O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复 的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷 二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成 寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚 合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子 [Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and  J.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染 色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在 志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间 [Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection and Immunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因， 糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O- 抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及 其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转 运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多 糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇 里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不 同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间 的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O- 抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又 具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志大肠杆菌及 其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反 应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的 唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数 量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时 长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清 学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门 氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙 门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。 Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的 CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血 清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111 的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111 的血清型[“Molecular microbiological investigation ofan outbreak of Hemolytic- Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的 研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的 血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于 wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可 能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的
志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166 种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specific selection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲 缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986) “Edwards and Ewing’s identification ofthe Enterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸。 它是大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因 和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的全长核 苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的基 因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy 基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3，orf4，orf5，orf9 基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O172型的 O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf3，orf4，orf5，orf9基因；源于编 码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的 基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸， 长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O172型的O-抗原是特异的；尤其是表1 中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O172型的O-抗原是高度特异的，而且这 些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O172型的O-抗原 也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反 应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通 过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O172型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌 O172型。
本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的全 序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列， 也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1 所示的分离的核苷酸，全长12850个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失 或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其由10个基因组成， 都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是： 转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy 基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf5、 orf9基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的1120至2388碱基的 核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的2381至3556碱基的核苷酸；orf3是SEQ ID NO：1中的3553至4335碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4335至5423 碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO：1中的5420至6499碱基的核苷酸；orf9 是SEQ ID NO：1中的9795至11003碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述 的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf3、orf4、orf5、orf9基因；以及 它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的所述的 源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1166至1182碱基的核苷 酸和1854至1870碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1415至1434碱基的核 苷酸和2286至2303碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1157至1174碱基的 核苷酸和1934至1951碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的2610至2627碱基的核苷酸和3452至3470碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2711至2728碱基的核苷酸和3460至3477碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2742至2759碱基的核苷酸和3480至3496碱基的核苷酸；源于orf3 基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的3660至3677碱基的核苷酸和4255 至4274碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3728至3745碱基的核苷酸和4296 至4313碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3752至3769碱基的核苷酸和4308 至4325碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4391 至4410碱基的核苷酸和5211至5228碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4463 至4470碱基的核苷酸和5271至5289碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4515 至4530碱基的核苷酸和5396至5418碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核 苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5435至5452碱基的核苷酸和5992至6009碱 基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5687至5704碱基的核苷酸和6230至6247 碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5724至5741碱基的核苷酸和6319至6336 碱基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的9825至9842 碱基的核苷酸和10687至10704碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10001至 10017碱基的核苷酸和10682至10699碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10201 至10218碱基的核苷酸和10954至10971碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的 细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通 过插入表达可提供表达大肠杆菌O172型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为 引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片 或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征 在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O172 型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬 细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。 