志贺氏菌是随着人类进化而发展起来的致病菌，能侵袭结肠膜上皮细胞， 导致自限性化脓性感染病灶，引起人类的细菌性痢疾。人类对志贺氏菌有较高 的敏感性，只需要少于十个菌就可以引起人的感染，儿童和成人易感染，特 别是儿童，易引起急性中毒性痢疾，而志贺氏菌的O-抗原是志贺氏菌引起疾 病的主要原因之一。    
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复 的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷 二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成 寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚 合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子 [Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责 O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇 [Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和 沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001) “Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection and Immunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含 有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因。其中 糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基 因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖 单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转 移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只 存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不 同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单 糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着， 所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又 具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其 O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应 自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一 的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不 足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、 灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检 测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏 菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门 氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”， J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血 清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因 的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年， Paton，A.W et.al用针对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核 苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producing Escherichiacoli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]， 但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定 E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R. 认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb) cluster of Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O- 抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度 特异的。
志贺氏菌有46种血清型，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，二者亲缘关 系非常近，并且有12种O-抗原是大肠杆菌和志贺氏菌共有的，其中鲍氏志贺 氏菌1型和大肠杆菌O149就拥有相同的O-抗原[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983) “Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]，传统的血清型 方法不能将它们区分。

本发明的目的是提供一种对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原 特异的核苷酸。它是鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于 糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的全长核 苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的基 因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy 基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf9基因； 糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlG GumL。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于鲍氏志贺氏菌1型 的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf8、orf9基因；源于编码转 运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因 即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长 度在10-20nt；它们对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原是特异的； 尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的 O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸 对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反 应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通 过这些方法来检测和鉴定鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原及检测 和鉴定鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149。
本发明的还一目的是提供了分离鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的全 序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列， 也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸， 其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长10005个碱基； 或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸 功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸，其 特征在于，其是由10个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸，其 特征在于，所述的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功 能的基因；聚合酶基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移 酶基因，包括orf8、orf9基因；其中，所述的wzx基因是SEQ ID NO：1中的 4570至5754碱基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO：1中的6605至7669碱基 的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO：1中的7666至8487碱基的核苷酸；orf9 基因是SEQ ID NO：1中的8529至9611碱基的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸，其 特征在于，其是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf8、orf9 基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸，其 特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5051至 5069碱基的核苷酸和5724至5742碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4654至 4672碱基的核苷酸和5276至5294碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5164至 5172碱基的核苷酸和5535至5553碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸 对是：SEQ ID NO：1中的6607至6625碱基的核苷酸和7545至7563碱基的核 苷酸；SEQ ID NO：1中的6667至6685碱基的核苷酸和7424至7441碱基的核 苷酸；SEQ ID NO：1中的6755至6773碱基的核苷酸和7235至7253碱基的核 苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7800至7818碱基 的核苷酸和8400至8417碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7676至7694碱基 的核苷酸和8280至8298碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的7896至8014碱基 的核苷酸和8293至8311碱基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的8697至8715碱基的核苷酸和9307至9325碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9002至9020碱基的核苷酸和9483至9502碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8965至8983碱基的核苷酸和9425至9443碱基的核苷酸。
