通过交流动电学检测生物标志物的方法
阅读：758发布：2020-05-16
专利汇可以提供通过交流动电学检测生物标志物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述当将 生物 样品施加到芯片上实验室上时，通过定量阻抗随着时间推移的变化用于检测病原体、感染性 疾病 和生理状况的方法。芯片上实验室采用交流动电学(ACEK)现象，使得分子在通过向芯片上实验室的 电极 阵列施加预定幅度和 频率 的电 信号 产生的 电场 中移动或被携带。，下面是通过交流动电学检测生物标志物的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测样品中的生物标志物的方法，包括：
通过用涂层材料包被电极阵列使所述电极阵列功能化，所述电极阵列包含多个电极；
向所述电极阵列施加所述样品；
使用控制器控制阻抗读取电路，以测量最初施加所述样品时所述电极阵列阻抗的初始值；
使用控制器控制耦合至所述电极阵列的信号发生器，以产生电信号，并在测量阻抗的初始值之后将电信号施加到所述电极阵列，所述电信号具有固定幅度和固定频率；
使用控制器控制所述阻抗读取电路，以在测量阻抗的初始值之后预定的时间段测量所述电极阵列的阻抗与时间的关系；和
相对于阻抗的初始值计算所述电极阵列的阻抗与时间的关系的变化。
2.权利要求1的方法，还包括：当所述电极阵列的阻抗变化超过预定的阈值时，指示存在疾病或状况。
3.权利要求1的方法，还包括：当所述电极阵列的阻抗变化超过预定的阈值时，指示存在以下中的一种：约内氏病、乳腺炎、妊娠、结核病、凝血、心脏病发作、流感和糖尿病。
4.权利要求1的方法，其中所述涂层材料包含结合生物标志物的分子。
5.权利要求1的方法，其中所述涂层材料包含与生物标志物反应的分子。
6.权利要求1的方法，其中所述涂层材料包含抗原、抗体、蛋白质、肽、核酸、脂质和酶中的一种或多种。
7.权利要求1的方法，其中所述生物标志物为抗原、抗体、蛋白质、肽、核酸、激素、脂质、糖和探针分子中的一种或多种。
8. 权利要求1的方法，还包括：在向所述电极阵列施加所述样品之前，
混合所述样品与预定浓度的标记颗粒，所述标记颗粒用对所述生物标志物特异性的接头分子功能化；和
温育所述样品与所述标记颗粒的混合物。
9.权利要求8的方法，其中所述标记颗粒为胶乳珠、磁珠和微生物中的一种。
10.权利要求1的方法，还包括：在使所述电极阵列功能化之前，用预包被材料包被所述电极阵列。
11.权利要求10的方法，其中所述预包被材料为3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)或聚吡咯。
12. 权利要求1的方法，其中所述电信号为具有小于10 Vrms的幅度和小于10 MHz的频率的电压信号。
13.权利要求1的方法，其中所述电极阵列以集成电路提供。
14.权利要求1的方法，其中所述预定的时间段为少于10分钟。
15.权利要求1的方法，其中将所述样品施加于所述电极阵列仅一次。
16.权利要求1的方法，其中所述电极阵列为共面电极阵列。
17.权利要求1的方法，其中所述电极阵列中的所述多个电极为平行板电极。
通过交流动电学检测生物标志物的方法
[0001] 相关申请的交叉参考这是2014年7月24日递交的美国国家阶段申请第14/374312号(基于2013年1月22日递交的国际申请第PCT/US2013/022447号)的部分继续，并且要求2012年1月27日递交的美国临时专利申请第61/591713号的优先权权益，其整个公开内容通过参照结合到本文中。
技术领域
[0003] 本发明主要涉及采用用于实地(即现场、床边、无实验室)检测许多病原体、疾病和生理状况或其指标的交流动电学(ACEK)，用于检测例如生物样品中的生物标志物的方法和相关装置，并且更具体地涉及通过这样的方法和装置现场检测用于诊断动物的细菌性疾病比如约内氏病(Johne's disease)和乳腺炎的抗体、用于诊断动物和人的结核病的抗体、用于诊断动物和人的肺栓塞的D-二聚体、用于诊断妊娠的小分子(例如孕酮)、用于诊断糖尿病的糖(例如葡萄糖)和酶(例如葡萄糖氧化酶)以及作为心脏病发作指标的其他酶。
背景技术
[0004] 介电电泳、交流(alternating current, AC)电热效应和AC电渗现象统称为交流(AC)动电学(ACEK)，现被用于在细胞尺度上操纵和分离颗粒。介电电泳(DEP)涉及在非均匀电场中悬浮介电颗粒。如同将在本文进一步讨论的那样，可自例如包被待测物质的分子探针(比如细菌抗原)的两个(或更多个)电极阵列认识到电容和阻抗的变化。如果极化颗粒悬浮在这样的场中，诱导偶极子将跨颗粒形成，并与场同步旋转或移动。此外，如本文将描绘和讨论的那样，AC电热和AC电渗现象或效应会诱导电极周围的微尺度流动，使颗粒/胶体/大分子向电极对流用于检测。
[0005] 叉指型微电极或两个紧密间隔的平行板为已知的，并且见述于例如Capacitive Microsystems for Biological Sensing (用于生物传感的电容微系统), V. Tsouti 等, Biosensors and Biolelectronics, 27, (2011), 第1-11页。在简化的形式中，电容式传感器的电极可包含两个具有特定间隔和厚度的紧密间隔的平行板。可形成具有两个电极的并联电容器。众所周知，并联的单个电容器之和包括并联电容器的电容。尽管被描述为电容器，但是没有电容器在没有产生阻抗的电阻和电感组件情况下呈现出完美的电容。然而，这种电容微系统的电阻和电感组件与电容组件相比较少指示表面结合。这种生物传感器已被特别开发和用于例如检测大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌属(salmonella)。已知另一种电极阵列用于前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)测试。又一种原型测试集成电路已被开发用于某些蛋白质检测。
[0006] 约内氏病由称为鸟分枝杆菌副结核型亚种(Mycobacteriumavium subspecies paratuberculosis)的细菌引起。约内氏病影响野生动物和家畜。在家畜比如牛或奶牛中，疾病导致奶产量下降(奶牛)、重量减轻和过早扑杀临床受影响的动物。仅在美国，已在68%的奶牛群中发现了约内氏病，并且仅对美国乳制品行业便造成每年估计2.2亿美元的损失。约内氏病目前在诊断实验室中采用免疫测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)或病原体检测方法(指示感染或污染的细菌培养或PCR)诊断。
[0007] 牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)在动物和人两者中引起牛结核病。尽管自美国家畜根除牛结核病取得了进展，但是像密歇根(Michigan)和明尼苏达(Minnesota)等州在其野生动物和养牛行动中仍在与牛结核病作斗争。牛的强制测试仅在明尼苏达州每年就要花费325万美元。在美国，在2008-2009年牛结核病的发病花费超过4000万美元用于测试和治疗。野生动物的牛结核病目前通过肉眼损害的尸检、细菌培养和皮肤测试来测试。
[0008] 在一千多万人中发生由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的人结核病，并且在世界范围内估计每年造成两百万人死亡。据估计，全世界每年超过10亿美元用于诊断和评估人结核病。人结核病目前是通过放射成像(常规胸部x光)、涂片镜检、细菌培养或结核菌素皮肤测试来诊断。
[0009] 乳腺炎是一种主要由细菌感染引起的导致乳腺炎症的疾病。这种疾病是成年奶牛最常见的死亡原因。确实，据估计全部奶牛中有38%患有乳腺炎。乳腺炎每年给美国乳制品行业造成估计17-20亿美元的经济损失。在世界范围内，这是影响乳制品行业最昂贵的疾病，造成的经济损失估计为500亿美元/年( 310亿英镑/年)。大肠杆菌和乳房链球菌~(Streptococcus uberis)为牛乳腺炎的常见病原体，并且分别造成该种疾病的约18%和5%。
乳腺炎奶牛的牛奶中细菌计数可达到107个细菌/mL。授乳动物乳腺炎的另一个指征是体细胞白血球计数，其可通过混合感染奶牛的牛奶与试剂测定，并且形成的凝胶量表明体细胞计数，并因此为乳腺炎的指征。鲜奶中细菌的检测与鉴定对奶牛场疾病的治疗和控制至关重要。
乳腺炎奶牛的牛奶中细菌计数可达到107个细菌/mL。授乳动物乳腺炎的另一个指征是体细胞白血球计数，其可通过混合感染奶牛的牛奶与试剂测定，并且形成的凝胶量表明体细胞计数，并因此为乳腺炎的指征。鲜奶中细菌的检测与鉴定对奶牛场疾病的治疗和控制至关重要。
[0010] 自转让于田纳西大学研究基金会(University of Tennessee Research Foundation)的美国专利第7517955和7812147号可知，包括Stephen P. Oliver等人在内的团队开发了名为“乳房链球菌粘附分子”或SUAM的多肽。SUAM可用于诊断和治疗。这些专利进一步描述了可用于“牛旁(cow-side)”诊断的免疫荧光牛奶卡片测试和凝集/沉淀测试，以及已知的ELISA测试，其可能在实验室中需要数小时得到结果。
[0011] 在家中和野外，如果如已对其他疾病开发的那样，集成电路(芯片)上的实验室和相关的方法可用于快速测试野生动物、家畜和人的疾病和生理状况比如细菌性疾病，包括结核病、约内氏病、乳腺炎和心脏病发作的情况等诊断，这将是有益的。
[0012] D-二聚体是凝块降解的指标，并且因此为肺栓塞、深部静脉血栓形成等的预测因子或指标。凝块通常是致命的，例如可在静脉内形成并返回心脏的凝块。合乎需要的是有一种芯片上实验室(lab-on-a-chip)测试用于检测D-二聚体。
[0013] 高/低糖含量(例如血液和其他体液的葡萄糖)在糖相关疾病的预测因子中为高或低血糖症的指标。糖含量的芯片上实验室测试可助于患者和医生立即确定这种与糖有关的缓解，并与现有方法学竞争。此外，可能的工业或商业应用为例如测试啤酒的糖含量。
[0014] 小分子检测通常与可能为病情预测因子的任何小分子有关。具体地讲，例如可为合乎需要的是测试孕酮作为状况比如妊娠的实例。
[0015] 酶为例如在人器官或骨骼结构的活细胞中产生的复合物。因此，尽管ELISA测试是可用的，但是需要一种简单的用于可为器官疾病标志物的酶水平的芯片上实验室测试，并在数分钟内完成ELISA可能需要正式实验室和数天获得结果的工作。
[0016] 另一种潜在的芯片上实验室应用为测试井水的大肠菌群(coliform)或水中大肠杆菌细菌而不是等待本领域已知的其他缓慢的实验室手段来进行测试培养。另一种需要擦拭(swabbing)和测试的细菌为链球菌属(Streptococcus)，其为例如链球菌性咽喉炎的指标。
[0017] 鉴于上述情况，需要的是方法和相关芯片上实验室装置，其可提供例如采用ACEK现象，通过生物标志物检测细菌性疾病和其他感染性疾病、病况或者甚至用于商业应用。
