面积相同。
[0198] 本发明中可使用的这样的载体的平均粒径通常为0.1～1000μm，优选为 1～50μm，平均孔径通常为 优选为
[0199] 另外，载体的比表面积通常为5～1000m2/g，优选为10～500m2/g。一般而言，在使聚合物负载于载体的情况下，在负载的前后，比表面积不会有误差以上的变化，因此固定相的平均粒径可视为与所使用的载体的平均粒径相同。即，在本发明的固定相为粒子状的情况下，其平均粒径可列举为 0.1μm～1000μm的实施方式，优选为1～50μm。
[0200] 负载于载体的该聚合物的平均厚度(每g载体负载量/载体比表面积)通常为2/105～2/107(μm)，优选为4/105～5/107(μm)。如果为上述范围则存在峰变得尖锐的倾向，故优选。
[0201] 像这样，在聚合物负载于载体上而成的固定相中，在固定相100质量份中包含的聚合物的质量份的比例(％)优选为1～50质量％，更优选为3～30 质量％，进一步优选为5～20质量％。通过设为这样的比例，可以适当地显示出聚合物的吸附能力，并且可以避免白白地增强保持、使峰宽度变宽，故优选。
[0202] 需要说明的是，在固定相100质量份中包含的聚合物的质量份的比例(％) 可以通过元素分析而测定，基于负载聚合物前的载体的碳含量和得到的固定相的碳含量的测定结果，将除了负载聚合物前的载体中包含的碳以外的碳设为全部来自聚合物，而计算出固定相中聚合物的质量份的比例。
[0203] 本发明的固定相为粒子状的情况下的平均粒径，如果为球形则指的是其直径，在为不规则粒子的情况下，以与该粒子体积相等的球的直径表示。平均粒径可以通过使用显微镜图像进行测定的装置，例如Malvern公司制 Mastersizer 2000E进行测定。
[0204] 以粒子形式使用本发明的固定相的情况下，优选为长宽比为2以下、更优选为1.5以下的球形粒子状。越接近正球则越优选，所以下限为1，没有特别限制。
[0205] 如下所述地测定长宽比。将试样以随机散布于观察台上的状态，从正上方利用电子显微镜或光学显微镜观察，在观察到独立的(与其它的任何粒子都不接触或重叠的)初级粒子10个以上的任意画面中，对画面内的各个独立的初级粒子求出长轴及短轴(垂直于长轴的最长部分的长度)，将两者的比作为单个粒子的长宽比。将针对画面内全部独立的初级粒子的长宽比进行算术平均而得到的值作为本发明的长宽比。初级粒子是指能够清晰地观察到粒子间的界面的粒子。通常，以避免在试样台上的初级粒子重叠的方式使其适度地分散而进行观察，但难以避免偶然发生的重叠，另外也存在多个初级粒子凝聚而成的块状粒子，将这些从观察对象中排除。
[0206] 本发明的固定相可以用作超临界流体色谱法(SFC)的固定相。
[0207] 如果将本发明的固定相用于SFC用途，则对酸性化合物、碱性化合物具有优异的分离特性，进一步，对利用HPLC难以分离的物质，例如稠环芳香族化合物、芳香族化合物的异构体的分离特性也优异。
[0208] 本发明的固定相例如可以像日本特开2006-058147号中记载的那样，填充于超临界流体色谱法用的柱而使用。
[0209] 在超临界流体色谱法中，将含有超临界流体与溶剂的流体用作流动相。这里的所述超临界流体色谱法，是对以超临界流体为主要流动相的色谱法的一般性名称。上述超临界流体为处于临界压力以上以及临界温度以上的状态(即超临界状态)的物质。作为可用作超临界流体的物质，例如可列举二氧化碳、氨、二氧化硫、卤化氢、一氧化二氮、硫化氢、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯、卤代烃、水等，但从适当的临界条件、安全性、成本等出发，实质上是指二氧化碳。另外，并不需要严格为超临界，也包括亚临界状态下的使用在内，将它们称为“超临界流体色谱法”。
[0210] 作为上述溶剂，根据上述目标物质的种类、超临界流体的种类等，可从公知的各种溶剂中选择一种或二种以上。作为上述溶剂，例如可列举甲醇、乙醇、2-丙醇等低级醇、丙酮等酮、乙腈、乙酸乙酯、THF等。另外，为了在分离碱性、酸性、两性化合物、极性化合物时使峰的形状良好，有时也进一步添加少量的水、酸、胺碱、铵盐等的情况。
