发明领域

本发明涉及环状酰胺低聚物的酶法合成。更具体的说，用水解 酶从各种二酯和二胺生产多种环状酰胺低聚物。

技术背景

聚酰胺的化学合成是本领域公知的。但是，化学合成往往会有 许多不合需要的特点，包括1)使用昂贵或毒性化学催化剂和反应物， 2)产生过量废物，尤其是对于需要用溶剂进行高度稀释的工艺，3)缺 乏生产高纯度所需产物所必需的选择性。

已说明了用多种水解酶(即脂肪酶、酯酶等)酶法合成聚酯和聚酰 胺。酶和它们的典型底物是无毒的，酶法工艺与传统的化学合成相 比通常在更为温和的条件下提供更高的选择性、减少的废物产生和 更快的催化速度。特别是，脂肪酶(E.C.3.1.1.3)已被广泛用于在有机 溶剂存在或不存在下合成聚酯和/或聚酯(酰胺)(Chaudary等，Biotech Prog.13：318-325(1997)；Brazwell等，J.Polym.Sci.Part A：Polym Chem. 33：89-95(1995)；Binns等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1：899-904 (1993)；Geresh等，Biotech.Bioeng.，37：883-888(1991)和WO 94/12652)。

化学法和/或酶法聚合物合成通常生产出线性低聚物，其可用于 传统的模内聚合(即反应注射成型)以形成定型制品。但是，模内聚合 使用线性(聚酯或聚酰胺)低聚物会有一些局限性。在模内聚合时，线 性低聚物上的端基在反应过程中会产生不需要的副产物，例如水(即 当羧酸端基与羟基或氨端基反应时)或有机醇如甲醇(即当酯与羟基或 氨端基反应时)。不需要的副产物通常需要去除，且会不利地影响模 制品的物理特性。这些不利影响包括孔隙体积增加和表面光洁度下 降。最后，线性低聚物趋向于具有高熔体粘度，这可能会限制它们 形成更高分子量的聚合物的能力，或者可能会限制它们在形成更精 细的可模压制品中的用途。

环状酯低聚物(CEO)和环状酰胺低聚物(CAO)提供优于使用线性 低聚物的独特加工优势。首先，环状低聚物在聚合过程中不会引入 端基。这使得材料能用模内聚合工艺进行制备，却不形成挥发性物 质。其次，可制备出更高分子量的聚合物，因为单体缺乏端基，结 果变成聚合物没有很多端基。再次，环状低聚物通常具有较低的熔 体粘度。较低熔体粘度环状低聚物用于模内聚合(例如反应注射成 型)，使得可以生产出具有使用线性低聚物时通常不可获得的分子量 的聚合物，并让更精细的可模压零件得以形成。

环状酯低聚物(CEO)为人所知已有多年，参见例如美国专利第 2,020,298号。已知CEO在许多线性聚酯中以不同的、通常较小的量 存在，并已从这种线性聚酯中分离出。它们通常为低粘度液体，可 通过开环聚合被聚合成更高分子量的线性聚酯，参见例如美国专利 第5,466,744号和第5,661,214号及其中引用的参考文献。CEO的酶 法合成先前已有报道(美国专利第10/698275号，其通过引用结合到 本文中；Lavalette等，Biomacromolecules，3：225-228(2002))。

环状酰胺低聚物(CAO)通常在化学缩聚反应过程中生产。 Kricheldorf等(Macromolecules，34：8879-8885(2001))通过二胺或甲硅 烷基化二胺与二酰氯的化学反应生产了多种脂族和芳族线性酰胺低 聚物(LAO)和CAO。Kricheldorf等并没有教导生产环状酰胺低聚物 的酶促方法。

WO 94/12652描述了在没有添加溶剂的酶催化反应中生产聚酯 或聚酯(酰胺)的工艺，按该工艺以高平均分子量和窄分散度生产了所 需的聚酯或聚酯(酰胺)。对于聚酯(酰胺)的生产，描述了至少一种脂 族二羧酸或其衍生物与至少一种脂族羟基胺、二醇、多元醇、二胺 或聚胺和任选至少一种脂族羟基羧酸、氨基羧酸或衍生物的反应。 用这种工艺生产的聚酯或聚酯(酰胺)具有最优选的约为1的酸值(第18 页第17行)，表明产物为线性聚酯或聚酯(酰胺)低聚物，并非环状聚 酯或聚酯(酰胺)低聚物。在聚酯生产的情况中，认为多至1.5％环状 二酯杂质的产生是不合需要的，提供了除去不需要的环状杂质的方 法(第19页第1-15行)。

最近有报告说，可用水解酶(例如脂肪酶、酯酶、蛋白酶等)从二 酯和二胺制造线性酰胺低聚物(LAO)。Cheng等(美国专利第6,677,427 号)报告了通过在水解酶存在下聚胺和二酯的反应制备各种线性和/或 分支聚酰胺低聚物的酶催化工艺，所述水解酶获自念珠菌属(Candida antartica(南极念珠菌))、假单胞菌属(Pseudomonas fluorescens(荧光 假单胞菌))或毛霉属(Mucor miehei(米氏毛霉))等种属。Cheng等并没 有报告环状酰胺低聚物的形成。具体的说，Cheng等在第13栏第2-4 行中说，“虽然聚酰胺可能为线性的或分支的，但本发明的聚酰胺 优选为线性的，且具有窄的分子量多分散性(Mw/Mn)”，在第6栏第 20-21行中说，“本发明的聚酰胺可能具有至少一个二酯和至少一个 聚胺的残基”。Cheng等所描述的聚酰胺通常具有约4,000至12,000 道尔顿的分子量范围(第6栏第29行)，表明形成了高分子量线性聚 酰胺。Cheng等的工艺在不添加溶剂下进行，或者任选在至少一种质 子溶剂如甲醇、乙醇、乙二醇、甘油、叔丁醇、异丙醇的存在下进 行，或者在水/盐混合物如水/NaCl中进行(第4栏第26-31行)；优选 地，反应在溶剂不存在下进行(第8栏第37-39行；第10栏第52-57 行；实施例1第17-19行；实施例3-5)。所有的工作实施例都在溶剂 不存在下以基本上等摩尔数量的二酯和聚胺来进行，其中每种底物 的浓度都超过约2.75摩尔。每个反应的完成通常通过固体产物的形 成和对固体产物的表征来确定。

Gutman等(Tetrahedron Lett.，33(27)：3943-3946(1992))描述了使 用猪胰腺脂肪酶来催化从二酯和二胺形成大环双内酰胺，发现在酶 不存在下没有反应发生，在酶存在下只有当采用活化的一氯乙基二 酯时反应才进行，用乙基二酯或游离二羧酸没有反应(第3944页最后 一段)。Gutman等教导说大环双内酰胺的酶法生产要求二酯的烷氧基 离去基团为活化的(例如2-氯乙氧基)，而在本发明中应用于生产环状 酰胺低聚物(CAO)的二酯可具有未活化的烷氧基离去基团(例如甲氧 基、乙氧基)。

要解决的问题为提供从非活化二酯和二胺酶法合成环状酰胺低 聚物的方法。

发明概述

以上提到的问题因提供出从非活化二酯和二胺酶法合成环状酰 胺低聚物的工艺已得到解决，所述工艺包括以下步骤：

(a)在一组合适的反应条件下，在由至少一种非质子有机溶 剂构成的介质中，在脂肪酶存在下使以下i)和ii)接触，所述脂肪酶 具有环状酰胺低聚物合成活性，以生产环状酰胺低聚物的二酯和二 胺的总重量计其量占至少约0.01％重量：

i)至少一种以下通式的二酯

R1OOC-[R3]m-[X1-R4]y-COOR2，

其中R1和R2独立为选自以下之一的C1-C20烃基：烷基、亚烷基、芳 基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基、烷氧基烷基和烯基，任 选被一个或多个醚键取代；m为0-1；R3和R4独立为选自以下之一 的C1-C10烃基：烷基、亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、 亚芳基和烯基；X1选自杂原子或非杂原子之一或不选自这两者，其 中所述杂原子包括氧，且其中所述非杂原子包括NH；y为0-5；其 中当X1为杂原子或非杂原子时m为1；

ii)至少一种以下通式的二胺

H2N-R5-[X2-R6]z-NH2

其中R5和R6为选自以下的C1-C6烃基：烷基、亚烷基、芳基、卤芳 基、芳烷基、亚芳烷基、亚烷芳基、亚芳基和烯基；X2选自杂原子 或非杂原子之一或不选自这两者，其中所述杂原子包括氧或硫，且 其中所述非杂原子包括胺、羰基或选自以下之一的C1-C6烃基：烷基、 亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基或烯基；z为0- 20；且其中R5和R6可相同或不同；

(b)从步骤(a)的反应回收一定量的环状酰胺低聚物。

在一个实施方案中，R1和R2独立为任选被一个或多个醚键取代 的C1-C6烃基；m为0或1；R3为C1-C10烃基；y为0-5；R4为C1-C3 烃基；R5和R6独立为C1-C6烃基；z为0-5；X2为杂原子或非杂原子 之一或不选自这两者，其中所述杂原子包括氧或硫，且其中所述非 杂原子包括胺、羰基或C1-4烃基。

在另一个实施方案中，R1和R2独立为任选被一个或多个醚键取 代的C1-C6烷基；m为1；R3为C1-C10烷基；y为0；R5和R6独立为 C1-C6烃基；z为0-4；X2为杂原子或非杂原子之一或不选自这两者， 其中所述杂原子包括氧或硫，且其中所述非杂原子包括胺、羰基或C1-4 烃基。

在又一个实施方案中，R1和R2独立为任选被醚键取代的C1-C6 烷基；m为1；R3为C1-C10烷基；y为0；R5为C1-C6烃基；z为0-4； R6为C1-C4烷基；X2为杂原子或非杂原子之一或不选自这两者，其 中所述杂原子为氧，且其中所述非杂原子为胺或C1-C4烷基。

在又另一个实施方案中，R1和R2独立为C1-C2烷基；m为1；R3 为C1-C10烷基；y为0；R5为C1-C6烷基；z为1；R6为C1-C4烷基； X2为C1-C2烷基。

酶催化剂为获自天然或合成来源的非固定化或固定化脂肪酶。 在一个实施方案中，脂肪酶获自植物、动物、细菌、酵母或真菌。 在另一个实施方案中，脂肪酶获自选自以下的天然来源：假单胞菌 (Psuedomonas sp.)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、毛霉属(Mucor)、 产碱菌属(Alcaligenes)和念珠菌属(Candida)。在又另一个实施方案中， 脂肪酶的天然来源为产碱菌(Alcaligenes sp.)、米氏毛霉(Mucor miehei)、假单胞菌(Psuedomonas sp.)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)和南极念珠菌 (Candida antartica)。在再一个实施方案中，脂肪酶选自南极念珠菌 脂肪酶B、产碱菌脂肪酶、米氏毛霉脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、洋葱 假单胞菌脂肪酶和洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶。在还再一个实施方案 中，脂肪酶选自南极念珠菌脂肪酶B(Novozym435)、产碱菌脂肪 酶(BioCatalytics ICR-117)、产碱菌脂肪酶(Boehringer Mannheim #1859366)、米氏毛霉脂肪酶(BioCatalytics ICR-116)、假单胞菌脂肪 酶(Biocatalytics ICR-113)、假单胞菌脂肪酶(BioCatalytics ICR-129)、 洋葱假单胞菌脂肪酶(Boehringer Mannehim #1827642)、洋葱伯克霍 尔德菌脂肪酶(Amano PS-C Amano I)和洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶 (Amano PS-C Amano II)。在一个优选的实施方案中，脂肪酶为南极 念珠菌脂肪酶B。