发明内容
[0019] 本发明通过提供具有电极阵列或特殊制作的电极阵列的装置比如成品的表面声波共振器来满足以上确定的需求。各自的电极阵列可包含用于检测病原体、疾病和生理状况的芯片上实验室。研究与制作的电极阵列有关的参数以提高病原体、疾病或生理状况的检测限。对于乳腺炎的体白细胞计数，设计了另一种特殊阵列，其包含具有不同大小开口的第一和第二叠置电极网格(第一和第二网络格)，如本文连同图19A-19D的讨论进一步定义的那样。此外，对约内氏病、结核病、病原体检测(乳腺炎)、体细胞检测(乳腺炎)、蛋白质检测(妊娠)、小分子和D-二聚体中的每种检测，将描述通用方法。所描述的电极阵列平台为助于任何基于非均相反应的检测/测定的平台技术。文献已充分记载，阻抗传感可用于免疫诊断、DNA测定和酶传感。所公开的平台整体上改善基于非均相的阻抗传感。适用于所公开平台的阻抗生物传感器包括以上介绍的3种类型(即用于抗原/抗体、DNA、RNA (核酸)和酶检测的生物传感器)，并且进一步包括葡萄糖作为糖的实例、D-二聚体作为蛋白生物标志物的一个实例、孕酮作为小分子的一个实例和乳房链球菌(S. uberis)作为包括细菌和细胞在内的微生物的实例。
[0020] 在一个实施方案中，本发明包含叉指电极阵列比如常规表面声波(SAW)共振器(433.92 MHz，可得自AVX Corporation，PARS 433.92)的电极阵列，具有间隔约2 μm远的交错式电极，即每个电极指宽度1-3微米和彼此分开1-3微米。一种制备芯片上实验室的相关方法包括用细菌抗原包被集成电路的电极阵列部分的表面。根据迄今实施的测试，细菌抗原可为约内氏病或结核病的病原体提取物。对于乳腺炎的病原体检测和妊娠的生物标志物(妊娠相关糖蛋白(PAG))检测，抗病原体或PAG的抗体可直接或间接(例如经G蛋白)包被到电极表面上以捕获病原体或蛋白质。任何未包被的表面用封闭试剂封闭。为了检测，将血清样品或病原体的悬浮液加载到包被和封闭的芯片上实验室上。当向电极施加预定幅度(magnitude)和频率的电信号时，抗体(通常为生物标志物)或病原体结合于细菌抗原或结合于抗病原体抗体或结合于抗生物标志物抗体。这样的抗体/病原体(通常为生物标志物)结合随着约1-6分钟的时间推移转化为电容或阻抗值的变化，取决于在与未受影响的样品相比时试图通过其抗体/病原体/生物标志物检测的状况。
[0021] 本文使用的生物标志物或生物学标志物作为应用于电极阵列的物质的一般描述，通常为用作生物状态指标的物质，其可指示感染性疾病或身体状况比如妊娠或凝血(栓塞发作)。孕酮可作为小分子检测的实例进行检测。其是客观测量的特征，并被评价为作为正常生物学过程、致病过程、异常生物学过程或对治疗干预的药理学反应的指标。其也可为其检测指示特定疾病状态的物质，例如抗体的存在可指示感染。更具体地讲，生物标志物的浓度可指示疾病的风险或进展，或者疾病对给定治疗的易感性。例如妊娠相关的糖蛋白、D-二聚体和葡萄糖分别为例如妊娠、栓塞和糖尿病(及其他糖相关疾病)的指标。本文使用的结合测定指的是一个分子对另一个的结合、亲和力、吸引或实际附着，如在图3B和图10中可见呈现的那样，例如结合测定为测量两个分子之间的结合或亲和力的量的特殊测定。
[0022] 在另一个实施方案中，不是检测由生物标志物与电极结合产生的电容或阻抗值随着时间推移的变化，而是芯片上实验室可检测由于靠近电极表面的酶促氧化还原(还原-氧化)反应产生的样品溶液电导率的改变造成的界面电容的变化。电极阵列用对诊断性氧化还原酶特异性的接头分子或氧化还原酶本身功能化/包被。向电极阵列施加低AC电压信号以诱导ACEK效应，其产生目标分子(例如酶、底物和/或探针)向电极阵列表面的对流，从而促进由接头分子捕获的酶或固定化酶催化的氧化还原反应。对酶-底物对特异性的氧化还原反应可通过测量电极阵列表面的界面电容变化来检测。
[0023] 在一个备选的实施方案中，电极的阵列以25-μm宽度和间隔的电极在硅基底或晶片上具有约5 μm触点(contact)的配置制作。在该实施方案中，平行交错的指可包含约25微米的指、约5微米的间隔、约5微米的指和约25微米的间隔，以形成硅基底上两个电极阵列的交错模式。这种制作的阵列导致超过市售可得到的已知SAW共振器的阵列的改善结果。研究了制作的不同阵列以确定这种阵列的检测限，例如对称和非对称叉指电极的组合，以检测甚至更低浓度的生物标志物结合。此外，在本发明用于检测D-二聚体的用途中，对聚吡咯(PPy)包被电极的使用进行了测试，并与使用无涂层的这种阵列的结果进行比较。而且，在本发明的小分子检测应用(例如孕酮检测)期间，测试了3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)涂层的影响，并且结果表明，与没有APTES的测试性检测相比，电容随着时间推移的变化率随着APTES上升。最后，开发了一种特殊的网格(格)电极用于检测生物样品中的体细胞作为乳腺炎的指标，并且同样也可用于其他检测，如本文参照图19A-19D将进一步讨论的那样。
[0024] 在本文讨论的一个实施方案中，多个电极阵列可分布在同一芯片的表面上，使得多个样品可以多路复用，并且对所有沉积的样品同时收集电容/阻抗随着时间推移的数字数据。可使用直径为4英寸(10厘米)的基底，或者小到5毫米或更小的其他合适大小(只要可以容纳电极对)。多达20或更多个生物样品可经在同一基底上形成的20或更多个电极阵列同时进行测试。
[0025] 在进一步的实施方案中，电极网格(格网络)可叠置在基底上(例如配置成电容器，如将参照图19A-19D讨论的那样)，或者如本文将进一步讨论的那样宽的叉指电极与窄电极一起使用。叠置的电极网格/格(图19A-19D)可用于患有乳腺炎的授乳动物的体细胞计数。
[0026] 其他电极配置可包括引脚-线(pin-line)共面电极和面对面模式电极。任何产生非均匀电场的微电极设计均可实现为基于ACEK的阻抗式芯片上实验室。任何均匀的导电聚合物可用作涂层，以在某些实施方案中改善检测，而聚吡咯(PPy)被用作实例。在一个备选的实施方案中，包含纳米结构材料的涂层可用于改善检测。纳米结构材料的实例包括氧化锌(ZnO)、纳米管和石墨烯等本领域已知的纳米结构材料涂层。在又一个实施方案中，通过使样品分析物与纳米至微米尺度的标记颗粒缀合，然后将缀合的样品加载到电极上，可放大检测。例如标记颗粒可为胶乳珠、磁珠或微生物比如病毒、细菌。
[0027] 市售可得到的、定制显微制作(micro-fabricate)的或这种电极阵列的其他实施方案可预先包被细菌抗原或抗目标病原体的抗体或蛋白并且封闭进行制作，使得包含芯片上实验室用于现场使用，从而节省与向实验室发送样品(例如用于酶联免疫吸附测定(ELISA)测试或其他实验室测试)有关的时间和费用。在细菌检测中，例如唾液中的链球菌属或者井水中的大肠菌群或大肠杆菌或者甚至食品中的沙门氏菌属采样，测试可在5分钟内实施，其中常规测试可能需要过夜的培养物生长等，即检测可更快速、更高效和成本更低。尽管奶被描述为人或动物的测试溶媒，但是其他体液比如汗液、唾液、血液和尿液也可被测试用于有价值的目的。应用可包括5分钟测试唾液的链球菌属、啤酒的糖含量或者血液或汗液或其他体液的D-二聚体和凝血证据。
[0028] 原则上，系统可检测除抗体、病原体(例如病原体的抗原、与疾病、感染、污染或生理状况相关的生物标志物蛋白)、蛋白质、小分子、各种糖比如葡萄糖和酶水平以外的分析物，并因此可用于诊断动物和人的各种疾病、蛋白质和生理状况比如妊娠、凝血、最近的心脏病发作及其他状况或者对动物或人的危险(比如应用于井水测试)，如本文将描述的那样。本文讨论的芯片上实验室实施方案和包被/封闭测试可在食品安全，例如在测试肉类、奶和乳制品、水等方面，以及在国土安全应用和商业应用比如测试啤酒中糖含量方面发现具有应用。芯片上实验室和相关方法的这种应用可包括在边境口岸快速测试和诊断人和动物的感染性疾病以及在港口或机场接收的进口食品。
附图说明
[0030] 当与附图结合时，本发明的特征和优点自以下示出的详述将变得更加显而易见，附图中相同的附图标记表示相同或功能相似的要素。
[0031] 图1A部分地为常规SAW共振器芯片的照片，芯片具有相关的交错电极部分用作电极阵列实施方案，并被包被以提供约内氏病和结核病的检测，该图还显示示例性电极阵列部分的放大图。
[0032] 图1B为显示3微米尺度的显微照片，其中可透视观看常规SAW芯片的电极结构。
[0033] 图2A为本发明检测方法的示例性流程图图解。
[0036] 图2D显示用于获取并经智能设备/个人计算机传输现场检测/诊断，和潜在地将结果发送给疾病控制中心/实验室等，或者将结果存储在本地的插入式存储器中的示例性现场过程。
[0037] 图3A显示当应用于微型电极阵列上方电场中捕捉的分子时一个这样的分子的介电电泳(DEP)现象。
[0038] 图3B提供显示夸大的旋转和所施加的定向力(比如由图1的电极阵列的示例性常规电极阵列引起的那些)的示例性电极阵列的扩展视图。
[0039] 图4提供采用图1的示例性电极阵列对20个血清样品的约内氏病的盲测结果，对该疾病10个测试为阴性和10个测试为阳性。
[0040] 图5A提供用于诊断约内氏病的阳性、阴性血清的归一化电容变化图表，其中缓冲溶液B作为对照样品(1:10抗原和1:20血清)。
[0041] 图5B为约内氏病1:80抗原的血清浓度相对于电容变化率的图。
[0042] 图5C为约内氏病1:80抗原和稀释的抗体以秒为单位随着时间推移的归一化电容图表，显示从1:20到1:80的浓度范围不同的线性结果。
[0043] 图5D提供显示阴性测试结果相对于阳性测试检测，约内氏病血清以每分钟%表示的电容变化率相对于10个阴性和阳性结果的线性柱状图，显示约内氏病检测结果。
[0044] 图6提供用于阻抗变化的本发明方法与用于检测人结核病的广泛使用的ELISA实验室方法之间的比较，显示阴性和阳性测试相似的结果。
[0045] 图7A为在100 kHz下100 mVrms和持续2分钟的检测限图结果相对于对照和各种微克/毫升浓度以每分钟%表示的变化率。
[0046] 图7B为通过电容随着时间推移的变化相对于所施加信号频率来显示獾结核病检测的图表。
[0047] 图8A和图8B为对图1电路施加信号的频率范围研究的图形结果，表示使用图1电路诊断约内氏病的电容随时间推移的变化相对于频率。
[0048] 图8C为与图8B相似的图，表示阻抗随时间推移的变化相对于所施加信号的频率。
[0049] 图8D和图8E为图1电路的电容和阻抗分别随着时间推移的变化相对于频率的图。
[0050] 图9A提供基底上构建的提供超过图1的常规电极阵列的改善结果的电极阵列的显微视图。
[0051] 图9B提供显示在图9A中描绘的电极阵列中重复的散布的25、5、5、25微米模式的显微照片。
[0052] 图10提供与图3B相似的图，显示电极阵列可如何利用长距离AC电热流进行对流在抗原包被层与封闭层之间提供改善的结合结果。
[0053] 图11提供10个阴性和10个阳性样品以每分钟%表示的电容变化率之间的改善的阴性/阳性差别的图解实例。
