技术领域
[0001] 本
发明属于固定化酶技术与等离子体
表面处理技术领域，具体涉及一种等离子体处理多壁
碳纳米管固定化酶的方法。
背景技术
[0002] 固定化酶是利用物理或化学方法处理
水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍
生物。固定化酶技术已经成为现代生物技术及其工业化环节中的一项核心关键技术。约12种固定化酶，包括
淀粉酶、转化酶、、蛋白酶、腈
水解酶、
氨基酰化酶、多种脂肪酶、青霉素G酰化酶等，已经被使用在许多工业生产的领域中，是不可或缺的催化剂。酶固定化的基本方法可以粗略分为5种：
吸附、共价键和、包埋、微囊化和交联，而这些方法通过组合又衍生出多达数百种的方法。为了保证多种生物固定化和生物分离，已经通过很多方式设计出了不同物理特性和化学特性的载体。这些酶的固定化技术和各种类别的载体以及合理可行的固定化方案，保证了来源广泛的酶都可以得到有效的固定化，使其更好地应用于生物化工、精细化学品工业、食品工业、医药工业等领域。这些应用的固定化酶一方面解决了以前通过化学手段无法解决或不易解决的问题，另一方面可以实现工艺的连续性、更好的控制催化过程和降低运行成本。
[0003] 碳纳米管是一种具有特殊结构（径向尺寸属于纳米量级，轴向尺寸属于微米量级，各
单层管的顶端有五边形或者七边形参与封闭）的一维
纳米材料。其重量轻，六边形结构连接完美，展现出了许多异常高效的
力学、化学以及电学性能。它是由碳六元环构成的类
石墨平面卷曲而成的
纳米级中空管。碳纳米管中的碳
原子以sp2杂化为主，同时六边形网格又存在一定程度的弯曲，形成空间拓扑结构，形成了一定的sp3杂化键，即形成的化学键会同时兼具sp2和sp3混合杂化状态，导致这些P轨道彼此交叠在碳纳米管
片层外形成高度离域化的大π键，碳纳米管外表面的大π键是碳纳米管与其他具有共轭性能的大分子以非共价键符合的化学
基础。因此，利用碳纳米管进行酶固定化时，除了范德华力的作用外，碳纳米管外表面的大π键会与酶蛋白中的芳香族氨基酸产生共轭，增强了酶在碳纳米管上的
稳定性。
[0004]
专利文件CN102373192A（201110024154.0）公开了纳米材料固载蛋白酶分子的方法，该方法以碳纳米管作为固定蛋白酶分子的载体，先使其分散成均一的溶液，再使用浓
硝酸与浓
硫酸的混酸对其进行
酸化作用，最后利用NHS和EDC在碳纳米管管壁接上功能化的连接胺基官能团，最后与酶的胺基反应，将酶固定化在管壁。
[0005] 专利文件CN1912200A（200610052954.2）公开了碳纳米管的
纳米纤维及其制备和
氧化还原酶固定化的方法，该方法将
多壁碳纳米管（或
单壁碳纳米管）首先超声分散于
溶剂中，再将丙烯腈/
丙烯酸共聚物溶解于其中，通过
静电纺丝制备含有碳纳米管、表面带有
反应性基团羧基的复合纳米纤维，通过碳二亚胺
盐酸盐/琥珀酰亚胺活化，将氧化还原酶固定到纤维表面上。
[0006] 上述专利利用碳纳米管或含有碳纳米管的复合纳米材料，都需要进行一定的修饰才能进行酶的固定化，虽然可回收重复利用、并且提高了酶的利用率与存储稳定性，但是所使用的多壁碳纳米管的表面积相对较小，而单壁碳纳米管的价格又较昂贵，酶固定化所采取的方法对酶的催化中心有所损伤使其酶活力有所降低，固定化过程繁琐且成本较高。
发明内容
[0007] 为了解决碳纳米管固定化酶
现有技术存在的问题，本发明提供一种等离子体处理多壁碳纳米管固定化酶的方法，采用价格便宜的多壁碳纳米管为载体，降低成本，并拓宽了固定化酶的应用领域。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 一种等离子体处理多壁碳纳米管固定化酶的方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤1，等离子体处理多壁碳纳米管
[0011] 将0.1～0.5 g的多壁碳纳米管粉末放置于低温
真空等离子体设备载物台上，调节等离子体
电极间间距为2～4 cm，再调节
电流的脉冲宽度使功率达到22～84 W，在真空条件下处理1～10 min；
[0012] 步骤2，多壁碳纳米管与酶液
物理吸附反应
[0013] 将处理后的多壁碳纳米管粉末溶于
磷酸缓冲液中，在
超声波清洗器中超声10～30 min，然后加入游离酶，在20～40℃的恒温水浴中固定30～240 min，得
混合液；
