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GLP-1 聚乙二醇化的化合物

阅读：442发布：2020-05-12

专利汇可以提供GLP-1 聚乙二醇化的化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供与两个聚乙二醇分子偶联的GLP-1化合物或其衍生物，产生与未聚乙二醇化的肽相比具有延长的半衰期和降低的清除率的生物活性肽。这些聚乙二醇化的GLP-1化合物和组合物对于治疗病症或紊乱是有用的，其通过降低血糖、减少食物摄取、减少胃或肠排空、增加β-细胞群、或减少胃或肠的能动性而获益。，下面是GLP-1 聚乙二醇化的化合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.聚乙二醇化的GLP-1化合物，其由以下通式的氨基酸序列组成：His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys45-Xaa46通式I(SEQ ID NO：1)，
其中Xaa8是：Val、Leu、或Ile；
Xaa22是：Glu或Asp；
Xaa33是：Val或Ile；
Xaa46是：Cys或Cys-NH2；
并且其中一个PEG分子共价结合到Cys45，且一个PEG分子共价结合到Cys46或Cys46-NH2。
2.权利要求1的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8是Val且Xaa22是Glu。
3.权利要求2的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8是Val，Xaa22是Glu，且Xaa33是Ile。
4.权利要求3的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8是Val，Xaa22是Glu，Xaa33是Ile，且Xaa46是Cys-NH2。
5.权利要求1-4中任一项的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中每个聚乙二醇分子量在
5,000至40,000道尔顿之间。
6.权利要求1-4中任一项的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中每个聚乙二醇分子量在
20,000至60,000道尔顿之间。
7.权利要求1-4中任一项的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中每个聚乙二醇分子量在
20,000至40,000道尔顿之间。
8.权利要求1-4中任一项的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中每个聚乙二醇的分子量为20,000道尔顿。
9.权利要求1-4的任一项的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中每个聚乙二醇分子为线性甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。
10.权利要求1-9中任一项的聚乙二醇化的GLP-1化合物在药物制备中的用途，所述药物用于治疗非胰岛素依赖的糖尿病或肥胖症。

说明书全文

GLP-1聚乙二醇化的化合物

技术领域

[0001] 本发明涉及聚乙二醇(PEG)修饰的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)化合物和相关的组合物以及治疗病症或功能紊乱的有用方法，其通过降低血糖、减少食物摄取、减少胃或肠排空、增加β-细胞数和/或功能和/或抑制β细胞凋亡、或减少胃或肠的能动性而获益。

背景技术

[0002] GLP-1诱导广泛的生物学效应，例如刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃能动性或肠能动性、增强葡萄糖利用和诱导体重减轻。GLP-1还能预防胰腺β-细胞退化，该病在非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)发展时发生。GLP-1的重要特点是其能够刺激刺激胰岛素的分泌而不伴随低血糖症的危险。只有当葡萄糖水平升高时GLP-1才诱导胰岛素分泌，不像其它疗法那样不管葡萄糖水平是否升高都通过增加胰岛素的表达来发挥作用。包含GLP-1肽的治疗的有效性一直受限于GLP-1(1-37)活性差的事实，并且两个天然产生的截短肽GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2在体内被快速清除，并且在体内的半衰期非常短。众所周知，内源产生的二肽基肽酶IV(DPP-IV)通过除去其N端的组氨酸和丙氨酸残基使循环的GLP-1肽失活，这是其体内半衰期短的主要原因。

[0003] 虽然已有多种方法使得GLP-1化合物比天然GLP-1具有更长的半衰期或者更大的药效，但还需要另外的化合物进一步降低清除率并延长半衰期，从而优化GLP-1作为一种治疗药物的功效，将其在时间延长期间的给药次数降至最低。编号为PCT/US2004/006082和PCT/US2000/11814的国际申请阐述了一个或更多的PEG分子与不同GLP-1以及促胰岛素分泌肽(exendin)化合物的共价结合。这些化合物的半衰期超过24小时，可以减少聚乙二醇化的GLP-1化合物的给药次数，同时延长该化合物在血液中维持高浓度的时间。