合适的二酯包括但不限于己二酸二烷基酯、丙二酸二烷基酯、 丁二酸二烷基酯、戊二酸二烷基酯、邻苯二甲酸二烷基酯、间苯二 甲酸二烷基酯、对苯二甲酸二烷基酯、马来酸二烷基酯、富马酸二 烷基酯、草酸二烷基酯、苯基丙二酸二烷基酯、辛二酸二烷基酯、 癸二酸二烷基酯、己二酸二(2-丁氧基乙基)酯、2，2′-氧二乙酸二甲酯、 3，3′-氧二丙酸二甲酯、3，3′-[1，2-亚乙二(氧基)]二丙酸二甲酯和β-丙氨 酸N-(3-甲氧基-3-氧代丙基)甲酯以及它们的混合物。

合适的二胺包括但不限于1，6-二氨基己烷、1，12-二氨基十二烷、 1，10-二氨基癸烷、二亚乙基三胺、三甘醇二胺(triethyleneglycol diamine)、乙二胺、丙二胺、三亚乙基四胺、二亚丙基三胺、三亚丙 基四胺、四亚丙基五胺、精胺、双六亚甲基三胺、邻苯二胺、聚氧 乙烯二胺、聚氧丙烯二胺、聚醚二胺以及它们的混合物。

合适的非质子溶剂包括但不限于邻二氯苯、二苯醚、氯苯、甲 基叔丁基醚、二异丙醚、四氢呋喃、丙酮、乙腈、1，4-二氧杂环己烷、 N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、1，1，1-三氯乙烷、二氯乙烷、甲苯、 二甲苯、环己烷、庚烷、异辛烷、全氯乙烯、摩尔过量的二胺、摩 尔过量的二酯以及它们的混合物。

在另一个方面，提供从线性酰胺低聚物生产环状酰胺低聚物的 工艺，所述工艺包括以下步骤：

(a)在具有环状酰胺低聚物合成活性的脂肪酶存在下，在一 组合适的反应条件下，在由至少一种非质子有机溶剂构成的介质中， 使至少一种以下通式的线性酰胺低聚物接触，所述脂肪酶以生产环 状酰胺低聚物的二酯和二胺的总重量计其量占至少约0.01％重量：

(A-B)n；

其中n＝1-20；A衍生自以下通式所示的二酯：

R1OOC-[R3]m-[X1-X4]y-COOR2

其中R1和R2独立为选自以下之一的C1-C20烃基：烷基、亚烷基、芳 基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基、烷氧基烷基和烯基，任 选被一个或多个醚键取代；m为0或1；R3和R4独立为选自以下之 一的C1-C10烃基：烷基、亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷 基、亚芳基和烯基；X1选自杂原子或非杂原子之一或不选自这两者， 其中所述杂原子包括氧，且其中所述非杂原子包括NH；y为0-5； 其中当X1为杂原子或非杂原子时m为1，B衍生自以下通式所示的 二胺：

H2N-R5-[X2-R6]z-NH2；

其中R5和R6为选自以下的C1-C6烃基：烷基、亚烷基、芳基、卤芳 基、芳烷基、亚芳烷基、亚烷芳基、亚芳基和烯基；X2选自杂原子 或非杂原子之一或不选自这两者，其中所述杂原子包括氧或硫，且 其中所述非杂原子包括胺、羰基或选自以下之一的C1-C6烃基：烷基、 亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基或烯基；z为0- 20；且其中R5和R6可相同或不同；

(b)从步骤(a)的反应回收一定量的环状酰胺低聚物。

在又一方面，本发明包括通过使环状酰胺低聚物聚合来形成定 型制品的方法，所述方法包括：

a)提供至少一种环状酰胺低聚物；

b)用选自以下的工艺使所述环状酰胺低聚物聚合：注射成 型、旋转成型、树脂膜溶渗、树脂传递成型、纤维缠绕(filament winding)、用以产生预浸料坯(prepeg)或膜的粉末涂装工艺、热熔体 预浸料坯制备、模压成型、辊缠绕(roll wrapping)和拉挤；从而生产 出定型制品。

在另一个实施方案中，本发明包括用选自以下的工艺使环状酰 胺低聚物聚合所形成的定型制品：注射成型、旋转成型、树脂膜溶 渗、树脂传递成型、纤维缠绕、用以产生预浸料坯或膜的粉末涂装 工艺、热熔体预浸料坯制备、模压成型、辊缠绕和拉挤。

这样形成的制品包括汽车车身板、汽车底盘部件、保险杠、飞 机机翼壁板、风车叶片、流体储罐、拖拉机挡泥板、网球拍、高尔 夫球棒杆、帆板桅杆、玩具、杆棒、管、棒料、自行车前叉、膜、 涂层、密封电缆和机器箱壳。

附图简述

由一起构成本申请的附图和发明详述，可更为充分地理解本发 明。

图1显示酶催化剂重量百分比对环状酰胺低聚物合成的影响(另 参见实施例6和表5)。在图1中，cU％指环状单聚体摩尔百分比，cD％ 指环状二聚体摩尔百分比，CAO％指所形成的总环状酰胺低聚物的摩 尔百分比。

发明详述

提供了在温和反应条件下从非活化的二酯和二胺以相对较高的 产率合成环状酰胺低聚物(CAO)的酶促工艺。分离的CAO在应用中 可用于进行开环聚合反应如反应注射成型，以制造高分子量聚酰胺。

在本公开说明书中，使用了许多术语和缩写。提供了以下定义：

本文所用术语“包含”指存在权利要求书所提及的规定特征、 整体、步骤或成分，但它并不排除存在或加入一个或多个特征、整 体、步骤、成分或它们的群组。

本文所用术语“二酯”用以描述含有至少两个酯基团的脂族或 芳族化合物，如下式所示：

R1OOC-[R3]m-[X1-X4]y-COOR2

其中R1和R2独立为选自以下之一的C1-C20烃基：烷基、亚烷基、 芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基、烷氧基烷基和烯基， 任选被一个或多个醚键取代；m为0-1；R3和R4独立为选自以下之 一的C1-C10烃基：烷基、亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷 基、亚芳基和烯基和它们的组合；X1选自杂原子或非杂原子之一或 不选自这两者，其中所述杂原子包括氧，且其中所述非杂原子包括 NH；y为0-5；其中当X1为杂原子或非杂原子时m为1；

合适的二酯的实例包括但不限于己二酸二烷基酯、丙二酸二烷 基酯、丁二酸二烷基酯、戊二酸二烷基酯、邻苯二甲酸二烷基酯、 间苯二甲酸二烷基酯、对苯二甲酸二烷基酯、马来酸二烷基酯、富 马酸二烷基酯、草酸二烷基酯、苯基丙二酸二烷基酯、辛二酸二烷 基酯、癸二酸二烷基酯、己二酸二(2-丁氧基乙基)酯、2，2′-氧二乙酸 二甲酯、3，3′-氧二丙酸二甲酯、3，3′-[1，2-亚乙二(氧基)]二丙酸二甲酯 和β-丙氨酸N-(3-甲氧基-3-氧代丙基)甲酯或它们的混合物。在另一 个实施方案中，二酯包括丙二酸二烷基酯、丁二酸二烷基酯、草酸 二烷基酯、辛二酸二烷基酯、癸二酸二烷基酯和己二酸二(2-丁氧基 乙基)酯。

本文所用术语“二胺”用以描述具有至少两个胺基团的脂族或 芳族化合物，如下式所示：

H2N-R5-[X2-R6]z-NH2

其中R5和R6为选自以下的C1-C6烃基：烷基、亚烷基、芳基、 卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚烷芳基、亚芳基和烯基；X2选自杂 原子或非杂原子之一或不选自这两者，其中所述杂原子包括氧或硫， 且其中所述非杂原子包括胺、羰基或选自以下之一的C1-C6烃基：烷 醇、烷基、亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基或 烯基；z为0-20；且其中R5和R6可相同或不同。

在一个实施方案中，合适的二胺的实例包括但不限于1，6-二氨 基己烷(己二胺)、1，12-二氨基十二烷、1，10-二氨基癸烷、二亚乙基三 胺、三甘醇二胺、乙二胺、丙二胺、三亚乙基四胺、二亚丙基三胺、 三亚丙基四胺、四亚丙基五胺、精胺、双六亚甲基三胺、邻苯二胺、 聚氧乙烯二胺、聚氧丙烯二胺、聚醚二胺以及它们的混合物。在另 一个实施方案中，二胺包括乙二胺、1，6-二氨基己烷、1，12-二氨基十 二烷、三甘醇二胺和邻苯二胺。

本文所用术语“芳族二酯”意指包括芳环作为其结构的一部分 且具有至少两个酯基团的有机化合物。芳族二酯可被一个或多个基 本上不干扰本文各工艺中描述的各种反应的官能团如醚、硫醚和氧 代基(酮基)所取代。

本文所用术语“脂族二酯”意指结构上通常为直链或支链、不 具有芳环作为其结构的一部分、但具有至少两个酯基团的有机化合 物。脂族二酯可被一个或多个基本上不干扰本文各方法中描述的各 种反应的官能团如醚、硫酯和氧代基(酮基)所取代。

本文所用术语“芳族二胺”意指包括芳环作为其结构的一部分 且具有至少两个胺基团的有机化合物。芳族二胺可被一个或多个基 本上不干扰本文各工艺中描述的各种反应的官能团如卤素、醚、硫 醚、胺和和氧代基(酮基)所取代。通常，芳族二胺由两个伯胺基团组 成。

本文所用术语“脂族二胺”意指结构上通常为直链或支链、不 具有芳环作为其结构的一部分、但具有至少两个胺基团的有机化合 物。脂族二胺可被一个或多个基本上不干扰本文各方法中描述的各 种反应的官能团如醚、硫酯、胺和氧代基(酮基)所取代。通常，脂族 二胺由两个伯胺基团组成。

本文所用术语“烃基”指包含碳和氢的脂族基团、环脂族基团 或芳族基团。烃基包括烷基、亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚 芳烷基、亚烷芳基、亚芳基和烯基。烃基应理解为包括饱和或不饱 和的环状、支链或直链的取代烃基，后者指带有另外的取代基如氧(例 如醚键)的烃部分。烃基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异 丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、甲基环 戊基、环己基、甲基环己基、苄基、苯基、邻甲苯基、间甲苯基、 对甲苯基、二甲苯基、乙烯基、烯丙基、丁烯基、环己烯基、环辛 烯基、环辛二烯基和丁炔基。

本文所用术语“杂原子”指碳之外的原子，包括但不限于S或 O。本文所用术语“非杂原子”指包括但不限于胺、羰基和烃基的多 个原子。

本文所用术语“取代的”意指被一个或多个不会造成化合物不 稳定或不适合于预定用途或反应的取代基取代并因此含有这些取代 基的基团。通常有用的取代基包括腈、醚、酯、卤素、氨基(包括伯 氨基、仲氨基和叔氨基)、羟基、氧代、亚乙烯基或取代的亚乙烯基、 甲硅烷基或取代的甲硅烷基、硝基、亚硝基、亚磺酰、磺酰基、磺 酸碱金属盐、硼烷基和取代的硼烷基及硫醚。

本文所用的“低聚物”意指含有至少一个可以识别的同式结构 重复单元的分子。

本文所用术语“环酰胺低聚物”、“CAO”、“大环聚酰胺” 和“MPA”可互换使用，用以描述具有至少两个衍生自二酯和二胺 的酰胺键的环状化合物。本发明的环状酰胺低聚物具有以下通式：