之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入 3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清 再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清 再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用 玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因 组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O172型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O172 型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现 于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因 设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)； 用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原 基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60 ℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续 延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小 及其特异性，合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps 纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构 建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ngPCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2， 1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中， 随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP， 10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟， 将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其 相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA 尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚 抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时， 总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后 用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物， 再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司 的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5 a细胞，取2-3ul 连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm 的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即 在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、 X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落， 将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培 养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大 小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在700bp以上的120 个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插 入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率，剩余10％的序列再通过将 部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council) 分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接 和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的核苷酸全 长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O172型的基因 组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基， 保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O172型O-抗原基因簇的核 苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅 读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框 的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基 因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大 肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的wzx、 wzy、orf3、orf4、orf5、orf9基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引 物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物 以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除源自orf9 的的三对在O12、O25、O26中得到大小正确的带外，在其他组中都没有扩 增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然 在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf3、 orf4、orf5基因对大肠杆菌O172型的O-抗原都是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O172型的O-抗原基因 簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长12850个碱基； 或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸 功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O172型 的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由10个基因组成，都位于galF 基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的基 因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy 基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf5、 orf9基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在 O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明 尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基 因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同 的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、 转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O172型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中 的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基 因和糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf5、orf9基因的寡核苷酸，它们 是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核 苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这 些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表 中的退火温度进行。这些引物在以大肠杆菌O172型为模板进行的PCR扩增 中得到预期大小的产物，而除源自orf9的三对在O12、O25、O26中得到大 小正确的带外，在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到 预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在 大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定除源自orf9的的三对这些 引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O172型的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述 步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O172型中的O-抗原基因簇； 3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼 接及分析；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是 显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基 转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分 子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这 些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的1120至2388 碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的2381至3556 碱基的核苷酸)；orf3基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的3553至4335 碱基的核苷酸)；orf4基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4335至5423 碱基的核苷酸)；orf5基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的5420至6499 碱基的核苷酸)；orf9基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的9795至11003 碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O172型是高度特异 的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突 变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中， 需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发 明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转 运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或 与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来 说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体 地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有 相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗 原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些 抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因 是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基 因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条 件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的 一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O172型。可用PCR 方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如 southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及 细菌。
