技术领域
[0001] 本
发明属
磁共振成像领域，涉及一种基于磁性弛豫开关的检测方法。具体涉及一种适合应用于低场
核磁共振分析仪的基于磁性弛豫开关的微型检测方法。
背景技术
[0002] 磁性弛豫开关(Magnetic Relaxation Switches)是一种基于磁性粒子的
生物传感器，其工作原理基于磁性粒仔在分散以及团聚状态下其横向弛豫时间(TransverseRelaxation Time)T2的变化来进行检测，通过对磁性粒子表面进行功能化修饰，可以对寡核苷酸，脱
氧核糖核酸，
蛋白质，酶，病毒，细菌，
抗体等生物活性分子进行检测。与传统的光学检测方法如紫外可见
光谱，
荧光光谱相比，该检测方法具有相当高的灵敏度以及特异性，其优点在于磁性粒子团聚后对周围
水质子的弛豫率(1/T2)的改变，而不依赖于光学性质的检测，因此特别适合于复杂的实际样品的检测。以其尺寸来区分，磁性弛豫开关主要有如下两种：一种为
纳米级别的粒子，其团聚会引起T2的缩短，另外一种为微米级别的粒子，其团聚会引起T2的增长。应用磁共振成像技术(MagneticResonance Imaging)，不同T2值的样品在T2权重图中图像灰度的深浅不同，从而可以对多个样品进行快速的平行检测。然而，一般的医用磁共振成像系统体积庞大，价格昂贵，日常运作与维护成本较高，不适合常规实验室应用与操作，从而限制了其应用与发展。
现有技术还公开了低场核磁共振分析仪由于采用永磁型磁
铁，能降低仪器设备成本，同时减小仪器体积，操作与维护方便，较适合于常规实验室使用。但出于成本考虑，其样品腔一般比较狭小，不适合多样品的检测。
[0003] 与本法明相关的现有技术有：
[0004] 以Magnetic、Relaxation以及Sensor为关键词组合对国际
专利检索，其中涉及磁性弛豫开关的专利1项US20060269965(Water Relaxation-Based Sensor)；另以NMR和detection为关键词组搜索，涉及弛豫开关的专利1项US7564245(NMR device fordetection of analytes)；以磁性传感器为关键词对中国专利进行搜索，共有44项专利，其中发明专利30项，实用新型专利12项，外观设计专利2项，但未见适合应用于低场核磁共振分析仪的基于磁性弛豫开关的微型检测方法相关专利。
发明内容
[0005] 本发明的目的是为了解决现有技术存在的问题，提供一种基于磁性弛豫开关的检测方法，尤其是一种适合应用于低场核磁共振分析仪的基于磁性弛豫开关的微型检测方法。
[0006] 本方法可以应用于显示蛋白质相互作用的快速高通量检测。
[0007] 本发明利用磁性
纳米粒子在分散与团聚状态下其横向弛豫时间T2的改变，同时在T2权重图像中引起灰度的不同，通过对磁性纳米粒子表面进行功能化修饰，从而对特定的目标分子进行检测。
[0008] 具体而言，本发明的一种基于磁性弛豫开关的检测方法，其特征在于，其包括，将待检样品与相应的功能化磁性纳米粒子混合后至微型检测芯片，在低场磁共振分析仪中进行检测。
[0009] 所述的相应的功能化磁性纳米粒子为经表面修饰的磁性纳米粒子；本发明中，所述的经磁性纳米粒包括其表面分别经
牛血清蛋白抗体和生物素修饰。
[0010] 所述的微型检测芯片为多样品的微型检测芯片。
[0011] 本发明的另一个目的是提供上述微型检测芯片及其制备方法。
[0012] 本发明通过下述方法制备所述微型检测芯片，包括步骤：
[0013] a.制备圆形PMMA基片，
[0014] b.制备上部多孔基片，
[0015] c.上下基片热融粘合。
[0016] 本发明中，微型检测芯片是以聚丙烯酰胺Poly(methyl methacrylate)即PMMA为基质的多孔圆形芯片；
[0017] 所述芯片主要包括上下两个基片，上部基片厚4.8mm，下部基片厚1.6mm。芯片外部直径为13mm，孔洞内部直径为1.3mm，孔深4.8mm，小孔圆心相距2mm，共有18个圆柱形小孔，以3×6排列方式均匀分布在在圆形芯片中部。
[0018] 本发明的再一个目的是提供所述功能化磁性纳米粒子的制备方法。
[0019] 本发明通过下述方法制备功能化磁性纳米粒子，其包括步骤：
[0022] 本发明的功能化磁性纳米粒子是以四氧化三铁纳米粒子为核，葡聚糖为壳，表面分别经牛血清蛋白抗体以及生物素修饰的超顺磁性纳米粒子。其四氧化三
铁磁性核尺寸小于10nm，粒子整体平均尺寸为60nm的
水溶性粒子，其中四氧化三铁含量49.85％，饱和磁化-1 -1 -1 -1强度为32.29emu/g，其纵向和横向弛豫度分别为18.51mM S 和269.2mM S[0023] 本发明的功能化磁性纳米粒子通过下述步骤制备：
[0024] (1)超顺磁性纳米粒子的合成；
[0025] (2)超顺磁性纳米粒子的表面修饰。
[0026] 本发明中，将待检样品与相应的功能化磁性纳米粒子混合后至微型检测芯片，在低场磁共振分析仪中进行检测。结果显示，所需样品量少，可以在低场核磁共振分析仪上对多个样品进行快速的平行检测。
[0027] 本发明解决能解决由于常规成像设备价格昂贵，体积庞大，操作复杂不适于常规实验室应用的问题以及低场磁共振成像仪样品腔狭小不适于多样品平行检测的限制。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0029] 1.本发明提供的微型检测芯片，体积细小，适合于低场核磁共振分析仪。