其中A衍生自二酯；B衍生自二胺；n通常为约1至约20，优 选约1至约15，更优选约1至约5，最优选约1至约3。当n＝1时所 形成的环状酰胺低聚物也称环状单聚体。用类似的命名规则描述当 n＝2(环状二聚体)、n＝3(环状三聚体)、n＝4(环状四聚体)时所形成的 环状酰胺。本发明实施例中述及的环状酰胺低聚物通常为单聚体、 二聚体和三聚体；但是用本发明的方法也可产生更大的环状酰胺低 聚物结构。在一个实施方案中，至少约1摩尔百分比(mol％)、更优 选至少约5摩尔百分比、甚至更优选至少约25摩尔百分比、最优选 至少约50摩尔百分比的底物(例如以所用的二酯和二胺计)被转化成 相应的环状酰胺低聚物。

本文所用术语“酶催化剂”指以特征为环状酰胺低聚物形成活 性的催化剂。已发现本文描述的脂肪酶具有环状酰胺低聚物形成活 性。本文所用的“环状酰胺低聚物形成活性”指酶(例如脂肪酶)在本 文描述的反应条件下具有催化环状酰胺低聚物形成的能力。二酯和 二胺的某些组合在本文描述的反应条件下不存在酶催化剂就能反应 产生环状酰胺低聚物(表10)。但是，在相同的反应条件下加入酶催化 剂大大地提高了所形成的总环状酰胺低聚物的摩尔百分比。在一个 实施方案中，相对于在相同的反应条件下不存在酶催化剂时所形成 的环状酰胺低聚物的量，本发明酶催化剂提高所形成的总环状酰胺 低聚物的摩尔百分比(CAO％)至少约1.5倍。

酶催化剂可以为完整微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微 生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化酶或纯化酶的形 式。酶催化剂可以以未固定化的形式使用，或者可以用本领域技术 人员公知的方法固定化在可溶性或不溶性载体上；参见例如 Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，(编辑)； Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。固定化酶的使用使得可以在 随后的反应中将催化剂回收和再使用。载体可包括例如以下材料： 硅藻土、多糖(即壳聚糖、海藻酸盐和卡拉胶)、二氧化钛、二氧化硅、 氧化铝、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯和离子交换 树脂，酶可吸附、共价键连接或离子键连接到载体，或者为交联酶 晶体(CLECS)的形式。

本文所用的术语“脂肪酶”指具有脂肪酶活性的任何酶。本文 所用的“脂肪酶活性”指与通过水解酯键将脂肪水解成甘油和脂肪 酸有关的酶活性。具有脂肪酶活性的水解酶还包括蛋白酶、酰胺酶 和酯酶。脂肪酶还具有催化聚合物的合成的能力，例如分别通过酯 键的形成(即酯交换)和酰胺键的形成(即转酰胺基作用)合成聚酯和聚 酰胺。在一个实施方案中，可用于本发明的脂肪酶为具有催化环状 酰胺低聚物合成的能力的脂肪酶。在另一个实施方案中，可用于本 发明的脂肪酶为相对于在相同的反应条件下不存在酶催化剂时所形 成的环状酰胺低聚物的量，能提高所形成的总环状酰胺低聚物的摩 尔百分比(CAO％)至少约1.5倍的脂肪酶。

已报告了许多脂肪酶(参见Biotechnology，第2版，第8a卷，编 辑H.J.Rehm等，Wiley-VCH，Weinheim，Germany，(1998)第40-191页 的R.J.Kazlauskas等，Biotransformation with Lipases的那章内容)。在 一个实施方案中，适合用于本发明方法中的脂肪酶可获自天然来源 如动物、植物、细菌、酵母、真菌或病毒，或者获自合成来源。在 一个实施方案中，合适的脂肪酶的天然来源包括产碱菌属、念珠菌 属(南极念珠菌脂肪酶B)、假单胞菌属、毛霉属(例如米氏毛霉)和伯 克霍尔德菌属(例如洋葱伯克霍尔德菌，以前称洋葱假单胞菌)。在又 一个实施方案中，脂肪酶选自产碱菌脂肪酶、米氏毛霉脂肪酶、假 单胞菌脂肪酶、洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶和南极念珠菌脂肪酶B。在 再一个实施方案中，脂肪酶获自市售来源。在还再一个实施方案中， 脂肪酶选自产碱菌脂肪酶(BioCatalytics，Inc.，ICR-117)、米氏毛霉脂 肪酶(BioCatalytics，Inc.，ICR-116)、假单胞菌脂肪酶(BioCatalytics，Inc.， ICR-113或ICR-129)、洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶(Amano Enzymes，Inc.， PS-C Amano I和PS-C Amano II)和南极念珠菌脂肪酶B(Novozymes A/S，固定化在丙烯酸树脂上；Novozym435)。在一个方面，特别有 用的催化剂为南极念珠菌脂肪酶B(Novozym435)和假单胞菌脂肪 酶(BioCatalytics，Inc.ICR-113，ICR-129)。在另一个方面，合适的脂肪 酶包括产碱菌脂肪酶(Boehringer Mannheim，# 1859366)和洋葱假单胞 菌脂肪酶(Boehringer Mannheim，# 1827642)。在再一个方面，固定化 催化剂包括南极念珠菌脂肪酶B(Novozym435)和固定化假单胞菌 脂肪酶(ICR-129，BioCatalytics，Inc)。

未固定化或固定化的酶的浓度(w/v百分比)以反应混合物的总重 量计，优选在约0.01重量百分比(wt％)至约25wt％的范围，更优选 约1wt％至约10wt％，最优选3wt％至约10wt％。未固定化酶的比 活优选在约0.1IU/mg蛋白质至约30,000IU/mg蛋白质的范围，其中 IU为酶活力的国际单位，相当于在指定温度下每分钟转化1微摩尔 底物。酶不需要可溶于反应混合物中，可连接到固体材料(支持的)。 固定化酶的比活优选为约0.1IU/g固定化酶至约2000IU/g固定化酶， 更优选为约10IU/g固定化酶至约500IU/g固定化酶。本文所用的一 单位(IU)比活相当于在合适的反应条件下(例如70℃)从己二胺和己二 酸二甲酯产生1μmol/min的环状聚己二酰己二胺。假如酶保持着催 化所需反应的活性，则它可在工艺中循环和再使用(例如通过将酶从 产物混合物滤出)。

本文所用术语“非质子溶剂”意指分子中没有氢原子连接到强 电负性元素(即氧)的原子的有机溶剂。照此，非质子溶剂为不与溶解 于其中的物质交换质子(即缺乏酸性氢原子)的有机溶剂。在一个实施 方案中，“非质子溶剂”可任选包括反应混合物中摩尔过量的二酯 或二胺。

本文所用术语“回收”意指分离、纯化或转移本发明工艺所形 成的产物。从反应混合物分离和纯化产物(即环状酰胺低聚物)的方法 为本领域公知的，可包括但不限于选择性沉淀、过滤、溶剂萃取、 结晶和柱色谱。在一个实施方案中，术语“回收”还包括将产物混 合物(通常在过滤出酶催化剂后)转移到另一反应中以制造一种或多种 另外的产物。

术语“分子筛”指具有二氧化硅和氧化铝四面体三维互连网络 的晶体金属铝硅酸盐。这种材料由能选择性吸附特定大小的分子的 均匀空穴组成。分子筛可市售获得，有多种孔径大小。分子筛3(指 3埃孔径大小)和4(指4埃孔径大小)通常用来吸附(除去)小分子。3 分子筛通常用来除水，4分子筛通常用来从极性和非极性的非含水 介质中除去水和/或甲醇。

本文所用的“纤维”意指具有纤细修长的结构的任何材料，如 聚合物或天然纤维。这种材料可以为玻璃纤维、陶瓷纤维、碳纤维 或有机聚合物如聚酯或聚酰胺纤维。

本文所用的纤维“丝束(tow)”或“线束(strand)”为通常缠绕到 线轴上的一组纤维或一束纤维，可能或可能不加捻。

本文所用术语“纤维预制体(preform)”意指按所需形状保持在 一起的纤维丝束的集合和/或织物。

本文所用术语“预浸料坯”意指已用足够体积的树脂材料浸渍 以提供复合材料基质的纤维材料，如碳纤维、玻璃纤维或其他纤维， 这样纤维与树脂的比例受严密控制。纤维构造可以为丝束形式，可 编织成织物，或者为单向性带(tape)形式。

本文所用的术语“约”修饰所采用的本发明成分或反应物的量， 指例如因以下原因可能会出现的数量上的变化：用以在现实中制备 浓缩物或使用溶液的典型测量和液体处理程序；这些程序中因疏忽 造成的误差；用来制备组合物或执行方法的成分在制造、来源或纯 度上的差异等。术语“约”还涵括因特定初始混合物所致的组合物 平衡条件不同而不同的数量。不管是否被术语“约”所修饰，权利 要求都包括所述数量的等价量。

合适的反应条件

本文描述的酶促方法在酶作为所需反应的催化剂有活性的温度 下执行。温度上限通常为酶停止作为活性催化剂的温度。往往这就 是酶在反应基质中发生变性的温度。这一温度上限会随所用的酶和 工艺成分特别是所用的预选溶剂而变。通常，这些温度可在约-20℃ 至约130℃(该上限适合于特种酶如从嗜热微生物中分离的酶)的范 围。在另一个实施方案中，温度范围为0℃至130℃。通常优选较高 的温度(但低于酶停止有活性的温度)，因为在较高温度下反应一般较 快，各种工艺成分的溶解度通常也较高。在一个实施方案中，有用 的温度可在约20℃至90℃的范围。在另一个实施方案中，优选的 温度可在约40℃至75℃的范围。

本文描述的酶促工艺用具有活性pH范围的酶催化剂来进行，在 所述活性pH范围内酶对所需的反应具有作为催化剂的活性，pH不 会显著影响所需产物的形成。当在本发明的非含水反应混合物中使 用酶催化剂时，对反应混合物的pH调节或控制可能成问题。Zaks等 (J.Biol.Chem，263：3194-3201(1988)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82：3192-3196(1985))先前已描述了这样的技术：将含有酶催化剂的溶 液的pH调节至获得酶的最大活性的pH，然后将酶催化剂从所述溶 液中回收(例如通过冷冻干燥、沉淀、结晶)，再用于非含水反应混合 物。在本发明中，酶催化剂可如上所述进行预处理后再用于本发明 的反应混合物。

在一个实施方案中，pH范围通常为约2至约10，优选约3至约 10，最优选约6至约8。本领域技术人员能调节反应的pH以便最优 地生产本发明产物。

本发明酶促工艺可添加或不添加非质子有机溶剂来实施，但是 优选使用非质子有机溶剂。已证实脂肪酶能在有机溶剂(D.A.Cowan 和A.R.Plant，ACS Symposium Series 498：86-107(1992)；Laane等， Biotechnol.Bioeng.30：81-87(1987))或在无溶剂体系(美国专利第 6,677,427号；WO 94/12652)中发挥功能。

非质子溶剂可以为极性溶剂或非极性溶剂。非质子溶剂的合适 实例包括但不限于邻二氯苯、二苯醚、氯苯、甲基叔丁基醚(MTBE)、 二异丙基醚、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈、1，4-二氧杂环己烷、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、1，1，1-三氯乙烷、二氯乙烷、 甲苯、二甲苯、环己烷、庚烷、异辛烷、全氯乙烯、己烷、苯、二 乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、摩尔过量的二酯、摩尔过量的二胺以 及它们的混合物。在一个实施方案中，反应中所用的二酯或二胺可 以以化学计量过量加入，充当反应的溶剂。在另一个实施方案中， 非质子溶剂选自甲苯、二苯醚和甲基叔丁基醚。