[0004] 进一步研究已阐明一个问题，其中在延长的储存期从聚乙二醇化的GLP-1或促胰岛素分泌肽化合物中发生聚乙二醇的分离。其结果是，游离的GLP-1或促胰岛素分泌肽使通过治疗窗的初始峰值浓度暴露谱升高。这有可能增加恶心和呕吐的副作用。

[0005] 本发明寻求通过引入两个聚乙二醇化位点至GLP-1或促胰岛素分泌肽化合物，然后使这两个聚乙二醇化位点同时发生聚乙二醇化，以此克服与延长储存时间和聚乙二醇可能从聚乙二醇化的GLP-1或促胰岛素分泌肽化合物中分离出的有关问题。本方法至少有四个方面的优点：第一、该化合物的聚乙二醇化将显著地延长其在体内的半衰期。第二、该化合物的聚乙二醇化将减缓其吸收速率并因此减少药物的最初发作，这被认为是产生副作用的原因。第三、线性的聚乙二醇可直接用于聚乙二醇化并将简化合成步骤。第四、串联的聚乙二醇化，通过降低两分子聚乙二醇从同一个GLP-1或促胰岛素分泌肽分子中分离出的可能性，将缓解与延长储存时间相关的问题、以及与聚乙二醇可能从聚乙二醇化的GLP-1或促胰岛素分泌肽化合物中分离出相关的问题。

[0006] 此外，引入两个聚乙二醇化位点至GLP-1或促胰岛素分泌肽化合物的C-末端，然后使这两个聚乙二醇化位点同时发生聚乙二醇化，导致该聚乙二醇化的化合物比那些其中至少一个聚乙二醇化位点不在肽C-末端的聚乙二醇化的化合物有更高的活性。此外，在GLP-1化合物的C-末端添加一个包含两个聚乙二醇化位点的接头，然后同时使这两个位点发生聚乙二醇化，导致该聚乙二醇化GLP-1化合物比那些聚乙二醇化位点添加在GLP-1化合物的C-末端而无接头的聚乙二醇化的化合物有更高的活性。

[0007] 这样的聚乙二醇化的GLP-1化合物可以用于治疗机能紊乱的受试者，包括，但不限于，糖尿病、肥胖症、胃和/或肠能动性异常、β细胞缺乏(例如β细胞不足或无功能)以及胃和/或肠排空异常，其具体的优点在于本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物在24小时内需要的剂量更少，提高了需此治疗的受试者的便利性以及受试者适应剂量要求的可能性。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明在此提供共价结合两分子聚乙二醇(PEG)的GLP-1化合物或其衍生物，其中每一个聚乙二醇结合到半胱氨酸残基上，其导致聚乙二醇化GLP-1化合物的消除半衰期是至少1小时，或者至少3、5、7、10、15、20小时或者至少24小时。本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物的清除率值为200ml/h/kg或者更小，或者180、150、120、100、80、60ml/h/kg或者更少，或者小于50、40或20ml/h/kg。

[0010] 本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物包含本通式的氨基酸序列：

[0011] His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys45-Xaa46，即通式I(SEQ ID NO：1)；其中Xaa8是：D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；

[0012] Xaa22是：Gly、Glu、Asp或Lys；

[0013] Xaa33是：Val或Ile；

[0014] Xaa46是：Cys或者Cys-NH2，

[0015] 并且其中一个PEG分子共价结合至Cys45且一个PEG分子共价结合至Cys46或Cys46-NH2。

[0016] 对通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物优选的是：Xaa8是Gly或Val；Xaa22是Gly或Glu；Xaa33是Val或Ile；以及Xaa46是Cys或Cys-NH2。同样优选的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33是Val或Ile；以及Xaa46是Cys或Cys-NH2。同样优选的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33是Val；以及Xaa46是Cys。同样优选的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33是Val；以及Xaa46是Cys-NH2。同样优选的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33是Ile；以及Xaa46是Cys。同样优选的通式I的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中Xaa8是Val；Xaa22是Glu；Xaa33是Ile；以及Xaa46是Cys-NH2。