[0030] 2.本发明提供的微型检测芯片，所需样品的量很少，每个样品只需6～7微升。
[0031] 3.本发明提供的微型检测芯片，具有18个微型圆柱形小孔，适合多样品的平行检测。
[0032] 4.本发明提供的功能化修饰磁性纳米粒子，其四氧化三铁磁性核尺寸小于10nm，其粒子平均尺寸为60nm。
[0033] 5.本发明提供的功能化修饰磁性纳米粒子，其中四氧化三铁含量49.85％，饱和磁化强度为32.29emu/g。
[0034] 6.本发明提供的功能化修饰磁性纳米粒子，其纵向与横向弛豫率分别高达-1 -1 -1 -118.51mM S 和269.2mM S
附图说明
[0035] 图1为本发明检测芯片的结构示意图。
[0036] 图2为本发明磁性纳米粒子的粒度分布图。
[0037] 图3为本发明磁性粒子磁性曲线图。
[0038] 图4为本发明磁性粒子的热重曲线图。
[0039] 图5为本发明牛血清蛋白抗体修饰的磁性粒子图像强度对牛血清蛋白浓度的线性拟合图。
[0040] 图6为本发明生物素化磁性粒子图像强度对抗生物素蛋白浓度的线性拟合图。具体实施方案
[0042] (1)圆形PMMA基片的制备
[0043] 在激光转床上以外径为16mm，内径为13mm的不锈
钢取孔器，分别在厚度为4.8mm和1.6mm的PMMA
基板上套取圆形基片，并将基片依次在去离子水，无水
乙醇，去粒子水中超声(250W)清洗20分钟，后在鼓
风烘箱中烘干。
[0044] (2)上部多孔基片的制备
[0045] 将芯片设计图形用CAD
软件绘制，采用激光打印到纸片上，在上部基片上覆上纸片，在激光转床上以外径为1.3mm的麻花砖头按照图纸转孔，得多孔基片。将基片依次在去离子水，无水乙醇，去离子水中超声(250W)清洗20分钟，后在鼓风烘箱中干燥。
[0046] (3)上下基片粘合
[0047] 以绝缘胶布调整上下基片
位置对齐，并以盖玻片压紧，置于90℃
真空烘箱中加热20分钟后，加放500g砝码，继续加热10分钟后卸去砝码，并自然冷却至室温，即的多孔芯片检测平台。
[0048] 实施例2.制备功能化磁性纳米粒子
[0049] (1)超顺磁性纳米粒子的合成
[0050] 采用共沉淀法合成超顺磁性纳米粒子，具体方法如下，324.4mg六水三氯化铁，119.3mg四水氯化亚铁和4.5g葡聚糖(Dextran)(分子量＝10T)溶解在10mL去离子水中，冷却到2～4℃，在强烈机械搅拌和氮气保护下加入450μL 2～4℃
氨水(25～28％)，反应混合物在一个小时内均匀加热到75～85℃后在该
温度维持75分钟。反应液自然冷却到室温后通过
透析(截留分子量＝300KD)除去杂质与多余的葡聚糖，最后经过
超滤(300KD)浓缩溶液。
[0051] (2)超顺磁性纳米粒子的表面修饰
[0052] 5mL步骤(1)中合成的超顺磁性纳米粒子(7mmol/L Fe)先经10.7mg高碘酸纳氧化1小时，反应
混合液经透析(截留分子量14KD)除去杂质后取1mL，加入100μL牛血清蛋白抗体(anti-BSA)(2mg/mL)，搅拌下反应24小时后以
硼氢化纳(1mg/mL)还原固定，产物最后以透析与超滤(截留分子量＝300KD)纯化。
[0053] 向1mL步骤(1)中合成的超顺磁性纳米粒子中加入8mL氢氧化钠(0.5mol/L)和2mL环氧氯丙烷(epichlorohydrin)，上述混合物在室温下搅拌24小时，加入5mL氨水(25～28％)继续搅拌12小时，过量的环氧氯丙烷和氨水通过透析(截留分子量＝14KD)出去。4mL上述反应液加入400μL氢氧化钠溶液(1mol/L)将pH值调至8.0-8.3，随后加入1mL含1.2mg生物素(Biotin)，1.0mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-
碳化二亚胺(EDC)，
0.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的二甲基亚砜(DMSO)溶液，室温下搅拌6小时。反应液在PBS缓冲溶液(10mmol/L，pH＝7.4)下透析(截留分子量＝300KD)出去杂质。
[0054] 实施例3.横向弛豫时间的检测
[0055] 不同浓度的牛血清蛋白(BSA)与抗生物素蛋白(Avidin)的PBS溶液分别与牛血清蛋白抗体修饰的磁性纳米粒子和生物素化的磁性纳米粒子混合并在38℃恒温水浴下恒温90分钟后，在
磁场强度为0.47特斯拉的低场磁共振分析仪中测量其T2，所用脉冲序列为Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列。
[0056] 实施例4.T2权重图像的获取
[0057] 浓度范围分别为0～1.0μmol/L的牛血清蛋白和0～0.6μmol/L的抗生物素蛋白分别与牛血清蛋白抗体修饰的磁性纳米粒子和生物素化的磁性纳米粒子混合并移液至微型检测芯片的小孔中，在38℃恒温空气浴下恒温60分钟，在磁场强度为0.47特斯拉的低场磁共振分析仪中进行T2权重成像，所用的脉冲序列为自旋回波spin echo(SE)，成像参数：重复时间TR＝3000ms，回波时间TE＝30ms，重复次数NS＝4，成像厚度＝5mm，成像
视野FOV＝8mm×12mm，
像素matrices＝80×120。