在较为稀释的反应条件下通常有利于分子内反应。照此，可对 用于反应混合物中的溶剂的量加以改变，以使环状酰胺低聚物的生 产最优化。在一个实施方案中，用于反应中的溶剂的量使二酯和/或 二胺反应物的浓度限定至低于约2.5摩尔浓度，优选低于约1.5摩尔 浓度，更优选低于约1摩尔浓度，甚至更优选低于约约0.75摩尔浓 度，最优选约0.5摩尔浓度或更低。在另一个实施方案中，二酯或二 胺可过量加入以充当反应中的溶剂，使得对应的有限底物(即不过量 加入的二酯或二胺底物)低于约2.5摩尔浓度，优选低于约1.5摩尔浓 度，更优选低于约1摩尔浓度，甚至更优选低于约0.75摩尔浓度， 最优选约0.5摩尔浓度或更低。

本发明生产环状酰胺低聚物的工艺可能包括或不包括从反应混 合物中除去过量的水和/或小烷基醇如甲醇和乙醇的方法。但是，Zaks 等(J.Biol.Chem，263：8017-8021(1988))报告说，在有机溶剂中进行的 酶催化反应有最优的水浓度能使酶活性最大化。在一个实施方案中， 可任选将极少量的水或小烷基醇加入到酶催化反应中，只要水和/或 小烷基醇的加入不会不利地影响环状酰胺低聚物形成。

Yan等(Biotechnol.Bioeng.78：31-34(2002)及其中的参考文献)描 述了活化分子筛、微波加热、无机盐、蒸发或共沸蒸馏作为从酶催 化反应混合物中除去反应副产物如水、甲醇和乙醇的方法的用途。 在商业规模上，水浓度的控制通过蒸发或蒸馏或者通过控制反应容 器中气体气氛的湿度来进行最容易和最经济。在本发明的实施例中， 水浓度的控制和甲醇或乙醇从反应混合物的除去通过将分子筛包含 在反应混合物中来进行最为方便。特别优选的是使用孔径大小为3 或4埃()的分子筛。以反应混合物的总重量计，用于本发明方法中 的分子筛的量可在约0重量百分比(wt％)至约50wt％的范围，优选约 0.1wt％至约30wt％，最优选约5wt％至约20wt％。

当本发明的工艺在所加入的非质子有机溶剂存在下进行时，反 应物(二酯和二胺)可完全溶解于溶液中，或者可以以溶解或未溶解固 体或液体的形式存在于反应混合物中，使得随着反应的进行未溶解 固体或液体继续溶解而被转化成所需产物。在反应物存在于溶液中 的情况下，反应物(二酯和二胺)在指定反应温度下的浓度可在0.001M 至各反应物在选定溶剂中的溶解度极限的范围。在一个实施方案中， 反应中二酯和/或二胺的浓度不超过约2.5摩尔浓度，优选低于约1.5 摩尔浓度，最优选约0.5摩尔浓度或更低。优选地，底物在预定的反 应温度下在预选溶剂中的溶解度为至少1.0w/v％。更优选地，所述 溶解度为至少约3w/v％，更优选至少约5w/v％。优选的是，所有的 工艺成分(除酶催化剂外)在整个酶催化过程中在预定的反应温度下完 全可溶于选定的溶剂中。但是，在工艺结束时(在分离出酶催化剂后)， 可将工艺混合物的温度降低，以使环状酰胺低聚物优先地从线性酰 胺低聚物中沉淀和分离出来(例如通过过滤来分离)。任选地，环状酰 胺低聚物在反应工艺过程中可在选定的反应溶剂中沉淀出来。沉淀 出的环状低聚物可通过过滤回收，或者可用另一溶剂和/或通过提高 溶剂温度进行再溶解。优选地，选择能促进环状酰胺低聚物或线性 酰胺低聚物的选择性沉淀的溶剂和/或溶剂温度。任选地，可通过本 领域技术人员公知的方法使可溶性环状酰胺低聚物与可溶性线性酰 胺低聚物分离开来，所述方法包括但不限于诸如环状或线性酰胺低 聚物的选择性提取或通过柱色谱分离之类的方法。

本发明工艺可以以分批、半分批或连续工艺的形式运行。如果 用惰性气体流(即喷射)来除去挥发性副产物，所述气体中的挥发性物 质可进行回收(即通过将气体冷却和将挥发性物质凝结)和/或所述气体 可在工艺中循环。

合适的二酯和二胺

用以生产本发明的大环酰胺低聚物的酶促工艺通常由下式表 示：

其中n＝1-20，优选n＝1-10，更优选n＝1-5，最优选n＝1-3；A衍生 自二酯，B衍生自二胺。

环状酰胺低聚物可描述为环状单聚体(其中n＝1)、二聚体(n＝2)、 三聚体(n＝3)、四聚体(n＝4)和五聚体(n＝5)，类似命名规则可用于具有 更高聚合程度的环状酰胺低聚物。

本发明所合成的环状酰胺低聚物的产量为至少约1摩尔百分比， 优选至少约5摩尔百分比，更优选至少25摩尔百分比，最优选至少 50摩尔百分比。

二酯与二胺的摩尔比可以大约相等，或者可以运行在化学计量 不平衡(stoichiometric imbalance)下。二酯与二胺的摩尔比(二酯/二胺) 可在约0.10至约10的范围。在另一个实施方案中，二酯与二胺的摩 尔比可在约0.25至约4的范围。在再一个实施方案中，二酯与二胺 的摩尔比可在约0.95至约1.05的范围。在还再一个实施方案中，当 将二酯或二胺用作溶剂时，化学计量不平衡可显著地更高，导致二 酯与二胺的摩尔比低于0.10至高于10。本文所用的“摩尔过量”指 反应混合物中的二酯和二胺之间存在化学计量不平衡的反应条件。 在一个实施方案中，反应混合物中的二酯可相对于二胺摩尔过量。 在另一个实施方案中，反应混合物中的二胺可相对于二酯摩尔过量。 在再一个实施方案中，摩尔过量的二酯或二胺在反应混合物中起到 溶剂的作用。在还另一个实施方案中，反应混合物包含摩尔过量的 二胺或二酯和非质子有机溶剂。

合适的二酯具有下式：

R1OOC-[R3]m-[X1-R4]yCOOR2，

其中R1和R2独立为选自以下之一的C1-C20烃基：烷基、亚烷基、芳 基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基、烷氧基烷基和烯基，任 选被一个或多个醚键取代；R3和R4独立为选自以下之一的C1-C10烃 基：烷基、亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基和 烯基；X1选自杂原子或非杂原子之一或不选自这两者，其中所述杂 原子包括氧，且其中所述非杂原子包括NH；y为0-5；m为0或1； 其中当X1为杂原子或非杂原子时m为1。

合适的二胺具有下式：

H2N-R5-[X2-R6]z-NH2

其中R5和R6为选自以下的C1-C6烃基：烷基、亚烷基、芳基、卤芳 基、芳烷基、亚芳烷基、亚烷芳基、亚芳基和烯基；X2选自杂原子 或非杂原子之一或不选自这两者，其中所述杂原子包括氧或硫，且 其中所述非杂原子包括胺、羰基或选自以下之一的C1-C6烃基：烷基、 亚烷基、芳基、卤芳基、芳烷基、亚芳烷基、亚芳基或烯基；z为0- 20；且其中R5和R6可相同或不同。

在一个实施方案中，R1和R2独立为任选被一个或多个醚键取代 的C1-C6烃基；m为0或1；R3为C1-C10烃基；y为0-5；R4为C1-C3 烃基；R5和R6独立为C1-C6烃基；z为0-5；X2为杂原子或非杂原子 之一或不选自这两者，其中所述杂原子包括氧或硫，且其中所述非 杂原子包括胺、羰基或C1-4烃基。

在另一个实施方案中，R1和R2独立为任选被一个或多个醚键取 代的C1-C6烷基；m为1；R3为C1-C10烷基；y为0；R5和R6独立为 C1-C6烃基；z为0-4；X2为杂原子或非杂原子之一或不选自这两者， 其中所述杂原子包括氧或硫，且其中所述非杂原子包括胺、羰基或C1-4 烃基。

在再一个实施方案中，R1和R2独立为任选被醚键取代的C1-C6 烷基；m为1；R3为C1-C10烷基；y为0；R5为C1-C6烃基；z为0-4； R6为C1-C4烷基；X2为杂原子或非杂原子之一或不选自这两者，其 中所述杂原子为氧，且其中所述非杂原子为胺或C1-C4烷基。

在还另一个实施方案中，R1和R2独立为C1-C2烷基；m为1；R3 为C1-C10烷基；y为0；R5为C1-C6烷基；z为1；R6为C1-C4烷基； X2为C1-C2烷基。

合适的二酯包括但不限于己二酸二烷基酯、丙二酸二烷基酯、 丁二酸二烷基酯、戊二酸二烷基酯、邻苯二甲酸二烷基酯、间苯二 甲酸二烷基酯、对苯二甲酸二烷基酯、马来酸二烷基酯、富马酸二 烷基酯、草酸二烷基酯、苯基丙二酸二烷基酯、辛二酸二烷基酯、 癸二酸二烷基酯、己二酸二(2-丁氧基乙基)酯、2，2′-氧二乙酸二甲酯、 3，3′-氧二丙酸二甲酯、3，3′-[1，2-亚乙二(氧基)]二丙酸二甲酯和β-丙氨 酸N-(3-甲氧基-3-氧代丙基)甲酯以及它们的混合物。在一个具体的 实施方案中，二酯是己二酸二烷基酯。

合适的二胺包括但不限于1，6-二氨基己烷(己二胺)、1，12-二氨基 十二烷、1，10-二氨基癸烷、二亚乙基三胺、三甘醇二胺、乙二胺、 丙二胺、三亚乙基四胺、二亚丙基三胺、三亚丙基四胺、四亚丙基 五胺、精胺、双六亚甲基三胺、邻苯二胺、聚氧乙烯二胺、聚氧丙 烯二胺、聚醚二胺以及它们的混合物。在一个具体的实施方案中， 二胺是1，6-二氨基己烷、1，10-二氨基十二烷或1，12-二氨基十二烷。