前述的对志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸在检测表 达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸的重 组分子，且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O- 抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸的 应用，其特征在于，其作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、 或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸的分 离方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心 收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37 ℃温育20分，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的 RNase，65℃ 30分。加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶ 氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以 除去残余的酚。上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用 70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂 糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌1型中的O-抗原基因簇：鲍氏志贺氏菌1 型的O-抗原基因簇通过Long PCR扩增。首先根据经常发现于O-抗原基因簇 启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预 变性2分；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分，这样进行 30个循环。最后，在68℃继续延伸7分，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega 公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法 构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽 提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA， 并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单 位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加 入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应 20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽 提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16 ℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA 连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连 接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用 BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5a细 胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad 公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫 秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有 氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得 到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培 养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入 片段的大小，得到的白色克隆群构成了鲍氏志贺氏1型的O-抗原基因簇文 库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个 克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片 段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的 序列设计引物，该两对引物，如下所示：5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和 3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及
5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’。再从鲍氏志 贺氏菌1型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基 因簇的所有序列；
(7)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4 软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的 核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对 鲍氏志贺氏菌1型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生 文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌 1型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发 现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比 较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger 中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列 间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的结构；
(8)特异基因的筛选：针对鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中的wzx、 wzy、orf8、orf9基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物 分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠 杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O149 中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数 组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小 不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf8、orf9、基因对鲍氏志贺氏菌8型的 O-抗原都是高度特异的。
也就是本发明的第一个方面，提供了鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇 的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长11005个碱基； 或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸 功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了鲍氏志贺氏菌1型 的O-抗原基因簇的结构(在表3中列出)，它总共由10个基因组成，都位于 galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中的基 因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy 基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf8、orf9基因； 细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC基因， 它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。 本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成 路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见 的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移 酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O- 抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中 的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因 和糖基转移酶基因，包括orf8、orf9基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的 任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1 中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为 引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。 这些引物只在以鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149为模板进行的PCR扩增中 得到预期大小的产物，而在以表2所列的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌为 模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核 苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，虽然在有 些菌中得到了PCR产物带，但其大小不符合预期大小，这是由于引物结合到 基因组的别的位置造成，这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。 所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌1型和大肠 杆菌O149及它们的O-抗原是高度特异的。
本发明提供的对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核 苷酸的分离方法包括下述步骤：(1)基因组的提取；(2)PCR扩增鲍氏志贺 氏菌1型中的O-抗原基因簇；(3)构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的 克隆测序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是 显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移 酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它 们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些 寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的4570至5754碱基)， wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的6605至7669碱基)，orf8基因(核 苷酸位置是从SEQ ID NO：1的7666至8487碱基)，orf9基因(核苷酸位置是 从SEQ ID NO：1的8529至9611碱基)，源于以上基因内的寡核苷酸对鲍氏志 贺氏菌1型(SEQ ID NO：1)和大肠杆菌O149都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突 变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中， 需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发 明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转 运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与 wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路径基因。