由于其纳米尺度和分子识别能力，作为直接组装纳米级材料载体的生 物系统已获得很大关注。本研究的最大挑战之一一直是成功接合生物系统 和纳米级材料如碳纳米管。为此目的，已发展了使用能够在水中分散单壁 碳纳米管的短DNA寡聚体的方法。然而，对特异性重复碱基序列的需要 限制了该方法的使用。因此，需要没有特异性重复碱基序列限制的基于 DNA分散单壁碳纳米管的方法。
发明概述
首先，本发明涉及一种方法，其包括：将单链DNA片段附着到单壁 碳纳米管上形成单链DNA片段/单壁碳纳米管络合物，其中每条单链DNA 片段长度大于2000碱基。
其次，本发明涉及一种方法，其包括：在第一引物和第二引物存在下 通过聚合酶链式反应复制双链DNA片段，所述第二引物在该第二引物一 个末端连接有端巯基，每条复制的双链DNA片段具有第一和第二互补链， 所述第二链在该第二链一个末端具有巯基；将金属纳米颗粒附着到复制的 双链DNA片段的巯基上；将复制的双链DNA片段断裂成为互补的第一和 第二单链DNA片段，第二单链DNA片段包括所述巯基和金属纳米颗粒； 并将第一单链DNA片段从第二单链DNA片段中取出。
再次，本发明涉及一种结构，其包括：单壁碳纳米管和螺旋缠绕于所 述单壁碳纳米管长度大于2000碱基的单链DNA片段。
附图简述
本发明的特征在所附权利要求中阐明。不过，当结合附图通过参考对 说明性实施方案的下列详细描述阅读本发明时，发明本身将会得到最佳理 解，其中：
图1是根据本发明的实施方案制备单链DNA和单壁CNT/单链DNA 络合物的示意图；
图2A是巯基化λDNA聚合酶链式反应扩增操作在离心前的凝胶电泳 分析照相；
图2B是金/双链DNA制备操作的凝胶电泳分析照相；
图2C是金/双链DNA制备操作在离心后的凝胶电泳分析照相；
图3A是与单壁碳纳米管混合的单链DNA-1seq和与SWNT混合的互 补单链DNA-2seq的照相比较；
图3B是结合于云母的单壁纳米管/单链DNA络合物的低放大倍率原 子力显微镜扫描照相；而
图3C、3D和3E是结合于云母的单壁纳米管/单链DNA络合物的高 放大倍率原子力显微镜扫描照相。
发明详述
碳纳米管(CNT)是由sp2杂化的碳原子以六边形和五边形排列组成 的封闭笼状分子。碳纳米管可以是中空管状结构的单壁纳米管(SWNT) 或由系列同心圆柱体组装的多壁纳米管(MWNT)。为本发明的目的计， 术语碳纳米管(CNT)和单壁纳米管(SWNT)被定义为单壁碳纳米管。 本发明的SWNT中可以掺杂除碳之外的其它元素，其实例包括但不限于： 磷、砷、硼和金属。
SWNT可以通过本技术领域已知的多种方法中的任何方法制备并且 是商业上可获得的。例如，使用高压一氧化碳方法(HiPCo)制备SWNT (P.Nikolaev等人Chem Phys.Lett.313，91-97(1999))。
为了使用DNA作为SWNT的分散体和图案载体(patterning vehicle) 以用于微电子，理想的线性延伸的DNA长度应该在数微米级。DNA长度 还可以表达为连接于DNA分子磷酸盐骨架的碱基对(bp)数。本发明所 用的DNA为基因组DNA。尽管本发明的实验部分使用的是大肠杆菌噬菌 体λDNA，但本发明并不局限于使用λDNA实施，且任何基因组DNA都 可以被使用。之所以选择λDNA，是因为其完整的48502碱基对序列已知， 且其限制性酶图谱已经充分表征。λDNA源自大肠杆菌(E.coli)并且是 商业上可获得的。
图1是根据本发明的实施方案制备单链DNA和单壁CNT/单链DNA 络合物的示意图。在图1中，第一步是使用两个碱基对长度短的引物进行 聚合酶链式反应(PCR)扩增碱基对长度长的双链DNA(dsDNA)(模板 dsDNA)。引物之一是被修饰的，在其5’末端含有巯基(-SH)。另一个引 物是未经修饰的。dsDNA可使用限制性酶通过消化更长的dsDNA来制备。 扩增的dsDNA片段(现为巯基化dsDNA)是由原始dsDNA片段经过修 饰获得的，在该dsDNA片段一条链的5’末端有巯基。
在图1中，第二步是将步骤1中制备的巯基化dsDNA与膦封端的Au 纳米颗粒(直径约5到25nm)以巯基化dsDNA相对于Au为约0.5到约 1的摩尔比混合。该步骤使Au纳米颗粒结合至巯基化dsDNA的巯基上， 产生Au/巯基化dsDNA络合物(Au/dsDNA)。对产生的混合物离心，以 从未结合的dsDNA中分离Au/dsDNA。