本发明生产的环状酰胺低聚物包括但不限于环状聚草酰乙二 胺、聚草酰己二胺、环状聚草酰癸二胺、环状聚草酰十二烷二胺、 环状聚富马酰乙二胺、环状聚富马酰己二胺、环状聚富马酰癸二胺、 环状聚富马酰十二烷二胺、环状聚丙二酰丙二胺、环状聚丙二酰己 二胺、环状聚丙二酰癸二胺、环状聚丙二酰十二烷二胺、环状聚马 来酰乙二胺、环状聚马来酰己二胺、环状聚马来酰癸二胺、环状聚 马来酰十二烷二胺、环状聚丁二酰己二胺、环状聚丁二酰癸二胺、 环状聚丁二酰十二烷二胺、环状聚戊二酰己二胺、环状聚戊二酰癸 二胺、环状聚戊二酰十二烷二胺、环状聚己二酰乙二胺、环状聚己 二酰丁二胺、环状聚己二酰戊二胺、环状聚己二酰己二胺、环状聚 己二酰癸二胺、环状聚己二酰十二烷二胺、环状聚己二酰三甲基己 二胺、环状聚己二酰邻苯二胺、环状聚庚二酰乙二胺、环状聚庚二 酰己二胺、环状聚庚二酰癸二胺、环状聚庚二酰十二烷二胺、环状 聚辛二酰丙二胺、环状聚辛二酰己二胺、环状聚辛二酰癸二胺、环 状聚辛二酰十二烷二胺、环状聚壬二酰乙二胺、环状聚壬二酰己二 胺、环状聚壬二酰癸二胺、环状聚壬二酰十二烷二胺、环状聚癸二 酰乙二胺、环状聚癸二酰己二胺、环状聚癸二酰癸二胺、环状聚癸 二酰十二烷二胺、环状聚癸二酰三甘醇二胺、环状聚癸二酰(亚氨基 二己胺)、环状聚癸二酰邻苯二胺、环状聚癸二酰二环己基亚甲二胺 聚poly(bis-cyclohexylmethane sebacamide)、环状聚十二烷二酰乙二 胺、环状聚癸十二烷二酰己二胺、环状聚十二烷二酰癸二胺、环状 聚十二烷二酰十二烷二胺、环状聚十二烷二酰三甘醇二胺、环状聚 十二烷二酰(亚氨基二己胺)、环状聚十二烷二酰二环己基亚甲二胺、 环状聚十二烷二酰邻苯二胺、环状聚对苯二甲酰对苯二胺、环状聚 对苯二甲酰间苯二胺、环状聚对苯二甲酰邻苯二胺、环状聚间苯二 甲酰对苯二胺、环状聚间苯二甲酰间苯二胺、环状聚间苯二甲酰邻 苯二胺、环状聚邻苯二甲酰对苯二胺、环状聚邻苯二甲酰间苯二胺、 环状聚邻苯二甲酰邻苯二胺、环状聚对苯二甲酰二环己基亚甲二胺、 环状聚对苯二甲酰二环己基亚甲二胺、环状聚对苯二甲酰二环己基 亚甲二胺、环状聚对苯二甲酰三甲基己二胺、环状聚间苯二甲酰三 甲基己二胺、环状聚邻苯二甲酰三甲基己二胺、环状聚对苯二甲酰 己二胺、环状聚对苯二甲酰癸二胺、环状聚对苯二甲酰十二烷二胺、 环状聚对苯二甲酰三甘醇二胺、环状聚对苯二甲酰(亚氨基二己胺)、 环状聚邻苯二甲酰己二胺、环状聚邻苯二甲酰癸二胺、环状聚邻苯 二甲酰十二烷二胺、环状聚邻苯二甲酰三甘醇二胺、环状聚邻苯二 甲酰(亚氨基二己胺)、环状聚间苯二甲酰己二胺、环状聚间苯二甲酰 癸二胺、环状聚间苯二甲酰十二烷二胺、环状聚间苯二甲酰三甘醇 二胺或环状聚间苯二甲酰(亚氨基二己胺)。

在一个优选的实施方案中，环状酰胺低聚物包括但不限于环状 聚草酰乙二胺、环状聚丙二酰丙二胺、环状聚己二酰丁二胺、环状 聚己二酰己二胺、环状聚己二酰癸二胺、环状聚己二酰十二烷二胺、 环状聚辛二酰己二胺、环状聚辛二酰十二烷二胺、环状聚壬二酰己 二胺、环状聚癸二酰乙二胺、环状聚癸二酰癸二胺、环状聚癸二酰 十二烷二胺、环状聚癸二酰三甘醇二胺、环状聚癸二酰己二胺 (poly(bis-hexamethylene sebacamide))、环状聚癸二酰邻苯二胺、环状 聚癸十二烷二酰己二胺、环状聚十二烷二酰癸二胺或环状聚十二烷 二酰十二烷二胺。

在一个特别优选的实施方案中，环状酰胺低聚物是环状聚己二 酰己二胺和环状聚己二酰十二烷二胺。

使用非环状低聚物生产环状酰胺低聚物

在另一个方面，可用非环状低聚物作为底物进行环状酰胺低聚 物的酶法生产。非环状低聚物可包括线性低聚物、分支低聚物、非 环状低聚物的混合物或者非环状低聚物与二酯和/或二胺的混合物。 例如，衍生自二酯(A)与二胺(B)的聚合→(A-B)n的线性低聚物可用来 生产环状酰胺低聚物，只要所得的线性低聚物包含至少一个酯基团 和至少一个胺基团，且其中n为1或以上，优选1至约30，更优选 1至约20，更优选1至约10，甚至更优选1至5。

使用稀释的反应条件通常有助于分子内反应。线性酰胺低聚物 向环状酰胺低聚物的酶促转化优选在非质子有机溶剂中进行。

取决于线性酰胺低聚物的平均长度，溶解度极限会不同。对于 较短的线性酰胺低聚物(例如n＝5或以下)，可调整用于线性酰胺低聚 物(LAO)向环状酰胺低聚物(CAO)酶促转化的溶剂的量，使得反应中 LAO的浓度通常低于约2.5摩尔浓度，优选低于约1摩尔浓度，更 优选低于约0.75摩尔浓度，甚至更优选低于约0.1M，最优选仅仅约 0.01摩尔浓度。对于较长的线性酰胺低聚物(例如n＞5)，可调整所用 的溶剂的量，使得线性酰胺低聚物的浓度接近线性酰胺低聚物的饱 和浓度，优选约0.3摩尔浓度或以下，更优选约0.1摩尔浓度或以下。

线性酰胺低聚物向环状酰胺低聚物酶促转化的合适反应条件 (pH、所用的非质子溶剂、温度和水解酶催化剂)为前文描述的条件(参 见“合适的反应条件”)。

环状酰胺低聚物的分离和分析

所需的环状酰胺低聚物(CAO)可通过本领域公知的纯化/分离技 术回收。例如，如果CAO是固体，则可这样从溶液中回收：冷却溶 液和/或除去一些或所有的溶剂，然后例如通过过滤回收固体CAO。 如果工艺中有一些线性聚酰胺(任何分子量)残余，则有可能通过差异 性沉淀或者由一种或多种溶剂萃取来使CAO与线性聚酰胺分离。合 适的溶剂的实例包括但不限于二氯甲烷、氯仿、二甲基乙酰胺、六 氟异丙醇、丙酮和二甲苯。其他使环状低聚物与线性链分离的方法 包括但不限于色谱法、结晶法(例如分离尼龙6，6环状体(cyclics))和升 华法(例如分离尼龙12，6环状体)。

有许多工具可供进行聚合物分析，包括但不限于薄层层析、尺 寸排阻层析、核磁共振波谱(质子谱和碳谱)、红外(IR)光谱、高效液 相色谱(HPLC)、气相色谱、质谱(包括MALDI-TOF MS和ESI-MS) (Klun等，Polymer，42：7095-7099(2001))。

用环状酰胺低聚物制造定型制品

在本发明的一个方面，可用环状酰胺低聚物材料(添加或不添加 填料)，通过在制品形成工艺中将材料聚合来生产定型制品，所用的 工艺例如但不限于注射和旋转成型、树脂膜溶渗、树脂传递成型、 纤维缠绕、用以产生预浸料坯或膜的粉末涂装、热熔体预浸料坯制 备、模压成型、辊缠绕和拉挤(伴加强，在一些情况下不伴加强)。唯 一的要求是，条件允许环状酰胺低聚物发生聚合形成高分子量聚酰 胺；也就是说环状酰胺低聚物应至少被加热至其熔点。通常，大多 数的这种工艺要求待加工的树脂具有低熔体粘度；因此，环状酰胺 低聚物(其具有低熔体粘度)特别适合于这种加工。

例如，从环状酰胺低聚物制造制品的成型工艺包括将至少一种 环状酰胺低聚物和至少一种聚合催化剂的混合物或加合物放入模具 中，将模具中的内容物加热至高得足以使低聚物发生聚合的温度。 这一温度在低聚物的熔点之上，通常在约120至约280℃的范围。 由于熔化的低聚物粘度低，可将熔化的低聚物和催化剂在远低于注 射成型工艺代表性的5,000-20,000psi(34Mpa-64MPa)的压力下注射 入模具中。

在模压成型中，将低聚物和催化剂放在压具当中的顶模和下模 之间。低聚物和催化剂通常被装载到纤维质基层材料上。模具(mold) 的各个模(die)以足够的压力互相挤压以均匀地填充模具，而模具内容 物被加热至高得足以发生聚合的温度。模压成型用来制造薄且通常 平坦的具有和缓特征和轮廓的塑料复合材料零件，如卡车和汽车车 身板、保险杠、各种盘子和机器箱壳。

在旋转成型中，成型工艺另外包括使模具同时绕着两条轴旋转， 使得内容物在模具内部的指定区域翻转，内容物被加热前就开始旋 转，继续使模具旋转直到内容物发生聚合和固化。旋转成型这种工 艺用以制造中空热塑性制品，如多种流体储罐、拖拉机挡泥板和大 龄儿童的玩具。

在树脂膜溶渗中，将含有催化剂的环状酰胺低聚物薄层或膜放 在靠近纤维质材料干层的模具中，当模具的内容物被加热时，低聚 物和催化剂就被迫注入到纤维质材料干层中。树脂膜溶渗这种工艺 用于制造主要有一个表面平坦且可具有明细特征的塑料复合材料制 品。这种制品的示例性实例是通常由碳纤维和环氧树脂造复合材料 建造的飞机机翼壁板。

反应注射成型(RIM)传统上使用尿烷基化学品，但DSM和Dupont 致力于将RIM技术应用于己内酰胺(Macosko，C，Fundamentals of Reaction Injection Molding，Hanser Publishers：New York，NY；第7章 (1989))。将RIM技术应用于己内酰胺是从人们专注于铸造技术的早 期成果发展起来的。例如，Darnell等(美国专利第3,309,343号)研究 了用于己内酰胺链生长聚合的活化单体方法的效力。通常，之所以 对环状酰胺的开环聚合(ROP)有兴趣，是因为环状酰胺单体的熔体粘 度低和它在类似RIM的工艺中会向高分子量聚酰胺转化(Brunelle， DJ.，“Synthesis and Polymerization of环状聚ester Oligomers”in Modern Polyesters.Schiers，J.and Long T.E.(编辑)Wiley and Sons， New York，NY.(2003))。单体固有的低熔体粘度状态(＜30cps)使得大 环方法(macrocyclic approach)可用于小型复杂零件的开发、纤维毡的 良好湿润和无孔隙材料的生产。此外，环状单体不存在端基有助于 异常高分子量聚合物的制备。这些环状单体容易适用于多种多样的 聚合物加工技术，如拉挤、树脂传递成型和铸造。例如，环状聚己 二酰己二胺可用于纤维、膜和用于塑造物如电气零件和汽车零件。

本发明的组合物和方法可用来从各种环状酰胺低聚物制造各种 大小和形状的制品。示例性的可由本发明制造的制品包括但不限于 车车身板和底盘部件、保险杠、飞机机翼壁板、风车叶片、流体储 罐、拖拉机挡泥板、网球拍、高尔夫球棒、帆板桅杆、玩具、杆棒、 管、棒料、自行车前叉和机器箱壳。