本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时， 寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一 套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码 糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与 wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这 套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O- 抗原是由大肠杆菌O172型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原 的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂 交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基 因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功 能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的 O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌 O172型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可 将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或 荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它 们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个 寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核 苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因 混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当 一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因 簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明 方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、 编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy 基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说 是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细 菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下 至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码 糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx 有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情 况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一 个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O172型。可用本发 明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷 酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的 抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中 的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因 或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。 此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交 到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来 检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗 原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由 于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发 明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的全长序列，而且 可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产 生表达大肠杆菌O172型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。 实施例1：基因组的提取：
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O172型，离心收集细胞。 用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分 钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml 的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase， 65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶ 异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以 除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％ 乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼 脂糖凝胶电泳检测。 实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O172型中的O-抗原基因簇：
以大肠杆菌O172型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因 簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游 引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗 原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然 后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。 最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检 测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公 司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。 实施例3：构建O-抗原基因簇文库：
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O- 抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA 片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4 管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍 体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。 随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP， 10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟， 将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其 相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA 尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚 抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时， 总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后 用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物， 再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细 胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中， 180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹 散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml 吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮 细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％ 的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管， -70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌 DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5干 伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使 菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养 基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆 转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒 并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆 菌O172型的O-抗原基因簇文库。 实施例4：对文库中的克隆测序：
从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限 公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序 列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获 得O-抗原基因簇的所有序列。 实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的 Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而 得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。 序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O172型的基因组作6个 Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个 以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O172型O-抗原基因簇的核苷酸序列 后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast 系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它 们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O172型的O- 抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1编码的蛋白含有11个潜在跨膜片段，而且与 许多Wzx蛋白相似，例如，和Y.pseudotuberculosis的Wzx在224个氨基酸 中有25％的相同性，47％的相似性，所以可以确定orf1是wzx基因，命名为 wzx。orf2含有9个潜在跨膜片段，它的内膜的拓扑结构具有众所周知的O- 抗原聚合酶(Wzy)的典型特征。此外，它与S.enterica subsp.Enterica serovar Vellore编码O-抗原聚合酶的Wzy在164个氨基酸中有26％的相同性，45％ 的相似性，说明它们之间有一定的同源性，所以命名orf2为wzy基因。orf3 通过blast比较，与E.ictaluri的糖基转移酶在255个氨基酸中有25％的相同 性，50％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，可以推测orf3也为糖基 转移酶基因，暂命名为orf3。orf4通过blast比较，与B.subtilis的糖基转移 酶在121个氨基酸中26％的相同性，48％的相似性，说明它们之间有高度的 同源性，可以推测orf4也为糖基转移酶基因，暂命名为orf4。orf5与E.coli 的糖基转移酶基因在339个氨基酸中有27％的相同性，48％的相似性，所以 推测orf5是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf5。orf9与P.aeruginose的糖 基转移酶基因在218个氨基酸中有27％的相同性，46％的相似性，所以推测 orf9是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf10。 实施例6：特异基因的筛选：