[0211] 上述超临界流体色谱法，只要是将含有上述超临界流体与上述溶剂的流体用于流动相的色谱法则没有特别限定。使用本发明的固定相的上述超临界流体色谱法，可以为分析用也可以为分取用。
[0212] 分取用的超临界流体色谱法，只要是包括下述工序的超临界流体色谱法则没有特别限定，所述工序根据利用柱分离的目标物质，将通过柱后的流动相利用馏分收集器而分别取得。
[0213] 填充的柱可以使用公知尺寸的那些。
[0214] 另外，流速也可以适宜调整而使用，例如对于内径0.46mm的柱的情况而言，可列举0.3～10ml/min的实施方式，可优选列举1～6ml/min的实施方式。
[0215] 另外，柱温也可列举0～50℃左右的实施方式，可列举20～40℃左右。
[0216] 背压可列举120～180bar左右的实施方式，可列举130～160bar左右。
[0217] 另外，本发明的固定相也可以以整块形式使用。在使本发明的固定相为整块的情况下，可通过使预先被成型为整块状且键合有聚合性官能团的载体、或使成型为整块状的成为载体的原料为键合有聚合性官能团的那些，使其与N-甲基-2-吡咯烷酮进行反应而获得。
[0218] 本发明的超临界流体色谱法用的固定相，对于苯基丙酸类NSAIDS(非甾体类抗炎药)这样的酸性化合物、咖啡因类似物这样的碱性化合物、菲、三联苯这样的芳香族、多环芳香族烃、其它的具有宽范围极性的化合物的分离性能优异。
[0219] 实施例
[0220] 以下，结合实施例对本发明进行具体说明。但本发明不受限于以下实施例的实施方式。
[0221] <实施例1>
[0222] (硅胶的N-甲基-N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]2-丙烯酰胺处理)
[0223] (制备例1)
[0224] 向300mL三颈烧瓶中加入甲苯200mL、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷3.91g、三乙胺2.74g、4-吡咯烷基吡啶约50mg，一边搅拌一边向其中滴加丙烯酰氯2.10g、甲苯4mL的混合液。滴加结束后，约3小时加温至80℃，获得悬浮着结晶性产物(三乙胺盐酸盐)的淡褐色液体。
[0225] 另一方面，向300mL三颈烧瓶中加入于160℃真空干燥后的标称孔径 粒径5μm的硅胶20.60g，设置搅拌桨。通过玻璃过滤器向其中注入上述反应所得到的淡褐色液体，利用50mL的甲苯冲洗残留于玻璃过滤器的固体。将该烧瓶一边搅拌一边在油浴中于90℃加温1小时、于125℃加温5 小时。这期间从侧管蒸馏出约100g的甲苯。将获得的硅胶在0.5μm膜滤器上过滤分离，利用50mL的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、100mL的甲醇、50mL 的丙酮洗涤后，于60℃真空干燥。
[0226] 产量21.74g，重量增加率为6.5％。
[0227] 元素分析值为C：2.65，H：0.55，N：0.44(各％)。
[0228] 1-乙烯基-2-吡咯烷酮(VP)与制备例1中获得的硅胶的共聚
[0229] 将VP 984mg、NMP 4.2mL、偶氮二异丁腈(AIBN)23mg混合，氮气鼓泡后，移液至加入有制备例1中获得的硅胶2.084g的烧瓶。将液体混合均一，将烧瓶进行氮气置换后，连接旋转蒸发仪，一边旋转一边分别于65℃、 80℃、90℃保温2小时。将获得的液体移至5.5μm玻璃过滤器，将NMP 50mL、甲醇50mL、丙酮50mL分别分成数次进行洗涤，进行了真空干燥(60℃)。产量2.262g，相对于制备例1中获得的硅胶的重量增加为8.5％，硅胶元素分析值为C：7.91，H：1.37，N：1.48(各％)。