在制品的制造中，可包括多种类型的填料之一者或多者。往往 包括特定的填料以达到所需的目的或性质，填料可存在于所制成的 聚酰胺聚合物中。例如，填料的目的可能是增加聚酰胺聚合物制品 的强度。在要求高水平导热性和低水平导电性的应用中，使用氮化 硼作为填料。填料还可提供重量或体积以达到特定的密度，作为较 为昂贵的材料的替代品，和/或提供技术人员公认的其他适宜特性。 填料的示例性实例有火成二氧化硅、二氧化钛、碳酸钙、短切纤维、 粉煤灰、玻璃微球体、微细圆润粉、碎石、纳米粘土、线型聚合物 和单体等。填料可在聚合反应之前、过程中或之后加入。取决于具 体填料和加入填料的目的，填料的加入量通常占总量(即低聚物加上 催化剂加上填料加上可能存在的任何其他添加剂)的约0.1％至70％重 量之间。例如，在碳酸钙情况下所述百分比优选在25％至50％重量 之间，纳米粘土情况下在2％至5％重量之间，玻璃微球体情况下在25％ 至70％重量之间。填料可用来制作聚酰胺聚合物复合材料。

此外，在制品的制造中，可加入另外的成分(例如添加剂)。示例 性的添加剂包括着色剂、颜料、磁性材料、抗氧化剂、紫外线稳定 剂、增塑剂、阻燃剂、润滑剂和脱模剂。

本发明生产的环状酰胺低聚物通常可用于基本上任何使用线性 酰胺低聚物的应用中。环状酰胺低聚物的另外用途包括但不限于例 如以下应用：粉末涂料(美国专利第6,141,103号和美国专利第 6,376,026号)、起绉粘合剂和制造纤维素制品的湿强树脂(美国专利第 6,677,427号)。

在一个实施方案中，用于形成定型制品的工艺中的环状酰胺低 聚物的量占用于制品成型工艺中的原料的至少1wt％，优选至少5 wt％，更优选至少25wt％，甚至更优选至少50wt％，还甚至更优选 至少90wt％，最优选至少99wt％。

本发明申请人明确地将所有引用的参考文献的全部内容结合到 本公开说明书中。此外，当某个量、浓度或其他数值或参数以某个 范围、优选范围或一列优选上限值和优选下限值给出时，这应理解 为明确地公开了由任何一对任何范围上限或优选值和任何范围下限 或优选值所构成的所有范围，而不论范围是否已单独公开。在本文 叙述了数值范围的地方，除非另有规定，否则该范围意指包括其端 点和落入其中的所有整数和分数。不想使本发明的范围受限于定义 某个范围时所叙述到的具体数值。

实施例

本发明进一步在以下实施例中得到说明。应认识到，这些实施 例虽然指明了本发明的优选实施方案，但只以示例说明的方式给出。 本领域技术人员从以上讨论和这些实施例，能明确本发明的必要特 征，且能不偏离本发明的精神和范围作出本发明的各种变化和修改， 以使本发明适应于各种应用和条件。

所有试剂均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，除非另有指明。水解酶获自 BioCatalytics Inc.(Pasadena，CA)、Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim，Germany)、Roche Diagnostics(Indianapolis，IN)、Amano Enzymes，Inc.USA(Elgin，IL)或Novozymes A/S(Bagsvaerd， Denmark)。

缩写词的含义如下：“h”指小时、“min”指分钟、“mL” 指毫升、“μL”指微升、“L”指升、“mg”指毫克、“MPA”指 大环聚酰胺，“CAO”指环状酰胺低聚物、“HMD”指己二胺、“DMA” 指己二酸二甲酯、“DADD”指二氨基十二烷、“DPE”指二苯醚、 “MTBE”指甲基叔丁基醚、“o-PD”指邻苯二胺、“MC％”指单 体(二酯)百分转化率、“cU％”指所形成的环状单聚体的摩尔百分比、 “cD％”指所形成的环状二聚体的摩尔百分比、“cT％”指所形成的 环状三聚体的摩尔百分比、“CAO％”指所形成的总环状酰胺低聚物 的摩尔百分比、“wt％”指重量百分比、“M”指摩尔浓度、“MALDI-TOF MS”指基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱、“HPLC MS”指高 效液相色谱与质谱联用、“rpm”指每分钟转数。

一般方法

二酯转化的HPLC测定

使用装备有2487 UV检测器(210nm)和Novapak C18柱 (3.9×150mm，60A孔径大小，4μm颗粒大小)的Waters Alliance 2695 分离系统。按以下梯度以1mL/min流速运行水：乙腈流动相：

时间(min)     水(％)     乙腈(％)     0     20     25     28     30     35     90     30     0     0     90     90     10     70     100     100     10     10

将适当的二酯和或无溶剂反应样品溶于乙腈/水中。观察到以下 二酯保留时间：草酸二甲酯(C2)2.36分钟、丙二酸二甲酯(C3)3.05 分钟、丁二酸二甲酯(C4)4.05分钟、己二酸二甲酯(C6)7.7分钟、辛 二酸二甲酯(C8)12.3分钟、癸二酸二甲酯(C10)16.5分钟、己二酸二 乙酯12分钟、己二酸二(2-丁氧基乙基)酯19.4分钟。单体转化率通 过将反应混合物中的二酯峰面积与用已知浓度二酯产生的校准曲线 比较来确定。

低聚组合物的MALDI-TOF分析

将产物混合物溶于甲苯/甲醇混合物(按各实施例的规定为50/50 或20/80)中，制成大约0.2M溶液(或者对于以0.025M反应物进行的 高度稀释的反应来说至少0.01M的溶液)。将这些样品300∶1(或者对 于高度稀释的反应混合物样品来说15∶1)稀释于六氟异丙醇(HFIP) 中。将看来并不溶于甲苯/甲醇中的样品溶解于三氯乙醇(TCE)中，用 TCE进行300∶1(或者对于高度稀释的反应混合物样品来说15∶1)稀 释。按以下方式将溶液放在基质辅助激光解吸/电离(MALDI)靶板上。 首先，将2，5-二羟基苯甲酸(DHB)(0.5mL)的饱和丙酮溶液加入到靶 板中充当基质。然后，将0.5mL的HFIP或TCE反应混合物溶液加 到干基质斑点。HFIP溶液在空气中快速干燥，TCE溶液则在真空下 进行干燥。使用PerSeptives Biosystems Voyager-DE STR MALDI-TOF 质谱仪，用氮(337nm)激光进行操作，获得所有样品的MALDI-TOF 质谱。每个质谱是100-250个激光事例的累积。

环状物类(species)和带酯-胺、酯-酯、胺-胺、酸-胺、酸-酯和酸- 酸末端的线性链在质谱中作为H+、Na+或K+加合物而被观察到。例 如，环状尼龙12，6单聚体[NH(CH2)12NH-C(O)(CH2)6C(O)]1分别以 311、333和/或349 Da作为氢、钠和钾阳离子化离子而被检测。

环状物类占所有低聚物的相对摩尔百分比由对应低聚物的所有 观察到离子的面积计算出。如下评估此定量的有效性，即低分子量 低聚酰胺(反应中观察到的不超过2500Da、其中1000Da以下最为丰 富的低聚酰胺)的相似电离效率。其中三聚体为最丰富物类的低分子 量尼龙6，6低聚物，按使主要低聚物为带酸性末端的线性低聚物的方 式合成。同样，合成具有主要胺末端而且还具有主要酸-胺末端的类 似线性低聚物。以三聚体为最丰富物类的环状低聚物通过用甲醇萃 取尼龙6，6来获得。将各固体材料称重并溶于HFIP中制成大约等摩 尔的溶液。在分别将溶液放到用DHB作为基质的MALDI-TOF靶板 上时和在获取质谱时，都使用相同的条件。检查各质谱中占优势低 聚物之外的低聚物的污染情况。然后将四种溶液混合，制成具有酸 末端、胺末端、酸-胺末端和环状体的低质量尼龙6，6低聚物等摩尔 混合物。等摩尔混合物的MALDI-TOF质谱中每种低聚物类型所观 察到的总离子丰度(考虑每种成分中的污染)显示，相对不同的末端或 环状体MALDI-TOF解吸/电离过程中的差别极小。

实施例1

在甲苯或二苯醚(DPE)中用Novozym435(10wt％)

从己二胺(HMD)或二氨基十二烷(DADD)(0.5M)

和己二酸二甲酯(DMA)合成大环酰胺

将装有搅拌棒并含有以下成分的8-mL反应小瓶(vial)在高温、 持续搅拌下进行温育：200mg Novozym435(Novozymes A/S)，116 mg HMD或200mg DADD，选定数量的DMA(表1)，1.84mL、1.72mL 或1.23mL甲苯或DPE(分别对于0.25、1或4的DMA/HMD摩尔比) 或者1.76mL、1.64mL或1.14mL甲苯或DPE(分别对于0.25、1或 4的DMA/DADD摩尔比)和200mg 4分子筛。

适当时间后停止加热反应，放入聚丙烯离心管中，用2mL温(60℃) 甲苯/甲醇(80/20)以12000rpm离心5min，收集上清液。再加入温甲 苯/甲醇(80/20)，重复进行离心和上清液移取，合并上清液级分。通 过MALDI-TOF MS分析上清液的环状酰胺低聚物含量(CAO，％)。

没有检测除环状单聚体(cU，％)和环状二聚体(cD，％)之外的环状 体。在不加酶的HMD反应中没有发现环状化合物，在不加酶的DADD 反应中检测到小于1％的环状单聚体。

表1

脂族二胺大小(C6或C12)和二酯(己二酸二甲酯)-二胺比、 溶剂、温度及反应时间对环状酰胺低聚物合成的影响

  二胺 二酯/二胺摩尔比   溶剂  温度，℃ 时间，h    cU，％    cD，％    CAO，％   HMD     0.25   DPE     70     6     5     10.2     15.2   HMD     0.25   甲苯     70     24     7     7     14   HMD     1   甲苯     60     15     5.3     1.3     6.6   HMD     1   甲苯     60     15     3.6     1.4     5   HMD     0.25   DPE     50     24     1.7     0     1.7   HMD     0.25   甲苯     50     6     1.3     0     1.3   HMD     4   甲苯     50     24     0.5     0     0.5   DADD     1   甲苯     60     15     53.4     1.6     55   DADD     1   甲苯     60     15     35.7     1.9     37.6   DADD     0.25   甲苯     50     24     21.7     0.5     22.2   DADD     0.25   DPE     70     24     21.3     0.7     22   DADD     0.25   甲苯     70     6     20.6     1.1     20.6   DADD     0.25   DPE     50     6     14.1     0     14.1   DADD     4   甲苯     70     24     15.2     0     15.2   DADD     4   DPE     70     6     14.8     0     14.8   DADD     4   DPE     50     24     10.9     0     10.9   DADD     4   甲苯     50     6     7.7     0     7.7

实施例2

70℃下在甲苯中用Novozym435(10wt％)

从HMD或DADD(0.5M)和DMA(0.5M)合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有以下成分的8-mL反应小瓶在70℃、持续 搅拌下进行温育：200mg Novozym435、116mg HMD或200mg DADD、164μl DMA、1.72mL(对于HMD)或1.64mL(对于DADD) 甲苯和选定数量(表2)的4或3分子筛(Aldrich)。

24小时后，将反应停止加热，放入聚丙烯离心管中，用2mL 温(60℃)甲苯/甲醇(80/20)以12000rpm离心5min，收集上清液。再 加入温甲苯/甲醇(1/1)，再次进行离心和上清液移取，合并两个上清 液级分。通过MALDI-TOF MS分析上清液和溶于三氯乙醇的固体产 物的环状聚酰胺含量——环状单聚体百分比(cU，％)、环状二聚体百分 比(cD，％)和总环状酰胺低聚物百分比(CAO，％)(没有观察到大于二聚 体的环状体)。单体(二酯)转化率(MC，％)通过对上清液的HPLC分析 来测定。在形成固体产物(固体，wt％)的反应中，总产物混合物中的 环状化合物摩尔含量从上清液中的环状体含量、固体产物中的环状 体含量及上清液和固体的相对重量计算出(表2)。通常，上清液比固 体富含环状物类。在固体中，较短的环状物类以相对较少的数量被 物理包埋着，固体主要由在甲苯/甲醇中溶解度低的较长线性聚酰胺 链(通常仍为较低的分子量＜2500Da)组成。