这些基因的混合物对一个特 殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗 原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、 wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy或与wzy有相似功能的基因中的寡 核苷酸与源于糖合成路径基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗 原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些 抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是： (i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因 或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许 可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个 以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌1型或大肠杆菌 O149。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针 通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检 测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核 苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡 核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基 转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx 有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡 核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是 由鲍氏志贺氏菌1型或大肠杆菌O149表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原 的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交， 这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因， 包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基 因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原 的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是鲍氏志贺氏菌1型 或大肠杆菌O149。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品， 也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如 southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及 细菌。
一般，一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但 它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一 个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡 核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基 因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使 当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基 因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发 明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、 编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基 因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是 特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细 菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下 至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码 糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx 有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况 下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个 以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌1型或大肠杆菌 O149。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本 发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或通过基因芯片或微阵列 检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中 的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或 与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此 外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到 不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检 测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗 原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于 O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，发明者 相信本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的全长序列，而且 可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产 生表达鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。 实施例1：基因组的提取
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分，然后 加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白 酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65 ℃30分。加等体积酚抽提混合物，取上清液液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊 醇(25∶24∶1)抽提两次，取上清液液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的 酚。上清液液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA， 最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。 实施例2：通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌1型中的O-抗原基因簇
鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇通过Long PCR扩增。首先根据经常发 现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设 计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR 反应程序如下：在94℃预变性2分；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒， 68℃延伸15分，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分，得到PCR 产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管 long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR 产物。 实施例3：O-抗原基因簇文库的构建
首先式连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建 O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，分别用等体积的酚和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽 提一次，再用等体积的乙醚抽提两次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA， 并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单 位的T4DNA聚合酶，11℃30分，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加 入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应 20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽 提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16 ℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA 连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连 接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细 胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180 rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm 剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分，于4℃4000rpm离心 15分。倾尽上清液液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4 ℃4000rpm离心15分。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体， 于4℃4000rpm离心15分。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm 离心10分，弃上清液液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即 为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌 DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏， 时间为5.0毫秒-6.0ms毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌 复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上 37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到 含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用 EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌 1型的O-抗原基因簇文库。 实施例4：对文库中的克隆测序
从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限 公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列 达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从鲍氏 志贺氏菌1型的基因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原 基因簇的所有序列。在鲍氏志贺氏菌1型中我们设计了两对引物，如下所示： 5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’ 5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’ 实施例5：核苷酸序列的拼接及分析