[0017] 用于本发明的聚乙二醇(“PEG”)聚合物，其分子量范围在500至100,000道尔顿之间，或者在5,000至40,000道尔顿之间，或者在20,000到60,000道尔顿之间，或者在20,000到40,000道尔顿之间，并可能是线性的或者含支链的分子，以及可能是本领域述及的聚乙二醇衍生物。本发明中共价结合至GLP-1化合物的PEG分子并非意在限定于特定类型。优选PEG是2万道尔顿的线性甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。更优选的PEG是：

[0018]

[0019] 本发明包含在受试者需要这样的刺激时刺激其GLP-1受体的方法，所述方法包括向受试者施用在此述及的有效剂量的聚乙二醇化GLP-1化合物的步骤。需要GLP-1受体刺激的受试者包括那些非胰岛素依赖性糖尿病、应激诱导的高血糖症、肥胖症、胃和/或肠能动性或排空机能紊乱(包括例如应激肠综合征、β细胞缺乏以及机能性消化不良)的受试者。

[0020] 发明详述

[0021] 胰高血糖素样肽1(GLP-1)是对食物摄入产生应答，由肠L细胞分泌的37个氨基酸的肽。本领域已有大量GLP-1类似物及其衍生物的阐述。本发明阐述对GLP-1的修饰，该修饰导致延长的消除半衰期和/或降低的清除率。掺入至肽的特定氨基酸位点的半胱氨酸残基提供了巯基，其可以与聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物共价结合以产生聚乙二醇化GLP-1化合物。

[0022] 此处用到的术语“GLP-1化合物”，包括天然GLP-1、[GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2]、GLP-1类似物、GLP-1衍生物、GLP-1生物活性片段、延长的GLP-1或类似物或延长的GLP-1肽的片段、促胰岛素分泌肽-4类似物和促胰岛素分泌肽-4衍生物。优选的，GLP-1类似物具有GLP-1(7-37)OH或延长的GLP-1肽的氨基酸序列，使1、2、3、4、5或6个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH的片段在相应位置的氨基酸不同，或经修饰使0、1、2、3、4、5或6个氨基酸与延长的GLP-1肽在相应位置的氨基酸不同。

[0023] 术语“聚乙二醇化”当指本发明的GLP-1化合物时是指通过两分子的聚乙二醇或其衍生物共价结合而化学修饰的GLP-1化合物。而且，术语“PEG”的意思是指在本领域已知的聚乙二醇或其衍生物(例如参见美国专利号：5,445,090、5,900,461、5,932,462、6,436,386、6,448,369、6,437,025、6,448,369、6,495,659、6,515,100和6,514,491)。在本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物中，优选PEG(或它的衍生物)共价结合到GLP-1化合物中引入的两个半胱氨酸残基上。在GLP-1化合物中两个引入的半胱氨酸残基优选位于45位和46位。

[0024] “促胰岛素活性”是指对升高的葡萄糖水平产生应答，刺激胰岛素分泌，从而导致细胞吸收葡萄糖以及降低血浆葡萄糖水平的能力。促胰岛素的活性可用本领域的已知方法进行评估，包括应用体内试验和测量GLP-1受体结合活性或受体激活作用的体外测定，例如：分别在EP 619,322 to Gelfand等和美国专利号5,120,712中所述，利用胰岛细胞或胰岛素瘤细胞的测定。在人体中是通过测量胰岛素水平或C-肽水平进行常规测定促胰岛素活性。为了达到本发明的目的，应用体外GLP-1受体信号测定来确定本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物在体内是否显示出促胰岛素活性。可以使用促胰岛素活性来证明聚乙二醇化GLP-1化合物具有生物学活性。本发明所有例证的聚乙二醇化GLP-1化合物都具有促胰岛素活性(参见例6)。