[0014] 步骤3，将混合液抽滤并用磷酸缓冲液洗涤，洗去未吸附的游离酶，室温条件下干燥过夜，得到多壁碳纳米管固定化酶。
[0015] 作为优选的是，步骤1，所述的多壁碳纳米管的层数为2～30层。
[0016] 作为优选的是，步骤2，所述的磷酸缓冲液pH值为6～8。
[0017] 作为优选的是，步骤2，所述的游离酶为脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶或
葡萄糖氧化酶中的任一种。
[0018] 作为优选的是，所述的脂肪酶为假丝
酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、皱落假丝酵母脂肪酶、Lipozyme CALB L 脂肪酶、Palatase 20000 L脂肪酶或Lipozyme TL100 L脂肪酶中的任一种。
[0019] 作为优选的是，步骤2中水浴时搅拌的转速为50～400 rpm。
[0020] 作为优选的是，步骤3中磷酸缓冲液的pH值为6～8。
[0021] 作为优选的是，步骤1，真空度为-99.99～-98.90 KPa。
[0022] 有益效果
[0023] 1.本发明所述的方法使用的载体多壁碳纳米管价格便宜、容易获取。
[0024] 2. 本发明所述的方法使用等离子体处理载体，清除除去多壁纳米管表面的杂质，提高了载体的
比表面积与表面自由能。
[0025] 3. 本发明所述的方法过程简便快捷，运行成本较低，且不产生任何有害物质、废弃物。
[0026] 4. 本发明制备的固定化酶粒径较小，所得固定化脂肪酶的长度为10～30μm，直径为20～40nm，可进一步用于各类酶反应器中进行酶催化反应。
附图说明
[0027] 图1 是经等离子体处理后多壁碳纳米管TEM图；
[0028] 图2 是
实施例2制备的多壁碳纳米管固定化脂肪酶TEM图，固定化脂肪酶的长度为10～30μm，直径为20～40nm。
具体实施方式
[0029] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0030] 实施例1
[0031] 等离子体处理多壁碳纳米管固定猪胰脂肪酶
[0032] 步骤1，将0.1 g壁层为20的多壁碳纳米管置于低温真空等离子体设备中，调节电流的脉冲宽度来将功率,设定在74.8 W，调节等离子体电极间间距为4 cm，在真空度为-99.99KPa下处理10 min。
[0033] 步骤2，将处理完的多壁碳纳米管转移到50 ml锥形瓶中，并加入50 ml pH值为7.0的磷酸缓冲液，超声10 min。称取0.15 g的猪胰脂肪酶加入锥形瓶，放入恒温磁力加热搅拌器中，设定
温度为30℃，转速200 rpm，固定1 h，得混合液；
[0034] 步骤3，将混合液抽滤并用大量磷酸缓冲液洗涤，洗去未吸附的游离酶，室温条件下干燥过夜，得到多壁碳纳米管固定化脂肪酶。
[0035] 采用滴定法测量酶活，在100 ml的锥形瓶中加入50 ml的去离子水、2 g三乙酸甘油脂和10 ml的pH值为7.0的磷酸缓冲液，磁力搅拌器强力搅拌10 min使其成为乳浊液。通过pH仪对乳浊液的pH值进行记录，当乳浊液的pH值稳定后，记录为初始pH值。加入0.1 g的多壁碳纳米管固定化脂肪酶，
环境温度为40℃。平稳搅拌反应30 min后立即加入4.5 ml的丙
酮终止反应。测定溶液pH值记录为终了值，然后用0.02 mol/L的氢氧化钠溶液缓慢将溶液终了值滴定回归pH初始值，记录消耗的氢氧化钠量。酶活力单位1U定义为在环境温度为40℃时，每分钟催化三乙酸甘油脂释放1 µmol乙酸所需要的酶量。并且利用Bradford方法测定固定前后酶蛋白溶液的
蛋白质浓度，用蛋白质浓度之差来计算酶蛋白的负载量。
[0036] 多壁碳纳米管经等离子体处理后，材料表面被
腐蚀，变得粗糙，比表面积有所提高，为游离酶提供了更大的固定化区域。经测定以等离子体处理后的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是117 U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.13g，比未用等离子体处理载体固定化酶的酶活提高了33%，酶蛋白负载量提高了30%。
[0037] 实施例2
[0038] 等离子体处理多壁碳纳米管固定Lipozyme CALB L 脂肪酶