[0054] 图12提供以每分钟%表示的电容变化率相对于以微克/毫升表示的浓度的图表。
[0055] 图13提供以每分钟%表示的电容变化相对于以纳克/毫升表示的浓度的图表。
[0056] 图14提供测试图9的晶片阵列的检测限的图示，显示电容随着时间推移的变化相对于所施加信号的频率。
[0057] 图15提供包括两个对照组和一个实验组(其中实验组包括乳房链球菌(乳腺炎的病原体)细菌)的病原体检测表，并且描述了分析在100 mV下所施加的信号频率范围和短暂的测试时间段的方法。
[0058] 图16A、16B和16C分别提供略掉细菌(标记为“无细菌”)的阴性对照组、消除血清(标记为“无血清”)的阴性对照组和具有血清和细菌(标记为“结合”)的实验组的图表。相应图的各柱表示电容随着时间推移的百分比变化相对于在5 kHz-1 MHz之间的所施加信号的频率。
[0059] 图16D提供显示图16A、16B和16C结果的组合图表，其中300 kHz看起来适用于检测乳房链球菌细菌。
[0060] 图16E提供无细菌、无血清和结合各自的每个测量频率、电容的百分比变化和标准偏差的数据表。
[0061] 图17提供电容随着时间推移的百分比变化相对于40 Hz-6 MHz的频率图的图表，由此可以得出，40 Hz-1 kHz为读取电容变化的灵敏频率(无dC/Co百分比变化值的重叠)。
[0062] 图18A、18B和18C分别为50 kHz、150 kHz和300 kHz各自的总结图表，优选的300 kHz施加信号显示，为了阻抗/电容测量更明显的差别，在300 kHz施加信号下的灵敏频率可在40 Hz-1 kHz之间，如由图17对乳房链球菌细菌检测(乳腺炎)显示的那样。
[0063] 图19A为用于白细胞计数(例如用于检测牛乳腺炎)的基底与不同大小开口的叠置电极网格的图解视图。
[0064] 图19B为显示图19A的顶部和底部电极网格间隔的图解。
[0065] 图19C为显示样品如何滴加在叠置的电极网格上和特定的交流信号如何施加于图19A的网格上的图解。
[0066] 图19D为图19A基底上的叠置网格电极照片的黑白线条图。
[0067] 图20A、20B和20C分别提供生成的归一化电容随着时间推移的图表(1分钟测试)，图20A曲线显示cell fix、样品3853号和样品4118号的特异性证实；图20B研究样品4118的浓度水平相对于无体细胞，以显示100倍稀释样品4118与无细胞相比可检测乳腺炎；图20C显示5分钟测试时间段的体细胞计数(体细胞计数或SCC)相对于电容随时间变化的变化，以显示实验结果的准确性。
[0068] 图21说明采用用于妊娠检测的α-PAG (抗PAG抗体)涂层制备用于妊娠测试的图1的SAW电极阵列的方法的步骤。
[0069] 图22A和22B分别提供：电容随着时间推移的变化相对于施加信号的频率的图表，其中可以得出，50 kHz和更大范围的信号可用于检测妊娠；和5个妊娠测试的总结，阳性相对于阴性或缓冲溶液显示可检测妊娠。
[0070] 图23A说明构造的叉指电极阵列，首先提供多个宽间隔的电极，然后对每个宽电极提供多个非常紧密间隔的电极，以研究这种构造的电极阵列的检测限。
[0071] 图23B为显示在动电学现象影响下被吸引至图23A的宽间隔的电极，然后结合于非常紧密间隔的电极的模拟吸引和颗粒流动的图解。
[0072] 图23C为显示生物标志物浓度在例如1 ng/mL、2 ng/mL和5 ng/mL下，采用图23A的叉指电极阵列改善检测的图解。
[0073] 图24A和24B通过阻抗虚部(imaginary part)相对于阻抗的电阻或实值部分(real-valued part)的Nyquist图显示使用本发明的测试结果，其中测试频率范围为1 kHz-110 MHz。
[0074] 图25A为说明通过AC电容传感检测氧化还原酶的概念图。
[0075] 图25B为图25A的‘电解液-电极’系统的代表性等效电路。
[0076] 图25C显示对于不同浓度的底物采用用酶功能化的电极进行底物检测的实验结果。
[0077] 图26A、26B和26C分别描绘样品分析物、标记颗粒和缀合样品。
[0078] 图26D、26E和26F为分别说明包被/功能化电极表面、在包被电极表面的分析物检测和在包被电极表面的缀合样品检测的概念图。
具体实施方式
[0079] 本发明涉及系统、方法和计算机程序产品，其提供示例性的电极阵列和与那些阵列有关的方法，用于检测病原体、疾病和生理状况，特别是妊娠、结核病、约内氏病和乳腺炎等状况，包括但不限于测试井水中的细菌、葡萄糖检测、酶水平检测、D-二聚体检测和以孕酮检测为例的小分子检测。用于电极阵列的优选拓扑结构的实例提供在图9A、9B中，但也可使用图1A、1B的市售阵列。在任一情况下，公开图2A的方法，由此结核病、约内氏病和乳腺炎等细菌性疾病的发病可采用图1和9的电极阵列区别。
[0080] 首先将讨论检测测试，其采用可市售得到的SAW共振器集成电路(即可得自AVX Corporation的PARS 433.92 SAW共振器)的电极阵列实施，其电极阵列按照图2A的方法包被和处理，以形成包括信号发生器、微控制器和电容/阻抗显示读出器的检测试剂盒。测试使用约内氏病血清样品实施，并且测试也使用牛、人和野生动物(獾)的结核病血清样品进行。而且，实施测试以检测导致两种类型乳腺炎的病原体(乳房链球菌)，病原体检测与异常白细胞检测。通过变化抗体浓度测试检测限。另外，实施测试以检测反刍动物的妊娠生物标志物(PAG)。如在Li, S. 等 (包括发明人Jie (Jayne) Wu), Biosensors and Bioelectronics (2012)“, Dielectrophoretic responses of DNA and fluorophore in physiological solution of impedimetric characterization (阻抗表征DNA和荧光团在生理溶液中的介电电泳反应),”中报道的那样(其整个内容结合到本文中)，这种相同的SAW共振器芯片成功地用于区分DNA。此外，将讨论检测测试的成功重现性。
[0081] 在采用市售可得到的电极阵列后，第一和第二优选的显微制作电极阵列被设计、构建和类似地测试，具有改善的结果。在讨论从市售可得到的SAW共振器获取的电极阵列使用之后，讨论改进的电极阵列(图9和23)以及改善的结果。还将参照图19A-19D讨论配置成电容器的第一和第二叠置电极网格/格网络。
[0082] 现参照图1A，显示一种以顶视图暴露的常规、市售可得到的PARS 433.92表面声波(SAW)共振器集成电路，以显示按照图2A使用的电极阵列部分130。在放大的形式中，电极阵列显示为电极阵列120，包含第一和第二平行电极导体的多个均匀间隔的指。电极阵列的结构在图1B的显微照片中更好看到，其中每个导体(铝的)位于石英/玻璃基底上。如本文将进一步讨论的那样，本领域已知的其他导电金属和基底可用于构造合适的电极阵列。每个指看起来都有相同的宽度，在0.5-100微米之间(例如1-3微米)，或者具体地讲为1.7微米，并且彼此具有相同的间隔或分隔，在.5-100微米范围内，而且优选地在1.0-3微米之间，或者间隔约1.6微米。例如在例如低至20 Hz (优选地1 kHz)和5 MHz和1 kHz至200 kHz范围内的预定频率下，施加在例如约5 mVrms-10 Vrms之间(优选地在10 mVrms-1 Vrms之间)或者例如在100-500 mVrms之间范围内的预定电压，特别是持续约1-10分钟，例如2-3分钟，以诱导ACEK效应。
[0083] 为了装配完整的系统，可结合板级信号发生器与电极阵列(例如一旦血清样本沉积，产生100 mv、100 kHz信号)、阻抗或电容读取装置、作为至阻抗/电容读取的智能接口的微控制器和显示读出器。如自以下描述的测试测定的那样，所施加信号的预定值可在5 mVrms-10 Vrms (优选地为10 mVrms-1 Vrms)范围内，并且频率在20 Hz (优选地为1 kHz)-5 MHz之间。
[0084] 检测测试试剂盒的构造和血清对其的应用通过图2A的流程图提供。在第一步骤210中，用细菌抗原(例如用于约内氏病的鸟分枝杆菌副结核型亚种或用于人结核病的结核分枝杆菌提取物、用于妊娠的抗PAG抗体或用于乳腺炎的抗病原体抗体)包被示例性电极阵列或集成电路阵列部分的表面。在步骤220中，用封闭缓冲试剂封闭表面。一种可使用的这样的封闭剂包括含有.05% Tween 20和可得自Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL的10% SuperBlock封闭缓冲剂的磷酸缓冲盐水(pH 7.0)。pH水平可在例如2.0-11.0之间，
7.0为优选。可使用本领域已知的其他封闭剂。可用洗液比如磷酸缓冲盐水Tween (PBST)或其他合适的洗液清洗未包被的表面。电极阵列装置也可采取例如如在图10的横截面中所见的形式：硅(Si)基底或晶片提供有在金/钛、金/铬、铝、铜、银或其他导电材料中通过常规蒸发/溅射沉积的电极阵列，封闭层在上方和抗原包被层在二者之间。在一个实施方案中，在样品加载之前把电极阵列芯片连接到信号发生器芯片、微控制器和显示读出器。对于有明显DEP反应的生物颗粒(即通过选择的电信号明显地吸引或排斥电极，比如细胞的DEP反应)，通过选择电信号频率和幅度，可实现选择性捕获/检测和改善的选择性。在某些情况下，表面功能化可能是不需要的，并且电极可重复使用而不用清洗等。
7.0为优选。可使用本领域已知的其他封闭剂。可用洗液比如磷酸缓冲盐水Tween (PBST)或其他合适的洗液清洗未包被的表面。电极阵列装置也可采取例如如在图10的横截面中所见的形式：硅(Si)基底或晶片提供有在金/钛、金/铬、铝、铜、银或其他导电材料中通过常规蒸发/溅射沉积的电极阵列，封闭层在上方和抗原包被层在二者之间。在一个实施方案中，在样品加载之前把电极阵列芯片连接到信号发生器芯片、微控制器和显示读出器。对于有明显DEP反应的生物颗粒(即通过选择的电信号明显地吸引或排斥电极，比如细胞的DEP反应)，通过选择电信号频率和幅度，可实现选择性捕获/检测和改善的选择性。在某些情况下，表面功能化可能是不需要的，并且电极可重复使用而不用清洗等。
[0085] 接下来，例如通过从移液枪滴到在如以下讨论的给定的毫伏水平和频率信号下操作的电极的包被表面上，在步骤230加载血清样品(生物标志物)。在测试中，实施会导致疾病阳性或疾病阴性结果的盲测等。如本文讨论的那样，在步骤240，在给定的信号的测试下血清中的抗体与包被的抗原层结合时，随着时间推移得到电容的变化(或阻抗的变化)。取决于阻抗传感器(芯片上实验室)的应用，血清可例如自选择的体液例如雌性授乳动物的乳汁、血液、唾液、汗液和尿液形成。
[0086] 一旦使用电极阵列芯片，其可被清洗并重复用于相同的信号发生器、微控制器和显示器。清洗可例如包括使用抗生物素蛋白(糖蛋白)-生物素相互作用或生物素/链霉亲和素相互作用连同氢氧化钠(NaOH)溶液或氢氧化钾/氢氧化钠(KOH/NaOH)溶液或本领域已知的其他清除抗原/涂层的清洗溶液，因此电极阵列可重复使用。