[0025] 这里用到的“体外药效”，是基于细胞测定对肽活化GLP-1受体能力的测量。体外药效用“EC50”来表示，它是在单剂量应答试验中化合物产生50％活性的有效浓度。为达到本发明的目的，应用荧光测定进行体外药效测定，该测定利用稳定表达人GLP-1受体的HEK-293细胞进行检测。这些HEK-293细胞已稳定整合了DNA载体，其具有驱动萤光素酶基因表达的cAMP应答元件(CRE)。GLP-1化合物或聚乙二醇化GLP-1化合物与其受体的相互作用引发的信号导致cAMP应答元件活化以及随后萤光素酶表达。列于例3中的聚乙二醇化GLP-1化合物的EC50值是使用上述萤光素酶测定法进行测定的。通过应用Val8-GLP-1(7-37)OH或天然GLP-1作为对照并指定对照的参考值为100％，可以确定相对体外药效值。

[0026] 术语“血浆半衰期”是指一半的有关分子在被清除之前在血浆中循环的时间。可替代其使用的术语是“消除半衰期”。在血浆半衰期或者消除半衰期的情况下用到的术语“延长的”或“更长的”是指相对于参照分子(如肽的非聚乙二醇化形式或者天然肽)在可比条件下的测定结果，在聚乙二醇化GLP-1化合物半衰期中有具统计学意义的增高。优选本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物的消除半衰期是至少1小时，更优选至少3、5、7、10、15、20小时以及最优选至少24小时。在实施例4和5中报告的半衰期是消除半衰期；其对应于消除的终末对数线性速率。本领域的技术人员理解半衰期是衍生参数，其作为清除率和分布容积二者的函数而变化。

[0027] 清除率是对身体消除药物能力的度量。当由于，例如，对药物的修饰而降低清除率时，半衰期将预期的升高。然而，只有当分布容积没有改变的时候，这种倒数关系才准确。方程式t1/2≈0.693(V/C)给出了终末对数-线性半衰期(t1/2)、清除率(C)和分配容积(V)之间有用的近似关系。清除率不是表明有多少药物正被清除，而是药物将被完全清除乃至消除的生物体液例如血液或血浆的容积。清除率以每单位时间的容积来表达。本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物的清除率值为200ml/h/kg或更小，或180、150、120、100、80、60ml/h/kg或更小，或者50、40或20ml/h/kg或更小(参见实施例4和5)。

[0028] 在本发明中半胱氨酸被掺入到GLP-1化合物的45和46位。该产生的分子在半胱氨酸上发生聚乙二醇化产生保留全部或部分生物学活性的修饰的分子，而比那些未修饰的分子或天然分子具有更长的半衰期。

[0029] 用于本发明的GLP-1化合物可应用液相或固相肽合成技术的标准方法制备。

[0030] 一旦制备并纯化GLP-1化合物，其通过共价连接两个PEG分子至GLP-1化合物使其聚乙二醇化。本领域已有许多种共价缀合PEG至肽的方法(参见综述文献，Roberts，M等，药物投送进展综述(Advanced DrugDelivery Reviews)，54：459-476，2002)。肽羧基末端的聚乙二醇化可以用重组GLP-1肽作为前体通过酶偶联的方法或者本领域已知的替代方法实施。参见例如美国专利4,343,898或International Journal of Peptide&Protein Research，43：121-38，1994。本发明的制备聚乙二醇化GLP-1化合物的一种方法涉及应用PEG-马来酰亚胺将PEG直接结合到肽巯基上。通过添加或插入半胱氨酸残基到肽的上述位置，实现巯基功能性的引入。也可以将巯基功能性引入到肽的侧链上(如含巯基酸的赖氨酸ε-氨基的酰化作用)。本发明的聚乙二醇化方法利用迈克尔加成形成稳定的硫醚接头。该反应是高度特异性的并在有其它官能团存在的温和条件下发生。PEG-马来酰亚胺一直被作为反应聚合物用于制备定义明确的、具有生物活性的PEG-蛋白质缀合物。优选的程序是，使用相对于PEG马来酰亚胺摩尔数过量的含巯基GLP-1化合物以促进反应的完成。该反应优选在pH4.0至9.0之间、室温下反应1至40小时。用传统分离方法很容易的从聚乙二醇化产物中分离未聚乙二醇化的过量含巯基肽。在实施例1和2中列出了GLP-1化合物的聚乙二醇化所需的典型条件。可以用PEG马来酰亚胺或分叉的PEG马来酰亚胺进行半胱氨酸聚乙二醇化。优选的PEG是20kD的线性甲氧基PEG马来酰亚胺。