针对大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf3、orf4、orr5、 orf9基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了大肠杆菌O172型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖 单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O172型 的0抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应 的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相 应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中 的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列 于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高 度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTA AAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从 166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆 菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来 源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们 的来源都列于表中。
在第24组中含有大肠杆菌O172型的基因组DNA作为阳性对照。以每 组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在94℃预变性2分 钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时 间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10 分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶 电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf3、orf4、orf5基因，每个基因都有三对引物被检测， 每对引物除了在第24组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在 其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得 到任何PCR产物带，所以wzx、wzy、orf3、orf4、orf5基因对大肠杆菌O172 型及其O-抗原是高度特异的。orf9的三对引物在O12、O25、O26中得到大 小正确的带外，在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到 预期大小的产物。
最后，通过PCR从大肠杆菌O172型中筛选到对大肠杆菌O172型的O- 抗原高度特异的基因：wzx、wzy和三个糖基转移酶基因。而这些基因内的任 何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O172型的O-抗原是特异的，尤其是 上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O172型 是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中 的大肠杆菌O172型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠 杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构，共由10个基因组成，每个基因用方 框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放 阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它 们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗 原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列 出了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准 确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠 杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。 序列列表 <110>南开大学 <120>对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸 <130>对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸 <160>1 <170>PatentIn version 3.1 <210>1 <211>12850 <212>DNA <213>Escherichia coli <400>1 attgtggctg cagggaatca aagaaatcct cctggtaact cacgcgtcca agaacgcggt     60 cgaaaaccac ttcgacacct cttatgaatt agaatctctc cttgaacagc gcgtgaagcg    120 tcagctgctg gcggaagtgc agtccatctg tccgccgggc gtgaccatta tgaacgtgcg    180 tcagggcgaa cctttaggtt tgggccactc cattttatgt gcacgacccg ccattggtga    240 caacccattt gtcgtggtgc tgccagacgt tgtgatcgat gacgccagcg ccgacccgct    300 gcgctacaac cttgctgcca tgattgcgcg cttcaacgaa acgggtcgta gccaggtgct    360 ggcaaaacgt atgccgggcg atctctctga atactccgtc attcagacca aagagccgct    420 ggaccgtgaa ggcaaagtca gccgcattgt tgaatttatc gaaaaaccgg atcagccgca    480 gacgctggac tcagacatca tggccgttgg tcgctatgtg ctttctgcag atatttggcc    540 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agggtgtcta tttccattgt gatgattttt ttggttatat tatcagggat ctaagtgata   5280 ttaatgatgc ctttatttcg gaaattttaa gagttaataa gttaaataat caagaattct   5340 taaaaagata ccctttttat ataaactata agaaaaagca ctctgagtta ttatttctag   5400 agacaatgga atataatcga tgaaaattat tatatatgcg acagcagcag ttgatggtgg   5460 cgctctttcg cttttaaatg atttgctgga atatgcgaat gatgatattg ataatgaata   5520 tactgtttgc gttaatgaaa aattaaataa cgaagtgtct gtttacaata atttgacatt   5580 tttatttgtt gatactaaag cttggcataa aagggtttat tttgacttta tagggtttaa   5640 aaaaaacttt gataataaag attattgctt ggtaataaat ttgcaaaata taccagttcg   5700 gacacaatta aaacaaatat tgtacttgca tcagcctttg cctttttcgg atattaagtt   5760 aaatattttg gagaagcgta atagaaaatt gatattctat aaatacttat atggattaat   5820 aataaaattt aattcatgtt ttattgatca ttgcttagtg caaactgagt ggatgagaaa   5880 agctgttatt gataaactaa acctgtctga gaaaaaaata agtataatta gaccagtaat   5940 agatattgat ttgaacaaaa ttttaaaaaa tgaaaatgaa aatgaaaata cattcatcta   6000 tcccgcagca tcttatagtt ataaaaatca tataatattg gttgaatcat taaatatgat   6060 tggtgtggat tttttgtttc agaataagat aactgttata tttacattag atcgtgatga   6120 aaattcgaag ttgtttgatc ggataaaaaa atataatctt caagagatta ttaaatttac   6180 aggaaatatc ccaagatatg atgttttaaa ttacatttat aatgctaaag ccttactgtt   6240 tccatcaaga ctagaaacat ttggtatacc attgatagaa gctgtaaaat ttaattctaa   6300 cataattgta agtgatctac cttatgcgca cgacgtattg gatggttatg aaaatgtcaa   6360 atactgtaat cctgattctc cagaggattg gtctgaagca atcaaatttg ctatcaatct   6420 aaaagagaat aaattaaatc agggctttga attaaattca gggtggagag agttgagttc   6480 gattatttca actctttaat taggctagat ataaaaaggt gtggtatgtt taaagataaa   6540 gttttattaa taaccggtgg gactggttct tttggaaatg ctgtattgcg gcgatttctt   6600 gacacagata ttaaagaaat tcgtgttttt tcgcgtgatg aaaagaaaca agatgatatg   6660 cgaaaaaaat acaataatga taaattgaaa ttctatattg gtgatgtcag agattataga   6720 agtattttaa atgctacacg aggtgttgat tatatttatc atgcagctgc attaaaacaa   6780 gttccttcgt gtgaattcca tcctatggag gcagttaaga ccaacgtgtt aggtactgag   6840 aatgtgttgg aggctgcaat ttctaatgga gttaaacgag tagtttgttt gagtactgat   6900 aaagccgtgt accccattaa tgtaatgggg atttccaaag caatgatgga aaaagtaatt   6960 gtagcgaaat cgcgtaattt ggatagttct aaaactgtca tttgtggaac tcgctatggc   7020 aacgttatgg catcgcgtgg ctcagttatt cctctgtttg tggatttgat taaagcagga   7080 aaaccgctaa cagtgacgaa ccctgatatg acaaggttta tgatgacgct tgaagatgcg   7140 gtagacctag ttctttatgc atttgaacat ggtaataatg gcgatatttt cgtacaaaaa   7200 gcaccagcag ctaccattga aactttagca attgcactca aggaactatt gggtgctaat   7260 gaacatccgg tcaaaattat aggtaccaga cacggcgaaa aattatatga ggcgttattg   7320 agtcgtgaag agatgatcgc agcaatcgat atgggagaat attactgtgt tccgccagac   7380 ttgcgtgacc ttaactatag taaatatgtt gagcatggtg attgtcgaat ttcagaaatt   7440 gaagactata attcacacaa