表2

分子筛含量对大环酰胺合成的影响

  胺 分子筛*，wt％   MC，％   固体，wt％    cU，％    cD，％    CAO，％   HMD     0     57     7     0.05     0     0.05   HMD     10     93     35     1.5     0.4     1.9   HMD     10     93     29     2.6     1.3     3.9   HMD     20     86     30     4.3     3.1     7.4   HMD     50     89     41     3.5     4.5     8   DADD     0     100     97     19.6     0.4     20   DADD     10     95     11     35 6     1.4     37   DADD     10*     66     17     32.6     0.8     33.4   DADD     20     100     59     22.5     1.5     24.1

*使用3分子筛

实施例3

70℃下在甲苯中用Novozym435(10wt％)

从不同浓度的等摩尔比HMD或DADD和DMA合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有以下成分的8-mL反应小瓶在70℃、持续 搅拌下进行温育：200mg Novozym435、200mg 4分子筛、适当 数量的HMD或DADD和DMA及甲苯(以产生2mL选定摩尔浓度 的反应溶液)(表3)。进行按完全相同的方式准备但不加固定化酶的 反应，作为非酶促对照。

24小时后，将反应停止加热，以温(60℃)甲苯/甲醇(1/1)滤过175 μm玻璃纤维，通过MALDI-TOF MS分析滤液和溶于三氯乙醇中的 固体产物的环状体含量(环状单聚体百分比(cU，％)、环状二聚体百分 比(cD，％)和总环状酰胺低聚物百分比(CAO，％)(没有观察到大于二聚 体的环状体))。单体(二酯)转化率(MC，％)通过按实施例2的描述对滤 液的HPLC分析来测定。在形成固体产物(固体，wt％)的反应中，产 物混合物中环状化合物的含量从滤液中的环状体含量、固体产物中 的环状体含量及滤液和固体的相对重量计算出(表3)。

表3

底物浓度对大环酰胺合成的影响

  胺   胺，M   DMA，M  酶催化  剂，wt％   MC，％   固体，   wt％    cU，％    cD，％    cT，％   CAO，％   HMD   HMD   HMD   HMD   0.025   0.025   1.0   1.0   0   10   10   0     0     10     2     0     nd     21     2     2     4.5     33.7     1.2     0     3.5     30.5     0.7     0     0     3.1     0     0     8     67.3     1.9     0   DADD   DADD   DADD   DADD   DADD   DADD   0.025   0.025   0.25   0.5   1.0   1.0   0   10   10   10   10   0     1     100     100     100     100     nd     nd     38     28     28     42     nd     0     67.4     16.8     34.8     33.7     0     0     0     11.7     3     0.3     0     0     0     0     0     0     0     0     87.4     28.5     37.8     34     0

nd＝未测定。

实施例4

70℃下用Novozym435(10wt％)从DADD(0.5M)和DMA

并用DMA作为溶剂合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有200mg Novozym435、200mg DADD和 1.8ml DMA的8-mL反应小瓶在70℃、持续搅拌下温育24小时。进 行按完全相同的方式准备但不加固定化酶的反应，作为非酶促对照。

按实施例3的描述对反应进行分析。没有测定DMA转化。在 加酶和不加分子筛4时反应产生13.4％环状单聚体(没有形成二聚 体)，在加酶和10wt％分子筛4存在下产生3.5％单聚体(没有形成 二聚体)，不加酶时没有环状低聚物形成。

实施例5

70℃下在甲苯中用Novozym435(10wt％)加水(0.2M)从DADD

(0.25M)和DMA(0.25M)合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有200mg Novozym435(如使用)、200mg DADD、164μL DMA和7.2μL水(任选加入)的8-mL反应小瓶在 70℃、持续搅拌下温育24小时。进行按完全相同的方式准备但不加 固定化酶的反应，作为非酶促对照。

按实施例3的描述对反应进行分析。结果在表4中显示。

表4

加水对大环酰胺合成的影响

  酶催化剂，   wt％   加水    MC，％     固体，     wt％   cU，％   cD，％   CAO，％     10   是    -     57     40.8     3.2     44     10   否    100     28     16.8     11.7     28.5     0   是    -     -     0     0     0

实施例6

70℃下在甲苯中用不同酶浓度的Novozym435

从DADD(0.5M)和DMA(0.5M)合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有适当数量的Novozym435、200mg DADD、164μl DMA和1.64ml甲苯的8-mL反应小瓶在70℃、持续 搅拌下进行温育。进行按完全相同的方式准备但不加固定化酶的反 应(反应物0.025M)，作为非酶促对照。

按实施例3的描述对反应进行分析。结果在表5和图1中显示。

表5

酶催化剂重量百分比对大环酰胺合成的影响

 酶催化剂，  wt％   MC，％    固体，    wt％   cU，％   cD，％   CAO，％     0     82     0     0     0     0     1     100     0     15.9     0     15.9     5     91     37     28.6     1.6     30.2     10     100     28     34.8     3     37.8     20     91     40     41.8     1.9     43.7

实施例7

不同温度下在甲苯中用Novozym435(10wt％)

从DADD(0.1M)和DMA(0.1M)合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有200mg Novozym435、40mg DADD、33 μL DMA和1.93mL甲苯的8-mL反应小瓶在45、70或90℃下持续 搅拌温育24小时。

按实施例3的描述对反应进行分析。结果在表中显示。

表6

温度对环状酰胺低聚物合成的影响

温度，℃   酶催化剂，   wt％   MC，％    固体，    wt％   cU，％   cD，％   CAO，％     45     10     100     78     6.9     1.3     8.2     45     0     3     0     0     0     0     70     10     97     73     33.3     20.8     54.1     70     0     6     0     0     0     0     90     10     97     68     21     16.3     36.2     90     0     13     0     0     0     0

实施例8

45℃下在甲苯或甲基叔丁基醚(MTBE)中用各种酶(wt％)

从DADD(0.1M)和DMA(0.1M)合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有200mg酶、33μL DMA、40mg DADD和 1.93mL甲苯或MTBE的8-mL反应小瓶在45℃、持续搅拌下进行温 育。进行按完全相同的方式准备但不加酶的反应，作为非酶促对照。

按实施例3的描述对反应进行分析，例外的是使用大约60μm 玻璃纤维进行酶的过滤。结果在表7(甲苯中反应)和表8(MTBE中 反应)中显示。

表7

甲苯中各种水解酶对大环酰胺合成的活性

商品名   酶     酶来源   供应商     目录号  MC，％     固体，wt％   cU，％   cD，％   CAO，％   脂肪酶     产碱菌属   BioCatalytics     ICR-117     49     1     0     0     0 Chirazyme L10   脂肪酶     产碱菌属   Boehringer Mannheim     1859366     44     38     0     0     0   脂肪酶     皱褶念珠菌   BioCatalytics     ICR-106     5     4     0     0     0 Chirazyme L3   脂肪酶     皱褶念珠菌   Boehringer Mannheim     1600885     5     1     0     0     0   脂肪酶     米氏毛霉   BioCatalytics     ICR-116     52     0     0     0     0 Chirazyme L9   脂肪酶     米氏毛霉   Boehringer Mannheim     1831313     9     0     0     0     0   脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-107     27     0     0     0     0   脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-108     32     0     0     0     0   脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-109     13     0     0     0     0   脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-113     60     0     64     1.4     65.4 Chirazyme L1   脂肪酶     洋葱假单胞菌   Boehringer Mannheim     1827642     74     7     5.7     0.5     6   脂肪酶     米根霉   BioCatalytics     ICR-103     0     0     0     0     0 Chirazyme L8   脂肪酶     嗜热真菌(Humicola)   Boehringer Mannheim     1625870     5     0     0     0     0   脂肪酶     念珠菌属   BioCatalytics     ICR-III     0     0     0     0     0   脂肪酶     洋葱伯克霍尔德菌   Amano     PC-C″Amano″I     0     0     0     0     0   脂肪酶     洋葱伯克霍尔德菌   Amano     PC-C″Amano″II     20     0     0     0     0   脂肪酶     洋葱伯克霍尔德菌   Amano     PC-D″Amano″I     21     0     0     0     0   脂肪酶     南极念珠菌A   BioCatalytics     IMB-104     0     0     0     0     0 Novozym 435   脂肪酶     南极念珠菌B   Novozymes     Novozym435     100     78     6.9     1.3     8.2 Chirazyme L7   脂肪酶     猪胰腺脂肪酶   BioCatalytics     ICR 114     92     12     0     0     0   胰蛋白酶   Fluka     41145     14     0     0     0     0   α-胰凝乳蛋白酶     牛，II型   Sigma     C-4129     11     0     0     0     0   α-胰凝乳蛋白酶     牛胰腺   Sigma     C7260     10     0     0     0     0   蛋白酶     芽孢杆菌属   BioCatalytics     ICR-119     18     0     0     0     0   酯酶     猪肝   BioCatalytics     ICR-I22     6     0     0     0     0   木瓜蛋白酶     番木瓜   Fluka     76221     0     0     0     0   无酶(对照)     N/A   N/A     N/A     0     0     0     0

N/A＝不适用。

表8

MTBE中各种水解酶对大环酰胺合成的活性

商品名     酶     酶来源   供应商     目录号     MC，％  固体，wt％   cU，％    cD，％   CAO，％     脂肪酶     产碱菌属   BioCatalytics     ICR-117     100     0     1     0     1 Chirazyme L10     脂肪酶     产碱菌属   Boehringer Mannheim     1859366     100     0     0.9     0     0.9     脂肪酶     皱褶念珠菌   BioCatalytics     ICR-106     0     0     0     0     0 Chirazyme L3     脂肪酶     皱褶念珠菌   Boehringer Mannheim     1600885     0     0     0     0     0     脂肪酶     米氏毛霉   BioCatalytics     ICR-116     38     0     1.6     0     1.6 Chirazyme L9     脂肪酶     米氏毛霉   Boehringer Mannheim     1831313     0     0     0     0     0     脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-107     64     0     0     0     0     脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-108     41     0     0     0     0     脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-109     45     0     0     0     0     脂肪酶     假单胞菌属   BioCatalytics     ICR-113     100     0     56     3.2     59.2 Chirazyme L1     脂肪酶     洋葱假单胞菌   Boehringer Mannheim     1827642     100     0     6.2     0.6     6.8     脂肪酶     米根霉   BioCatalytics     ICR-103     0     0     0     0     0 Chirazyme L8     脂肪酶     嗜热真菌(Humicola)   Boehringer Mannheim     1625870     4     0     0     0     0     脂肪酶     念珠菌属   BioCatalytics     ICR-III     11     0     0     0     0     脂肪酶     洋葱伯克霍尔德菌   Amano     PC-C″Amano″I     0     0     0.9     0     0.9     脂肪酶     洋葱伯克霍尔德菌   Amano     PC-C″Amano″II     74     0     1.2     0     1.2     脂肪酶     洋葱伯克霍尔德菌   Amano     PC-D″Amano″I     67     0     0     0     0     脂肪酶     南极念珠菌A   BioCatalytics     IMB-104     7     0     0     0     0 Novozym 435     脂肪酶     南极念珠菌B   Novozymes     Novozym435     100     60     30.9     2     32.9     胰蛋白酶   Fluka     41145     12     0     0     0     0     α-胰凝乳蛋白酶     牛，II型   Sigma     C-4129     5     0     0     0     0     α-胰凝乳蛋白酶     牛胰腺   Sigma     C7260     11     0     0     0     0     蛋白酶     芽孢杆菌属   BioCatalytics     ICR-119     7     5     0     0     0     酯酶     猪肝   BioCatalytics     ICR-I22     14     0     0     0     0     木瓜蛋白酶     番木瓜   Fluka     76221     Na     0     0     0     0     无酶(对照)     N/A   N/A     N/A     10     0     0     0     0