[0031] 在其典型形式中，PEG是一个具有末端羟基的线性聚合物并有HO-CH2CH2-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH通式，其中n从大约8到4000左右。末端氢原子可被保护性基团例如烷基或芳基取代。PEG优选至少含一个羟基，更优选的是含末端羟基。其为这样的羟基，优选其被活化以便与肽反应。多种形式的PEG对本发明是有用的。本领域中存在的大量PEG衍生物适用于本发明。(参见，如美国专利号5,445,090、5,900,461、5,932,462、6,436,386、6,448,369、6,437,025、6,448,369、6,495,659、6,515,100和 6,514,491 以及Zalipsky，S.Bioconjugate Chem.6：150-165，1995)。本发明中与GLP-1化合物共价结合的PEG分子并非意在限于特定类型。PEG的分子量优选从500到100,000道尔顿，更优选从
20,000到60,000道尔顿以及最优选从20,000到40,000道尔顿。PEG可能是线性的或分枝的。

[0032] 本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物所具有的体外生物学活性至少是天然GLP-1或Val8-GLP-1(7-37)OH活性的0.5％。本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物所具有的体外生物学活性至少是天然GLP-1或Val8-GLP-1(7-37)OH活性的1％。本发明的聚乙二醇化的GLP-1化合物所具有的体外生物学活性至少是天然GLP-1或Val8-GLP-1(7-37)OH活性的3％。这样的生物学活性可以通过如这里(实施例3)所述的体外药效测定或通过其它的本领域已知的GLP-1测定进行确定。当用特定测定法测量时，虽然本发明的某些聚乙二醇化GLP-1化合物的生物学活性可能比天然GLP-1或Val8-GLP-1(7-37)OH更低，但该化合物延长的半衰期和/或降低的清除率值可补偿这种活性降低。

[0033] 可以由普通技术的医生经由任何公知的有效途径施用聚乙二醇化的GLP-1化合物。外周肠胃外给药就是这样的一种方式。肠胃外给药在医学文献中的通常理解是通过无菌注射器或一些其它的医学装置例如输注泵将剂型注射到身体内。外周肠胃外给药途径可包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和腹膜内注射给药途径。本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物可能也适于通过口服、直肠、鼻腔或下呼吸道给药，其为非肠胃外给药途径。在这些非肠胃外给药途径中，优选下呼吸道和口服途径给药。

[0034] 本发明的聚乙二醇化的GLP-1化合物可用于治疗多种疾病和机能紊乱。本发明的聚乙二醇化的GLP-1化合物主要通过作用于受体(被称为“GLP-1受体”)发挥它们的生物学效应。患有能对GLP-1受体刺激或施用GLP-1化合物顺利应答的疾病或机能紊乱的受试者，因此能用本发明的聚乙二醇化GLP-1化合物治疗。这些受试者是所谓“需要使用GLP-1化合物治疗”或“需要GLP-1受体刺激”的对象。包括那些患有非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、中风(参见WO 00/16797)、心肌梗塞(参见WO 98/08531)、肥胖症(参见WO 98/19698)、手术后分解代谢改变(参见美国专利号6,006,753)、机能性消化不良和过敏性肠综合征(参见WO99/64060)的受试者。也包括需要应用GLP-1化合物预防处理的受试者，例如有发展非胰岛素依赖性糖尿病风险的受试者(参见WO 00/07617)。葡萄糖耐量受损或者空腹血糖异常的受试者、体重超过与身高和体格对应的正常体重约25％的受试者、部分胰脏切除的受试者、有一个或更多亲代患有非胰岛素依赖性糖尿病的受试者、已患有妊娠糖尿病的受试者以及已患有急性或慢性胰腺炎有发展非胰岛素依赖性糖尿病风险的受试者。