tacagtaagg ctggatgtta aaggaatgaa ggaattattg   7500 cttaaactac cgtttgttcg agctttgata gctggtgaag cttttgaatt ggattcataa   7560 tatgaaaata ctaattactg gttctaaagg ttttattgct cgtaatttaa tctatcgcct   7620 gcaggaagca ggctttaaag atttaattac gatcgaccgt gaatcacctt tgcaagagtt   7680 agaacaggga ctcaaaattg ctgattttat ttatcatctt gctggtgtaa ataggccaaa   7740 ggaagaacat gagtttcagg agggaaatac tgatcttaca aaattaattg ttgactatct   7800 gctttgtaat gcaaaaaaga ctcctattat gcttagttcc tccattcagg ctgaatgtga   7860 taacgcgtat ggaaaaagca aggcatcggc ggaaaaaatc attcaacatt atggtcatgt   7920 tagtggcgca gaatattata tctatcgatt accaaatgtg ttcggtaagt ggtgtcgacc   7980 aaattacaac tcctttgttg caactttttg tcataggata gcaaacgatc aagatattat   8040 cattcatgac ccgacagcag aggtcgagct tgtttatatt gatgattttt gtactgatgc   8100 tatcaactta ttaaataaca agtacgcgtc aggttttaaa aatataaagc cgacgtattc   8160 aataacagtg ggtgaggtag caaatctaat ttataaattt aaagaaagta gacatactct   8220 tattacggaa aatgttggtc agggtttttc acgagcgtta tattcaactt ggcttagtta   8280 cttgcaacca gagcagttcg tgtatgcagt gccttcctat agtgatgaaa gaggagtgtt   8340 ctgcgaggtc ttaaaaaccc attcctctgg acaattttca ttttttaccg cacttccagg   8400 agtaacgcgt ggagggcact atcatcatac aaagaatgaa aaatttatcg ttattcgtgg   8460 aacagcatgt tttaggttta aaaatgtttt aacaggagaa cgatatgaga ttaatgttgc   8520 gtcagatgaa tataaaattg tagaaactgt gccaggttgg tcccatgata ttactaatac   8580 cggtcatgat gaattaatcg taatgttgtg ggcgaatgaa atatttaatc gtgatcaacc   8640 tgatactata gcgagcgttt tatcatgaaa aaattgaaag tcatgtcggt tgttgggact   8700 cgtccagaaa ttattcgact ttcgcgtgtc cttgcaaaat tagatgaata ttgtgaccac   8760 cttattgttc atactggaca aaactacgat tatgaattga atgaagtttt tttcaaagat   8820 ttgggtgttc gcaaacctga ttattttctt aatgccgcag gtaaaaatgc agcagagact   8880 attggacaag ttattattaa agttgatgag gtccttgaac aggaaaaacc agaagccatg   8940 ttagttcttg gtgatactaa ctcctgtatt tcagcaatac cagcaaagcg tcgaagaatt   9000 ccgatcttcc atatggaggc tgggaatcgt tgttttgacc aacgcgtacc ggaagaaact   9060 aacagaaaaa tagttgacca taccgctgat atcaatatga catatagtga tatcgcgcgt   9120 gaatatcttc tggctgaagg tgtaccagcc gatagaatta ttaaaactgg tagcccaatg   9180 tttgaagtac tcacgcatta tatgccgcag attgatggtt ccgatgtact ttctcgcctg   9240 aatttaacac ctgggaattt ctttgtggta agtgcccaca gagaagaaaa tgttgatacc   9300 cctaaacagc ttgcgaaact ggcgaatata cttaataccg tagctgaaaa atatgatgtc   9360 ccggtagtcg tttctactca tcctcgcact cgtaaccgca tcaacgaaaa cggtattcaa   9420 ttccataaaa atatcttgct tcttaagcca ttaggatttc acgattacaa ccatctgcaa   9480 aaaaatgcgc gtgctgtttt atcggatagt gggactatta cagaagagtc ctccattatg   9540 aacttccctg cactcaatat acgagaagcg cacgaacgcc cggaaggctt cgaagaaggg   9600 gcagtaatga tggtcggcct tgaatctgag cgcgttttac aggcattaga aattatcgca   9660 acacagcctc gtggagaagt acgcttactc cgtcaggtca gtgactatag catgccaaat   9720 gtttcagata aagttgtgcg tattatccat tcatacactg actacgttaa acgggttgtc   9780 tggaagcaat actaatgaaa cttgcattaa tcattgatga ttatttgccc catagcacac   9840 gtgttggggc taaaatgttt catgagttag gccttgaatt gctgagcaga ggccatgatg   9900 taactgtaat tacgcctgac atcacattac aagtaatcta ttctgttagt atgattgatg   9960 gtataaaggt ttggcgtttc aaaagtggcc ctttaaagga tgtaggtaag gctaaacgtg  10020 ccataaatga aactctttta tcttttcgtg catggcgcgc atttaagcac ctcattcagc  10080 atgatacatt tgatggtatt gtttattatt ccccctctat tttttgggga gacttggtta  10140 aaaaaataaa acagcgatgc cagtgcccaa gctatctggt cctgagggat atgtttccac  10200 agtgggttat tgatgcaggt atgttgaaag ccggttcacc aattgaaaaa tatttcaggt  10260 attttgaaaa aaaatcatat cagcaggctg accggatagg gttaatgtct gataagaatc  10320 ttgagatatt tcgtcaggcc aataaaaatt atccgtgtga agttttacgt aattgggcct  10380 caatgactcc tgtgtctgcc agcgatgatt atcattcact tcgtcaaaaa tacgatctaa  10440 aagataaagt tatttttttc tatggcggaa atattgggca tgctcaagat atggcaaact  10500 taatgcgcct tgcgcgtgat atgatgcgtt atcatgatgc tcatttcctg tttatagggc  10560 agggtgatga agttgacctg ataaaatctc ttgctgtaga atggaattta actaatttca  10620 ttcatctacc ttcagtgacc caagaagagt tcaaattaat tttatctgaa gttgatgtcg  10680 gcctattctc cctttcatct cgccattctt cacataattt ccccgggaaa ttactcgggt  10740 atatggttca ttcaatcccg attcttggga gtgtgaatga cggcaatgat ttgatggata  10800 taattaacaa gcacagggcc ggttttattc atgttaatgg tgaagatgat aaactgtttg  10860 aatctgcaca attgcttctt agtgattcag ttttaagaaa acagttaggt cagaacgcta  10920 atgtgttgtt aaagtctcaa ttttcggttg aatcggcggc acatactatc gaagtccgac  10980 tggaggcagg agaatgcatt tagttgatga caatattctg gatgaacttt ttcgcactgc  11040 agtaaattct gaacgtttgc gcgctcatta tttattgcac gcatctcatc aggagaaagt  11100 tcaacgttta cttattgcat ttgtacgcga cagctatgtt gaaccccatt ggcatgagtt  11160 accgcatcag tgggaaatgt ttgtcgtcat gcaagggcaa ttagaagttt gtttgtatga  11220 gcaaaatggt gagatccaaa aaaagtttgt tgttggagac ggtacgggaa taagcgtcgt  11280 ggaattttcc ccaggagata tacatagtgt caaatgcctg tcaccaaaag cccttatgtt  11340 agagataaag gaggggccat ttgacccact gaaagctaag gttttttcta agtggttata  11400 gggcgataca tcaccgttta ttcttctatc ttattctata catgctgggt taccatctta  11460 gcttcttcaa gccgcacacc cgcagcgaac acccctgaca ggagtaaaca atgtcaaagc  11520 aacagatcgg cgtcgtcggt atggcagtaa tggggcgcaa ccttgcgctc aacatcgaaa  11580 gccgtggtta taccgtctct attttcaacc gttcccgtga gaagacggaa gaagtgattg  11640 ccgaaaatcc gggcaagaaa ctggttcctt actatacggt gaaagagttt gttgaatctc  11700 tggaaacgcc tcgtcgcatc ctgttaatgg tgaaagcagg tgcaggcacg gatgctgcta  11760 ttgattctct caagccatac ctcgataaag gcgacatcat cattgatggt ggtaacacct  11820 tcttccagga caccatccgt cgtaaccgtg agctttctgc agaaggcttt aacttcatcg  11880 gtaccggtgt ctccggcggt gaagaaggtg cgctgaaagg tccttccatt atgcctggtg  11940 ggcagaaaga agcctatgaa ctggttgcgc cgatcctgac caaaatcgcc gcagtggctg  12000 aagatggcga accgtgcgtt acctatattg gtgccgatgg tgcaggtcat tatgtgaaga  12060 tggttcacaa cggtattgaa tacggtgata tgcagctgat tgccgaagcc tattctctgc  12120 taaaaggtgg cctgaacctt accaacgaag aacttgcaca gacctttacc gaatggaata  12180 acggtgaact gagcagctac ctgatcgaca tcaccaaaga tatcttcacc aaaaaagatg  12240 aagacggtaa ctacctggtt gatgtgattc tggatgaagc agcaaacaaa ggtacgggta  12300 aatggaccag ccagagtgcg ctggatctcg gtgaaccgct gtcgctaatt accgagtctg  12360 tgtttgcacg ttatgtctct tctctgaaag atcagcgtgt tgccgcatct aaagttctct  12420 ctggcccgca agcgcagcca gctggcgaca aggctgagtt catcgaaaaa gttcgtcgtg  12480 cgctgtatct gggcaaaatc gtttcttacg cccagggctt ctctcagctg cgtgctgcgt  12540 ctgaagagta caactgggat ctgaactacg gcgaaatcgc gaagattttc cgtgctggct  12600 gcatcatccg tgcgcagttc ctgcagaaaa tcaccgatgc ttatgccgaa aatccacaga  12660 tcactaacct gctgctggct ccgtacttca agcaaattgc cgatgactac cagcaggcgc  12720 tgcgcgatgt cgtcgcatat gcagtacaga acggtatccc ggttccgacc ttcgccgctg  12780 cggttgccta ttatgacagc taccgtgccg ctgttctgcc tgcgaacctg atccaggcac  12840 agcgcgacta                                                         12850 表1大肠杆菌O172型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的