[0087] 在商业生产中，预计集成电路可与芯片上的信号发生器一起分布，并且暴露的电极阵列已经涂布了抗原涂层并用试剂封闭。或者，抗原和涂层可现场涂布、封闭，芯片上实验室一旦使用，则清洗然后重复使用直到其变为无效。在一个实施方案中，电极阵列可包含可易于重复使用和替换的单独芯片，例如如果在多次使用和清洗之后其有效性衰减。如本文关于图2B将进一步讨论的那样，系统可包含微控制器、多样品阵列、复用器、信号发生器和连接到个人计算机或通信设备用于将结果传输到远程实验室或疾病中心或其他远程设施的连接器。在该实例中，集成电路准备好加载可同时测试的多个样品。可同时测试多达例如20个样品，在同一基底上沉积类似数目的电极阵列。整个系统可构造成便携式的，并可在现场(而不是在实验室)，比如在奶牛场或养牛场，或者甚至在家里使用。结果可在数分钟内得到，而不是像实验室ELISA (酶联免疫吸附测定)测试那样需要数小时。而且，从迄今实施的测试可见，如本文将进一步讨论的那样，在给定浓度下仅需要约两微升的血清样品来提供令人满意的检测。因此，许多样品可同时在同一芯片上实验室上进行测试。这样的血清量可易于自人或动物体液(奶、血液、尿液、唾液、…)样品获得，而不需要任何离心机的使用。
[0088] 图2B为多路复用电极阵列与信号发生器、控制器(计算机处理器和存储器)和显示器组合，用于现场检测生理状况和感染性疾病比如细菌性疾病约内氏病和结核病的示例性电路方框图。具体地讲，图2B的装置包含多样品支架565，其可包含多个图1A的电极阵列或图9的芯片上实验室，其中可存在多个电极阵列用于接收多个生物样本进行同时测试(显示3个)。信号发生器570被显示连接控制单元(优选地本领域已知的微控制器554，包括板上数据存储器(未显示))至多样品支架565。自控制器554至信号发生器570的线表示控制信号线，指示预定的信号或电压水平和预定的频率，使得信号发生器570在响应时将根据用户信号选择来输出信号。用户选择的电压和频率信号值可自个人计算机(包括键盘)或其他智能设备比如掌上电脑或智能电话输入，并存储在未显示的微控制器存储器或外部存储器中。
微控制器554还连接至复用器562，后者经缓冲电路558连接在阻抗读取电路556和多样品支架565之间。
微控制器554还连接至复用器562，后者经缓冲电路558连接在阻抗读取电路556和多样品支架565之间。
[0089] 在图2B的左侧显示连接至个人计算机(例如USB接口)或至存储内存卡。个人计算机可接收来自微控制器554的数据，并用于经通信端口和网络将数据重新传输到疾病控制机构、外部实验室或用户可能希望发送数据的任何地方。例如一旦生物样品被加载到多样品支架565中，启动按钮用于启动测试或多个测试的同步采样。检测/诊断可以3个步骤进行。步骤1：当按下启动按钮时，控制信号被发送至控制器554以激活复用器562和阻抗读取芯片556，以经自样品支架565至阻抗芯片556的阻抗读取线路获得多路复用读数。阻抗芯片556向控制器554报告电容/阻抗值作为信号或多个信号(每个样品一个)，设置电极阵列的初始电容/阻抗值。步骤2：控制器554激活信号发生器570，以向样品支架565施加所选的幅度和频率的信号，持续预定的时间段(例如少于10分钟)，这意味着诱导ACEK效应，以增强大分子/生物颗粒沉积到电极表面上。步骤3：控制器554再次激活复用器562和阻抗读取芯片
556，以经自样品支架565至阻抗芯片556的阻抗读取线路获得多路复用读数，这提供预定时间段结束后电容/阻抗值的最终状态。阻抗芯片556向控制器554报告电容/阻抗值作为信号或多个信号(每个样品一个)。LCD或其他显示器552可对芯片上实验室的具体应用，在预定的时间段内以预先选定的时间间隔提供样品数据例如电容或阻抗值形式的读数。这些周期性数值可连同对照暂时存储在微控制器554的存储器(未显示)中。个人计算机可用于根据本文提供的若干附图，提供与对照或其他浓度等相比，电容或阻抗随着时间推移的变化的图形指示。
556，以经自样品支架565至阻抗芯片556的阻抗读取线路获得多路复用读数，这提供预定时间段结束后电容/阻抗值的最终状态。阻抗芯片556向控制器554报告电容/阻抗值作为信号或多个信号(每个样品一个)。LCD或其他显示器552可对芯片上实验室的具体应用，在预定的时间段内以预先选定的时间间隔提供样品数据例如电容或阻抗值形式的读数。这些周期性数值可连同对照暂时存储在微控制器554的存储器(未显示)中。个人计算机可用于根据本文提供的若干附图，提供与对照或其他浓度等相比，电容或阻抗随着时间推移的变化的图形指示。
[0090] 现参照图2C，显示用于芯片上实验室实施方案的完整试剂盒，其包含例如用于将血液/奶/唾液/尿液或其他生物样品滴加到阵列530上的移液枪510，阵列530可为例如8个阵列中的一个，其可经内部连线525连接到试剂盒515的插槽上。试剂盒515可经标准连接电缆连接到智能电话520的端口用于数据的远程传输。
[0091] 根据图2D，显示一种示例性的农场应用，其中诊断医生携带图2C的试剂盒去牛舍，在图1A、9阵列的预包被表面上滴加一些血液/奶/唾液/尿液或其他生物样品，然后可将数据本地存储在示例性的插入式存储器中，或者使用智能设备520或个人计算机用于数据分析或远程传输到实验室或疾病控制中心或其他远程位置。
[0092] 简略地参照图3A，通过在电场(由以所选择的电压和所选择的频率施加的电信号引起)内作用的对分子作用的实例显示负向和正向介电电泳。现参照图3B，其以更大尺度并参照给定几何学的包被电极阵列显示AC动电学，在以米/秒计的表面速度场中显示分子，箭头和流线显示该现象的速度场。
[0093] 实施例1-约内氏病现参照图4，显示包括20个样品(10个阴性和10个阳性)的约内氏病盲测结果，其中显示电容的每分钟变化率。最小阴性结果具有电容每分钟变化值-8.4539%和最大结果具有
8.2321%。阳性测试结果显示电容每分钟变化最小-15.0843%和最大阴性-65.0035%，差异显著。在阳性和阴性测试之间存在约-11%的明显界限。也显示了平均值，阴性为-1.28953% (相较于-36.14971%)，再次显示阳性检测和阴性测试之间明显的界限。约内氏病的盲测由不同的学生一致地运行，对20个样品实施测试，结果相似：对于阴性每分钟-5%至+5%，而对于阳性检测每分钟-20%至-30%。
8.2321%。阳性测试结果显示电容每分钟变化最小-15.0843%和最大阴性-65.0035%，差异显著。在阳性和阴性测试之间存在约-11%的明显界限。也显示了平均值，阴性为-1.28953% (相较于-36.14971%)，再次显示阳性检测和阴性测试之间明显的界限。约内氏病的盲测由不同的学生一致地运行，对20个样品实施测试，结果相似：对于阴性每分钟-5%至+5%，而对于阳性检测每分钟-20%至-30%。
[0094] 现参照图5A，显示用于约内氏病诊断的阳性、阴性血清的归一化电容变化的图表，缓冲溶液作为对照样品(1:10抗原和1:20抗体血清浓度)。用以所选择的500 mVrms幅度和所选择的100 kHz频率施加于电极阵列上的电信号采集数据。测试的持续时间显示为运行200秒，或者刚刚超过三分钟。与实验室测试相比，在约1分钟或更短时间内可见与对照相比的测试结果(阴性/阳性)。图5C是相似的。图5C显示血清浓度可自1:1到1:80变化，而以图形形式显示的测量的电容/阻抗随着时间的推移没有运行到对照水平。1:120至1:200的浓度太弱而无法与对照区分。图5B为对约内氏病以1:80的血清浓度相对于电容%变化率的图表，施加信号为100 kHz频率下100 mV，持续预定的测试时间段，在本应用中对于图1的芯片上实验室为约120秒或2分钟。如本文将讨论的那样，自图8的芯片上实验室获得改善的结果。
图5D提供显示阴性测试结果相对于阳性测试检测，约内氏病血清以每分钟%表示的电容变化率相对于10个阴性和阳性结果的线性柱状图，显示约内氏病检测结果，具有清楚的阈值分析。
图5D提供显示阴性测试结果相对于阳性测试检测，约内氏病血清以每分钟%表示的电容变化率相对于10个阴性和阳性结果的线性柱状图，显示约内氏病检测结果，具有清楚的阈值分析。
[0095] 通过在5种不同包被电极上使用相同的测试样品测试了芯片-芯片重现性。所有5种包被的芯片样品以相似的电容变化率测试相同的血清样品，每分钟-20%至每分钟-28%之间)。还用不同的约内氏病血清样品测试了血清-血清重现性。在10个芯片上测试了10个阳性样品，并且结果的范围为每分钟电容变化在-20%至-28%之间。
[0096] 实施例2-结核病11个人结核病样品经图2的方法进行测试，6个阳性和5个阴性。每个样品测试两次。样品1呈现在第一次测试中电容随着时间推移变化39.0679%，相同的样品第二次测试变化
14.3615%，平均值26.7147%，得出结论为疾病测试阳性。数值25被确定为合适的阈值。其他的平均阳性结果包括42.89935、45.7834、71.02315和92.9081。与之相比，阴性平均结果
21.95305、21.12935、11.1021、9.37895和8.49295小于阈值25。
14.3615%，平均值26.7147%，得出结论为疾病测试阳性。数值25被确定为合适的阈值。其他的平均阳性结果包括42.89935、45.7834、71.02315和92.9081。与之相比，阴性平均结果
21.95305、21.12935、11.1021、9.37895和8.49295小于阈值25。
[0097] 参照图6，人结核病测试结果与使用ELISA的结果相比-显示阴性和阳性结果，由此可见，本发明测试方法与ELISA提供相似的结果。而且，比较了人结核病测试结果，其中阻抗读数Z随着时间推移的变化百分比与电容读数C随着时间推移相比具有等同的结果。换句话说，随着时间推移的阻抗可相当于随着时间推移对电容的测量结果。
[0098] 参照图7A，显示该结核病应用中于100 kHz下施加的100 mVrms信号和预定的2分钟持续时间的检测限图结果，相对于对照和各种微克/毫升浓度以每分钟%表示的变化率，目的是确定血清浓度的极限。如可见的，抗体在1-10 µg/mL范围的浓度下与对照相比产生明显的差别。浓度.1 µg/mL可能被一些人认为是可接受的。
[0099] 现将讨论牛结核病测试结果，其中测试了10个阴性和10个阳性(总计20个)獾结核病样品，并测量了电容随着时间推移的变化率。
[0100] 提供下表显示结果：标1
样品编号 dC/dt 电容测量的结论 ELISA的结果
N1 -31.2174 P N
N2 -1.2917 N N
N3 4.6227 N N
N4 -18.1005 P N
N5 -4.6286 N N
N6 -16.4941 P N
N7 -4.9776 N N
N8 -3.3192 N N
N9 -3.2161 N N
N10 N N
P1 -21.6996 P P
P2 -18.8937 P P
P3 -24.9467 P P
P4 -12.544 P P
P5 -15.9398 P P
P6 -19.0317 P P
P7 -26.0158 P P
P8 -38.8778 P P