[0230] 可推定获得的聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)键合硅胶具有以下结构。
[0231] [化学式13]
[0232]
[0233] <实施例2>
[0234] 基于 硅胶的填充剂
[0235] 向50ml的梨形瓶A中加入于160℃真空干燥后的标称孔径 直径5μm的硅胶2098mg、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷123mg、干燥甲苯 20mL，连接旋转蒸发仪，一边旋转一边升温2小时至90℃，接着缓慢升温 3小时至118℃。这期间，有约4.5g的甲苯转移至收集器。向获得的硅胶分散液添加三乙胺212mg、丙烯酰氯114mg，一边旋转一边于97℃保持
1小时。冷却后，与甲醇10mL一起移至5.5μm的玻璃过滤器，利用甲醇10mL 洗涤3次，进行真空干燥(60℃)。获得的硅胶的重量为2.267g，元素分析值为C：2.91，H：0.84，N：0.49％。
1小时。冷却后，与甲醇10mL一起移至5.5μm的玻璃过滤器，利用甲醇10mL 洗涤3次，进行真空干燥(60℃)。获得的硅胶的重量为2.267g，元素分析值为C：2.91，H：0.84，N：0.49％。
[0236] 向获得的硅胶中的2216mg中滴加将VP 618mg、AIBN 8.9mg、丙酮2.5mL混合而成的液体，利用刮勺混和至均一。通过将其利用真空泵进行减压而除去丙酮，用氮气充满。将该容器分别于70℃、80℃、90℃保温2小时。获得的硅胶利用甲醇40mL、NMP30mL、甲醇30mL、丙酮32mL洗涤后进行真空干燥。产量2.637g。相对于上述表面处理硅胶的重量增加为 19.0％，元素分析值为C：10.2，H：1.7，N：1.82。
[0237] 推测获得的聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)键合硅胶具有与实施例1相同的结构。
[0238] <实施例3>
[0239] 基于二官能偶联剂的丙烯酰基酰胺键合硅胶的制备
[0240] 与实施例1同样地进行，只是代替三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷而使二甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]甲基硅烷690mg、三乙胺786mg、甲苯30mL、丙烯酰氯537mg和甲苯5.5mL反应，将该反应液与实施例1同样注入硅胶 4427mg中，加温并对所得硅胶进行过滤洗涤。产量4721mg(重量增加 6.65％)，元素分析值为C：3.52，H：0.7，N：0.5。
[0241] 将获得的硅胶2081mg分散于包含VP 965mg、NMP 4.0mL、AIBN 18.9mg的溶液中，与实施例1同样地进行反应，获得2350mg的硅胶(重量增加12.9％)。元素分析值为C：10.2，H：1.7，N：1.82。
[0242] 推测获得的聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)键合硅胶具有与实施例1相同的结构。
[0243] <实施例4>巯基键合硅胶的制备
[0244] (制备例2)
[0245] 在50mL的梨形瓶中，向经过真空干燥后的硅胶(细孔直径 直径 5μm)2233mg注入甲苯25ml，三甲氧基(巯基丙基)硅烷523mg，将烧瓶与旋转蒸发仪连接，一边旋转一边在3小时25分钟的期间内将浴温从105℃上升至125℃。这期间，有约10mL的液体(主要为甲苯)转移至收集器。冷却烧瓶后，利用5.5μm的玻璃过滤器过滤分离硅胶，利用甲醇
15mL洗涤4 次、利用丙酮15mL洗涤2次，用60℃的真空干燥器进行了干燥。获得2310mg 的巯基键合硅胶。重量增加3.4％，元素分析值为C：1.72，H：0.56，N： 0％。