引物及PCR数据   基因     功能 基因的碱基     位置     正向引物     反向引物    PCR产物     的长度 产生正确 大小电泳 带的组数   PCR的退   火温度    (℃)   Wzx  O-抗原转运酶 1120-2388     1166-1182     1854-1870     705bp     0*     50     1415-1434     2286-2303     889bp     0*     51     1157-1174     1934-1951     7956p     0*     50   Wzy  O-抗原聚合酶 2381-3556     2610-2627     3452-3470     861bp     0*     50     2711-2728     3460-3477     767bp     0*     50     2742-2759     3480-3496     755bp     0*     50   orf3   糖基转移酶 3553-4335     3660-3677     4255-4274     615bp     0*     51     3728-3745     4296-4313     586bp     0*     51     3752-3769     4308-4325     574bp     0*     45   orf4   糖基转移酶 4335-5423     4391-4410     5211-5228     838bp     0*     50     4463-4470     5271-5289     827bp     0*     52     4515-4530     5396-5418     904bp     0*     53   orf5   糖基转移酶 5420-6499     5435-5452     5992-6009     613bp     0*     50     5687-5704     6230-6247     561bp     0*     50     5724-5741     6319-6336     613bp     0*     51   orf9   糖基转移酶 9795-11003     9825-9842     10687-10704     880bp     0**     50     10001-10017     10682-10699     699bp     0**     51     10201-10218     10954-10971     771bp     0**     51
*只在大肠杆菌O172型中得到正确的一条带
**在O12、O25、O26中得到大小正确的带
表2  166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号               该组中含有的菌株                                    来源
1    野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39                  IMVSa
2    野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100             IMVS
3    野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137      IMVS 4     野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12                   IMVS 5     野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22                 IMVS 6     野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30                   IMVS 7     野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42                   IMVS 8     野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53                   IMVS 9     野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61                   IMVS 10    野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70                   IMVS 11    野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81                   IMVS 12    野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90                   IMVS 13    野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101                  IMVS 14    野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118           IMVS 15    野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171           See b 16    野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132，         See c 17    野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143           IMVS 18    野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152           IMVS 19    野生型大肠杆菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，               IMVS 20    野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111                     IMVS 21    野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110                 IMVS 22    鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14                    See d 23    鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18         See d 24    痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8                       See d 25    痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13                                 See d 26    弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：7)F5(v：4)    See d 27    宋内氏志贺氏菌D5，DR                                                   See d  a.   Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia  b.   O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark  c.   172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVS  d.   中国预防医学科学院流行病学研究所 表3大肠杆菌O172型O抗原基因结构图 表4大肠杆菌O172型O抗原基因簇基因位置
 1 ATTGTGGCTG CAGGGAATCA AAGAAATCCT CCTGGTAACT CACGCGTCCA AGAACGCGGT
61 CGAAAACCAC TTCGACACCT CTTATGAATT AGAATCTCTC CTTGAACAGC GCGTGAAGCG    121 TCAGCTGCTG GCGGAAGTGC AGTCCATCTG TCCGCCGGGC GTGACCATTA TGAACGTGCG    181 TCAGGGCGAA CCTTTAGGTT TGGGCCACTC CATTTTATGT GCACGACCCG CCATTGGTGA    241 CAACCCATTT GTCGTGGTGC TGCCAGACGT TGTGATCGAT GACGCCAGCG CCGACCCGCT    301 GCGCTACAAC CTTGCTGCCA TGATTGCGCG CTTCAACGAA ACGGGTCGTA GCCAGGTGCT    361 GGCAAAACGT ATGCCGGGCG ATCTCTCTGA ATACTCCGTC ATTCAGACCA AAGAGCCGCT    421 GGACCGTGAA GGCAAAGTCA GCCGCATTGT TGAATTTATC GAAAAACCGG ATCAGCCGCA    481 GACGCTGGAC TCAGACATCA TGGCCGTTGG TCGCTATGTG CTTTCTGCAG ATATTTGGCC 541  GGAACTTGAA CGCACTCAGC CTGGTGCATG GGGGCGTATT CAGCTGACTG ATGCCATCGC 601  TGAACTGGCG AAAAAACAGT CCGTTGACGC CATGCTGATG ACTGGAGACA GCTACGACTG 661  TGGTAAAAAA ATGGGCTATA TGCAAGCGTT CGTGAAGTAT GGGCTGCGCA ACCTGAAAGA 721  AGGGGCGAAG TTCCGTAAAG GCATTGAGAA GCTGTTAAGC GAATAATGAA AATCTGACCG 781  GATGTAACGG TTGATAAGAA AATTATAACG GCAGTGAAGA TTCGTGGCGA AAGTAATTTG 841  TTGCGAATAT TCCTGCCGTT GTTTTATATA AACAATCAGA ATAACAACGA GTTAGCAATA 901  GGATTTTAGT CAAAGTTTTC CAGGATTTTC CTTGTTTCCA GAGCGGATTG GTAAGACAAT 961  TAGCGTTTGA ATTTTTCGGG TTTAGCGCGA GTGGGTAACG CTCGTCACAT CGTAGGCATG 1021 CATGCAGTGC TCTGGTAGCT GTAAAGCCAG GGGCGGTAGC GTACCTTTTA TATAGAGCTT
                               SD    orf1的起始 1141 ATCTTTATAA CCTCACTGAA CGCCCTGTTG ATGGTTAAAA TACTATCACC GAAAGATCTG 1201 GGGGTGTGGT ATGTTTTTAT GACTCTTCAA ACTTTAATAT TTACACTTAA TAATGCGATA 1261 ATACCTAACA TTGCTCGGCA ATATACATTG GGTAGCCTCA GTAAAGAATT AAACTTTAAT 1321 TGTTATATTT TTCATCGCTC AACTCAAAAG ACATTTATAT ATCTTATATT ATTGATATTA 1381 ATCATATGTG CAATTGCAAC ATTTACATAT TTGAGCTCTG TTTTAGCGAT CTTGGAATCA 1441 CAAAATAAAA TAGTCTTAGT TTCTTGGCTT ATAATCGTAT TCTCTTTGTG TTTGGAAGTT 1501 TATTATTCTT CATATGACTG TGCTTTTAAT GGGATGGGCA AATTTAAAAA TGTAAATAAA 1561 ATTAATTTTA TATCGCGGGC ATGTTTGTTT TTGATAAGTA TTGGCATGAT  AGCATATGAT 1621 ATTGATGGTA GAAATGCATT ATTATATTTT TGCATTGGTT ATTTTATTAG TAATTTAATA 1681 AAAAGATTTT TTATATACAG GCTATTTATA TCCAATTATC ATAATCTATG TTTTAATAGT 1741 GAATCTGATA CTGAATCTTT TTATAAAAAA AATGAAAAAA TAATACTCAA TTTGTCATGT 1801 ATGTCCTTTA TATCATCAAT TGGCGGGATG TTAATTGTGA GAGGTGGGAT GCTTATTCTA 1861 CCTTATTATG TATCTATCGA AGAAGTTGGT AAATATGGTC TAACTTATCA ATTGTTTGAG 1921 ATTGCTTTTA ATTTGCTATT CACTGCGTCA GCAATAAAAA CGCCTAGTTG GATTTTTTTG 1981 TATAAAGAAA ATAAGTGTGA GCTAAAAAAA TCATATTTAA AAATAAAATA TGTAAGTTTA 2041 ATTGTGATGG CAATAGGGGG GGGGGTGATC AGTTTTTATG GGGGGCAGAT ACTGTCACTG 2101 TTTGGACTGC ATGCAACATT ATTAACTACA AATTTGTGTT TACTTCTGAC ATTAATTTTT 2161 ATTTTACAAT TGAATCATAG TATATCAGGG CAGTTGTTAA CTATTCAGAA TAAAATACCT 2221 TATGCATATG CTTCTCTTTA TACAGGAATT GGGGTTGTTT TACTGTCGAT GATTTTTATA 2281 CCGATAACAG GATTCAAGGG AGCATTGGTT GCGATTTTTA TTTCCCAATT AGCATATAAT