P9 -25.838 P P
P10 -19.0333 P P
缓冲液对照 .8837 N/A N/A
自上表可见，总共20个样品中，3个测试为阳性的样品与ELISA结果相比应测试为阴性。
然而，獾样品的牛结核病测试显示85%的准确率。相信改进的图9电极阵列将提供改善的结果。
样品编号 dC/dt 电容测量的结论 ELISA的结果
N1 -31.2174 P N
N2 -1.2917 N N
N3 4.6227 N N
N4 -18.1005 P N
N5 -4.6286 N N
N6 -16.4941 P N
N7 -4.9776 N N
N8 -3.3192 N N
N9 -3.2161 N N
N10 N N
P1 -21.6996 P P
P2 -18.8937 P P
P3 -24.9467 P P
P4 -12.544 P P
P5 -15.9398 P P
P6 -19.0317 P P
P7 -26.0158 P P
P8 -38.8778 P P
P9 -25.838 P P
P10 -19.0333 P P
缓冲液对照 .8837 N/A N/A
自上表可见，总共20个样品中，3个测试为阳性的样品与ELISA结果相比应测试为阴性。
然而，獾样品的牛结核病测试显示85%的准确率。相信改进的图9电极阵列将提供改善的结果。
[0101] 现参照图7B，显示在图1的SAW共振器电极阵列上的獾结核病诊断的图表，其中抗原1:10浓度和血清1:20浓度，施加100 mV/1.1 µm电压下降信号持续120秒，频率自kHz至5MHz变化。从图表的分析可以得出，10 kHz-30 kHz为读取电容随着时间推移的变化数据的优选频率范围。对约内氏病检测实施了类似的测试，并且现将参照图8进行讨论。
[0102] 首先参照图8A，显示在图1的SAW共振器电极阵列上的约内氏病诊断的图表，其中副结核分枝杆菌(M. paratuberculosis) (MAP)抗原1:10浓度和血清1:20浓度，在预定的持续时间内(在该应用中为120秒或2分钟)施加电压100mV/1.1 µm。从图表的分析可以得出，约10 kHz-100 kHz为读取电容随着时间推移的变化数据的灵敏频率范围。在图8B和8C中，施加的信号和浓度没有改变，但是图8B和8C表示5种生物标志物样品及其电容数据随着时间推移变化的平均值相对于所施加信号频率的图表，同时图8C提供阻抗数据随着时间推移的变化相对于频率的相似结果。在图8B和8C中，从约40 Hz到6 MHz实施测试。从图8B可以得出，1 kHz-10 kHz为读取电容的灵敏频率范围，而从图8C可以得出，1 kHz-50 kHz为读取阻抗随着时间推移的变化数据的灵敏频率范围。因此，为了读取电容或阻抗数据，从图8B和8C可以得出，所施加的信号在1 kHz-50 kHz范围内。
[0103] 图8D和8E也表示用于检测约内氏病的电容随着时间推移的变化和阻抗随着时间推移的变化数据相对于所施加信号频率的图表，使用图1的电路和相同的抗原和血清浓度。测试的频率范围也在约40 Hz-6 MHz。图8D的分析表明，10-100 kHz为施加信号读取电容数据的灵敏频率范围，而图8E表明1 kHz-10 kHz的较低频率范围为施加信号读取阻抗数据的灵敏频率范围。
[0104] 以上对牛结核病和约内氏病和对牛结核病讨论的结果使用牛型结核分枝杆菌和副结核分枝杆菌的乙醇提取物，采用田纳西大学的发明人S. Eda和C.A. Speer的2008年9月9日授权的美国专利第7422869号和2010年5月11日授权的7713715号中描述的方法。
[0105] 具有改善性能的备选电极阵列图9A提供基底上构造的电极阵列的显微视图，该阵列提供超过图1的常规电极阵列的改善结果。基底直径可大至10厘米，并且包含20个电极阵列用于接收生物测试样品。如以上简要描述的那样，图9A的电极阵列提供硅基底，并且使用熟知的光刻工艺构造，以提供可重复的指和指间间隔模式，并且根据所需的许多样品接收位置存放1或2毫升的样品储库(甚至微升储库，取决于浓度水平)。图9B提供显示在图8A中描绘的电极阵列中重复的散布的5、
5、25、25微米模式的显微照片。第一电极显示具有25.1876 µm的宽度。然后提供宽度
5.140960 µm的间隔。下一个导体具有5.497225 µm的宽度。模式重复之前的最后分隔为
25.09273 µm。从图9A可注意到，多个电极阵列可分布在同一芯片的表面上用于同时接收和测试多个样品。其他电极配置可包括引脚-线共面电极和面对面模式电极。产生非均匀电场的微电极设计可实现为芯片上实验室。作为电容器形成的电极网格将参照图19A-19D进行讨论，和另外的电极阵列将参照图23进行讨论。
5、25、25微米模式的显微照片。第一电极显示具有25.1876 µm的宽度。然后提供宽度
5.140960 µm的间隔。下一个导体具有5.497225 µm的宽度。模式重复之前的最后分隔为
25.09273 µm。从图9A可注意到，多个电极阵列可分布在同一芯片的表面上用于同时接收和测试多个样品。其他电极配置可包括引脚-线共面电极和面对面模式电极。产生非均匀电场的微电极设计可实现为芯片上实验室。作为电容器形成的电极网格将参照图19A-19D进行讨论，和另外的电极阵列将参照图23进行讨论。
[0106] 图10提供与图3B相似的图，显示电极阵列可如何利用长距离AC动电学微流提供抗原/抗病原体抗体涂层之间改善的结合结果。电极阵列可包含硅Si基底905。在整个基底上重复5、5、25、25、5、5、25、25指/间隔模式，由此通过施加的给定幅度和频率的电信号产生+Vcosωt、-Vcosωt、+Vcosωt和-Vcosωt。抗原/抗病原体抗体涂层920上显示有抗原/抗病原体抗体，其呈现为Y形受体，用于通过AC动电学结合或不结合分子。抗原/抗病原体抗体涂层的分子显示向5微米指和25微米指之间的5微米间隔移动，并远离25微米间隔和然后再返回来。自图9的设计和与图1设计的比较可以得出，在1和也许100微米之间的指值范围可成功用于测试细菌性疾病。类似地，指间的间隔范围可在1和也许100微米范围之间具有成功的测试结果。尽管金/铬用于电极组成，但可有利地使用其他导电金属，比如金/钛、金、银、铝和铜。本文随后还讨论了涂层相对于无涂层电极的应用有效性。
[0107] 在实践中，实施了20个约内氏病测试-10个阴性和10个阳性，如之前一样使用图1的电极阵列，具有以下结果。对于测试阴性，变化范围在-2.6356和+.7537%之间。对于测试阴性，变化范围在-52.3152和-83.8032%之间。这些范围证实，在显微制作的5-5-25-25芯片和市售可得到的电极阵列之间约内氏病的电容变化率的差别极大改善。这些测试中施加的信号为在500 mV和100 kHz。
[0108] 图11提供约内氏病的10个阴性和10个阳性样品以每分钟%表示的电容变化率之间的改善的阴性/阳性差别的图解实例，显示结果之间的显著差别。
[0109] 图12提供以每分钟%表示的电容变化率相对于以微克/毫升表示的浓度的图表，以显示使用图9芯片的检测限。如图所示，低至.01 µg/mL的浓度证实在500 mV信号和100 kHz信号频率下结果可接受。
[0110] 图13提供以每分钟%表示的电容变化相对于以纳克/毫升表示的浓度的图表。信号强度升至1 Vrms并自图表可见.5 ng/mL浓度下的检测水平可接受。
[0111] 图14提供对于100纳克/毫升浓度和在500 mV/5微米电极指的施加信号，在图9的晶片上另外的检测限测试，其中电容随着时间推移的变化相对于施加信号10 kHz至10 MHz的频率绘图。在约40 Hz-约6 MHz的频率范围，在300秒(5分钟)内实施测试。自图14的图表分析可以得出，10-100 kHz的频率范围为读取图9晶片的电容随着时间推移的变化数据的灵敏频率范围，其与图1的SAW电极阵列的灵敏频率范围相比有利。
[0112] 实施例3A-病原体检测(乳腺炎)现参照图15-19，讨论乳腺炎的病原体检测，其中奶样品可取自授乳动物。乳房链球菌为链球菌属物种。G蛋白为在C和G组链球菌细菌中表达的免疫球蛋白结合蛋白，很像A蛋白，但有不同的特异性。其为65-kDa (G148 G蛋白)和58 kDa (C40 G蛋白)细胞表面蛋白，在通过其与Fc区结合纯化抗体方面具有用途。G蛋白用于制备实验组和对照组样本中的每一种，用于封闭图15中显示的芯片上实验室和细菌。
[0113] 参照图15，两个阴性对照组和一个实验组参与病原体检测。根据图15，G蛋白可以10微克/毫升的浓度和2毫升的量在盒(humidor)中温育过夜，以用于包被如以上描述的电极阵列。在标示封闭、对照(无血清)的区域，缓冲液B显示为以.1x浓度和2微升的量持续1小时。实验封闭溶液可含有以缓冲液B 1:10稀释的血清。阵列用.1x浓度的PBST使用2微升清洗两次。图15的细菌部分包含乳房链球菌细菌，以1x107细胞计数存在(每毫升细菌的细胞密度相同，在奶细菌计数中达到)，使用.1x PBS溶液中的2微升作为实验组。对照(无细菌)可为PBS，以.1x浓度和2微升存在。
[0114] 根据图15，实施3种频率扫描用于病原体检测。扫描1为在5 mV信号幅度下40 Hz-6 MHz之间持续1秒。扫描2为在100 mV信号幅度下和采用201个测量点的扫描频率为5 kHz、10 kHz、20 kHz、50 kHz、100 kHz、300 kHz、500 kHz、800 kHz和1 MHz。第三频率扫描(扫描3)为在5 mVrms下40 Hz-6 MHz之间持续1秒(类似于扫描1)。扫描2为实验扫描，以通过与对照组比较不同频率下病原体检测涂层的细菌溶液结合，测试合适的频率，并相对于对照电容变化，保持证实细菌性疾病(乳腺炎)的诊断的电容随着时间推移的变化。这些结果显示在图16中。
[0115] 现参照图16A，显示.1x浓度PBS的无细菌对照组血清电容随着时间推移的百分比变化的图表，仅扫描2结果。当信号在400 kHz时无细菌的阴性对照组显示电容随着时间推移的百分比变化最大。在800 kHz 和300 kHz下，电容随着时间推移的百分比变化略微减少。不过在50 kHz下，电容随着时间推移的百分比变化降低更多。
[0116] 现参照图16B，显示无特异性血清抗体的阴性对照组溶液电容随着时间推移的百分比变化的图表，仅扫描2结果。当信号在800 kHz时，阴性对照组显示电容随着时间推移的百分比变化最大。在所有其他扫描频率下，电容的百分比变化明显更少(更好)。
[0117] 现参照图16C，显示结合于抗体血清的细菌溶液(乳房链球菌/乳腺炎)的电容随着时间推移的百分比变化的图表，仅扫描2结果。当信号在300 kHz和在50 kHz时，细菌溶液组显示电容随着时间推移的百分比变化最大。在100和200 kHz下，电容的百分比变化较低。
[0118] 结果概述在图16D中，其为显示互相叠加的图16A、B和C结果的组合图表，其中灰度显示对每个频率，电容随着时间推移的百分比变化按无血清、无细菌和结合的顺序从左到右显示。在图16D中的所有频率点，除了800 kHz的频率结果外，结合超过血清和细菌对照。自图表可以得出，在100 mV下施加50 kHz-4000 kHz之间的信号60秒(扫描2信号参数)适当地区分乳房链球菌结合与阴性对照。图16E提供对所有点采集的所有数据和计算的标准偏差表。