N/A＝不适用。

实施例9

70C下在甲苯中用Novozym435(10wt％)

从各种脂族二胺(0.5M)和二酯(0.5M)合成大环酰胺

将草酸二甲酯(C2二酯)、丙二酸二甲酯(C3二酯)、丁二酸二甲 酯(C4二酯)、己二酸二甲酯(C6二酯)、辛二酸二甲酯(C8二酯)或癸 二酸二甲酯(C1 0二酯)和乙二胺(C2二胺)、1，3-丙二胺(C3二胺)、1，10- 二氨基癸烷(C10二胺)或1，12-二氨基十二烷(C12二胺)用于形成环状 酰胺低聚物。将装有搅拌棒和含有以下成分的8-mL反应小瓶在 70℃、持续搅拌下进行温育：200mg Novozym435，选定数量的二 胺、二酯和甲苯(表9)和200mg 4分子筛。进行按完全相同的方式 准备但不加固定化酶的反应，作为非酶促对照。

表9

用各种脂族二酯和二胺进行的反应中二酯、二胺和甲苯的数量

    二酯类型     二酯，mg     二胺类型     二胺，mg     甲苯，ml     C2     118.1     C2     60     1.82     C6     174.2     C2     60     1.77     C10     230.31     C2     60     1.74     C8     202.25     C3     84     1.71     C10     230.31     C3     84     1.69     C6     174.2     C10     172     1.65     C10     230.31     C10     172     1.63     C2     118.1     C12     200     1.68     C3     132.1     C12     200     1.67     C4     146.1     C12     200     1.65     C6     174.2     C12     200     1.63     C8     202.25     C12     200     1.60     C10     230.31     C12     200     1.57

按实施例3的描述对反应进行分析。结果在表10中显示。

表10

脂族二酯或二胺对大环酰胺合成的影响

    酶催化剂，     wt％     二酯     二胺   MC，％   固体，wt％    cU，％     cD，％     cT，％     CAO，％     10     C2     C2     100     69     42.8     1.5     0     44.3     0     C2     C2     100     75     20.6     0     0     20.6     10     C6     C2     100     44     3     17     3.5     23.5     0     C6     C2     100     15     8.4     0.9     0     9.3     10     C10     C2     100     71     6.7     34.1     5     45.8     0     C10     C2     10     0     0.7     0     0     0.7     10     C8     C3     72     21     3.3     7.9     0.4     11.6     0     C8     C3     0     15     3.2     0     0     3.2     10     C10     C3     100     33     11.2     15.1     1     27.3     0     C10     C3     46     0     1.3     0     0     1.3     10     C6     C10     100     38     29.4     2.5     0     31.9     0     C6     C10     65     0     0     0     0     0     10     C10     C10     93     53     15.4     5.9     0     21.3     0     C10     C10     59     0     1.4     0     0     1.4     10     C2     C12     100     56     1.4     17.6     0     19     0     C2     C12     100     47     2     8.7     0     10.7     10     C3     C12     100     66     23     14.6     0.5     38.1     0     C3     C12     76     33     4.5     6.4     0     10.9     10     C4     C12     100     28     36.6     4.9     0     41.5     0     C4     C12     -     0     25.3     0.7     0     26     10     C6     C12     94     38     24.6     1.1     0     25.7     0     C6     C12     0     0     0     0     0     0     10     C8     C12     96     39     37.7     4.1     0     41.8     0     C8     C12     -     -     0     0     0     0     10     C10     C12     97     59     38.6     3.1     0     41.7     0     C10     C12     34     0     0.9     0     0     0.9

实施例10

70℃下在甲苯中用选定的酶(10wt％)

从DADD(0.5M)和丙二酸二甲酯(0.5M)合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有以下成分的8-mL反应小瓶在70℃、持续 搅拌下进行温育：200mg酶(参见表11)、132μl丙二酸二甲酯、201mg DADD、1.67ml甲苯和200mg 4分子筛(如使用)。非酶促对照按完 全相同的方式准备，但不加酶。

按实施例8的描述对反应进行分析。结果在表11中显示。

表11

用C3二酯进行大环酰胺合成

  酶 分子筛*，wt％    MC，％ 固体，wt％   cU，％   cD，％   CAO，％   ICR 113     0     99     0     67     2     69   ICR 129     10     100     23     0     0     0   N435     10     100     48     15.4     3.2     18.6   无酶     10     92     6     0     0     0

实施例11

70℃下在甲苯中用Novozym435(10wt％)

从各种二胺(0.5M)和二酯(0.5M)合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有以下成分的8-mL反应小瓶在70℃、持续 搅拌下进行温育：200mg Novozym435，选定数量的二胺、二酯、 甲苯(表12)和200mg 4分子筛。非酶促对照按完全相同的方式准 备，但不加固定化酶。各个反应的结果在表13中显示。

表12

以各种二酯和二胺进行的反应中二酯、二胺和甲苯的数量

  二酯类型   二酯，mg   二胺类型   二胺，mg     甲苯，mL   己二酸二乙酯     202   C12     200     1.98   己二酸二(2-丁氧   基乙基)酯     364   C12     200     1.44   C10     230   三甘醇二胺     200     1.57   C10     230   双(六亚甲基)三胺     215     1.56   C6     174.2   o-PD     108     1.71   C10     202.25   o-PD     108     1.69

按实施例2的描述对反应进行分析。结果在表13中显示。

表13

用各种二酯和二胺进行的环状酰胺低聚物合成

    酶催化     剂，wt％     二酯     二胺   MC，   ％   固体，   wt％   cU，％   cD，   ％   CAO，   ％     10     0     己二酸二乙酯     己二酸二乙酯     C12     C12   87   67   85   2   11.1   0   0.8   0   11.9   0     10     0     己二酸二(2-丁氧     基乙基)酯     己二酸二(2-丁氧     基乙基)酯     C12     C12   100   58   40   2   49.7   0   4   0   53.7   0     10     0     C10     C10     三甘醇二胺     三甘醇二胺   91   55   27   7   16.8   0   2.6   0   37.4   0     10     0     C10     C10    双(六亚甲基)三胺     双(六亚甲基)三胺   81   84   28   2   26.5   0   0   0   26.5   0     10     0     C6     C6     o-PD     o-PD   100   59   8   0   21.4   6.6   0   3.4   21.4   10     10     0     C10     C10     o-PD     o-PD   10   0   6   0   45.1   9.6   0   0   45.1   9.6

实施例12

60℃下在甲苯中用南极念珠菌脂肪酶B(ChirazymeTM L-2，c-f)

从2，2′-(亚乙二氧基)二乙胺和对苯二甲酸二甲酯合成大环酰胺

将装有搅拌棒和含有以下成分的600-mL过滤式反应器在油加 热浴中60℃、持续搅拌下进行温育：20g南极念珠菌脂肪酶B (CHIRAZYMETM L-2，c-f C2，lyo(ID#2207257 Biocatalytics，Pasadena CA))、7.5g对苯二甲酸二甲酯(0.0386摩尔)、22.8g 2，2′-(亚乙二氧基) 二乙胺(也称三甘醇二胺；JeffamineEDR-148；CAS 929-59-9；Aldrich 目录号38，550-6)(0.1538摩尔)和500mL甲苯。7天后，当根据LC- MS(见下)所有的DMT都被消耗时，使反应器通过底部过滤料排放， 把酶留在反应器中，排放液体中形成的沉淀物(真空炉中干燥后为3.96 g)通过#1滤纸分离，将滤液在真空炉中干燥。

将乙腈加入到干燥滤液中，使样品在50℃下干燥15分钟，所 得混浊溶液滤过0.45微米过滤器(AcrodiscCR 25mm针头过滤器， Gelman Laboratory)到液相色谱样品小瓶中。用装有HP G1315A UV 二极管阵列检测器和HP G1946A质谱仪检测器(Agilent Technologies) 的Hewlett-Packard1100液相色谱仪(Agilent Technologies，Palo Alto， CA)进行LC/MS分析。使用两根PLgel 50 Angstrom柱(Agilent Technologies)，以CHCI3为洗脱液，流速为1mL/min。保留时间为13.1 min的环状二聚体(mw＝556Da)随短的线性低聚物一起通过质量色谱 法得到鉴定。环状二聚体在含有线性低聚物的混合物中的浓度通过 面积百分比计算测定出为80mol％。运行以相似方式进行但没有酶存 在的反应作为对照，没有产生环状或线性酰胺低聚物。

实施例13(预言性)

在脂肪酶存在下线性低聚物向环状低聚物的转化

本实施例的目的是证实在具有环状酰胺低聚物形成活性的酶催 化剂存在下，环状低聚物从线性低聚物混合物的形成。

将装有搅拌棒和含有悬浮于1.843mL甲苯中的以下成分的8-mL 反应小瓶在60℃下温育7天：200mg南极念珠菌脂肪酶B(Novozym 435)、200mg分子筛3、157mg线性尼龙12，6(链中平均有10个单 体单位，Mn＝3132Da)和20μL甲醇。在45℃下于甲基叔丁基醚(MTBE) 中进行类似的反应。在两种溶剂中在各自温度下进行按完全相同的 方式准备但不加酶的反应，作为非酶促对照。

按实施例8的描述对反应进行分析。酶促反应预期产生环状酰 胺低聚物，而非酶促反应预期不产生环状低聚物。

实施例14(预言性)

在脂肪酶存在下加入二胺时线性低聚物向环状低聚物的转化

本实施例的目的是证实在具有转酰胺基酶和环状酰胺低聚物形 成活性的水解酶存在下，环状低聚物从线性低聚物和二胺的混合物 的形成。

将装有搅拌棒和含有悬浮于1.843mL甲苯中的以下成分的8-mL 反应小瓶在60℃下进行温育：200mg南极念珠菌脂肪酶B(Novozym 43 5)、200mg分子筛3、157mg线性尼龙12，6(链中平均有10个单 体单位，Mn＝3132Da)和20μL甲醇。3天后，加入50mg DADD， 再继续进行反应7天。

按实施例8的描述对反应进行分析。酶促反应预期产生环状酰 胺低聚物，而非酶促反应预期不产生环状低聚物。

实施例15(预言性)

在脂肪酶存在下加入二酯时线性低聚物向环状低聚物的转化

本实施例的目的是证实在具有环状酰胺低聚物形成活性的水解 酶存在下，环状低聚物从线性低聚物和二酯的混合物的形成。

将装有搅拌棒和含有悬浮于1.843mL甲苯中的以下成分的8-mL 反应小瓶在60℃下进行温育：200mg南极念珠菌脂肪酶B(Novozym 435)、200mg分子筛3、157mg线性尼龙12，6(链中平均有10个单 体单位，Mn＝3132Da)和20μL甲醇。3天后，加入43.5μL己二酸二 甲酯，再继续进行反应7天。

按实施例8的描述对反应进行分析。酶促反应预期产生环状酰 胺低聚物，而非酶促反应预期不产生环状低聚物。

本申请要求2004年11月9日提交的美国临时申请第60/626,222 号的权利。