                    SD            orf2的起始，orf1的终止 2401 TAAAAAAATC ACAAAGATGT TTGTCTTTTG TGAGTTTTTA TGTGGATTGT ATATTTTATT 2461 TTATGGTGAA TATGTCTCTG ACTATCTCAA TGTTGAAACA AATGTTAAGC ATATTTACAT 2521 AATATGTTTT CTTATTTGTA TCGTATTTTT TCATTATTTG TTTTTATATA GTTGGTGTAT 2581 ATTAAGTGTT TTGTTTTTCC GCAAAAGCAA ACTAACAACA TCAGTAAATA TTAATTCTAT 2641 ATTTTTGTTG TTAGTTATAA TATACTTTAT TTTTCTTCTC AAAACCGGAA GTGGAAAAGT 2701 ATATGCGGAC GGCGGTAGCA TAGGTGAATT AAGTAGTTTT GATAAGTTGT TATTTTTCCC 2761 AATAATAATT CTTAAACTTA ATTTTCTAAT ATACATATAT GCAGCGGGTT GTAAAAAAAA 2821 GGATAATATA TATTATCTTG TGCTATTTAT ATTTTTAATT TGTGAACTTT ATAGAGGTGT 2881 TTCATTTTCA ATATTACTGA TCGCTCTAAT TGAAATTGAG AAAATAAAAA GGTGTTTTAG 2941 GATTAAATGT TTGTTAATAT CACTGCCTCT TTTTGTCTTA TTTGTTAATA TAGTATATAA 3001 TATTAAATTT ATGGTAAGGT TAGGGGAGCA TTATGATTAT CTTGATATAT TCCAAACCTT 3061 AATAATGTTA CTTGGTAGGT TAAGTATAAT TTCAAATGTT TTGTATAATT ATGAGCATTT 3121 TTACTCAGTT AGCAACTTTG TAGAAGGTTT TGGTTATAGT GCGATAAATG AGTTTTTAGA 3181 AAAATTGACG CCAATGCCGT CATTATTTGG AATAACTGAA AAAACGACAG AAATAGGGAA 3241 GTTGATATTT TATCATTCAT ATGGAAGATG GGATAGTGCA ATTGCAATCT CTGTGTTAGG 3301 TATATTAAGT ATTGTGCCTG GACAACTATT AGAGATATGT GCAATTTTAA TTATTAGTTT 3361 TGTTTTTATT CAATTAATTA TAAATATGCT TGACAATACT GAGCAGCAAA ATACGGTTGC 3421 ATTTTTCTTC ATTATATTAA CTCTTTATCA GGGGTTTTGG GGGTTGCTGG CTAATTATGT 3481 CTATGCGCTA TTCATTTATT TAATTATTAT AGCATCTTGT AATTTAATGA TGTCTAAAAG
 SD  orf3的起始，orf2的终止 3601 CGAAGGACGA AATTTCAGGA AAGATTTTCT TTAGTCTCCA AATTGAAATT TCAATTTTTC 3661 GATGGCGTGT ATGGGAAGAA TATTCCAGAC GAGATTTTGA AAAGTATATA TGATGATAAA 3721 AAGGCTAAGT TGAAGATTAA CCGAAGTATG ACAGTAGGTG AAATTGGGGC AACATATTCA 3781 CATTACTTAA TATATAAAGA CGCATATGAA AAAAAACTTG ATTATCTAAT TGTACTCGAG 3841 GATGACTCTT TTGTAGATGA AAATTTTGAT GATGTAATTA ATAGGTTACT TGTAAAAATA 3901 ACACCAGATG ATGATGCTAT TATATTTATA CAAAAGCATA CCCTTGACTC TAAAGTGATT 3961 TTTAGTCGAA AAAAAGATAT ATTGAAAAAC GGTTTTGAGT TGGTAAAAAT GTTAGGAAGT 4021 TCACAATATT TTGTTGGGTC ATATGGCTAT ATTCTAACTA AAAAATCAAT TAACAAAATA 4081 ATACAGAACT ATTTGCCAAT ATATTGTGTT TGCGACCATT GGTTCTTTAT TAAAAAAGAT 4141 AGTAAGATAG AGTCATTTTA TTGTGTGAGC CCAAGTTTAG TATATACTAA TGATGAAGAT 4201 ATTAGACTGG TTGATAGTTT TATCAATGAA GAAAGGAAAA ATGTTCTGAA AAATCGAGGT
                                                 SD 4321 AAGGATTGGG AA TAGTGTTT TATATTTGTA AGGTAATCAC CGTTTTAATC AAGGTTATAA
        orf3的终止；orf4的起始 4381 TTTCATTCTT GGTGTTTCCA TTGTGTAAGC CATTTAGTAA TAAAAATAAA AAAGTGGTTG 4441 TAATAGGAAC TCGAAATGGA AATCAAGGTA ATGATAATGG TGAGGTTTTT TATTCATATT 4501 TAAATGACAA TAATGACAAT GACGATCTTC TGGTTTATTT AATACGGAGA AGTAAGAATA 4561 AGGAGAAATA TAAAAATATC CTAATAAAAA ACTCCATCAG AGCTAACATT AAGATTTTAA 4621 GTGCGGACAT ATTATATATA ACACATTCAG AATCAGATTT AATTGACTTC TGGTGGCGAT 4681 TCGTTACTTA TAAAAAAATA GTTTTTATTC AGCATGGTGT TATAGGAATA AAAAGACTTC 4741 CTGAGTACGA AAAGAAAAAA TTCTCTCTTT TTGTTTCAAG CAACAATTAT GAATATGAGA 4801 TTTTGATTAA ATATTATAAT ATATGTAGCG AAAGAATAGT TAAATCAGGA ATACCTAGGT 4861 TTGATAATTA TACTATATTG AACGAAGCCC CACAGAAAAT AAAAAAATGC CTAGTCATGT 4921 TTACATGGCG AAAATTTTAT AAAGATGAAC AATCAATCAG ATTGAAGCGT GTTATTAGTA 4981 CAATAATTAG AAATGAGCCT TCAATAAAGA TATACGTTGC ATCGCACGAA TTATCTGATT 5041 ATTCACTGTC AGAATTTGAA TTTTATAATA TCAATTATGT GGAATCAATA GGTATACAGA 5101 ATGCAATTAA AGAGTGTGAT CTATTAATAA CTGATTTTTC AAGTATTGCT TGGGATTTTT 5161 TATATCAAAA TAAATTGATT TGCTTTATAC AAACTGATTA TTTAGAATAT GTTTTCAATG 5221 AGGGTGTCTA TTTCCATTGT GATGATTTTT TTGGTTATAT TATCAGGGAT CTAAGTGATA 5281 TTAATGATGC CTTTATTTCG GAAATTTTAA GAGTTAATAA GTTAAATAAT CAAGAATTCT 5341 TAAAAAGATA CCCTTTTTAT ATAAACTATA AGAAAAAGCA CTCTGAGTTA TTATTTCTAG
    SD          orf5的起始，orf4的终止 5461 CGCTCTTTCG CTTTTAAATG ATTTGCTGGA ATATGCGAAT GATGATATTG ATAATGAATA 5521 TACTGTTTGC GTTAATGAAA AATTAAATAA CGAAGTGTCT GTTTACAATA ATTTGACATT 5581 TTTATTTGTT GATACTAAAG CTTGGCATAA AAGGGTTTAT TTTGACTTTA TAGGGTTTAA 5641 AAAAAACTTT GATAATAAAG ATTATTGCTT GGTAATAAAT TTGCAAAATA TACCAGTTCG 5701 GACACAATTA AAACAAATAT TGTACTTGCA TCAGCCTTTG CCTTTTTCGG ATATTAAGTT 5761 AAAATTTTTG GAGAAGCGTA ATAGAAAATT GATATTCTAT AATAACTTAT ATGGATTAAT 5821 AATAAAATTT AATTCATGTT TTATTGATCA TTGCTTAGTG CAAACTGAGT GGATGAGAAA 5881 AGCTGTTATT GATAAACTAA ACCTGTCTGA GAAAAAAATA AGTATAATTA GACCAGTAAT 5941 AGATATTGAT TTGAACAAAA TTTTAAAAAA TGAAAATGAA AATGAAAATA CATTCATCTA 6001 TCCCGCAGCA TCTTATAGTT ATAAAAATCA TATAATATTG GTTGAATCAT TAAATATGAT 6061 TGGTGTGGAT TTTTTGTTTC AGAATAAGAT AACTGTTATA TTTACATTAG ATCGTGATGA 6121 AAATTCGAAG TTGTTTGATC GGATAAAAAA ATATAATCTT CAAGAGATTA TTAAATTTAC 6181 AGGAAATATC CCAAGATATG ATGTTTTAAA TTACATTTAT AATGCTAAAG CCTTACTGTT 6241 TCCATCAAGA CTAGAAACAT TTGGTATACC ATTGATAGAA GCTGTAAAAT TTAATTCTAA 6301 CATAATTGTA AGTGATCTAC CTTATGCGCA CGACGTATTG GATGGTTATG AAAATGTCAA 6361 ATACTGTAAT CCTGATTCTC CAGAGGATTG GTCTGAAGCA ATCAAATTTG CTATCAATCT 6421 AAAAGAGAAT AAATTAAATC AGGGCTTTGA ATTAAATTCA GGGTGGAGAG AGTTGAGTTC
          orf5的终止                SD     orf6的起始 6541 GTTTTATTAA TAACCGGTGG GACTGGTTCT TTTGGAAATG CTGTATTGCG GCGATTTCTT 6601 GACACAGATA TTAAAGAAAT TCGTGTTTTT TCGCGTGATG AAAAGAAACA AGATGATATG 6661 CGAAAAAAAT ACAATAATGA TAAATTGAAA TTCTATATTG GTGATGTCAG AGATTATAGA 6721 AGTATTTTAA ATGCTACACG AGGTGTTGAT TATATTTATC ATGCAGCTGC ATTAAAACAA 6781 GTTCCTTCGT GTGAATTCCA TCCTATGGAG GCAGTTAAGA CCAACGTGTT AGGTACTGAG 6841 AATGTGTTGG AGGCTGCAAT TTCTAATGGA GTTAAACGAG TAGTTTGTTT GAGTACTGAT 6901 AAAGCCGTGT ACCCCATTAA TGTAATGGGG ATTTCCAAAG CAATGATGGA AAAAGTAATT 6961 GTAGCGAAAT CGCGTAATTT GGATAGTTCT AAAACTGTCA TTTGTGGAAC TCGCTATGGC 7021 AACGTTATGG CATCGCGTGG CTCAGTTATT CCTCTGTTTG TGGATTTGAT TAAAGCAGGA 7081 AAACCGCTAA CAGTGACGAA CCCTGATATG ACAAGGTTTA TGATGACGCT TGAAGATGCG 7141 GTAGACCTAG TTCTTTATGC ATTTGAACAT GGTAATAATG GCGATATTTT CGTACAAAAA 7201 GCACCAGCAG CTACCATTGA AACTTTAGCA ATTGCACTCA AGGAACTATT GGGTGCTAAT 7261 GAACATCCGG TCAAAATTAT AGGTACCAGA CACGGCGAAA AATTATATGA GGCGTTATTG 7321 AGTCGTGAAG AGATGATCGC AGCAATCGAT ATGGGAGAAT ATTACTGTGT TCCGCCAGAC 7381 TTGCGTGACC TTAACTATAG TAAATATGTT GAGCATGGTG ATTGTCGAAT TTCAGAAATT 7441 GAAGACTATA ATTCACACAA TACAGTAAGG CTGGATGTTA AAGGAATGAA GGAATTATTG