[0035] 此处所述的聚乙二醇化的GLP-1化合物的有效剂量是，当给需要GLP-1受体刺激的受试者施用后，产生期望的疗效和/或预防效果而不导致难以接受的副作用的剂量。“期望的疗效”包括以下一项或多项：1)与疾病或机能紊乱相关症状的改善；2)延缓与疾病或机能紊乱相关症状的发生；3)与缺乏该治疗的患者相比受试者寿命延长；以及4)与缺乏该治疗的患者相比受试者生活质量提高。例如，聚乙二醇化的GLP-1化合物用于治疗糖尿病的有效剂量是与缺乏治疗相比能更好地控制血糖浓度的药量，从而导致延缓糖尿病综合症例如视网膜病、神经病变或肾脏疾病的发生。聚乙二醇化的GLP-1化合物用于预防糖尿病的有效剂量是与缺乏治疗相比能延缓发生血糖水平升高的剂量，该病要求用抗高血糖药例如磺酰脲、噻唑二酮、二甲双胍、胰岛素和/或双胍化合物治疗。一般地，施用本发明的聚乙二醇化的GLP-1化合物使血浆浓度在大约5皮摩尔/升和大约200皮摩尔/升之间。所确定的Val8-GLP-1(7-37)OH的最佳血浆浓度是在30皮摩尔/升和大约200皮摩尔/升之间。

[0036] 能使患者血糖恢复正常的聚乙二醇化的GLP-1化合物有效剂量依赖于多种因素，其中包括(不限于)患者的性别、体重和年龄、失去调控血糖能力的严重程度、给药途径和生物利用度、聚乙二醇化的GLP-1化合物的药代动力学类型、药效及其配方。本发明的聚乙二醇化的GLP-1化合物通常的剂量范围为成人每天从大约0.01毫克至大约1000毫克。优选的剂量范围是从每天大约0.1毫克至每天大约100毫克，更优选的剂量范围是从每天大约1.0毫克至每天大约10毫克。

[0037] 本发明的聚乙二醇化的GLP-1化合物优选每两周给药一次或每周给药一次。依据所治疗的疾病，聚乙二醇化的GLP-1化合物更频繁的给药(例如每周两到三次)可能是必要的。

[0038] “受试者”是哺乳动物，优选人，但也可能是动物，如伴侣动物(例如狗、猫等等)、农场动物(如奶牛、绵羊、猪、马等等)以及实验动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等等)。

[0039] 本发明用于生产聚乙二醇化的GLP-1化合物的肽可通过使用液相或固相肽合成技术的标准方法制备。

[0040] 本发明通过以下实施例(并非意在限制)予以说明。

[0041] 实施例

[0042] 实施例1、GLP-1相关类似物的聚乙二醇化

[0043] 聚乙二醇化反应在适合硫醚键形成的条件下进行。具体来讲，溶液的pH范围在大约4到9之间，且含巯基肽浓度范围在比甲氧基PEG2-MAL浓度过量1摩尔到10摩尔之间。正常情况下聚乙二醇化反应在室温下进行。然后用反相高压液相层析、离子交换层析分离或大小排阻层析(SEC)将聚乙二醇化GLP-1肽分离。聚乙二醇化的GLP-1类似物用分析RP-HPLC，HPLC-SEC，SDS-PAGE和/或MALDI质谱确定其特性。