在图1中，第三步是将An/dsDNA变性成为Au/巯基ssDNA络合物 (Au/ssDNA)和游离的单链DNA(ssDNA-1seq)。在一个实例中，通过 加热随之迅速冷却Au/dsDNA实现变性。
在图1中，第四步是离心Au/ssDNA和ssDNA-1seq混合物以在沉淀 中收集Au/ssDNA，将ssDNA-1seq留在上清中。随后倾出上清液并冻干。 随后可混入水将Au/ssDNA重构至任何期望的浓度。重构的ssDNA-1seq 溶液或备选地上清液本身可以如下文所述与SWNT混合。ssDNA-1seq不 能通过互补碱基配对自杂交。dsDNA的长度和ssDNA-1seq的长度是相同 的。在一个实例中，ssDNA-1seq的延伸长度约为1.4微米。在另一实例中， ssDNA-1seq长度大于2000bp。在又一实例中，ssDNA-1seq长度在约3000 bp和约50000bp之间。在另一实例中，ssDNA-1seq的线性延伸长度大于 1微米。
为了形成单链DNA片段/单壁碳纳米管络合物(ssDNA/SWNT)，将 ssDNA-1seq溶液与SWNT混合并为防过热在低温下(例如，约4℃)进 行超声处理(由声波提供能量)，络合的SWNT借助于ssDNA-1seq保留 在溶液中，而未络合的SWNT将不保持悬浮并且可经由离心除去。在一个 实例中，约90％的SWNT是络合的。
原子力显微镜检(AFM)显示ssDNA/SWNT络合物含有螺旋缠绕 SWNT的ssDNA链。在一个实例中，ssDNA缠绕的SWNT直径在约0.5 纳米和约2.0纳米之间，而长度在约0.7微米和约2.0微米之间。原子力显 微镜检(AFM)还显示在任何特定的SWNT上ssDNA缠绕的螺距是恒定 的，例如约60nm，但是螺距可能因不同的SWNT而改变。在一个实例中， 缠绕于任何特定的SWNT的ssDNA的螺距是在约12nm和约80nm之间 的常数。
申请人已发现当使用如上所述方法用dsDNA片段产生ssDNA-1seq并 用同样的dsDNA片段产生具有互补ssDNA链的ssDNA-2seq(通过常规变 性方法)时，ssDNA-2seq将不络合SWNT。见图3A和如下描述。另外， 所用dsDNA碱基的随机序列(随机是因为其是基因组DNA)与现有理论 恰好相反，该现有理论认为络合SWNT需要有非随机碱基序列的ssDNA、 SWNT的ssDNA络合涉及具体CNT结构的一致性、SWNT的ssDNA络 合仅与长度小于2000bp的ssDNA发生，或环绕CNT的紧密螺旋的形成 有赖于ssDNA的碱基对序列。
图3A是与SWNT混合的ssDNA-1seq和与SWNT混合的互补 ssDNA-2seq的照相比较。标记ssDNA-seq2的试管是澄清的表明没有 ssDNA-seq2和SWNT的反应，而标记ssDNA-seq1的试管是暗色的表明 ssDNA-seq1与SWNT的结合。
高密度阵列的ssDNA/SWNT可以通过在氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)封端的硅基质上风干ssDNA/SWNT溶液的微滴产生，其可用 于微电子或纳米电子应用。
实验
材料
(1)λDNA购自Invitrogen，Carlsbad，CA。
(2)NdeI酶购自New England Biolabs，Ipswich，MA。
(3)全部DNA引物购自Integrated DNA Technologies，Coralville，Iowa。
(4)HiPCo碳纳米管购自Carbon Nanotechnologies。
(5)(双)(对-磺基苯基)苯基膦二水合物二钾盐购自Strem Chemical， Newburyport，MA。
(6)柠檬酸钠封端的Au纳米颗粒购自Ted Pella，Redding，CA。
(7)膦封端的Au纳米颗粒使用“配体交换”法制备，混合30mg(双)(对- 磺基苯基)苯基膦二水合物二钾盐和100ml柠檬酸钠封端的Au纳米颗粒的 悬浮液，并搅拌过夜。向悬浮液中加入氯化钠来沉淀并收集膦封端的Au 纳米颗粒。随后在去离子水中重悬膦封端的Au纳米颗粒。
5’巯基化 dsDNA的制备