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的 Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从 而得到鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。 序列的质量主要由两个方面来保证：1)对鲍氏志贺氏菌1型的基因组作6个 Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以 上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌1型O-抗原基因簇的核苷酸序列后， 用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast 系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它 们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用 Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌1 型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Escherichia coli K12的rmlB基因在 297个氨基酸的序列中都有95％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所 以可以确定orf1是rmlB基因。orf2与Shigella boydii的rmlD基因在 299个氨基酸的序列中有97％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所以， 可以确定orf2是rmlD基因。orf3与Escherichia coli K12的rmlA基因 在293个氨基酸的序列中有98％的相同性，表明它们之间有高度的同源性。所 以，可以确定orf3是rmlA基因。orf4与Shigella boydii的rmlC基因在 171个氨基酸的序列中有90％的相同性，表明它们之间也有高度的同源性。所 以，可以确定orf4是rmlC基因。此外，在志贺氏菌和大肠杆菌中，rmlB、 rmlD、rmlA、rmlC是专门合成鼠李糖的四个基因，在鲍氏志贺氏菌1型的O- 抗原的结构中也有鼠李糖。orf5与salmonella enterica的wzx基因在361 个氨基酸的序列中有24％的相同性，48％的相似性，并且通过Eisenberg等人的算 法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179： 125-142]发现orf6有12个潜在的穿膜区，它与许多wzx蛋白相似，而且在 wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf5 是wzx基因，命名为wzx。orf6与Xanthomonas oryzae的gumL基因在199 个氨基酸中有37％的相同性，可以确定orf6是gumL基因，命名为gumL。orf7 与S.boydii的wzy基因在343个氨基酸序列中有24％的相同性，44％的相似性， 另外通过Eisenberg算法得知orf7有10个潜在的穿膜区，与其他的O-抗原 聚合酶有相似的二级结构，所以确定orf7就是wzy基因，命名为orf7。orf8 与大肠杆菌的糖基转移酶基因在227个氨基酸序列中有29％的相同性，49％的 相似性，所以确定orf8是一个糖基转移酶基因。orf9与S.boydii的糖基转 移酶基因在348个氨基酸序列中有51％的相同性，68％的相似性，所以确定orf9 是一个糖基转移酶基因，命名为orf9。 实施例6：特异基因的筛选。针对鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中的wzx、 wzy、orf8、orf9基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了鲍氏志贺氏菌1型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖 单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了鲍氏志贺氏菌1型 的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应 的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相 应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的 所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且 高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTA AAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株 大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基 因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来 源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们 的来源都列于表中。
在第25组中含有鲍氏志贺氏菌1型的基因组DNA作为阳性对照。以每组 菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在94℃预变性2分后， 94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50 秒，72℃延伸2分，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分，反应体 系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增 出的片段。
对于wzx、wzy、orf8、orf9基因，每个基因都有三对引物被检测，每对 引物除了在第25组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在第18 组中也都得到同样大小的特异性带。以第18组中的每个菌的基因组DNA做模 板PCR后，发现只在大肠杆菌O149中得到了阳性结果。更详细地说，以上每 个基因的每一对引物都在大肠杆菌O149中得到预期大小的正确的PCR产物 带。据报道，鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原结构是一样的，我 们的结果从另一个侧面证实了这一点。此外，所有的引物在其他组中都没有 扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物 带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、 wzy、orf8、orf9基因对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149及其O-抗原都是 高度特异的。
最后，通过PCR从鲍氏志贺氏菌1型中筛选到对鲍氏志贺氏菌1型和大 肠杆菌O149的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。 而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆 菌O149的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经 PCR检测后证实对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149是高度特异的。所有的 这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的鲍氏志贺氏菌1型和 大肠杆菌O149，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了鲍氏 志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的结构，共由9个基因组成，每个基因用方框 表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅 读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，这两 个基因不负责O-抗原的合成，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O- 抗原基因簇的全长序列。
表4是鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列 出了鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准 确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。
序列列表
                     SEQUENCE LISTING <110>南开大学 <120>对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸 <130>对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌O149的O-抗原特异的核苷酸 <160>1 <170>PatentIn version 3.1 <210>1 <211>11005 <212>DNA <213>Shigella boydii <400>1
ctcctggtaa ctcacgcgtc caaaaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa     60
ttagaatctc tccttgaact gcgcgtgaag cgtcagctgc tggcggaagt acagtccatc    120
tgtccgccgg gcgtgaccat tatgaacgtg cgtcagggcg aacctttagg tttaggccac    180
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aagaggctgt agggcgtaag gttgaatttg ttcaggataa tcattcgaag tctagtaaag    4200 gcgttttacg tgggctgcac tatcagttag aaccttatgc gcaaggaaaa ctggtacgct    4260 gcgttgttgg tgaagttttt gacgtagcgg ttgatattcg taaatcgtca ccaacttttg    4320 gcaaatgggt tggggtgaat ttatctgctg agaataagcg ccagttgtgg atccctgaag    4380 gatttgcaca tggttttttg gtgctgagtg aaacggcgga gtttttgtat aagacgacta    4440 attattatca tccgataagt gaaagagggg ttaaatggga tgatccctgt attgatatta    4500 agtggcctct agtatcgtct cccctgttat cagaaaaaga taagtgttat tcatggctaa    4560 cgaaacaaaa tgaacagtaa taagagacaa actttattct tttcgcttga tcaaataata    4620 gattctggac ttgtttttat ttttattgct attggcggta atttacttga caaatcagat    4680 atggctaatg ttgtgtcatt ccaatctgtt gcattagtat ctgtattgtt ttgttcctgt    4740 tttacaacgc aatatttact gttgcgctat aaaaaacaat cttcactttt ttggctaaag    4800 ttatttttat ttttttgtat tattactatg ttgattgtat cattatggtt tcaatcggca    4860 gaaatattat tcttgttttt tgttggaata tcttcagaat acataaaacg atactgcttt    4920 tatattaata attcttgtct ctctttcttt tcaacgataa taacggcatt tatttttttt    4980 gtttttatat tgatgtgttg gctgaatttc atgcgcatta attcgactat atatatatat    5040 atatatagcg gtgcaaagtt aattccgcta acgataatat gttgttttct ttttattaaa    5100 acaaagttca atagtgatgg tgaatatgaa atgccatctt tatggtatgc aattactgat    5160 tcattaagat ttggaggcgt gttttctgtt attaccatta tttattggat tacaaatcaa    5220 ggtttcttta tattctttca tgacagaatg cctgcagcag