[0039] 步骤1，将0.15 g的多壁碳纳米管置于低温真空等离子体设备中，调节电流的脉冲宽度来将功率设定在74.8 W，调节等离子体两电极之间的距离，为4 cm，在真空度为-99.00KPa下处理4 min。
[0040] 步骤2，将处理完的多壁碳纳米管放入50 ml锥形瓶中，加入50 ml pH值为7.0的磷酸缓冲液，超声10 min。将3 ml的Lipozyme CALB L 脂肪酶加入锥形瓶，放入恒温磁力加热搅拌器中，设定温度为30℃，转速250 rpm，固定40 min后，得混合液；
[0041] 步骤3，将混合液抽滤并用大量磷酸缓冲液洗涤，洗去未吸附的游离酶，室温条件下干燥过夜，得到多壁碳纳米管固定化脂肪酶。
[0042] 酶活测定方法与酶蛋白负载量测定方法同实施例1。经测定以等离子体处理后的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是580 U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.16g，比未用等离子体处理载体固定化酶的酶活提高了22%，酶蛋白负载量提高了21%。
[0043] 实施例3
[0044] 等离子体处理多壁碳纳米管固定Lipozyme TL100 L脂肪酶
[0045] 如实施例2所述，所不同的是采用Lipozyme TL100 L脂肪酶酶液作为游离酶进行固定化。经测定以等离子体处理后的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是146 U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.06g，比未用等离子体处理载体固定化酶的酶活提高了19%，酶蛋白负载量提高了17%。
[0046] 实施例4
[0047] 等离子体处理多壁碳纳米管固定猪胰脂肪酶
[0048] 步骤1，将0.1 g壁层为2的多壁碳纳米管置于低温真空等离子体设备中，调节电流的脉冲宽度来将功率,设定在74.8 W，调节等离子体电极间间距为4 cm，在真空度为-99.00KPa下处理10 min。
[0049] 步骤2，将处理完的多壁碳纳米管转移到50 ml锥形瓶中，并加入50 ml pH值为7.0的磷酸缓冲液，超声10 min。称取0.15 g的猪胰脂肪酶加入锥形瓶，放入恒温磁力加热搅拌器中，设定温度为30℃，转速50 rpm，固定1 h，得混合液；
[0050] 步骤3，将混合液抽滤并用大量磷酸缓冲液洗涤，洗去未吸附的游离酶，室温条件下干燥过夜，得到多壁碳纳米管固定化脂肪酶。
[0051] 酶活测定方法与酶蛋白负载量测定方法同实施例1。经测定以等离子体处理后的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是320 U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.28g，比未用等离子体处理载体固定化酶的酶活提高了15%，酶蛋白负载量提高了18%。
[0052] 实施例5
[0053] 等离子体处理多壁碳纳米管固定猪胰脂肪酶
[0054] 步骤1，将0.1 g壁层为30的多壁碳纳米管置于低温真空等离子体设备中，调节电流的脉冲宽度来将功率,设定在74.8 W，调节等离子体电极间间距为4 cm，在真空度为-98.90KPa下处理10 min。
[0055] 步骤2，将处理完的多壁碳纳米管转移到50 ml锥形瓶中，并加入50 ml pH值为7.0的磷酸缓冲液，超声10 min。称取0.15 g的猪胰脂肪酶加入锥形瓶，放入恒温磁力加热搅拌器中，设定温度为30℃，转速400 rpm，固定1 h，得混合液；
[0056] 步骤3，将混合液抽滤并用大量磷酸缓冲液洗涤，洗去未吸附的游离酶，室温条件下干燥过夜，得到多壁碳纳米管固定化脂肪酶。
[0057] 酶活测定方法与酶蛋白负载量测定方法同实施例1。经测定以等离子体处理后的多壁碳纳米管为载体的固定化酶的酶活是260 U/g，每克多壁碳纳米管固定化脂肪酶酶蛋白负载量是0.23g，比未用等离子体处理载体固定化酶的酶活提高了20%，酶蛋白负载量提高了19%。
[0058] 通过实施例1-5可以看出本发明制备的固定化酶的酶活高，酶蛋白负载量大，等离子体处理时的真空度和水浴加热的搅拌速度对固定化酶的性能都有一定的影响，最优真空度为-99.99KPa，转速为200rpm。