[0044] 含巯基的GLP-1肽与聚乙烯乙二醇-马来酰亚胺(PEG-马来酰亚胺)反应，生成通过硫醚键与PEG共价结合的衍生物。例如，GLP-1化合物，其长度为46个氨基酸；7.5mg，1.8μmol溶于2ml的200mM 磷酸盐缓冲液(含有20mM EDTA，pH7.4)中。然后用氩气冲洗该溶液。往溶液中加入40mg甲氧基-PEG-MAL，一种线性或分枝的PEG马来酰亚胺(ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville，Alabama)(PEG对肽的比率为0.55mol∶1mol)。
反应进行2小时。然后，25mg的该聚乙二醇化肽用RP-HPLC纯化，用大小排阻HPLC定性分析并检测其体外活性。

[0045] 实施例2、2×20kDa PEG-马来酰亚胺与GLP类似物的反应

[0046] 用马来酰亚胺活化的20kDa的线性mPEG(NOF公司)将GLP类似物在所引入的半胱氨酸残基上选择性地聚乙二醇化。为了完成该聚乙二醇化反应，将要被聚乙二醇化的肽溶于包含10mM EDTA，pH6.8的100mMNH4Ac缓冲液中，并加入1.25倍摩尔数的超量的20kDa mPEG。在室温下搅拌1-4小时使该反应进行，并且用SP-琼脂糖阳离子交换层析将聚乙二醇化的化合物与游离的PEG以及游离的肽分离。该缀合物用RP-HPLC脱盐，然后冷冻干燥。

[0047] 实施例3、体外活性测定

[0048] 将用于CRE-萤光素酶系统的、稳定表达人GLP-1受体的HEK-293细胞，按照每孔80μl低血清DMEM F12培养基、30,000个细胞接种到96孔板中。接种后当天，将20μl等分试样的待测蛋白质溶于0.5％BSA中，与该细胞混合并孵育5小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线(从该曲线测定EC50值)之前，一般为待测GLP-1化合物制备包含从0.001nM到10nM的10种稀释液，以及为Val8-GLP-1(7-37)OH标准品准备0.0003nM和3nM的溶液。
在孵育之后，将100μl萤光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合2分钟。将平板放入Tri-lux发光计中并计算萤光素酶表达导致的光输出。通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物(其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为Cys)的平均EC50值是
0.22±0.03nM。通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物(其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为CyS-NH2)的平均EC50值是0.36±0.04nM。

[0049] 实施例4、GLP-1衍生肽的药物代谢动力学分析

[0050] 通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为Cys-NH2，通过静脉注射(IV)或皮下注射(SC)途径按照0.1mg/kg的剂量给雄性SD大鼠用药。在给药后0至192小时之间的不同时间点，将该动物(每组3只大鼠)放血。收集每个样本的血浆并用N-端特异的放射免疫测定法分析。用无房室法(WinNonlin Pro)计算药物动力学参数。通过静脉注射施用，聚乙二醇化的GLP-1类似物的消除半衰期是大约1.2天；而通过皮下注射，聚乙二醇化的GLP-1类似物的消除半衰期是大约1.1天。没有发现与静脉注射或皮下注射0.1mg/kg药物相关的临床不良反应。观察到该化合物消除半衰期延长、清除率减慢和大约30％的皮下生物利用度。代表性的数据如以下表1所示。

[0051] 表1-

[0052] 通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物的平均值(±SD)药物代谢动力学参数值(其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为Cys-NH2；在向雄性SD大鼠静脉注射或皮下注射0.1mg/kg之后)。

[0053]Cmaxa Tmaxb AUC0-lastc t1/2d CL/Fe Vss/Ff
给药途径 (ng/mL) (h) (ng*h/mL) (h) (mL/h/kg) (mL/kg)
2020 0.08 52292 25.8 1.9 54
IV
(235) (0.00) (4546) (2.2) (0.2) (2.5)
SC 191 24.0 15423 28.3 6.5 268
(SD) (31) (0.0) (2821) (0.8) (1.2) (56)a