agttggtaga aattagagtt    5280 acgcagaatg tgtttggtgt agttacaatg ctaattgcat tgtacgactc tatgttttta    5340 aagaaaaaca tagagaataa aaataaaata tttgattggc gatcttattt taaattcctt    5400 gtaatttcaa ttgttttgat tacatttaat tttattttat tatatatatt atcaataaca    5460 atatataaac atttggatgt ttttaaatat tcgatatgtc ttgcactggc ccaatttttt    5520 tatctttccg caaggatgcc tgtacttatt ttgaaattgc gctatagttt aagtattatt    5580 ctgtggttat acgtgtgttc gctttttttg tcctcgtgtt acttattctt gaaacataat    5640 gattatgatt ttcaatatat agtgcaatct ataacattat ctaacttctt tatttttcta    5700 ttttcattat taatagtgtt ttacaaagag aggatttatg ggaagaatta ttgaagctct    5760 gtatgggata tcaacggaac tgaaagagcg aatcttgaat atgggagaga aaacagttcc    5820 ggtgaattac tatacaagac ataataactg gggtgatcaa ttaaataaat atttaattga    5880 aaaaattacc aataaaaagg tagtaaagaa caacttcaaa aagctacctc atatattagc    5940 tataggaagc gttctttcaa gtgcatcaaa taaaagtatc gtatggggga gtggttttat    6000 atctaaagat gcgccattac gagaaacagc ccctgatatt agggctgttc gaggtgtttt    6060 gactagaaat aaacttcaga aagatttttc aattgactgc cctgatgtgt tgggagaccc    6120 ggccgttctt ttgcctttat tttataaagc aaaacataga agtaaaaaat acaaagtcgg    6180 tattattcca cactataaag ataagcaacg agctgttgta caggattttt tacataaagg    6240 atgtgttctt gttgatattc aagatgacat tgaagttttt attgataaaa ttaacgaatg    6300 tgaggttgta atttcatcgt cacttcatgg attaattgct gcagatactt atggtatacc    6360 taatttatgg gtttcatttg gtgaccaagt attaggtggt gattttaagt ttttggacta    6420 ttatagtact actaataata taaatcctaa aatgatacga ctagataatg atcataaata    6480 ttctattgat gatttggtta gaatttctag atgtaataaa tttattagaa gttctgaaga    6540 gttacttgaa gcgtttccta gggagtacat atgaattact attatataat tgtgtaggtg    6600 aaaaatgcta gttacaatcc tggctttatt tctgtttata caattactct atttaatatc    6660 gtataaacgt aatttcaata caaaaagtat aaatgacatt ttgtcattta taatttttct    6720 atttttaatt gtattgtttt tctttaggaa tgaagatttt ggtgcagata ctcagaacta    6780 tttaaatgaa tttgatgaat attgttctaa tcctagtgga tatataggag tggattacac    6840 atataaatat atatttgatt taattaattt tctaatgttg gatagttgcc atattagttg    6900 gttaatttgg atatggccaa tatttgttat tggttgcatc tttttagcaa taacaatatt    6960 tagagttgat aaaatttata tcatggcttt gttttcttca tttataggca ttgagttgtt    7020 aactaatgct ctgaggcagg gattctcaat agcagtactg ttattatcgt tctgtttgtt    7080 tataaagagg cgatattttt tattcttgat agctgtaacc atttcttttc tttttcatca    7140 agcttcgatt ctgatcgttt ctatttttat tatttctaga tgtagcatta gaattgtagt    7200 tcctagtatt gttgtaggtg tgtttttgtt gtttgcgaca aatattctag atgttgtgcc    7260 ttgggttatt gagtttaaaa agttaatata taaatatttg ccgtatgcag atgaggactt    7320 tattattcga atcataagta taattaatac tttatgtctt tgtgtattat atttaattgt    7380 catgattaaa tcacattgta aggataaaat aataaacaat attgttatta atgctacctt    7440 tgtttgttgt atcgcatcta ttgttccgta tcttggtttt cgaattatat atggcgtata    7500 tccattatta ttacttttaa cctactgtag cataagaaat tatatcggca gagtgtcttc    7560 atataattat ttatcgcttt cgatatgtat taatatcttt atctcaatta tgtggttgtg    7620 tggttcctcc catatgaaca aaataccatt tgtgagcatt attatatgaa aaaaaggagt    7680 ttcggtattt ctgttgttgt acctgtgtat aacaggaaag aaaagttaat cagggctatt    7740 gactcagttg atactttatc cccacatctt gtggagatta ttgtaattga tgattgttca    7800 gatttggctc ctgacacatt tttagagaag agtaataagt atggggttaa tgttcacatt    7860 tatcgcaata aatataataa ggggccgcaa atttgtagga acattgggat taggagagct    7920 aaatttaatt atattgcctt tttagattca gatgattatt tttgcatggg aaaaatagat    7980 tggctattga atattctgaa ggatgaggat atagattttc tctaccatgc agtaaatgga    8040 tgtgaaaaat ataatcgaat ttcatcatat tggtttaata cagtaggtaa gtttattcat    8100 tttagatggt ttttgatttt tttgaatcct tgtgttacac caagtgtagt gattaaaagg    8160 aaagtttgtt tatttaatcc atgtttgaga tattcagagg attatgcata ttttttatct    8220 tatattaatt caaaaactaa agttaaatat tttgaaagca tatatacaac agttcctcga    8280 gaaataggca caagaggtgg tatttcgcat aatattataa aaatgagaaa gggagaattt    8340 tatggaaaaa aaaatatatt aaggaagagg cgaaatatat cgaattatat tcggtttctg    8400 atatctttag gcatggcttg tcttagagtt ttctttgata tagtgagaaa acggtataaa    8460 gtgaataatt tatttaaaga tatatagtta aatttctaat attagcaaga taaattaagg    8520 tcatcagtat gacagaacaa ttttcagaga aaaaaataga tgttgttgga attgttggat    8580 tgccagcatg ttatggtgga tttgaatcat tagttcaaaa tttagttgat tatcaaagtc    8640 aaaatataaa atacaatgta tattgttcac gaaaaaaata taaaaacacc ccaaaaaaat    8700 acaagcgtgc tgacttgaag tatataccat ttgacgccaa tggtagttct agtatcttgt     8760 atgatatcta ttcgttattt ttgtcattgt ttaacaaggt agatgttgtc ctaattctcg     8820 gggtttcagg gtgtgttttt ctaccaattt acagattttt ttcgtcatca aaggttattg     8880 taaatattga tggattagaa tggaaaagag caaaatggaa gggtattgct aagtggtatt     8940 taaaaaattc agagaaaata gctgttaaat attcagatgt tgttgtggct gataatgaag     9000 ctattgctaa atatgtctta aaaaaatacg gtttagaagc taaaattatt gcttatggtg     9060 gtgatcattc attggttaag aagccaatat cagttataaa agaggactat ttttttactg     9120 tctgcaggat tgaaccagaa aataacataa gaatgatatt agaagcattt aaaaatacaa     9180 cacacagtct aaaaattgtt ggtaattggg attccagttt gtatgggcga cgactaaaag     9240 aagaatttgg gaattataat aatattgaaa ttatagaccc tatatatgat tctgatatcc     9300 tttttaactt taggtcttta tgccgtggct atattcatgg gcattcagct ggtgggacaa     9360 atccttcttt agtcgaggct atgcattttc aaattcctat tattgccttt gattgtgatt     9420 tcaatcggtt tacaactgac aactatgcgt tttattttaa aaataaaaat gagctatctt     9480 ttatcgtcaa tgatatatta aatggcaatc agaatgaaca ggcagaaatc tgcgcaaaaa     9540 aaatgaagga aattgctaca aaaaaataca cgtgggatac catagccaaa atgtatgaag     9600 aactttattg atatttaata aatgaacgat tatttaaaga ttggcatata atttagttca     9660 gaagcaagcc ataaccccct gacaggagta aacaatgtca aagcaacaga tcggcgtcgt     9720 cggtatggca gtgatggggc gcaaccttgc gctcaacatc gaaagccgtg gttataccgt     9780 ctctattttc aaccgttccc gtgaaaaaac ggaagaagtg attgccgaaa atccaggcaa     9840 aaaactggtt ccttactata cggtgaaaga gtttgttgaa tctctggaaa cgcctcgtcg     9900 catcctgtta atggtgaaag caggtgcagg cacggatgct gctattgatt ccctcaagcc     9960 atacctcgat aaaggtgaca tcatcattga tggtggtaac accttcttcc aggacaccat    10020 tcgtcgtaac cgtgagcttt ctgccgaagg ttttaacttt atcggtaccg gtgtttccgg    10080 aggcgaagaa ggcgcgttga aaggtccttc cattatgcct ggtgggcaga aagaagccta    10140 cgaactggtt gcgccgatcc tgaccaaaat cgccgccgtt gctgaagacg gcgagccatg    10200 cgttacctat attggtaccg atggtgcagg tcactatgtg aagatggttc acaacggtat    10260 tgaatacggc gatatgcaac tgattgctga agcctattct ctcctgaaag gcggcctgaa    10320 tctctctaac gaagaactgg cacagacctt taccgagtgg aataacggtg aactgagtag    10380 ctacctgatc gacatcacca aagacatctt caccaaaaaa gatgaagacg gtaactacct    10440 ggttgatgtg atcctggatg aagcagcaaa caaaggtacg ggcaaatgga ccagccagag    10500 cgcgctggat ctcggcgaac cgctgtcgct gattaccgag tctgtgtttg cacgttatat    10560 ctcgtctctg aaagatcagc gtgttgccgc gtctaaagtt ctctctggtc cgcaagcgca    10620 gccagcaggc gacaaggctg agtttatcga gaaagttcgt cgtgcgctgt atctgggcaa    10680 aatcgtttct tatgctcagg gcttctctca actgcgtgct gcgtctgaag agtacaactg    10740 ggatctgaac tacggcgaga tcgcgaagat tttccgtgct ggttgcatca tccgtgcgca    10800