[0119] 现参照图17，显示通过每60秒扫描3-扫描1计算的图表，其中在9个不同频率下电容随着时间推移的百分比变化曲线显示反应的平均变化。自图表可以得出，40 Hz-1 kHz为通过在该范围内实验组(结合)相对于阴性对照组(无血清或无细菌)的区别，读取电容随着时间推移的百分比变化的灵敏频率范围。
[0120] 在图18A、18B和18C中，显示通过每60秒扫描3-扫描1计算的电容随着时间推移的百分比变化的相应图表，其中对50 kHz、150 kHz和300 kHz信号研究了电容随着时间推移的百分比变化曲线，优选的信号频率自图16D计算。自图表可以得出，当在较低频率比如40 Hz-2 kHz之间获取电容或阻抗百分比变化时，区别更加明显。注意到在这些频率之间，实验组(结合)为300 kHz最低曲线(图18C)，在300 kHz下比阴性对照组无细菌或无血清提供明显更大的电容百分比变化。超出10 kHz时，实验组(结合)和无细菌和无血清变为密集在一起，使得结合不易区分。还注意到在这些频率之间，结合在50 kHz施加频率下紧邻最低曲线，区别略高于100 Hz-1 KHz之间的频率范围的细菌曲线，并且区别不明显，但是然后又移动分开，例如在10 kHz。图18B的150 kHz组看起来在整个频率谱中显示出清晰的结合检测。总的来说，从该图表可以看到，乳腺炎/乳房链球菌的区别在150 kHz或300 kHz信号频率和在40 Hz-10 kHz之间为优选的。细菌可于如所描述的那样包被的电极阵列上，在100 mV施加信号下，通过60秒或1分钟的测试来区分。
[0121] 实施例3B-体细胞计数(乳腺炎)图19A提供用于白细胞计数，例如用于检测牛乳腺炎的基底与不同大小开口的叠置电极网格的视图。体细胞计数测量牛奶样品中的体细胞(免疫细胞，像嗜中性细胞)的数目。根据图19A，可叠置包含具有例如100 µm开口的顶部电极网格的电极阵列，并与具有例如50 µm较小开口的底部电极网格隔开，目的是允许真正的生物标志物样品通过顶部和底部的电极网格到达例如样品储库或开口(未显示)，以允许自阵列收集和/或清除样品，使得图19A的实施方案如以上描述的那样，提高通过经电容变化进行体细胞计数来检测乳腺炎的机会。在实践中，顶部电极可具有10-500微米之间的开口(优选地50-150微米之间的开口)和底部电极具有5-150微米的间隔(优选地20-80微米之间的间隔)，取决于测试的授乳动物、牛、山羊、绵羊等。图19B显示顶部和底部电极网格(电容器的两个板)之间的间隔，两个网格或格网络形成电容器。如本文和权利要求书中使用的，第一“网格”包含网络模式的例如矩形网络电极，包含第一电极阵列，有或没有开口。下面的网格同样可包括或不包括开口。换句话说，网格可以是实心的。第二网格显示在第一网格下面，并提供网格之间的间隔以形成电容器。在图19A的实施方案中，样品通过并到达储库。在备选的实施方案中，图案化的网络网格可为没有开口的实心表面，并且样品可停留在形成电容器的两个网格的顶部或者通过顶部网格到实心的底部网格。图19C提供样品如何滴加在叠置的电极网格上和特定的交流信号如何施加于网格的图解。图19D提供基底上的叠置网格电极照片的黑白线条图和显示一个实施方案的叠置电极网格的扩展视图。
[0122] 样品3853包含例如1.92 x 106个颗粒/毫升的颗粒密度，和样品4118可包含3.5 x 6
10个颗粒/毫升的颗粒密度。这些样品包含取自授乳动物的体细胞(奶)样品。图20A提供在图20A曲线中对cell fix (无细胞)、样品3853号和样品4118号显示的生成的归一化电容随着时间推移的图表(1分钟测试)。实验方法与用于上述装置的方法完全相同。对于向图19A-
19D的叠置电极网格阵列施加的频率为100 kHz和电压为500 mV的信号，以方框显示的cell fix (无细胞)溶液和样品3853的电容在1分钟(60秒)测试中增加5.469%和1.13065%。图20B研究样品4118的浓度水平相对于无体细胞，显示100倍稀释样品4118与无细胞相比可检测乳腺炎。施加相同的扫描电压500 mV和频率100 kHz。纯的4118显示电容呈负向变化-
1.54%，如图20A以-.9%显示的那样。另一方面，100倍稀释4118显示电容呈正向变化2.15%和
10倍稀释4118显示电容呈正向变化1.27%。图20C显示在5分钟测试中的体细胞计数相对于电容随着时间推移的变化的图表。在牛奶的电容变化率和体细胞计数之间观察到很强的相关性，证明该方法可用于诊断乳腺炎。在图中，y=-1.874ln(x)+14.517和R2=0.8763。在200 K体细胞/mL的良好截止值，测试的灵敏度和特异性分别计算为94.7%和100%。结果在5分钟内获得，这足够短，可以用于在线系统并实现高准确率。在其他两个单独的实验中得到了类似的结果。通过改变测试参数或通过放弃一些准确率可缩短测试持续时间。在欧洲，400k的体细胞计数用于确定牛奶是否可以出售；在美国，用于确定牛奶可以出售的体细胞计数值为750k。这些数字可在相应的位置用于体细胞计数的截止值，并获得相似的灵敏度和特异性。
10个颗粒/毫升的颗粒密度。这些样品包含取自授乳动物的体细胞(奶)样品。图20A提供在图20A曲线中对cell fix (无细胞)、样品3853号和样品4118号显示的生成的归一化电容随着时间推移的图表(1分钟测试)。实验方法与用于上述装置的方法完全相同。对于向图19A-
19D的叠置电极网格阵列施加的频率为100 kHz和电压为500 mV的信号，以方框显示的cell fix (无细胞)溶液和样品3853的电容在1分钟(60秒)测试中增加5.469%和1.13065%。图20B研究样品4118的浓度水平相对于无体细胞，显示100倍稀释样品4118与无细胞相比可检测乳腺炎。施加相同的扫描电压500 mV和频率100 kHz。纯的4118显示电容呈负向变化-
1.54%，如图20A以-.9%显示的那样。另一方面，100倍稀释4118显示电容呈正向变化2.15%和
10倍稀释4118显示电容呈正向变化1.27%。图20C显示在5分钟测试中的体细胞计数相对于电容随着时间推移的变化的图表。在牛奶的电容变化率和体细胞计数之间观察到很强的相关性，证明该方法可用于诊断乳腺炎。在图中，y=-1.874ln(x)+14.517和R2=0.8763。在200 K体细胞/mL的良好截止值，测试的灵敏度和特异性分别计算为94.7%和100%。结果在5分钟内获得，这足够短，可以用于在线系统并实现高准确率。在其他两个单独的实验中得到了类似的结果。通过改变测试参数或通过放弃一些准确率可缩短测试持续时间。在欧洲，400k的体细胞计数用于确定牛奶是否可以出售；在美国，用于确定牛奶可以出售的体细胞计数值为750k。这些数字可在相应的位置用于体细胞计数的截止值，并获得相似的灵敏度和特异性。
[0123] 实施例4A-经抗PAG抗体测试妊娠图21说明采用用于妊娠检测的α-PAG (抗PAG抗体) (可获自IDEXX)涂层制备用于妊娠测试的图1的SAW电极阵列的方法的步骤。第一步为在室温下，于盒中用1X PBS中10 µg/毫升的G蛋白处理SAW阵列过夜。然后，阵列可用0.1X PBST清洗一次。然后加载可得自IDEXX的α-PAG，并在室温下保持约1小时。再次用0.1X PBST清洗加载的阵列，然后在室温下用0.1X B封闭约30分钟-1小时。
[0124] 测试可包括加载1:5-1:20血清，以把稀释物优化为阳性或阴性实验组。而且，也可作为对照加载0.1X缓冲液B。
[0125] 扫描和数据收集过程可包括在40 Hz-6 MHz之间施加约5 mV持续1秒，以初始化频率范围内的电容值。然后，施加的信号可为在100 kHz下100 mV持续约1分钟，测试记录对照和实际样品随着时间推移的电容。处理器然后可计算电容随着时间推移的变化作为初始电容扫描的函数。
[0126] 图22A和22B分别提供：电容随着时间推移的变化相对于施加信号的频率的相应图表，其中可以得出，50 kHz以上的信号可用于检测妊娠；和5个妊娠测试的总结，在总结表中显示，阳性相对于阴性或缓冲溶液显示可检测妊娠。
[0127] 电极阵列设计的检测限研究图23A提供构造的叉指电极阵列图，首先提供多个宽间隔的电极，然后对每个宽电极提供多个非常紧密间隔的电极，以研究这种构造电极阵列的检测限。设计和测试的目的是探究阵列结构的检测限，阵列结构包含宽间隔的非对称电极和宽电极，以将生物标志物吸引到狭窄的多个平行对称电极上。非对称电极的宽间隔的具体尺寸从上到下为：第一非对称电极的宽度D1为22.89946 µm (约20微米)；宽非对称叉指电极之间的第一间隔D2为
9.159782 µm (约10微米)；非对称叉指电极之间的宽间隔D3为29.31130 (约30微米)；和最宽的非对称电极的宽度D4为59.53359 µm (约60微米)。然后是窄间隔的多个对称的窄宽度电极，以图23A底部的放大图特别详细地显示。放大图显示对称电极的流动间隔和宽度：多个对称电极的总体宽度D3为约30 µm；D4为约1.5 µm对称电极之间的间隔；和D2为一个对称电极的宽度或约2 µm。新电极的检测限测试包括形成作为对称和非对称叉指电极的组合的电极模式，由此非对称电极可助于产生流动，使得更多颗粒被吸引到其可能会结合的对称电极上。非对称模式大致为10/20/30/60和对称模式大致为1.5/1.5/1.5/1.5 (或2/2/2/2或交错的1.5/2模式)。
9.159782 µm (约10微米)；非对称叉指电极之间的宽间隔D3为29.31130 (约30微米)；和最宽的非对称电极的宽度D4为59.53359 µm (约60微米)。然后是窄间隔的多个对称的窄宽度电极，以图23A底部的放大图特别详细地显示。放大图显示对称电极的流动间隔和宽度：多个对称电极的总体宽度D3为约30 µm；D4为约1.5 µm对称电极之间的间隔；和D2为一个对称电极的宽度或约2 µm。新电极的检测限测试包括形成作为对称和非对称叉指电极的组合的电极模式，由此非对称电极可助于产生流动，使得更多颗粒被吸引到其可能会结合的对称电极上。非对称模式大致为10/20/30/60和对称模式大致为1.5/1.5/1.5/1.5 (或2/2/2/2或交错的1.5/2模式)。
[0128] 图23B为显示在动电学现象影响下被吸引至宽间隔的电极，然后结合于非常紧密间隔的电极的模拟吸引和颗粒流动的图解。箭头表示流动和线条显示颗粒向由宽间隔的电极确定的指定区域(其中存在窄间隔的电极)的对流。图23C为显示生物标志物颗粒的浓度在例如1 ng/mL、2 ng/mL和5 ng/mL下改善检测的图解。可见电容的变化从1 ng/mL浓度到2 ng/mL浓度翻倍，然后在5 ng/mL浓度再次翻倍，其中以57.5 kHz的施加信号频率实施测试。还指示对照1和2表现出电容正向变化(如同.5 ng/mL的低浓度那样)。此外，检测限实验看起来证实，窄和宽的叉指电极的组合对于提供颗粒到对称电极的吸引用于结合为优选的。