15mL洗涤4 次、利用丙酮15mL洗涤2次，用60℃的真空干燥器进行了干燥。获得2310mg 的巯基键合硅胶。重量增加3.4％，元素分析值为C：1.72，H：0.56，N： 0％。
[0246] 使用-SH-的基于活性自由基聚合法的键合
[0247] 使制备例2中得到的巯基键合硅胶2.221g吸收将VP 696mg、AIBN(偶氮二异丁腈)15mg溶于丙酮3mL而成的液体，利用刮勺混合均一后，利用真空泵(1Torr)减压而除去丙酮。
向该烧瓶中填充氮气，在浴中于65℃、80℃、 90℃分别保温2小时。将冷却后的粉体与适量甲醇一起转移至5.5μm的玻璃过滤器，利用甲醇15mL洗涤3次，用NMP15mL洗涤3次，用甲醇
15mL 洗涤3次，用丙酮10mL洗涤3次，利用60℃的真空干燥器干燥。干燥后的粉体为2.499g。
重量增加11.9％，元素分析值为C：8.18，H：1.48，N： 1.31％。
向该烧瓶中填充氮气，在浴中于65℃、80℃、 90℃分别保温2小时。将冷却后的粉体与适量甲醇一起转移至5.5μm的玻璃过滤器，利用甲醇15mL洗涤3次，用NMP15mL洗涤3次，用甲醇
15mL 洗涤3次，用丙酮10mL洗涤3次，利用60℃的真空干燥器干燥。干燥后的粉体为2.499g。
重量增加11.9％，元素分析值为C：8.18，H：1.48，N： 1.31％。
[0248] 可推定获得的聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)键合硅胶具有以下结构。
[0249] [化学式14]
[0250]
[0251] <实施例5>
[0252] 甲基丙烯酰氧基键合硅胶的制备
[0253] (制备例3)
[0254] 将于160℃真空干燥后的与实施例1中使用的相同的硅胶2.187g与甲苯25mL、三氟乙酸10μL、三甲氧基(3-甲基丙烯酰氧丙基)硅烷500μL一起，在与旋转蒸发仪连接的烧瓶中经历3小时30分钟从105℃缓慢升温至 120℃。这期间，有约10mL的液体转移至收集器。将经处理的硅胶在冷却后移至5.5μm的玻璃过滤器，进行过滤分离，利用NMP 8mL洗涤2次，用甲醇10mL洗涤3次，用丙酮8mL洗涤2次，于60℃真空干燥，获得2.307g 粉体。重量增加5.5％，元素分析值为C：2.64，H：0.55，N：0.00％。
[0255] 将制备例3中获得的甲基丙烯酰氧基键合硅胶2.194g与实施例1同样地分散于VP 1.0mL、NMP 4.0mL、AIBN 22.8mg的溶液中，与旋转蒸发仪连接，一边旋转一边在氮气氛围中分别于70℃、80℃、90℃保持2小时。冷却本液后，添加NMP 5mL进行稀释，转移至5.5μm的玻璃过滤器，利用 NMP约7mL洗涤3次，用甲醇约7mL洗涤3次，用丙酮约7mL洗涤3次，于60℃真空干燥。产量2.364g(重量增加7.8％)，元素分析值为C：6.91，H： 1.16，N：0.90％。
[0256] 可推定获得的聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)键合硅胶具有以下结构。
[0257] [化学式15]
[0258]
[0259] <实施例6>
[0260] 与3μm硅胶的键合
[0261] 相对于平均粒径3μm、平均细孔直径 的硅胶4.427g，进行与制备例1相同的处理，得到了4.721g的表面处理硅胶(重量增加6.6％)。
[0262] 将包含VP 1343mg、NMP 4.00mL、偶氮二异丁腈25.6mg的溶液进行氮气鼓泡后注入于上述得到的硅胶2.090g中。对得到的浆料一边在氮气下搅拌一边于73℃保持12小时。获得的硅胶与制备例2同样，在玻璃过滤器上利用NMP、甲醇、丙酮各20mL进行洗涤，于60℃真空干燥。产量2.440g(重量增加16.7％)。
[0263] 对于上述得到的各硅胶，浆料填充于4.6mmφ×150mm柱中而制作了 HPLC用的柱，以适合高压气体安全法的方式浆料填充于保证为耐压制的 4.6mmφ×150mm柱而制作了SFC用的柱。在以下分离例中，使用这些柱进行。