gttcctgcag aaaatcaccg atgcttatgc cgaaaatccg caaatcgcta acctgctgct  10860
ggctccgtac ttcaagcaaa ttgcagatga ctaccagcag gctctgcgtg atgtcgttgc  10920
ttatgcagta cagaacggta tcccggttcc gaccttcgcc gctgcggttg cctattacga  10980
tagctaccgt gccgctgttc tgcct                                        11005 表1 鲍氏志贺氏菌1型O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引
物及PCR数据 基因   功能   基因的碱基位置   正向引物     反向引物  PCR产物    长度   产生正确   大小电泳   带的组数 PCR的退火 温度(℃) Wzx  转运酶   4570至5754   #13(5051至     5069) #14(5724至5742)    692bp     0     55   1#27(4654至     4672) #128(5276至5294)    641bp     0     52   #129(5164至     5172) #130(5535至5553)    390bp     0     50  wzy   聚合酶   6605至7669   #21(6607至     6625) #22(7545至7563)    957bp     0*     55   #23(6667至     6685) #24(7424至7441)    775bp     0***     50   #27(6755至     6773) #28(7235至7253)    499bp     0***     45  Orf8   糖基转   移酶   7666至8487   #25(7800至     7818) #26(8400至8417)    618bp     0     55   #131(7676至     7694) #132(8280至8298)    623bp     0     55   #133(7896至     8014) #134(8293至8311)    416bp     0     55  orf9   糖基转   移酶   8529至9611   #29(8697至     8715) #30(9307至9325)    629bp     0**     55   #31(9002至     9020) #32(9483至9502)    501bp     0***     45   #33(8965至     8983) #34(9425至9443)    479bp     0***     45 *在4组中得到1条错误大小的带，在3组中得到2条错误大小的带 **在3组中得到1条错误大小的带，在6组中得到2条错误大小的带 ***在所有组中都得到1条错误大小的带 表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源 组号                         该组中含有的菌株                                     来源 1                野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O10，O16，O18，O39                     IMVSa 2                野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100            IMVS 3                野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137     IMVS 4                野生型大肠杆菌O138，O139，O7，O5，O6，O11，O12                   IMVS 5                野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22           IMVS 6                野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30             IMVS 7                野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42             IMVS 8          野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53                    IMVS 9          野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61                    IMVS 10         野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70                    IMVS 11         野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81                    IMVS 12         野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90                    IMVS 13         野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101                   IMVS 14         野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118            IMVS 15         野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171            See b 16         野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132，          See c 17         野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143            IMVS 18         野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152            IMVS 19         野生型大肠杆菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，O164            IMVS 20         野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111                      IMVS 21         野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110                  IMVS 22         鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14                     See d 23         鲍氏志贺氏菌血清型B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18           See d 25         痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13                                  See d 26         弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：7)F5(v：4)     See d 27         宋内氏志贺氏菌D5，DR                                                    See d  a.        Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia  b.        O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark  c.        172and173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVS  d.        中国预防医学科学院流行病学研究所
表3 为鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇的结构表
1Kb 表4 为鲍氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中的基因的位置表 ctcctggtaa ctcacgcgtc caaaaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa     60 ttagaatctc tccttgaact gcgcgtgaag cgtcagctgc tggcggaagt acagtccatc    120 tgtccgccgg gcgtgaccat tatgaacgtg cgtcagggcg aacctttagg tttaggccac    180 tccattttgt gtgcacgacc cgccattggt gacaacccat ttgttgtggt attgccggac    240 gttgtgatcg acgacgccag tgccgacccg ctgcgctaca accttgctgc catgattgcg    300 cgcttcaatg aaacgggccg cagccaggtg ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct    360 gaatactccg tcattcagac caaagaacca ctggatcgtg aaggtaaagt cagccgcatc    420 gtcgaattta tcgaaaaacc ggatcagccg cagacgctgg actcagacat catggccgtt     480 ggtcgctatg tgctttctgc cgatatttgg ccggaactgg aacgtactca gcctggtgca     540 tggggacgta ttcagctgac tgatgctatt gccgagctgg cgaaaaaaca gtccgttgat     600 gccatgctga tgactgggga cagttacgac tgcggtaaaa aaatgggtta tatgcaggca     660 tttgtgaagt atggactacg caacctcaaa gaaggggcga agttccgtaa agggattgag     720 aagctgttaa gcgaataatg aaaatctgac cggatgtaac ggttgataag aaaattataa     780 cggcagtgaa gattcgtggc gaaagtaatt tgttgcgaat attcctgccg ttgttttata     840 taaacaatca gaataacaac gagttagcaa taggatttta gtcaaagttt tccaggattt     900 tccttgtttc cagagcggat tggtaagaca attagcgttt gaatttttcg ggtttagcgc     960 gagtgggtaa cgctcgtcac atcgtagaca tgcatgtagt gctctggtag ctgtaaagcc    1020 aggggcggta gcgtgcatta acacctctat taatcaacct aagagccgct tatttcaccg    1080 catgctctga agttatatgg aataaataag tgaagatact tgttactggt ggcgcaggat    1140 ttattggttc tgctgtagtt cgtcacatta taaataatac gcaggatagt gttgttaatg    1200 tcgataaatt aacgtacgcc ggaaacctgg aatcacttgc tgatgtttct gattctgaac    1260