[0054] 最大血浆浓度b

[0055] 观测到的最大血浆浓度的时间c

[0056] 从0到最后时间点的血浆浓度-时间曲线下的面积d

[0057] 消除半衰期e

[0058] 作为生物利用度函数的总体清除率f

[0059] 作为生物利用度函数的稳态分配容积

[0060] 当按照10μg/kg的剂量给Fischer344大鼠类似地静脉注射Val8-GLP(7-37)OH，得到了如下所示显著不同的清除率和消除半衰期。

[0061] 清除率：1449ml/hr/kg

[0062] t1/2(hr)：0.05

[0063] 实施例5、GLP-1衍生肽的药物代谢动力学分析

[0064] 通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为CyS-NH2)，通过皮下注射(SC)途径按照0.01mg/kg的剂量给雄性短尾猴用药。在给药后0至168小时之间的不同时间点，将该动物放血。收集每个样本的血浆并用N-端特异的放射免疫测定法分析。用无房室法(WinNonlin Pro)计算药物动力学参数。代表性的数据如以下表2所示。

[0065] 表2-

[0066] 通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物的平均值(±SD)药物代谢动力学参数值(其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为Cys-NH2；在向雄性短尾猴皮下注射0.01mg/kg以后)。

[0067]Cmaxa Tmaxb AUC0-lastc t1/2d CL/Fe Vss/Ff动物# (ng/mL) (hr) (ng*hr/mL) (h) (mL/hr/kg) (mL/kg)平均值 69.49 48 7464.78 75.69 1.06 117.15
SD 17.07 0 1612.03 11.67 0.26 44.89

[0068] 缩写：SD＝标准差

[0069] a最大血浆浓度

[0070] b观测到的最大血浆浓度的时间

[0071] c从0到最后时间点的血浆浓度-时间曲线下的面积

[0072] d消除半衰期

[0073] e作为生物利用度函数的总体清除率

[0074] f作为生物利用度函数的稳态分配容积

[0075] 实施例6、GLP-1衍生肽的药效学分析

[0076] 通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物，其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为Cys-NH2)，通过皮下注射(SC)途径按照0.01mg/kg的剂量给雄性短尾猴用药。在皮下注射溶剂对照(磷酸盐缓冲液)后立即分步葡萄糖液输注以及在皮下注射0.01mg/kg聚乙二醇化GLP-1类似物后1、5和7天分步葡萄糖液输注。分步葡萄糖液输注步骤是在禁食16小时后在给与镇静剂的猴子上进行。在开始葡萄糖输注10分钟之前和马上开始前抽取血液样本定义基线。然后，以10mg/kg/min的速率分步输注葡萄糖(20％右旋糖)20分钟，接下来以25mg/kg/min的速率再输注20分钟。在输注期间以10分钟为间隔抽取血液样本。用免疫测定法确定胰岛素水平。在单次皮下注射0.01mg/kg聚乙二醇化的GLP-1类似物后至少7天证明其具有促胰岛素活性(相对于安慰剂；p＜0.0001)。有代表性的数据显示如下表3所示。

[0077] 表3-

[0078] 通式I的聚乙二醇化的GLP-1化合物的平均值(±SD)药效学参数值(其中Xaa8为Val、Xaa22为Glu、Xaa33为Ile以及Xaa46为Cys-NH2；在向雄性短尾猴皮下注射0.01mg/kg以后)

[0079] 胰岛素曲线下面积

[0080] 分组 AUClast(pM*min)

[0081] 溶剂平均值＝14983；SD＝5789；SE＝2363

[0082] 第一天平均值＝30862；SD＝10770；SE＝4397

[0083] 第五天平均值＝27203；SD＝6507；SE＝2657

[0084] 第七天平均值＝28542；SD＝7685；SE＝3137

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GLP-1聚乙二醇化的化合物

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