[0129] 如以上结果表明，如所描述的那样包被和因此制备用于接收给定幅度、频率和在短的时间段(比如少于10分钟)内的信号的芯片上实验室的几个实施方案，极有可能可被用于快速的、现场或床边诊断一些感染性疾病(经抗原、病原体、异常白细胞计数)和蛋白质检测，例如用于身体状况比如妊娠。
[0130] 实施例4B-小分子检测对于小分子检测，孕酮只是其一个实例，芯片上实验室构造和测试的程序和以上描述的非常相似。孕酮水平可为测试妊娠的一种手段。采用晶片上的5/5/25/25 µm电极。然而，分析用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理的影响，以确定这种处理是否会对电容随着时间推移的变化率产生一些影响。
[0131] 特别是，对于小分子检测，例如孕酮，向电极表面加入0.1XPBS中的抗孕酮多克隆抗体，并使得例如在盒中温育过夜(例如4-8小时，优选地6小时为优选的)。一旦温育过，电极可例如用PBS-T清洗例如3次。然后使用0.1X缓冲液B实施封闭一段时间，例如超过30分钟，以确保成功封闭。然后，用抗孕酮多克隆抗体封闭的电极用PBS-T清洗例如3次。
[0132] 通过加入不同浓度的孕酮实施测试，使用普通1X缓冲液B作为对照，从1 ng/毫升起始，使孕酮的浓度增加至高达10000 ng/毫升，在0.1X缓冲液B中。在手边测试中测试了3种芯片。浓度水平导致电容随着时间的推移从对照无变化增加至约4.2 dC/dt (%/分钟)，然后至10 ng/毫升孕酮的约10.1 dC/dt (%/分钟)。对于10 ng/mL，CV为1.7%。那么，当测试较高浓度水平的孕酮例如100 ng/毫升或1000 ng/毫升时，仍然呈现dC/dt %/分钟的测试结果，但水平降低至约2.5 dC/dt，提示对较高的孕酮水平饱和。
[0133] 如以上所指出的那样，也尝试了APTES处理，并且结果引人关注。具体地讲，加入乙醇中的约2 v/v% APTES，并使得在63℃下温育约4小时，然后用双蒸水清洗3次并干燥。气枪可用来加速干燥。APTES处理的表面用气枪快速干燥，并且在显微镜下检查时没有形成簇(cluster)。
[0134] 然后加入2.5%戊二醛溶液，并使得在室温下温育约2小时。然后用双蒸水把电极清洗3次。在加入如以上描述的孕酮抗体之前，不使电极干燥。最后，加入100 mM乙醇胺溶液，并使得在室温下温育1小时。其余的用于加载孕酮的准备相同-用.1X缓冲液B封闭超过30分钟，并用PBS-T清洗。
[0135] 以0 (对照)和在.1X缓冲液B中1 ng、.5 ng、1 ng、5 ng、10 ng和100 ng/毫升浓度之间的水平向APTES处理的芯片加入孕酮。测量概述在下表中，其中以100 kHz频率实施dC/dt (%/分钟)，并且电压水平为500 mV：表2
浓度 不用APTES 用APTES
0 ng/mL对照 1.2019 3.886
.5 ng/mL 2.5754 6.3182
1 ng/mL 2.989 9.7209
5 ng/mL 1.3632 6.2795
10 ng/mL 1.2909 5.1568
用APTES处理相对于不用APTES处理的测试结果趋于显示，相对于不用时，电容随着时间推移的变化在用APTES处理时上升，例如1 ng/mL相对于5或10 ng/mL看起来显示较不显著的饱和，例如从9至6至5相对于不用APTES，1.2909的10 ng/mL结果与对照的1.2019几乎没有区别。因此可以适当地得出，如以上描述的APTES处理可助于小分子检测。
浓度 不用APTES 用APTES
0 ng/mL对照 1.2019 3.886
.5 ng/mL 2.5754 6.3182
1 ng/mL 2.989 9.7209
5 ng/mL 1.3632 6.2795
10 ng/mL 1.2909 5.1568
用APTES处理相对于不用APTES处理的测试结果趋于显示，相对于不用时，电容随着时间推移的变化在用APTES处理时上升，例如1 ng/mL相对于5或10 ng/mL看起来显示较不显著的饱和，例如从9至6至5相对于不用APTES，1.2909的10 ng/mL结果与对照的1.2019几乎没有区别。因此可以适当地得出，如以上描述的APTES处理可助于小分子检测。
[0136] 实施例5-D-二聚体作为凝血指标紧急情况可能发生在手术后或独立生活期间。D-二聚体为凝血的指标。在以下系列测试中，将PPy包被的电极与未包被的电极相比。制备包被芯片涉及几个步骤。芯片用0.1M硫酸二钠(diabasic sodium sulfate)清洗3次。然后通过向930 µl硫酸钠中加入70 µl吡咯以制备0.1 M吡咯/0.1 M硫酸钠来制备聚合物包被溶液。然后通过把0.1 M吡咯/0.1 M硫酸钠加载到5/5/25/25 µm晶片上来电化学沉积聚合物。在室温下施加约1.5 V持续约5秒以沉积涂层，并把晶片用PBS清洗两次。为了加载抗原或用抗原使聚吡咯包被的芯片表面功能化，以在0.1X PBS中的10 µg/毫升形式加载抗D-二聚体抗体，并在室温下于盒中固化30分钟(盒为任选或者视需要)。然后，芯片用PBST清洗3次。
[0137] 测试结果通过加载0.1X缓冲液B中不同浓度的D-二聚体溶液来实现，对照不含D-二聚体。0.1X PBS用作测试溶液。测试的频率范围在40 Hz-6 MHz之间。
[0138] 下表显示3个测试的浓度(/mL)的详细结果，测试条件为500 mv (电压)、100 kHz (频率)和1分钟持续时间。结果的单位为dC/dt (%/分钟)：表3
浓度(/mL) 测试-1 测试-2 平均值 标准偏差
Pbs (对照) 1.5896 3.4225 2.50605 .91645
0 pg 2.793 2.5786 2.6858 .1072
.1pg 7.8 .809 4.3045 3.4955
1 pg 4.904 7.8288 6.3664 1.4624
10 pg 25.0948 28.5901 26.84245 1.74765
100 pg 36.4224 47.1754 41.7989 5.3765
1000 pg 22.2459 5.7128 13.97935 8.26655
在D-二聚体检测中，看起来在约100 pg似乎达到饱和。测试成功的测试范围看起来是在10 pg-100 pg之间，在达到饱和之后，与对照相比1000 pg仍然产生令人满意的结果。
浓度(/mL) 测试-1 测试-2 平均值 标准偏差
Pbs (对照) 1.5896 3.4225 2.50605 .91645
0 pg 2.793 2.5786 2.6858 .1072
.1pg 7.8 .809 4.3045 3.4955
1 pg 4.904 7.8288 6.3664 1.4624
10 pg 25.0948 28.5901 26.84245 1.74765
100 pg 36.4224 47.1754 41.7989 5.3765
1000 pg 22.2459 5.7128 13.97935 8.26655
在D-二聚体检测中，看起来在约100 pg似乎达到饱和。测试成功的测试范围看起来是在10 pg-100 pg之间，在达到饱和之后，与对照相比1000 pg仍然产生令人满意的结果。
[0139] 以下显示对照测试结果，其中样品直接滴加到没有表面功能化和封闭的PPy包被的电极上。结果是变化率非常小，倾向于排除大规模非特异性结合的可能性。
[0140] 表4样品 dC/dt (%/分钟)
仅1 pg 1.968
仅100 pg 2.1729
仅10000 pg 1.216
图24A和B显示对于测试频率范围1 kHz-110 MHz，通过阻抗相对于电阻的Nyquist图的测试结果。曲线相关性良好，例如10 pg浓度/mL，这也被我们的测试结果所证实，并表明，目前10-100 pg可能是我们的检测限，并且超过100 pg的结果呈现饱和。
仅1 pg 1.968
仅100 pg 2.1729
仅10000 pg 1.216
图24A和B显示对于测试频率范围1 kHz-110 MHz，通过阻抗相对于电阻的Nyquist图的测试结果。曲线相关性良好，例如10 pg浓度/mL，这也被我们的测试结果所证实，并表明，目前10-100 pg可能是我们的检测限，并且超过100 pg的结果呈现饱和。
[0141] 实施例6-糖(葡萄糖检测)5/5/25/25电极实施方案也用于测试糖，特别是葡萄糖。遵循类似的过程加载和封闭芯片进行糖测试。对于葡萄糖，我们使用了葡萄糖氧化酶，该酶作为分子探针加载到芯片上并被封闭。下表用于显示测试频率的优化。如自下表可见的那样，频率在50-100 kHz之间为优选的：
表5
1 mg/mL .1 mg/mL 0 mg/mL
10 kHz -1.7146 3.5377 -2.1191
50 kHz -10.2018 -7.7705 -2.9972
100 kHz -14.9818 -10.4084 -3.3253
200 kHz -2.2687 0.9512 -4.4439
以下也显示一个表格，从中可确定电压水平不是测试的重要因素。对10 mV-500 mV之间的电压值实施测试，电压水平没有对结果产生很大影响：
表6
10 mv 100 mv 500 mv
0 mg/mL -5.9452 -8.8171 -4.9855
.1 mg/mL -7.7512 -5.2861 -6.1618
1 mg/mL 4.9818 -6.0203 -6.3895
10 mg/mL -11.4325 -6.4134 -6.8759
下表提供葡萄糖检测的测试结果，其中所用频率为100 kHz，电压为500 mV和Agilent装置用于在选择的测试频率下施加电压：
表7
测试1 测试2 测试3 平均值 标准偏差
10k µg -2.081 -2.091 -1.517 -1.896 .2679
1k µg -11.09 -12.01 -13.38 -12.16 .9409
100 µg .8471 -3.124 -5.293 -2.5236 2.5425
10 µg -5.868 -.3218 -2.795 -2.9953 2.2689
0 µg 6.9314 3.1267 -.6871 3.1236 3.1102
饱和看起来在1000 µg已经达到，结果显示为dR/dt (%/分钟)，其中R为电阻。如所表明的那样，葡萄糖只是可进行类似测试的糖的一个实例。除了医学应用(例如葡萄糖)以外，一个建议的糖检测(例如蔗糖)应用是检测啤酒中的糖。
表5
1 mg/mL .1 mg/mL 0 mg/mL
10 kHz -1.7146 3.5377 -2.1191
50 kHz -10.2018 -7.7705 -2.9972
100 kHz -14.9818 -10.4084 -3.3253
200 kHz -2.2687 0.9512 -4.4439
以下也显示一个表格，从中可确定电压水平不是测试的重要因素。对10 mV-500 mV之间的电压值实施测试，电压水平没有对结果产生很大影响：
表6