                                        orf1的起始 gctatgtttt tgaacatgcg gatatttgcg atgctgctgc a atggcgcga attttttctc  1320 agcatcagcc ggatgcagtg atgcacctgg ctgctgaaag ccatgttgac cgttcaatta    1380 caggccctgc ggcatttatt gaaaccaata ttgttggtac ttatgtcctt ttggacgctg    1440 ctcgcaatta ctggtctgct cttgatagcg acaagaaaaa tagcttccgt tttcatcata    1500 tttctactga cgaagtctat ggtgatttgc ctcatcctga cgaagtaaat aataaagaaa    1560 aattaccctt atttattgag acaacagctt acgcaccaag cagcccttat tccgcatcca    1620 aagcatccag cgatcattta gtccgcgcgt ggaaacgtac ctatggttta ccgaccattg    1680 tgactaattg ctctaacaat tatggccctt atcatttccc ggaaaaattg attccattgg    1740 ttattctgaa tgctctggaa ggtaagatgt tgcctattta tggcaaaggg gatcaaattc    1800 gtgattggct gtatgtagag gatcatgctc gagcgttata tacagttgtt actgaaggta    1860 aagcaggtga aacctataat attggtggac acaacgaaaa gaaaaacatc gatgtagtgc    1920 tcactatttg tgatttgttg gatgagattg tcccgaaaga gaaatcttac cgcgagcaaa    1980 ttacttatgt tgccgatcgt ccgggacacg atcgccgtta tgcgattaat gctgagaaga    2040 ttggtcgcga attgggctgg aaaccacagg aaacgtttga gagcgggatt cgtaaaacag    2100 tggaatggta ccttgctaat gcaaaatggg tcgaaaatat gaaaagtggt gcctatcaat    2160
                        orf1的中止orf2的起始 cgtggattga acagaactat gagggccgcc ag taatgaat attctccttt tcggcaaaac  2220 agggcaggta ggttgggaac tacagcgtgc tctggcacct ctgggtaatt tgattgctct    2280 tgatgttcac tccactgatt attgtggtga ttttagtaat cctgaaggtg tagctgaaac    2340 cgtaagaagc attcggcctg atattattgt caacgcagcc gctcacaccg cagtagacaa    2400 agcagaatca gaaccggagt ttgcacaatt acttaacgcg acaagtgtcg aagcgattgc     2460 gaaagcagcc aatgaagtcg gcgcctgggt tattcactac tctactgact acgtatttcc     2520 ggggaccggt gaaataccat ggcaggagac ggatgcaacc gcaccgctaa atgtgtacgg     2580 tgaaaccaag ttagctggag aaaaagcatt acaagagcat tgtgcgaagc accttatttt     2640 ccgtaccagc tgggtatatg caggtaaagg aaacaatttt gccaagacaa tgttacgtct     2700 ggcaaaagag cgcgaagaat tagctgtcat taacgatcag tttggtgcac caacaggtgc     2760 tgagttgctg gctgattgta cggcacatgc cattcgtgtt gcactgaata aaccagaagt     2820 cgcaggctta taccatctgg tagccagtgg taccacaacc tggtacgatt atgctgcgct     2880 ggtttttgaa gaggcgcgcg aagcaggcat tccccttgca ctcaacaagc tcaacgcagt     2940 accaacaaca gcctatccta cactagctcg tcgtccgcat aactctcgcc ttgatacaga     3000 aaaatttcag cagaactttg cgcttgtctt gcctgactgg cagattggcg tgaaacgcat     3060
                              orf2的中止 gctcaacgaa ttatttacga ctacagctat t taatagttt ttgcatcttg tttgtgatgg   3120
                              orf3的起始 tggagcaaga tgaattaaaa ggaatgatga a atgaaaacg cgtaaaggta ttattttagc   3180 gggtggttct ggtactcgtc tttatcctgt gactatggca gtcagtaaac agctgctacc     3240 gatttatgat aaaccgatga tctattatcc gctctctaca ctgatgttgg cgggtattcg     3300 cgatattttg attatcagta cgccacagga tactcctcgt tttcaacaac tgttgggtga     3360 cggtagccag tgggggctga atcttcagta caaagtgcaa gcgagtccgg atggtcttgc     3420 gcaggcgttt attatcggtg aagagtttat tggtggtgat gattgtgctt tgattcttgg     3480 tgataatatc ttttacggtc acgatctgcc gaagttaatg gatgccgctg ttaacaaaga     3540 aagtggtgca acggtatttg catatcacgt aaatgatcct gaacgctatg gtgtcgtgga     3600 gtttgataat aacggaacag ccattagcct tgaagaaaaa ccgttagagc caaaaagcaa     3660 ttatgctgta accggacttt atttctatga caatgatgtt gtagaaatgg cgaaaaacct     3720 taagccttct gcccgtggcg aactggaaat taccgatatt aaccgtattt atatggagca     3780 gggacgttta tctgttgcca tgatgggacg tggatatgca tggttggaca cggggacaca     3840 tcaaagtctt attgaggcaa gcaattttat cgcaacaata gaagaacgtc aggggctgaa     3900 agtttcctgc ccggaagaaa ttgcttaccg taaagggttt atcgatgctg agcaggtgaa     3960 agtattagct gaaccgttga agaaaaatgc ttatggtcag tatctgctga aaatgattaa     4020
 orf3的中止orf4的起始 aggttattaa  taaa atgaac gtaattaaaa ctgaaattcc tgatgtgtta attttcgagc 4080 cgaaagtttt tggtgatgag cgtggtttct ttatggaaag ctttaatcag aaagttttcg     4140 aagaggctgt agggcgtaag gttgaatttg ttcaggataa tcattcgaag tctagtaaag     4200 gcgttttacg tgggctgcac tatcagttag aaccttatgc gcaaggaaaa ctggtacgct     4260 gcgttgttgg tgaagttttt gacgtagcgg ttgatattcg taaatcgtca ccaacttttg     4320 gcaaatgggt tggggtgaat ttatctgctg agaataagcg ccagttgtgg atccctgaag    4380 gatttgcaca tggttttttg gtgctgagtg aaacggcgga gtttttgtat aagacgacta    4440 attattatca tccgataagt gaaagagggg ttaaatggga tgatccctgt attgatatta    4500 agtggcctct agtatcgtct cccctgttat cagaaaaaga taagtgttat tcatggctaa    4560
  orf5的起始    orf4的中止 cgaaacaaa a tgaacag taa taagagacaa actttattct tttcgcttga tcaaataata4620 gattctggac ttgtttttat ttttattgct attggcggta atttacttga caaatcagat    4680 atggctaatg ttgtgtcatt ccaatctgtt gcattagtat ctgtattgtt ttgttcctgt    4740 tttacaacgc aatatttact gttgcgctat aaaaaacaat cttcactttt ttggctaaag    4800 ttatttttat ttttttgtat tattactatg ttgattgtat cattatggtt tcaatcggca    4860 gaaatattat tcttgttttt tgttggaata tcttcagaat acataaaacg atactgcttt    4920 tatattaata attcttgtct ctctttcttt tcaacgataa taacggcatt tatttttttt    4980 gtttttatat tgatgtgttg gctgaatttc atgcgcatta attcgactat atatatatat    5040 atatatagcg gtgcaaagtt aattccgcta acgataatat gttgttttct ttttattaaa    5100 acaaagttca atagtgatgg tgaatatgaa atgccatctt tatggtatgc aattactgat    5160 tcattaagat ttggaggcgt gttttctgtt attaccatta tttattggat tacaaatcaa    5220 ggtttcttta tattctttca tgacagaatg cctgcagcag agttggtaga aattagagtt    5280 acgcagaatg tgtttggtgt agttacaatg ctaattgcat tgtacgactc tatgttttta    5340 aagaaaaaca tagagaataa aaataaaata tttgattggc gatcttattt taaattcctt    5400 gtaatttcaa ttgttttgat tacatttaat tttattttat tatatatatt atcaataaca    5460 atatataaac atttggatgt ttttaaatat tcgatatgtc ttgcactggc ccaatttttt    5520 tatctttccg caaggatgcc tgtacttatt ttgaaattgc gctatagttt aagtattatt    5580 ctgtggttat acgtgtgttc gctttttttg tcctcgtgtt acttattctt gaaacataat    5640 gattatgatt ttcaatatat agtgcaatct ataacattat ctaacttctt tatttttcta    5700