用限制性酶NdeI消化λDNA并收集3796bp的λDNA片段来制备模 板dsDNA。向含有1μg/100μl 3796bpλDNA片段的PCR反应物中加入 100nM第一(巯基化)引物和100nM第二(非巯基化)引物，第一引物 具有如下序列： 5’-SH-TGCAGATACTCACCTGCATCCTGAACCCATTGACCTCCAAC CCCGTAATA-3’；而第二引物具有如下序列： 5’-TGGTGTTGTGTGTGAGTTCGACTGGAATGATGGAAATGGTCA GGAAGGAT-3’。递降PCR以95℃30秒、60℃45秒和72℃5分钟进行 40个循环产生长度为3796bp的巯基化λDNA。
图2A是刚才所述巯基化λDNA PCR扩增操作的凝胶电泳照相。在图 2A中，标记“MW”的栏包含分子量标志物；标记“λDNA”的栏仅包含起始 λDNA；标记“对照”的栏包含仅使用引物1和引物2的PCR产物，而标记 “PCR”的栏包含引物和λDNA PCR反应的结果。
Au/dsDNA络合物的制备
以巯基化dsDNA比Au纳米颗粒从0.5到1的几种不同摩尔比混合上 述制备的巯基化λdsDNA与膦封端的15nm金颗粒。通常，在1小时后离 心混合物，在上清液中收集未结合的巯基化dsDNA，并在沉淀中收集Au/ 巯基化dsDNA络合物(Au/dsDNA)。
图2B是刚才所述Au/dsDNA制备操作在离心前的凝胶电泳分析照相。 在图2B中，在白光下(左边)可见Au纳米颗粒，而在UV光下(右边) 可见溴乙啶(EtBr)染色的Au/dsDNA。在相同的距离处检测到Au带和 Au/dsDNA带(圈出的)，表明Au纳米颗粒与巯基化dsDNA的结合。
图2C是刚才所述Au/dsDNA制备操作在离心后的凝胶电泳分析照相。 在图2C中，在白光下观察左边泳道1到5，并在UV光下观察右边泳道1 到5。泳道1包含分子量标记物。泳道2包含上述制备的5’巯基化dsDNA。 泳道3仅包含15nm金纳米颗粒。泳道4包含含有Au/ssDNA的重悬的沉 淀。泳道5包含离心后获得的上清液。如在泳道4和5中所观察到的，尽 管有些巯基化dsDNA确实结合金纳米颗粒，一小部分dsDNA不结合金纳 米颗粒。
ssDNA的制备
Au/dsDNA的分散体(来自“Au/dsDNA的制备”中的上述沉淀)在 98℃热变性并在冰上淬火以产生Au/ssDNA络合物(Au/ssDNA)和未结合 的ssDNA的混合物。离心混合物并回收含有未结合ssDNA的上清液。
碳纳米管的ssDNA分散体
将少于1mg的HiPCo纳米管加入10μg/ml未结合的ssDNA溶液中， 并在冰水浴中超声处理10到20分钟。以400到1000rpm速度离心后除 去任何不溶物质。含有50mM MgCl2的ssDNA或ssDNA/SWNT溶液的 10μl微滴在新鲜切割的云母表面沉积、风干、水洗并在成像前氩气干燥。 不添加MgCl2的10μl微滴在氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理的Si 晶片上沉积和干燥。APTES在购自Yield Engineering Systems，San Jose， CA的硅烷化烤箱中于150℃沉积30分钟。全部成像以轻敲模式(tapping mode)在空气中完成。
图3B是制备的结合于云母的ssDNA/SWNT的低放大倍率原子力显微 镜扫描的照相。在图3B中，右边的照片是云母上结合于SWCT的ssDNA 的大面积AFM扫描高度图像。左边的照片是右边大面积扫描图的特写。
图3C、3D和3E是结合于云母的ssDNA/SWNT络合物的高放大倍率 原子力显微镜扫描的照相。在图3C中，右边是ssDNA/SWNT的高放大倍 率图像。左边是特定ssDNA/SWNT的AFM高度图像，而其上为由箭头所 示的特定ssDNA/SWNT的截面分析。截面分析给出ssDNA缠绕特定 ssDNA/SWNT的螺距约为60nm。应该注意到在右图中心和左边放大图像 中显示的特定结构中螺距的差异。图3D中显示单个ssDNA/SWNT，且清 晰显示出螺旋缠绕。图3E中显示了若干ssDNA/SWNT。再次清晰显示出 螺旋缠绕。
因此，本发明提供了没有特异性重复碱基序列限制的基于DNA分散 单壁碳纳米管的方法。
以上给出本发明实施方案的描述以理解本发明。应该理解的是本发明 不限于此处描述的特定实施方案，而是正如对于本领域的技术人员将会显 而易见的那样，能够进行多种修饰、重排和取代而不背离本发明的范围。 因此，下列权利要求旨在覆盖落于本发明的实质精神和范围之内的全部这 样的修饰和改变。