                                                     SD      orf6的终止 7561 T ATGAAAATA CTAATTACTG GTTCTAAAGG TTTTATTGCT CGTAATTTAA TCTATCGCCT  orf7的起始 7621 GCAGGAAGCA GGCTTTAAAG ATTTAATTAC GATCGACCGT GAATCACCTT TGCAAGAGTT 7681 AGAACAGGGA CTCAAAATTG CTGATTTTAT TTATCATCTT GCTGGTGTAA ATAGGCCAAA 7741 GGAAGAACAT GAGTTTCAGG AGGGAAATAC TGATCTTACA AAATTAATTG TTGACTATCT 7801 GCTTTGTAAT GCAAAAAAGA CTCCTATTAT GCTTAGTTCC TCCATTCAGG CTGAATGTGA 7861 TAACGCGTAT GGAAAAAGCA AGGCATCGGC GGAAAAAATC ATTCAACATT ATGGTCATGT 7921 TAGTGGCGCA GAATATTATA TCTATCGATT ACCAAATGTG TTCGGTAAGT GGTGTCGACC 7981 AAATTACAAC TCCTTTGTTG CAACTTTTTG TCATAGGATA GCAAACGATC AAGATATTAT 8041 CATTCATGAC CCGACAGCAG AGGTCGAGCT TGTTTATATT GATGATTTTT GTACTGATGC 8101 TATCAACTTA TTAAATAACA AGTACGCGTC AGGTTTTAAA AATATAAAGC CGACGTATTC 8161 AATAACAGTG GGTGAGGTAG CAAATCTAAT TTATAAATTT AAAGAAAGTA GACATACTCT 8221 TATTACGGAA AATGTTGGTC AGGGTTTTTC ACGAGCGTTA TATTCAACTT GGCTTAGTTA 8281 CTTGCAACCA GAGCAGTTCG TGTATGCAGT GCCTTCCTAT AGTGATGAAA GAGGAGTGTT 8341 CTGCGAGGTC TTAAAAACCC ATTCCTCTGG ACAATTTTCA TTTTTTACCG CACTTCCAGG 8401 AGTAACGCGT GGAGGGCACT ATCATCATAC AAAGAATGAA AAATTTATCG TTATTCGTGG 8461 AACAGCATGT TTTAGGTTTA AAAATGTTTT AACAGGAGAA CGATATGAGA TTAATGTTGC 8521 GTCAGATGAA TATAAAATTG TAGAAACTGT GCCAGGTTGG TCCCATGATA TTACTAATAC 8581 CGGTCATGAT GAATTAATCG TAATGTTGTG GGCGAATGAA ATATTTAATC GTGATCAACC
         SD      orf8的起始，orf7的终止 8701 CGTCCAGAAA TTATTCGACT TTCGCGTGTC CTTGCAAAAT TAGATGAATA TTGTGACCAC 8761 CTTATTGTTC ATACTGGACA AAACTACGAT TATGAATTGA ATGAAGTTTT TTTCAAAGAT 8821 TTGGGTGTTC GCAAACCTGA TTATTTTCTT AATGCCGCAG GTAAAAATGC AGCAGAGACT 8881 ATTGGACAAG TTATTATTAA AGTTGATGAG GTCCTTGAAC AGGAAAAACC AGAAGCCATG 8941 TTAGTTCTTG GTGATACTAA CTCCTGTATT TCAGCAATAC CAGCAAAGCG TCGAAGAATT 9001 CCGATCTTCC ATATGGAGGC TGGGAATCGT TGTTTTGACC AACGCGTACC GGAAGAAACT 9061 AACAGAAAAA TAGTTGACCA TACCGCTGAT ATCAATATGA CATATAGTGA TATCGCGCGT 9121 GAATATCTTC TGGCTGAAGG TGTACCAGCC GATAGAATTA TTAAAACTGG TAGCCCAATG 9181 TTTGAAGTAC TCACGCATTA TATGCCGCAG ATTGATGGTT CCGATGTACT TTCTCGCCTG 9241 AATTTAACAC CTGGGAATTT CTTTGTGGTA AGTGCCCACA GAGAAGAAAA TGTTGATACC 9301  CCTAAACAGC TTGCGAAACT GGCGAATATA CTTAATACCG TAGCTGAAAA ATATGATGTC 9361  CCGGTAGTCG TTTCTACTCA TCCTCGCACT CGTAACCGCA TCAACGAAAA CGGTATTCAA 9421  TTCCATAAAA ATATCTTGCT TCTTAAGCCA TTAGGATTTC ACGATTACAA CCATCTGCAA 9481  AAAAATGCGC GTGCTGTTTT ATCGGATAGT GGGACTATTA CAGAAGAGTC CTCCATTATG 9541  AACTTCCCTG CACTCAATAT ACGAGAAGCG CACGAACGCC CGGAAGGCTT CGAAGAAGGG 9601  GCAGTAATGA TGGTCGGCCT TGAATCTGAG CGCGTTTTAC AGGCATTAGA AATTATCGCA 9661  ACACAGCCTC GTGGAGAAGT ACGCTTACTC CGTCAGGTCA GTGACTATAG CATGCCAAAT 9721  GTTTCAGATA AAGTTGTGCG TATTATCCAT TCATACACTG ACTACGTTAA ACGGGTTGTC   SD         orf8的终止，orf9的起始 9841  GTGTTGGGGC TAAAATGTTT CATGAGTTAG GCCTTGAATT GCTGAGCAGA GGCCATGATG 9901  TAACTGTAAT TACGCCTGAC ATCACATTAC AAGTAATCTA TTCTGTTAGT ATGATTGATG 9961  GTATAAAGGT TTGGCGTTTC AAAAGTGGCC CTTTAAAGGA TGTAGGTAAG GCTAAACGTG 10021 CCATAAATGA AACTCTTTTA TCTTTTCGTG CATGGCGCGC ATTTAAGCAC CTCATTCAGC 10081 ATGATACATT TGATGGTATT GTTTATTATT CCCCCTCTAT TTTTTGGGGA GACTTGGTTA 10141 AAAAAATAAA ACAGCGATGC CAGTGCCCAA GCTATCTGGT CCTGAGGGAT ATGTTTCCAC 10201 AGTGGGTTAT TGATGCAGGT ATGTTGAAAG CCGGTTCACC AATTGAAAAA TATTTCAGGT 10261 ATTTTGAAAA AAAATCATAT CAGCAGGCTG ACCGGATAGG GTTAATGTCT GATAAGAATC 10321 TTGAGATATT TCGTCAGGCC AATAAAAATT ATCCGTGTGA AGTTTTACGT AATTGGGCCT 10381 CAATGACTCC TGTGTCTGCC AGCGATGATT ATCATTCACT TCGTCAAAAA TACGATCTAA 10441 AAGATAAAGT TATTTTTTTC TATGGCGGAA ATATTGGGCA TGCTCAAGAT ATGGCAAACT 10501 TAATGCGCCT TGCGCGTGAT ATGATGCGTT ATCATGATGC TCATTTCCTG TTTATAGGGC 10561 AGGGTGATGA AGTTGACCTG ATAAAATCTC TTGCTGTAGA ATGGAATTTA ACTAATTTCA 10621 TTCATCTACC TTCAGTGACC CAAGAAGAGT TCAAATTAAT TTTATCTGAA GTTGATGTCG 10681 GCCTATTCTC CCTTTCATCT CGCCATTCTT CACATAATTT CCCCGGGAAA TTACTCGGGT 10741 ATATGGTTCA TTCAATCCCG ATTCTTGGGA GTGTGAATGA CGGCAATGAT TTGATGGATA 10801 TAATTAACAA GCACAGGGCC GGTTTTATTC ATGTTAATGG TGAAGATGAT AAACTGTTTG 10861 AATCTGCACA ATTGCTTCTT AGTGATTCAG TTTTAAGAAA ACAGTTAGGT CAGAACGCTA 10921 ATGTGTTGTT AAAGTCTCAA TTTTCGGTTG AATCGGCGGC ACATACTATC GAAGTCCGAC    SD          orf10的起始    orf9的终止 11041 AGTAAATTCT GAACGTTTGC GCGCTCATTA TTTATTGCAC GCATCTCATC AGGAGAAAGT 11101 TCAACGTTTA CTTATTGCAT TTGTACGCGA CAGCTATGTT GAACCCCATT GGCATGAGTT 11161 ACCGCATCAG TGGGAAATGT TTGTCGTCAT GCAAGGGCAA TTAGAAGTTT GTTTGTATGA 11221 GCAAAATGGT GAGATCCAAA AAAAGTTTGT TGTTGGAGAC GGTACGGGAA TAAGCGTCGT 11281 GGAATTTTCC CCAGGAGATA TACATAGTGT CAAATGCCTG TCACCAAAAG CCCTTATGTT 11341 AGAGATAAAG GAGGGGCCAT TTGACCCACT GAAAGCTAAG GTTTTTTCTA AGTGGTTATA 11401 GGGCGATACA TCACCGTTTA TTCTTCTATC TTATTCTATA CATGCTGGGT TACCATCTTA orfl0的终止
11461 GCTTCTTCAA GCCGCACACC CGCAGCGAAC ACCCCTGACA GGAGTAAACA ATGTCAAAGC
11521 AACAGATCGG CGTCGTCGGT ATGGCAGTAA TGGGGCGCAA CCTTGCGCTC AACATCGAAA
11581 GCCGTGGTTA TACCGTCTCT ATTTTCAACC GTTCCCGTGA GAAGACGGAA GAAGTGATTG
11641 CCGAAAATCC GGGCAAGAAA CTGGTTCCTT ACTATACGGT GAAAGAGTTT GTTGAATCTC
11701 TGGAAACGCC TCGTCGCATC CTGTTAATGG TGAAAGCAGG TGCAGGCACG GATGCTGCTA
11761 TTGATTCTCT CAAGCCATAC CTCGATAAAG GCGACATCAT CATTGATGGT GGTAACACCT
11821 TCTTCCAGGA CACCATCCGT CGTAACCGTG AGCTTTCTGC AGAAGGCTTT AACTTCATCG
11881 GTACCGGTGT CTCCGGCGGT GAAGAAGGTG CGCTGAAAGG TCCTTCCATT ATGCCTGGTG
11941 GGCAGAAAGA AGCCTATGAA CTGGTTGCGC CGATCCTGAC CAAAATCGCC GCAGTGGCTG
12001 AAGATGGCGA ACCGTGCGTT ACCTATATTG GTGCCGATGG TGCAGGTCAT TATGTGAAGA
12061 TGGTTCACAA CGGTATTGAA TACGGTGATA TGCAGCTGAT TGCCGAAGCC TATTCTCTGC
12121 TAAAAGGTGG CCTGAACCTT ACCAACGAAG AACTGTCACA GACCTTTACC GAATGGAATA
12181 ACGGTGAACT GAGCAGCTAC CTGATCGACA TCACCAAAGA TATCTTCACC AAAAAAGATG
12241 AAGACGGTAA CTACCTGGTT GATGTGATTC TGGATGAAGC AGCAAACAAA GGTACGGGTA
12301 AATGGACCAG CCAGAGTGCG CTGGATCTCG GTGAACCGCT GTCGCTAATT ACCGAGTCTG
12361 TGTTTGCACG TTATGTCTCT TCTCTGAAAG ATCAGCGTGT TGCCGCATCT AAAGTTCTCT
12421 CTGGCCCGCA AGCGCAGCCA GCTGGCGACA AGGCTGAGTT CATCGAAAAA GTTCGTCGTG
12481 CGCTGTATCT GGGCAAAATC GTTTCTTACG CCCAGGGCTT CTCTCAGCTG CGTGCTGCGT
12541 CTGAAGAGTA CAACTGGGAT CTGAACTACG GCGAAATCGC GAAGATTTTC CGTGCTGGCT
12601 GCATCATCCG TGCGCAGTTC CTGCAGAAAA TCACCGATGC TTATGCCGAA AATCCACAGA
12661 TCACTAACCT GCTGCTGGCT CCGTACTTCA AGCAAATTGC CGATGACTAC CAGCAGGCGC
12721 TGCGCGATGT CGTCGCATAT GCAGTACAGA ACGGTATCCC GGTTCCGACC TTCGCCGCTG
12781 CGGTTGCCTA TTATGACAGC TACCGTGCCG CTGTTCTGCC TGCGAACCTG ATCCAGGCAC
12841 AGCGCGACTA
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上 的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。