                                 orf6的起始       orf5的中止 ttttcattat taatagtgtt ttacaaagag aggattt atg ggaagaa tta ttgaagctct5760 gtatgggata tcaacggaac tgaaagagcg aatcttgaat atgggagaga aaacagttcc    5820 ggtgaattac tatacaagac ataataactg gggtgatcaa ttaaataaat atttaattga    5880 aaaaattacc aataaaaagg tagtaaagaa caacttcaaa aagctacctc atatattagc    5940 tataggaagc gttctttcaa gtgcatcaaa taaaagtatc gtatggggga gtggttttat    6000 atctaaagat gcgccattac gagaaacagc ccctgatatt agggctgttc gaggtgtttt    6060 gactagaaat aaacttcaga aagatttttc aattgactgc cctgatgtgt tgggagaccc    6120 ggccgttctt ttgcctttat tttataaagc aaaacataga agtaaaaaat acaaagtcgg    6180 tattattcca cactataaag ataagcaacg agctgttgta caggattttt tacataaagg    6240 atgtgttctt gttgatattc aagatgacat tgaagttttt attgataaaa ttaacgaatg    6300 tgaggttgta atttcatcgt cacttcatgg attaattgct gcagatactt atggtatacc    6360 taatttatgg gtttcatttg gtgaccaagt attaggtggt gattttaagt ttttggacta    6420 ttatagtact actaataata taaatcctaa aatgatacga ctagataatg atcataaata    6480 ttctattgat gatttggtta gaatttctag atgtaataaa tttattagaa gttctgaaga    6540
                          orf6的中止                      orf7的起始 gttacttgaa gcgtttccta gggagtacat a tgaattact attatataat tgtgtagg tg6600 aaaaatgcta gttacaatcc tggctttatt tctgtttata caattactct atttaatatc    6660 gtataaacgt aatttcaata caaaaagtat aaatgacatt ttgtcattta taatttttct    6720 atttttaatt gtattgtttt tctttaggaa tgaagatttt ggtgcagata ctcagaacta    6780 tttaaatgaa tttgatgaat attgttctaa tcctagtgga tatataggag tggattacac    6840 atataaatat atatttgatt taattaattt tctaatgttg gatagttgcc atattagttg    6900 gttaatttgg atatggccaa tatttgttat tggttgcatc tttttagcaa taacaatatt    6960 tagagttgat aaaatttata tcatggcttt gttttcttca tttataggca ttgagttgtt    7020 aactaatgct ctgaggcagg gattctcaat agcagtactg ttattatcgt tctgtttgtt    7080 tataaagagg cgatattttt tattcttgat agctgtaacc atttcttttc tttttcatca    7140 agcttcgatt ctgatcgttt ctatttttat tatttctaga tgtagcatta gaattgtagt    7200 tcctagtatt gttgtaggtg tgtttttgtt gtttgcgaca aatattctag atgttgtgcc    7260 ttgggttatt gagtttaaaa agttaatata taaatatttg ccgtatgcag atgaggactt    7320 tattattcga atcataagta taattaatac tttatgtctt tgtgtattatatttaattgt     7380 catgattaaa tcacattgta aggataaaat aataaacaat attgttatta atgctacctt    7440 tgtttgttgt atcgcatcta ttgttccgta tcttggtttt cgaattatat atggcgtata    7500 tccattatta ttacttttaa cctactgtag cataagaaat tatatcggca gagtgtcttc    7560 atataattat ttatcgcttt cgatatgtat taatatcttt atctcaatta tgtggttgtg    7620
                                   orf8的起始   orf7的中止 tggttcctcc catatgaaca aaataccatt tgtgagcatt attat atgaa aaaaaggagt  7680 ttcggtattt ctgttgttgt acctgtgtat aacaggaaag aaaagttaat cagggctatt    7740 gactcagttg atactttatc cccacatctt gtggagatta ttgtaattga tgattgttca    7800 gatttggctc ctgacacatt tttagagaag agtaataagt atggggttaa tgttcacatt    7860 tatcgcaata aatataataa ggggccgcaa atttgtagga acattgggat taggagagct    7920 aaatttaatt atattgcctt tttagattca gatgattatt tttgcatggg aaaaatagat    7980 tggctattga atattctgaa ggatgaggat atagattttc tctaccatgc agtaaatgga    8040 tgtgaaaaat ataatcgaat ttcatcatat tggtttaata cagtaggtaa gtttattcat    8100 tttagatggt ttttgatttt tttgaatcct tgtgttacac caagtgtagt gattaaaagg    8160 aaagtttgtt tatttaatcc atgtttgaga tattcagagg attatgcata ttttttatct    8220 tatattaatt caaaaactaa agttaaatat tttgaaagca tatatacaac agttcctcga    8280 gaaataggca caagaggtgg tatttcgcat aatattataa aaatgagaaa gggagaattt    8340 tatggaaaaa aaaatatatt aaggaagagg cgaaatatat cgaattatat tcggtttctg    8400 atatctttag gcatggcttg tcttagagtt ttctttgata tagtgagaaa acggtataaa    8460
                   orf8的中止 gtgaataatt tatttaaaga tata tagtta aatttctaat attagcaaga taaattaagg  8520
orf9的起始 tcatcagt at gacagaacaa ttttcagaga aaaaaataga tgttgttgga attgttggat  8580 tgccagcatg ttatggtgga tttgaatcat tagttcaaaa tttagttgat tatcaaagtc    8640 aaaatataaa atacaatgta tattgttcac gaaaaaaata taaaaacacc ccaaaaaaat    8700 acaagcgtgc tgacttgaag tatataccat ttgacgccaa tggtagttct agtatcttgt    8760 atgatatcta ttcgttattt ttgtcattgt ttaacaaggt agatgttgtc ctaattctcg    8820 gggtttcagg gtgtgttttt ctaccaattt acagattttt ttcgtcatca aaggttattg    8880 taaatattga tggattagaa tggaaaagag caaaatggaa gggtattgct aagtggtatt    8940 taaaaaattc agagaaaata gctgttaaat attcagatgt tgttgtggct gataatgaag    9000 ctattgctaa atatgtctta aaaaaatacg gtttagaagc taaaattatt gcttatggtg    9060 gtgatcattc attggttaag aagccaatat cagttataaa agaggactat ttttttactg    9120 tctgcaggat tgaaccagaa aataacataa gaatgatatt agaagcattt aaaaatacaa    9180 cacacagtct aaaaattgtt ggtaattggg attccagttt gtatgggcga cgactaaaag    9240 aagaatttgg gaattataat aatattgaaa ttatagaccc tatatatgat tctgatatcc    9300 tttttaactt taggtcttta tgccgtggct atattcatgg gcattcagct ggtgggacaa    9360 atccttcttt agtcgaggct atgcattttc aaattcctat tattgccttt gattgtgatt    9420 tcaatcggtt tacaactgac aactatgcgt tttattttaa aaataaaaat gagctatctt    9480 ttatcgtcaa tgatatatta aatggcaatc agaatgaaca ggcagaaatc tgcgcaaaaa    9540 aaatgaagga aattgctaca aaaaaataca cgtgggatac catagccaaa atgtatgaag    9600
 orf9的中止 aactttat tg atatttaata aatgaacgat tatttaaaga ttggcatata atttagttca  9660 gaagcaagcc ataaccccct gacaggagta aacaatgtca aagcaacaga tcggcgtcgt    9720 cggtatggca gtgatggggc gcaaccttgc gctcaacatc gaaagccgtg gttataccgt    9780 ctctattttc aaccgttccc gtgaaaaaac ggaagaagtg attgccgaaa atccaggcaa    9840 aaaactggtt ccttactata cggtgaaaga gtttgttgaa tctctggaaa cgcctcgtcg    9900 catcctgtta atggtgaaag caggtgcagg cacggatgct gctattgatt ccctcaagcc    9960 atacctcgat aaaggtgaca tcatcattga tggtggtaac accttcttcc aggacaccat   10020 tcgtcgtaac cgtgagcttt ctgccgaagg ttttaacttt atcggtaccg gtgtttccgg   10080 aggcgaagaa ggcgcgttga aaggtccttc cattatgcct ggtgggcaga aagaagccta   10140 cgaactggtt gcgccgatcc tgaccaaaat cgccgccgtt gctgaagacg gcgagccatg   10200
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tagctaccgt gccgctgttc tgcct                                        11005
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上 的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。