10 mv 100 mv 500 mv
0 mg/mL -5.9452 -8.8171 -4.9855
.1 mg/mL -7.7512 -5.2861 -6.1618
1 mg/mL 4.9818 -6.0203 -6.3895
10 mg/mL -11.4325 -6.4134 -6.8759
下表提供葡萄糖检测的测试结果，其中所用频率为100 kHz，电压为500 mV和Agilent装置用于在选择的测试频率下施加电压：
表7
测试1 测试2 测试3 平均值 标准偏差
10k µg -2.081 -2.091 -1.517 -1.896 .2679
1k µg -11.09 -12.01 -13.38 -12.16 .9409
100 µg .8471 -3.124 -5.293 -2.5236 2.5425
10 µg -5.868 -.3218 -2.795 -2.9953 2.2689
0 µg 6.9314 3.1267 -.6871 3.1236 3.1102
饱和看起来在1000 µg已经达到，结果显示为dR/dt (%/分钟)，其中R为电阻。如所表明的那样，葡萄糖只是可进行类似测试的糖的一个实例。除了医学应用(例如葡萄糖)以外，一个建议的糖检测(例如蔗糖)应用是检测啤酒中的糖。
[0142] 实施例7-酶促氧化还原反应检测酶促氧化还原反应已被用于诊断疾病或检测溶液中的分子。酶促氧化还原反应通常涉及酶和底物之间的反应，产生改变溶液电导率的离子。电导率的变化可例如通过测量流过溶液的电流变化进行电化学检测。
[0143] 至少有3种不同的酶促氧化还原反应可用于通过电化学检测诊断疾病的方法-底物检测、酶检测和探针检测。
[0144] 底物检测的实例是使用诊断性氧化还原酶葡萄糖氧化酶，其催化葡萄糖(底物)转化为葡萄糖酸内酯，同时产生过氧化氢。过氧化氢的水平可作为样品中葡萄糖水平的替代物进行电化学测量。该反应是测量糖尿病患者升高的葡萄糖(底物)水平的基础。正常的血液葡萄糖水平为5 mM，并且据报道基于此原理的葡萄糖检测限在1 nM-25 μM范围内。
[0145] 酶检测的实例为乳酸脱氢酶(LDH)，其为一般组织损伤的标志物，催化天冬氨酸转化为谷氨酸。当谷氨酸通过谷氨酸氧化酶转化为酮戊二酸时，过氧化氢作为副产物产生，并可如以上提及的那样进行电化学检测。正常的LDH水平为3 nM和商业测试的检测限为30 pM。
[0146] 至于探针检测，当目标分析物(比如适体(aptamer))的探针与氧化还原酶抑制剂缀合时，这种缀合物只有在分析物不存在下抑制氧化还原酶的反应，并且因此可用于测量溶液中分析物的水平。这不仅可用于疾病诊断，而且可用于其他目的，比如环境样品中的化学污染物。
[0147] 这3个概念可应用于芯片上实验室的灵敏和快速诊断。芯片上实验室可检测由于电极表面附近的酶促氧化还原反应引起的样品溶液电导率的改变造成的界面电容的变化。电极阵列可用对诊断性氧化还原酶特异性的接头分子(用于酶检测)或氧化还原酶本身(用于底物或探针检测)功能化/包被。可向电极阵列施加低AC电压信号以诱导ACEK效应，其产生目标分子(例如酶、底物和/或探针)向电极阵列表面的对流，促进由接头分子捕获的酶(酶检测)或固定化酶(底物或探针检测)催化的氧化还原反应。对酶-底物对特异性的氧化还原反应可通过测量电极阵列表面的界面电容变化进行检测。
[0148] 图25A为说明通过AC电容传感来检测氧化还原酶的概念图。抗体呈现为Y形受体(即接头分子)并固定在电极上，捕获特异性的酶(显示为●)，其然后催化与样品溶液/电解液中底物(显示为*)的氧化还原反应。反应发生在电解液/电极界面，并可通过界面电容的变化进行检测。
[0149] 图25B为图25A的‘电解液-电极’系统的代表性等效电路。电荷转移电阻Rct和界面电容Cint可引起电极/电解液界面的电荷传输。在图25B中，电解液电阻表示为R流体和电解液电容表示为C流体。酶促反应导致电荷跨电极上的生物聚合物层转移。电学上，这一现象可解释为Rct下降和Cint上升。通过监测Cint，芯片上实验室聚焦于电极表面附近发生的过程。随着酶促反应继续，Cint不断增加。由于酶促放大和界面电容测量，这种方法预计获得更高的灵敏度。
[0150] 界面电容Cint为酶促氧化还原反应的指标。Cint仅指示传感器表面的变化，如由图25B的等效电路说明的那样。因此，检测高度局限于发生酶促反应的界面周围。反应不是和常规电化学检测一样的电极之间的平均离子环境。因此，利用芯片上实验室检测酶促氧化还原反应更为灵敏。另外，复杂流体中干扰的影响最主要通过流体电阻R流体显现出来。当只测量Cint时这种干扰可易于消除。因此，当使用芯片上实验室检测酶促氧化还原反应时预期高灵敏度和特异性。
[0151] 检测在固定频率下进行，这使得同时诱导分子(包括底物和产物)的ACEK对流和界面电容测量。在通常用于ACEK的频率下，阻抗可近似为Cint和R流体的串行连接(serial connection)，使得直接获取Cint而不需采用复杂的数据处理或仪器使用。
[0152] 此外，对于采用归一化Cint变化率的检测度量，可避免基线漂移或对参比传感器/参比样品的需要，大大简化检测程序和仪器使用。对仪器精度的要求也可放宽，最小化传感器之间差异的影响，并使得系统以可承受的价格建造。
[0153] 图25C显示对于不同浓度的底物，采用用酶功能化的电极进行底物检测的实验结果。溶液中的底物为四甲基联苯胺二盐酸盐二水合物(TMB) (M.W.=349.3, MP Biomedicals, LLC, 目录编号: 152116)。固定在电极上的酶为辣根过氧化物酶(HRP) (Thermo Scientific, 编号: 31490)。电极表面用0.01%的Triton封闭半小时。实验用20-kHz, 100-mV AC信号实施。图25C显示对1 fM、10 fM、100 fM和1000 fM (1 pM)的TMB样品记录的归一化dC/dt。如可见的那样，归一化的dC/dt随着底物浓度的增加而成比例地增加。
[0154] 用标记颗粒放大检测已经发现芯片上实验室的检测限(LOD)取决于目标分子或分析物的大小。具体地讲，LOD随着分析物大小的增大而减小。例如，当测试大小为约10 nm的特异性蛋白质时，LOD为约1 ng/mL，而当检测大小为约100 nm的病毒颗粒时LOD为约1 pg/mL。
[0155] 因此，小样品分析物的检测可通过使小样品分析物与纳米至微米大小的颗粒标记缀合，然后把缀合的样品加载到芯片上实验室的电极上进行放大(即LOD可被降低)。标记颗粒在分析之前用对目标分析物特异性的接头分子功能化。使已知浓度的标记颗粒与样品溶液混合。混合物用标记颗粒温育以与目标分析物缀合。把缀合的样品加载到电极上进行测试。标记颗粒可为胶乳珠、磁珠或微生物比如病毒、细菌。图26A、26B和26C分别描绘样品分析物、标记颗粒和缀合样品。
[0156] 图26D描绘芯片上实验室的包被/功能化电极。图26E说明结合于包被电极的无标记颗粒的分析物。在这里，电极的阻抗或电容变化是由于加入分析物。这种电容变化对于分析物的稀释浓度来说可能很小。另一方面，图26F说明结合于包被电极的缀合样品。在这种情况下，分析物和标记颗粒两者有助于阻抗或电容的变化，从而放大芯片上实验室的检测。
[0157] 本发明芯片上实验室也可以比ELISA或其他实验室方法更快速的方式用于检测酶水平。以上讨论了酶(葡萄糖氧化酶)用于糖尿病诊断。某些组织细胞(比如器官组织细胞)含有特征性酶，其只有在限制它们的细胞受损或破坏时才进入血液。一种可对动物血液进行检测的酶的实例是醛缩酶，其在血液中以高血清水平存在可能是骨骼肌损伤和进行性肌营养不良的症状。而且，在病毒性肝炎的早期阶段和晚期前列腺癌(男性)，醛缩酶水平可能会略有增加。肌酸磷酸激酶(CPK)为可用芯片上实验室测量血液样品的另一种酶，并可能对区分与心脏病发作相关的诊断信息或指示骨骼肌损伤具有价值。GGT为胆道梗阻性疾病和肝癌的酶症状。乳酸脱氢酶(LDH)可进一步分为5种组分或同工酶LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4和LDH-5。这些同工酶的水平差异可能指示肝脏或肌肉疾病。LDH-1水平高于LDH-2可指示最近的心脏病发作或心脏损伤。因为总的LDH水平在心脏病发作后24-48小时内上升，所以LDH水平测试是心脏病发作的延迟诊断的有用工具。可经芯片上实验室测试的其他酶水平包括用于胰腺炎的脂肪酶、用于心绞痛或肝损伤(包括肝硬化)和胆道梗阻的GOT。
[0158] 井水的测试一般地包括细菌含量的测试，特别是大肠菌群和大肠杆菌。本发明芯片上实验室可具有井水细菌测试的商业用途。
[0159] 可被类似地诊断的感染性疾病的列表包括HIV、乙型和丙型肝炎、SARS、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染、麻风病、莱姆病、弓形虫病、鸡新城疫(NewCastle disease)、口蹄疫、猪细小病毒、伪狂犬病、禽流感、猪繁殖与呼吸综合征、布鲁氏杆菌病以及克罗恩病。相当的证据表明，MAP也是人克罗恩病的病原体生物，并且一些MAP抗原(特别是p35和p36)被发现在大多数(95%)克罗恩病患者的血液样品中是反应性的，如由Ira Shafran 等, 2002年9月, Digestive Diseases and Sciences, 第2079-2081页报道的那样。而且，已知抗酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的抗体(ASCA/中性粒细胞胞浆(ANCA)为克罗恩病的指标，并且用于可得自Orgentec和The Doctors Doctor的商业免疫测定试剂盒。ASCA/ANCA免疫测定用于具有类似症状的溃疡性结肠炎和克罗恩病的区别诊断。因此，本发明芯片上实验室实施方案可在人克罗恩病的诊断中具有应用。
[0160] 尽管本发明的各个方面已在以上得到描述，但是应该理解它们通过实例呈现而非限制性的。对相关领域技术人员明显的是，可在其中进行各种形式和细节的变化而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明不应受到上述任何一种示例性方面的限制，而是仅应根据以下权利要求书及其等同物来界定。
[0161] 另外，应该理解，突出说明本发明的结构、方法学、功能性和优点的附件中的图表仅提供用于实例目的。本发明具有足够的灵活性和可配置性，使得其可以不同于附图中显示的方式实施。本文的任何专利申请、专利或文章参考文献视为通过参照结合，作为任何对理解本文描述的实施方案和方法认为必要的材料。
[0162] 另外，上述摘要的目的是使美国专利和商标局(U.S. Patent and Trademark Office)和普遍公众，并且尤其是相关领域不熟悉专利或法律术语或用语的科学家、工程师和从业人员，从粗略的查阅快速地确定该技术公开文本的性质和本质。摘要不旨在以任何方式限制本发明的范围。
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