[0264] <分离例1>
[0265] 图1示出了使用相同的物质作为固定相而进行苯基苯酚(邻、间、对的混合物)的分离，使用高效液相色谱法而获得的色谱图(a)、和使用SFC进行分离而获得的色谱图(b)。
[0266] 高效液相色谱法的条件：洗脱液(Hex/EtOH＝97/3)，流速：1.0mL/min，检测：UV254nm。
[0267] 超临界流体色谱法的条件：在洗脱液：CO2/甲醇(97:3v/v)，流速： 4ml/min，温度：40℃，背压：150bar的条件下进行。检测于UV254nm下进行。
[0268] <分离例2>
[0269] 图2为使用与分离例1相同的固定相进行氢化可的松与泼尼松龙的分离而获得的色谱图，使用HPLC获得的为(a)，使用SFC获得的为(b)。
[0270] 除了在HPLC中使用了洗脱液：CO2/乙醇(90:10v/v)、和在SFC中使用了洗脱液：CO2/甲醇(90:10v/v)以外，条件与分离例1相同。
[0271] <分离例3>
[0272] 图3为使用与分离例1相同的固定相进行乙酰基菲与乙酰基蒽的分离而获得的色谱，使用HPLC获得的为(a)，使用SFC获得的为(b)。
[0273] HPLC和SFC的条件与分离例1相同。
[0274] <分离例4>
[0275] 图4示出了使用市售品2-乙基吡啶键合硅胶作为固定相进行乙酰基菲和乙酰基蒽的分离而获得的色谱图(a)、和使用分离例1的SFC中使用的固定相而获得的色谱图(b)。
[0276] 各自的SFC的条件与分离例1相同。
[0277] 将市售品2-吡啶基乙基固定相(以下式表示)的结构示于以下。
[0278] [化学式16]
[0279]
[0280] <分离例5>
[0281] 图5示出了在基于SFC的氢化可的松与泼尼松龙的分离中，分别使用在分离例4中使用的2-乙基吡啶键合硅胶(比较例)而获得的色谱图(a)、和在分离例1的SFC中使用的聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)键合硅胶而获得的色谱图 (b)。
[0282] 各自的SFC的条件除了使用了洗脱液：CO2/甲醇(90：10v/v)以外，与分离例1相同。
[0283] <分离例6>
[0284] 图6为示出了对于4种统称为β-阻滞剂的医药成分(阿普洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、吲哚洛尔)的分离，使用实施例4的固定相(活性自由基聚合法)进行的结果(a)、使用实施例5的固定相(甲基丙烯酸酯共聚法)进行的结果(b)、使用实施例1的固定相进行的结果(c)的图。在(b)、(c)中，确认到各成分发生了洗脱，而在(a)中，仅确认到阿普洛尔发生洗脱而结束。需要说明的是，就各色谱法中的SFC条件而言，除了使用了洗脱液：CO2/甲醇(90:10 v/v)以外，与分离例1相同。
[0285] 对图1、图2以及图5的各峰算出分离度(Rs)，汇总于以下的表。
[0286] 需要说明的是，分离度通过下式求出。
[0287] 分离度(Rs)：2×(受到较强吸附的分离对象和受到较弱吸附的分离对象的两峰间的距离)/两峰的谱带宽度的总和
[0288] [表1]
[0289]
[0290] 由表1的记载也可知，与在HPLC中使用本发明的固定相的情况相比，在SFC中使用本发明的固定相时目标物质的分离度更高。另外可知，即使同样在SFC中，也显示出与以往最常被使用的2-乙基吡啶固定不同的特性，经常可提供更好的分离。
[0291] 工业实用性
[0292] 本发明的固定相即使对在传统HPLC中难以分离的化合物也具有良好的分离特性。具体而言，可预期柱级数的提高。从这一点出发，本发明的固定相不仅可期待对迄今为止难以分离的各种物质的新的分离条件的发现、改良，还可期待促进经分离的物质的鉴定、分析的便利性的提高。
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